Tratamento com vancomicina carregado de sulfato de cálcio e osso autógeno em um modelo melhorado coelho de infecção óssea

* These authors contributed equally
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Summary

Este estudo apresenta um melhoria coelho modelo infectado com Staphylococcus aureus , bloqueando a mesma quantidade de bactérias na medula óssea. Vancomicina carregado de sulfato de cálcio e osso autógeno são utilizados para tratamento de reparação de antibiótico e osso. O protocolo pode ser útil para estudar a infecção óssea e regeneração.

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Zhang, Y., Shen, L., Wang, P., Xi, W., Yu, Z., Huang, X., Wang, X., Shou, D. Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection. J. Vis. Exp. (145), e57294, doi:10.3791/57294 (2019).

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Abstract

Infecção óssea resulta da invasão bacteriana, que é extremamente difícil de tratar em cirurgia clínica, ortopédica e traumática. A infecção óssea pode resultar em inflamação sustentada, osteomielite e osso eventual não-sindicalizados. Estabelecimento de um modelo animal viável, pode ser reproduzido é importante para pesquisa de infecção e tratamento antibiótico de osso. Como um modelo in vivo, o modelo de coelho é amplamente utilizado na investigação de infecção óssea. No entanto, estudos anteriores sobre coelho óssea modelos de infecção, mostrou que o status de infecção era inconsistente, como a quantidade de bactérias foi variável. Este estudo apresenta um melhor método cirúrgico para induzir infecção óssea em um coelho, bloqueando as bactérias na medula óssea. Em seguida, multi-nível avaliações podem efectuar para verificar se o método de modelagem.

Em geral, desbridante tecido necrótico e implantação vancomicina-carregado de sulfato de cálcio (VCS) são predominantes no tratamento com antibióticos. Apesar de sulfato de cálcio em VCS beneficia osteócito rastejando e crescimento de novo osso, defeitos ósseos maciça ocorrerem após desbridamento. Osso autógeno (AB) é uma estratégia atraente para superar falhas ósseas para o tratamento de defeitos de massa óssea após desbridamento ósseo necrótico.

Neste estudo, nós usamos o osso da cauda como um osso autógeno implantado no defeito ósseo. Reparação óssea foi medida usando micro--tomografia computadorizada (micro-CT) e análise histológica após o sacrifício de animais. Como resultado, o grupo de VCS, não-união óssea consistentemente foi obtido. Em contraste, as áreas de defeito ósseo no grupo de VCS-AB foram diminuiu significativamente. O presente método de modelagem descrito um método reprodutível, viável, estável para preparar um modelo de infecção óssea. O tratamento de VCS-AB resultou em taxas mais baixas de não-união óssea após tratamento com antibióticos. O modelo de infecção óssea melhorada e o tratamento de combinação de VCS e osso autógeno podem ser útil para estudar os mecanismos subjacentes em infecção e osso regeneração óssea pertinente para aplicações ortopédicas de Traumatologia.

Introduction

Infecção óssea geralmente resulta de bactérias ou outra invasão de microorganismo após trauma, fratura óssea ou outros ossos doenças1. Infecção óssea pode induzir a um elevado nível de destruição tecidual de inflamação e osso. Na clínica, Staphylococcus aureus (S. aureus) é o agente causador predominante de osso infecção2,3. A infecção óssea é dolorosa, debilitante e muitas vezes leva um curso crônico que é extremamente difícil de tratar4. Presentemente, desbridamento de tecido necrótico e implantação dos grânulos de cálcio vancomicina-carregado (VCS) foram confirmados como uma estratégia eficiente para controlar a infecção local5,6. No entanto, 10% a 15% dos pacientes experimentaram um processo de reparação óssea prolongada, retarde ou não-União após tratamento anti-infecção7. O grande segmento de um defeito ósseo é a questão mais difícil para os cirurgiões ortopédicos. Um enxerto ósseo autólogo é considerado a substituição óssea ideal no tratamento de não-União de osso8,9.

Até à data, a maioria dos estudos sobre osso autólogo implantação e infecção têm sido realizados em vários tipos de modelos animais, como ratos, coelhos, cães, porcos e ovelhas10,11. Modelos de coelho são mais comumente utilizados para estudos de infecção do osso, como primeira interpretada por Norden e Kennedy em 197012,13. Em nosso estudo anterior, usamos modelos de coelho, seguindo o método do Norden, e achamos que a quantidade de S. aureus injetado em medula óssea não foi possível quantificar com precisão, como o vazamento de sangue fora da medula óssea levou ao excesso de solução de bactérias.

Este artigo apresenta um método cirúrgico melhorado para induzir infecção óssea em coelhos. No final do processo, um exame de bioquímica de sangue, um exame bacteriológico e um exame histopatológico foram realizados para verificar o modelo de infecção óssea. Então, VCS foi implantado para inibir a infecção, e osso autógeno foi implantado para promover a regeneração óssea.

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Protocol

Os coelhos utilizados no presente estudo foram tratados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório. Todos os procedimentos experimentais foram seguidos as regras da bioética Comité de Zhejiang Academia de medicina tradicional chinesa.

1. preparação da suspensão bacteriana

  1. Dissolva 0,5 mg de S. aureus (ATCC 6538) de pó de liofilização com 0,3 mL de meio de cultura de Luria-Bertani. Misture a suspensão completamente.
  2. Marcam a suspensão de bactérias em placas de ágar tryptic soy e incubar as colônias bacterianas a 37 ° C durante 16 h.
  3. Selecione uma única colônia bacteriana, formando unidade (CFU) e cultura em tubos de caldo tryptic soy por 24 h. realizar uma subcultura por aproximadamente 24 h a 37 ° C e obter crescimento meados-logarítmica bactérias fase após 16 a 18 h, quando o valor de densidade óptica (OD) é de 0,6 a 600 nm 14.
  4. Transferi 1 mL da suspensão de bactérias em um tubo de centrífuga. Centrifugue por 5 min em 825 x g e 4 ° C e descartar o sobrenadante. Resuspenda e lavar as bactérias com 100 µ l de soro de tampão fosfato (PBS); Repita este passo 3 vezes. Finalmente, Ressuspender as bactérias com 3 mL de PBS.
  5. Estime a concentração de bactérias usando Turbidimetria15 do McFarland.
    1. Transferência 100 a 500 µ l de suspensão de bactérias de um tubo colorimétrico até que a turbidez é equivalente a um padrão de McFarland 0,5.
    2. Avaliar turbidez por comparação visual com a 0,5 de McFarland, quando o conteúdo de bactérias atinge aproximadamente 108 UFC/mL.
      Nota: Certifique-se que o volume da suspensão de bactérias é suficiente para os seguintes protocolos. Para cada coelho, o volume da suspensão de bactérias é menos de 1 mL.
  6. Transferência de 0,2 mL de suspensão bacteriana para uma placa de ágar e aplicá-lo uniformemente. Incube a placa a 37 ° C, durante 16 h. contagem das colônias de bactérias para verificar se o UFC da suspensão de bactérias.

2. preparação dos modelos de infecção óssea

  1. Manter masculina Nova Zelândia coelhos brancos, com 3 meses, em gaiolas individuais, sob condições controladas de ar (20 ± 1 ° C) e ciclos de iluminação de claro-escuro de 12 h/12 h. Oferecer dieta rotineira e água da torneira diariamente.
  2. Certifique-se de que no momento da cirurgia que o coelho pesa mais de 3 kg.
  3. Anestesiar coelhos por injeção intraperitoneal com pentobarbital de sódio (3 mg por 100 g de peso corporal). Certifique-se de coelhos são totalmente anestesiados por uma falha para responder a uma pitada de pata. Corrigi os coelhos na mesa de operação durante o procedimento de operação.
    Nota: Certifique-se que a modelagem duração do procedimento é inferior a 1 h.
  4. Raspe a região proximal da tíbia usando um barbeador elétrico no sentido contrário do crescimento dos pelos. Desinfecte a pele aplicando uma solução de iodo-povidona.
  5. Marca a extremidade superior da tíbia e a posição de buraco da perfuração para injeção com S. aureus (a distância para a extremidade superior da tíbia é 1,5 cm), com caneta e régua. Certifique-se de que as posições da perfuração do furo são no meio da tíbia na horizontal (Figura 1A).
  6. Cortar a pele de tíbia usando um bisturi n º 11 e faça uma incisão de 1 cm no periósteo (Figura 1B, C). Um buraco de 2 milímetros de diâmetro na tíbia usando uma unidade de broca elétrica do osso (Figura 1D).
  7. Pressione os furos de 2 mm de diâmetro no planalto tibial com um cilindro de cera óssea de 2 mm de diâmetro e 2 mm de altura (Figura 1E). Remova a cera de reposição óssea ao longo do plano horizontal do planalto tibial (Figura 1-F). Verifique se o buraco de 2 milímetros é cheio de cera para osso (Figura 1G).
    Nota: Certifique-se de que os buracos estão cheios de cera para osso, verificando o buraco com ou sem excesso de sangue.
  8. Coser o periósteo e pele com sutura cirúrgica na sutura vertical para evitar que o animal mastigar as suturas (Figura 1-H).
  9. Injecte 1 x 108 UFC/mL das soluções de S. aureus (30 µ l 100 g de peso corporal), com um injector de assepsia de 1 mL (Figura 1eu). Certifica-se de que as agulhas penetram a cera para osso e injetam a solução de S. aureus em medula óssea lentamente.
  10. Manter o animal em condições quentes e limpas para evitar a perda de calor após a modelagem. Monitorar a frequência respiratória e cardíaca. Depois de acordar, casa dos coelhos em gaiolas individuais com livre acesso à comida e água.

3. avaliação do modelo de infecção óssea

  1. Nos dias 7, 14, 21 e 28 após a infecção, coloca coelhos o fixador de coelho com a cabeça e a orelha fora o fixador.
  2. Desenhe 2 mL de sangue das veias auriculares em um recipiente de sangue anticoagulante dipotássico etilenodiaminotetracético ácido (EDTA-K2). Empate 1 mL de sangue de um vaso sanguíneo em um recipiente de sangue. Centrifugue o soro para 10 min com uma velocidade de 651 x g , à temperatura ambiente.
    1. Determinar a contagem de glóbulos brancos (WBC) em sangue total utilizando um analisador bioquímico do sangue, e proteína C - reativa (CRP) por uma enzima-lig da imunoabsorção (ELISA) método16de ensaios.
  3. Nos dias 7, 14, 21 e 28 após a infecção, anestesiar um coelhinho de modelo com pentobarbital de sódio na dosagem de 3 mg por 100 g de massa corporal. Cortar a pele de tíbia usando um bisturi n º 11 e faça uma incisão de 2 cm no periósteo(Figura 2).
  4. Limpar a cera para osso. Debride osso necrótico, perfurando dois furos adjacentes 4,8 mm de diâmetro que usando uma unidade de broca elétrica do osso (Figura 2B). Debride necrótico da medula óssea e tecido de granulação, usando uma colher de osso (Figura 2C).
    Nota: Limpe o tecido ósseo durante o desbridamento para evitar tecido ósseo restante na medula óssea.
  5. Raspar e limpar o tecido ósseo entre os dois furos (Figura 2D).
  6. Espalhou-se 1 mL de medula óssea em placas de ágar sangue de carneiro. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C. Selecione as placas de 30 a 300 colônias e calcular o número de colônias.
  7. No final do dia 28, após a infecção, extrair amostras de tíbia ao longo das bordas das articulações do joelho e tornozelo. Corrigi os espécimes de tíbia em paraformaldeído 4% por 24 h. Decalcify os espécimes de tíbia em EDTA 10% durante 8 semanas.
  8. Desidratar os espécimes de tíbia em uma série graduada de diluições de etanol e em seguida incorporar em cera de parafina. Corte 4 consecutivos 5 µm seções dos planos coronais. Mancha de seções com hematoxilina e eosina (H & E) coloração kit.
  9. Use um microscópio para ver as seções manchadas e gravar imagens de luz transmitidas com software padrão.

4. preparação dos grânulos de VCS

  1. Adicionar 1 g de pó de cloridrato de vancomicina para 9,5 g de sulfato de cálcio da classe médica e em seguida, adicionar 3 mL de solução salina para a alimentação mista. Misture-os bem com uma espátula para 30 a 45 s.
  2. Coloque o produto misturado em um molde de gel de silicone flexível (cilindro de diâmetro de 4,8 mm e 4,8 mm de altura) e secar em temperatura ambiente por 15 min. remover as contas de VCS flexionando o molde.

5. antibioterapia e implantação do osso autógeno

  1. Anestesiar coelhos modelo com pentobarbital de sódio na dosagem de 3 mg por 100 g de massa corporal sobre o 28º dia após a infecção. Raspe a região proximal da tíbia usando um barbeador elétrico. Desinfecte a pele através da aplicação de solução de iodo-povidona.
    Nota: Certifique-se que o procedimento de modelização é menos de 1 h.
  2. Raspar a região da cauda usando um barbeador elétrico e desinfectar a cauda através da aplicação de solução de iodo-povidona.
  3. Corte o rabo com uma tesoura cirúrgica. Cortar a pele de cauda usando um bisturi n º 11 e revelar o osso da cauda. Costure a pele na região da cauda com suturas cirúrgicas absorvíveis na sutura vertical para evitar que o animal mastigar as suturas.
  4. Remova qualquer músculo, tecidos moles e periósteo. Retire o osso da cauda em cada junta e transferir o fragmento de osso para um prato de plástico de 100mm contendo solução salina estéril.
  5. Prótese 4 pedaços de grânulos de VCS (cilindro de 4,8 mm de diâmetro e 4,8 mm de altura, vancomicina 1,25 mg por peça do grânulo) na cavidade da medula, usando uma pinça curva (Figura 2E).
  6. Preencher o defeito ósseo com 8 pedaços de ossos autógenos (cilindro de 2 mm de diâmetro e 4 mm de altura por cada peça) usando curvas de pinça(Figura 2).
  7. Coser o periósteo e pele com suturas cirúrgicas absorvíveis de forma colchão de sutura (Figura 2-F).
    Nota: Manter a temperatura a 25 ° C durante a cirurgia.
  8. Manter o animal em condições quentes e limpas para evitar a perda de calor após a cirurgia. Monitorar a frequência respiratória e cardíaca. Depois de acordar, casa dos coelhos em gaiolas individuais com livre acesso à comida e água.

6. as avaliações da actividade antibiótica

  1. Colocou um fixador coelho coelhos e coloque a cabeça e a orelha fora o fixador em 2, 4, 6 e 8 semanas após o tratamento.
  2. Tirar sangue das veias auriculares com EDTA-K2 anticoagulante dos vasos sanguíneos. Empate 1 mL de sangue de um vaso sanguíneo em um recipiente de sangue. Centrifugue o soro para 10 min com uma velocidade de 651 x g , à temperatura ambiente.
  3. Determine a contagem de glóbulos brancos (WBC) em sangue total por meio de analisador bioquímico do sangue e proteína C - reativa (CRP) por um método de ELISA16.

7. as avaliações de regeneração óssea

  1. Eutanásia em coelhos injetando com um sobre dosagens de pentobarbital de sódio, no final de 8 ou 12 semanas após o tratamento.
  2. Extrair amostras de tíbia, ao longo das bordas das articulações do joelho e tornozelo. Debride camadas da fáscia e músculos.
  3. Analise a estrutura do tibia usando microtomografia computadorizada (micro-CT). Escolha uma área oval 4,8 mm de diâmetro e 9,6 mm de comprimento como a região de interesse (ROI). Reconstrua o modelo 3D imagens usando dados de bitmap.
  4. Escolher as partituras da proporção de volume de volume/tecido ósseo (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th), número Trabécula (Tb.N) e separação trabecular (Tb.Sp)from the3D modelos para avaliar a regeneração óssea.

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Representative Results

Avaliação do modelo de infecção óssea
Após a infecção com S. aureus, as manifestações patológicas de coelhos foram semelhantes para o sintoma representativo da osteomielite crônica na clínica. Em nosso estudo, 30 coelhos foram infectados e submetidos como um grupo de modelos, e 10 coelhos estavam sujeitos como animais de controle. Todos os coelhos de modelo tem infectado seios do site local da tíbia, com pus branco e amarelo sobre o fluxo de seios do face(Figura 3). Os resultados da coloração H & E indicam que agregados bacterianos estão localizados ao redor do osso morto no grupo de modelo, e osteócitos normais não podem ser identificados. Os níveis de CRP e WBC são mais elevados no grupo de modelo que o grupo controle (Figura 3B). Os lysates necrótico da medula óssea são listrados em placas de ágar, que resultam em aumento do número de colônias para o grupo de modelo após a infecção (Figura 3C). No final da modelagem, havia 3 coelhos mortos por causa de infecção grave. Os restantes coelhos infectados foram identificados como o modelo de infecção óssea e foram divididos em 3 grupos: grupo, grupo de VCS e VCS-AB-grupo do modelo.

Avaliações da atividade antibiótica e regeneração óssea
2, 4, 6 e 8 semanas após o tratamento com VCS ou VCS-AB, os níveis de CRP e WBC são significativamente reduzidos(Figura 4). Após 12 semanas de implantação de VCS e enxerto de osso, defeitos da tíbia do grupo VCS-AB pareciam totalmente coalescente. Superfícies de planalto tibial do grupo VCS-AB são mais planas do que a do grupo de VCS. Imagens de reconstrução 2D indicam um aumento progressivo no volume ósseo durante o período de 12 semanas após o tratamento com VCS-AB e VCS, enquanto a perda óssea é significativa no grupo modelo (Figura 4B). Para analisar os índices quantitativos de regeneração óssea, uma área oval 4,8 mm de diâmetro e 9,6 mm de comprimento foi escolhida como a região de interesse (ROI) (Figura 4C), e imagens do modelo 3D foram reconstruídas usando dados de bitmap. Os índices de micro-CT BV/TV no grupo modelo eram significativamente inferiores que em VCS e VCS-AB grupos. O golo de Tb.N e Tb.Th no grupo de VCS-AB foram significativamente maiores do que os do modelo e o grupo de VCS. Além disso, os escores de Tb.Sp no grupo de VCS-AB são consideravelmente menores do que no grupo de modelo e grupo VCS (Figura 4-D).

Estes resultados sugerem que a infecção com S. aureus causas aumentando WBC e CRP no grupo modelo, que pode ser diminuído usando os VCS. A implantação de VCS é considerada como o tratamento antibiótico ideal. No entanto, o defeito ósseo é observável no grupo de VCS. O tratamento de osso autógeno e VCS aumentam a espessura de trabéculas e número de trabéculas e diminuem a separação trabecular. O tratamento de VCS-AB mostrou a capacidade de promover a consolidação óssea.

Figure 1
Figura 1 . Preparação cirúrgica do modelo de infecção óssea. (A) mostra a perfuração posição na tíbia. A distância entre a posição da perfuração do furo para injeção com S. aureus à extremidade superior da tíbia é 1,5 cm. (B) incisão feita na pele para expor o periósteo. (C) mostra a incisão feita através do periósteo para expor a tíbia. (D) soco um buraco de 2mm de diâmetro na tíbia. (E) preencher o buraco de diâmetro 2mm cheio de cera para osso. (F) cortar a cera para osso de reposição. (G) mostrar a cera para osso enchendo o defeito ósseo. (H) Sew o periósteo e a pele. (eu) Inject com solução de S. aureus . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Preparação do tratamento antibiótico e enxerto de osso. (A) incisão feita na pele para expor o periósteo. (B) buracos dois adjacentes 4,8 mm de diâmetro. (C) Debride osso necrótico e inflamatória da medula óssea. (D) raspar e limpar o tecido ósseo entre os dois furos para fazer um longo círculo de 4,8 mm de diâmetro e 9,6 mm de comprimento. (E) preencher o buraco com VCS e enxerto de osso. (F) Sew o periósteo e a pele. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Avaliação do modelo de infecção óssea. (A) características de aparência das pernas coelho infectadas com S. aureuse imagens de histopatologia típico da tíbia coelho nos grupos de controle e modelo. Seta azul: osteócito; seta rosa: osso trabeculado; seta amarela: agregações bacterianas; Arqueiro Verde: osso morto. (B) o WBC e CRP resulta do soro de coelho, nos pontos de tempo antes de modelar, 7, 14, 21 e 28 dias após a infecção. As colunas representam a média ±SE, *p < 0.05 vs o grupo de controle. (C) o número de colônias bacterianas na medula tíbia contados após incubação durante a noite. As colunas representam a média ±SE, *p < 0.05 vs a colônia contar no dia 0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Avaliações de regeneração de atividade e osso antibiótica. (A) os resultados de WBC e CRP no soro de coelho, os pontos de tempo de 2, 4, 6 e 8 semanas após o implante de VCS e VCS-AB, os pontos representam a média ±SE, #p < 0,05 e *p < 0,05 em relação ao grupo de modelo. (B) a secção coronal imagens do tibia analisaram por micro-CT. (C) a localização do ROI. (D) o show de histogramas o osso tecido/volume volume (BV/TV), espessura trabecular (Tb.Th), número Trabécula (Tb.N) e dezenas de separação trabecular (Tb.Sp) de ROI de cinco coelhos por grupo. As colunas representam a média ±SE, *p < 0.05 vs grupo controle ou o grupo de modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . O cronograma de todos os procedimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nos estudos anteriores, vários tipos de modelos animais foram construídos para estudar ambos infecção óssea aguda e crônica; no entanto, a busca do modelo ideal ainda persiste17,18. Além disso, o modelo de infecção óssea ideal é esperado para simular as características patológicas da infecção óssea em ambiente clínico, enquanto os períodos de modelização, permanecem, baixo custo e fácil de realizar. Até agora, o modelo de infecção óssea coelho é o modelo mais comum na investigação de doença inflamatória óssea, como os coelhos são disponíveis, viável e barata. Em nosso estudo anterior, comparamos a taxa de mortalidade e a taxa de infecção de coelhos com diferentes pesos de corpo. Os resultados mostraram que o peso do corpo deve ser mais de 3 kg; caso contrário, haveria uma alta taxa de mortalidade ou uma alta incidência de haematosepsis e uma maior taxa de mortalidade após a cirurgia.

Ao contrário de estudos anteriores, os modelos de infecção óssea coelho e tratamento antibiótico em nosso estudo são consistentes com as características patológicas da doença humana e a terapia cirúrgica. No estudo anterior, animais injetados com Morruato de sódio e S. aureus não tinha estado patológico mais de 60 dias. Além disso, a taxa de mortalidade foi mais do que 20%12,19. O excesso de solução de S. aureus de defeitos ósseos tinha sido comprovado para induzir uma taxa baixa de infecção. Usamos a cera para osso para encher o buraco de 2 milímetros na tíbia, a fim de bloquear a solução de S. aureus na medula óssea e assegurou que os buracos estavam cheios de cera para osso, verificando o buraco com ou sem excesso de sangue. Como a espessura de uma tíbia de coelho foi 2mm, pressionamos um cilindro de 2 mm de diâmetro e cera óssea de 2 mm de altura para os furos 2 mm de diâmetro, que garantiu a cera para osso preenchido o buraco e não poderia infiltrar a medula óssea. Além disso, como a cera para osso era flexível e estável, é cheia de buracos e poderia não derreter ou reagir com medula óssea. Em nosso estudo, com o 28º dia após a infecção, a cera para osso estava ainda completa e cheia de buracos totalmente. Como os pesos de coelhos foram mais de 3 kg e inferior a 3,2 kg, o volume da suspensão de bactérias foi µ l 900 a 960 µ l. Devido a baixa velocidade de injeção e função de bloqueio de cera para osso, este volume da suspensão de bactérias pode ser injetado em medula óssea sem pressão alta. Os resultados mostraram que este protocolo garante a quantidade de S. aureus infectado na medula óssea. Um buraco de 2 milímetros de diâmetro foi um soco no tibia para garantir que a distância até a extremidade superior da tíbia é 1,5 cm, que se localiza o buraco no planalto tibial, garantindo espaço suficiente para debride e implante VCS grânulos e osso autógeno no tratamento seguinte. Durante o processo de modelagem, 3 coelhos morreram por causa de infecção grave. Os coelhos permaneceu identificaram como coelhos de infecção óssea, e a taxa de infecção em coelhos os restantes foi 100%. Em comparação com outros protocolos de infecção óssea, como a implantação de esponjas embebidas com S. aureus ou a implantação de matérias estranhas, nossos protocolos intimamente simular infecção óssea em ambiente clínico e têm pouco efeito sobre os procedimentos, tais como desbridante osso necrótico e tratamento com antibióticos.

Diagnosticar a infecção óssea é um desafio para os cirurgiões. Os resultados do teste de laboratório, incluindo detecção de marcador de inflamação de soro, análise de Microbiologia e análise de histopatologia foram usados para avaliar a infecção óssea em ambientes clínicos20. Além disso, diagnósticos por imagem, como ultra-som, Radiologia, tomografia computadorizada, ressonância magnética ou Espectroscopia Raman foram aplicados para detecção de infecção óssea21. Infelizmente, a diagnosticar osteomielite através de métodos de imagem muitas vezes é tardio porque necrose óssea é difficult para detectar por radiografia simples até a semana 3 de infecção. Em nosso estudo, usamos soro inflamação marcador deteção e histopatologia análise para avaliar modelos de infecção do osso, como esses métodos foram eficazes, operável e os índices foram sensíveis. Os seguintes foram os mais importantes passos do procedimento cirúrgico para criar um modelo de infecção óssea em nosso estudo. Escolha os coelhos com peso adequado para realizar a cirurgia e o tratamento. Manter um ambiente estéril durante o procedimento cirúrgico e sensibilização e garantir condições quentes, seguindo o protocolo do procedimento cirúrgico. Um buraco de 2 milímetros de diâmetro na tíbia e garantir que a distância para a extremidade superior da tíbia é 1,5 cm. preencher o buraco com cera para osso e costurar o periósteo e a pele, a fim de bloquear a solução de bactérias. Os passos mais importantes do tratamento antibiótico são a seguir. Garantir a infecção óssea patológica dos coelhos, detectando WBC em sangue total e CRP no soro. Debride osso necrótico completamente, buracos dois adjacentes 4,8 mm de diâmetro e raspar e limpar o tecido ósseo entre os 2 furos. 4 pedaços de grânulos de VCS e 8 pedaços de osso autógeno implante na medula óssea e defeito ósseo.

Após tratamento com antibióticos, observamos que os coelhos no grupo de VCS-AB tinham um potencial osteogênico mais elevado do que no grupo de VCS. Isto pode ser porque o osso autógeno contém osteócitos ativados e fatores de crescimento e formação óssea, que produzem matriz óssea em toda a superfície do enxerto, Considerando que induz a degradação de VCS escassa óssea matriz na região do defeito. Nossos resultados indicam que o osso autógeno tem a capacidade osteogênica superior. Apesar de osso autógeno colheita é limitada em volume e implica morbilidade para o site do doador, a importância de osso autógeno não é negligenciável22,23,24. Em nosso estudo, o osso autógeno foi adquirido a partir do osso da cauda, que evita lesão sistêmica e diminui a taxa de mortalidade em comparação com o ganho de osso autógeno do osso ilíaco. Auto-enxerto ósseo do osso da cauda é pode ser o material de enxerto preferido no estudo animal de infecção óssea.

Em conclusão, um modelo melhorado coelho de infecção óssea foi estabelecido neste estudo. Índices de inflamação e índices bioquímicos de sangue foram usados para estimar o modelo de infecção óssea. Também, após tratamento com antibióticos, análises multi-nível foram realizadas para detectar a capacidade de regeneração de atividade e osso antibiótica. A modelagem, protocolos de tratamento e métodos de avaliação são viável e confiável. Mais estudos serão focados em aproveitando várias modalidades de dispositivos visuais para monitorar o processo patológico de infecção óssea e o processo de reparação óssea.

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Disclosures

Os autores relatam que não há conflitos de interesse neste trabalho.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Nacional Natural Science Foundation da China (81803808, 81873062), Zhejiang Provincial médica e Ciências da saúde e Technology Fund (2017KY271) e ciência e tecnologia de projeto da província de Zhejiang (2017 37181).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable surgical suture Jinghuan 18S0604A
asepsis injector Jinglong 20170501
bone wax ETHICON JH5CQLM
CCD camera Olympus DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel XINGE 20170802
Electric bone drill unit Bao Kang BKZ-1
Electric shaver Codos 3800
flexible silica gel mold  WRIGHT 1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Beyotime 20170523
Luria-Bertani culture medium Baisi Biothchnology 20170306
Medical-grade calcium sulphate WRIGHT 1527745
microcomputed tomography (micro-CT) Bruker SkyScan 1172 
Microscope Olympus CX41
New Zealand white rabbits Zhejiang Experimental Animal Center  SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel  Yuanlikang 20170604
normal saline Mingsheng 20170903
PBS TBD(Jingyi) 20170703-0592
pentobarbital sodium Merk 2070124
povidone-iodinesolution Lierkang 20170114
S. aureus freeze drying powder China General Microbiological Culture Collection Center ATCC 6538
sheep blood agar HuanKai Microbial 3103210
tryptic soy agar plates HuanKai Microbial 3105697
tryptic soy broth tubes HuanKai Microbial 3104260
Vancomycin Lilly C599180

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References

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