Trattamento con vancomicina caricato di solfato di calcio e dell'osso autogeno in un modello di coniglio migliorata dell'infezione dell'osso

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Questo studio presenta un coniglio migliorato modello infettato da Staphylococcus aureus bloccando la stessa quantità di batteri nel midollo osseo. Vancomicina caricato di solfato di calcio e dell'osso autogeno sono utilizzati per il trattamento di riparazione dell'osso e antibiotico. Il protocollo potrebbe essere utile per studiare l'infezione dell'osso e la rigenerazione.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Shen, L., Wang, P., Xi, W., Yu, Z., Huang, X., Wang, X., Shou, D. Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection. J. Vis. Exp. (145), e57294, doi:10.3791/57294 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Risultati di infezione dell'osso dall'invasione batterica, che è estremamente difficile da trattare in chirurgia clinica, ortopedica e traumatica. L'infezione ossea può provocare l'infiammazione continua, osteomielite ed eventuale osso non-Unione. Istituzione di un modello animale fattibile, riproducibile è importante alle ossa ricerca di infezione e di trattamento antibiotico. Come un modello in vivo, il modello di coniglio è ampiamente usato nella ricerca di infezione dell'osso. Tuttavia, gli studi precedenti sul coniglio dell'osso ha mostrati che lo stato di infezione era incoerente, così come la quantità di batteri variabile di modelli di infezione. Questo studio presenta un metodo chirurgico migliore per indurre l'infezione dell'osso su un coniglio, bloccando i batteri nel midollo osseo. Quindi, valutazioni multi-livelli possono essere effettuate per verificare il metodo di modellazione.

In generale, sbrigliamento del tessuto necrotico e l'impianto di solfato di calcio di vancomicina-caricato (VCS) sono predominanti nel trattamento antibiotico. Sebbene il solfato di calcio in VCS benefici Osteocita strisciando e nuova crescita ossea, voluminosa dell'osso difetti si verificano dopo rimuovere il tessuto morto. L'osso autogeno (AB) è una strategia interessante per superare i difetti dell'osso per il trattamento di difetti ossei massiccia dopo rimuovere il tessuto morto osso necrotico.

In questo studio, abbiamo usato l'osso della coda come un osso autologo impiantato nel difetto osseo. Riparazione ossea è stata misurata utilizzando micro-computare-tomografia (micro-CT) e l'analisi istologica dopo sacrificio animale. Di conseguenza, nel gruppo VCS, non-Unione dell'osso è stata ottenuta costantemente. Al contrario, le zone di difetto dell'osso nel gruppo VCS-AB sono state diminuite significativamente. Il presente metodo di modellazione descritto un metodo riproducibile, fattibile, stabile per preparare un modello di infezione dell'osso. Il trattamento di VCS-AB è provocato da tassi più bassi di pseudoartrosi dell'osso dopo il trattamento antibiotico. Il modello di infezione migliore dell'osso e il trattamento di combinazione di VCS e osso autogeno potrebbe essere utile per studiare i meccanismi di fondo nella rigenerazione ossea dell'osso e infezione pertinente per applicazioni ortopediche di traumatologia.

Introduction

L'infezione dell'osso provoca solitamente da batteri o altri invasione microorganismo dopo traumi, fratture ossee o altre malattie di osso1. L'infezione dell'osso può indurre un alto livello di distruzione del tessuto dell'osso e l'infiammazione. Nella clinica, lo Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) è l'agente causativo predominante di osso infezione2,3. L'infezione dell'osso è doloroso e debilitante e spesso assume un decorso cronico che è estremamente difficile da trattare4. Allo stato attuale, lo sbrigliamento del tessuto necrotico e impiantare dei branelli di vancomicina-caricati del calcio (VCS) sono stati confermati come una strategia efficace per il controllo di infezione locale5,6. Tuttavia, 10-15% dei pazienti ha avvertito un processo di riparazione dell'osso prolungato, ritardi di consolidazione o pseudoartrosi dopo trattamento anti-infezione7. Il grande segmento di un difetto dell'osso è la questione più difficile per i chirurghi ortopedici. Un innesto di osso autologo è considerato la sostituzione ottimale dell'osso nell'osso non sindacale trattamento8,9.

Ad oggi, la maggior parte degli studi sull'osso infezione e l'impianto di osso autologo sono stati condotti in vari tipi di modelli animali, come i ratti, conigli, cani, maiali e pecore10,11. Modelli di coniglio sono più comunemente utilizzati per studi di infezione dell'osso, come prima interpretata da Norden e Kennedy nel 197012,13. Nel nostro studio precedente, abbiamo utilizzato modelli di coniglio seguendo il metodo di Norden, e abbiamo trovato che la quantità di S. aureus iniettato nel midollo osseo non era possibile quantificare con precisione, come la fuoriuscita di sangue dal midollo osseo ha condotto all'overflow di soluzione di batteri.

Questo articolo presenta un metodo chirurgico migliore per indurre infezione ossea sui conigli. Al termine della procedura, un'analisi biochimica del sangue, un esame batteriologico e un esame istopatologico sono stati effettuati per verificare il modello di infezione dell'osso. Quindi, VCS è stata impiantata per inibire l'infezione e l'osso autogeno è stato impiantato per promuovere la rigenerazione ossea.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I conigli utilizzati nel presente studio sono stati trattati in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Tutte le procedure sperimentali sono state seguite dalle regole di bioetica Comitato di Zhejiang Accademia di medicina tradizionale cinese.

1. preparazione della sospensione batterica

  1. Sciogliere 0,5 mg di S. aureus liofilizzazione polvere (ATCC 6538) con 0,3 mL di terreno di coltura di Luria-Bertani. Mescolare la sospensione completamente.
  2. Inoculare la sospensione di batteri su piastre di agar soia triptico ed incubare le colonie batteriche a 37 ° C per 16 h.
  3. Selezionare una singola colonia batterica formando unità (CFU) e cultura in tubi di brodo di soia triptico per 24 h. eseguire una sottocultura per circa 24 h a 37 ° C e ottenere metà-logaritmica crescita fase batteri dopo 16-18 h, quando il valore di densità ottica (OD) è 0,6 a 600 nm 14.
  4. Trasferire 1 mL di sospensione di batteri in una provetta da centrifuga. Centrifugare per 5 min a 825 x g e a 4 ° C e scartare il surnatante. Risospendere e lavare i batteri con 100 µ l di tampone fosfato salino (PBS); Ripetere l'operazione 3 volte. Infine, risospendere i batteri con 3 mL di PBS.
  5. Stimare la concentrazione di batteri usando Turbidimetria15 di McFarland.
    1. Trasferire 100 e 500 µ l della sospensione di batteri in una provetta colorimetrica, fino a quando la torbidità è equivalente a un 0,5 McFarland standard.
    2. Valutare la torbidità di confronto visivo per il 0,5 McFarland, quando il contenuto di batteri raggiunge circa 108 CFU/mL.
      Nota: Assicurarsi che il volume della sospensione di batteri è sufficiente per i seguenti protocolli. Per ogni coniglio, il volume della sospensione di batteri è inferiore a 1 mL.
  6. Trasferire 0.2 mL di sospensione batterica ad una piastra di agar e applicarlo in modo uniforme. Incubare la piastra a 37 ° C per 16 h. conteggio delle colonie di batteri per verificare il CFU della sospensione di batteri.

2. preparazione di modelli di infezione dell'osso

  1. Mantenere maschio Nuova Zelanda conigli bianchi, invecchiati 3 mesi, in gabbie individuali, sotto condizioni di aria-controllato (20 ± 1 ° C) e cicli di illuminazione luce-buio di 12 h/12 h. Offriamo dieta ordinaria e acqua di rubinetto al giorno.
  2. Assicurare che al momento dell'intervento che il coniglio pesa più di 3 kg.
  3. Anestetizzare conigli tramite l'iniezione intraperitoneale con sodio pentobarbital (3 mg per 100 g di peso corporeo). Assicurarsi di conigli sono completamente anestetizzati da un tentativo di rispondere a un pizzico di zampa. Difficoltà conigli sul tavolo operatorio durante la procedura di funzionamento.
    Nota: Assicurarsi che la modellazione procedura dura meno di 1 h.
  4. Radere l'area di tibia prossimale utilizzando un rasoio elettrico contro la direzione della crescita dei capelli. Disinfettare la pelle applicando una soluzione povidone-iodio.
  5. Contrassegnare l'estremità superiore della tibia e la posizione del foro foratura per iniezione con S. aureus (la distanza all'estremità superiore della tibia è 1,5 cm) con penna e righello. Assicurarsi che la posizione dei fori perforazione sono nel mezzo del plateau tibia in orizzontale (Figura 1A).
  6. Tagliare la tibia pelle usando un bisturi n. 11 e praticare un'incisione di 1 cm nel periostio (Figura 1B, C). Effettuare un foro di diametro di 2 mm nella tibia utilizzando un'unità di trapano elettrico dell'osso (Figura 1D).
  7. Premere i fori di diametro di 2 mm nel plateau tibia con un cilindro di cera dell'osso del diametro di 2 mm e 2 mm di altezza (Figura 1E). Rimuovere la cera di ricambio osseo lungo il piano orizzontale del plateau tibia (Figura 1,F). Controllare che il foro di 2 mm è pieno di cera dell'osso (Figura 1G).
    Nota: Assicurarsi che i fori siano pieni di cera dell'osso controllando il foro con o senza troppo pieno di sangue.
  8. Cucire il periostio e pelle con sutura chirurgica riassorbibile in una sutura verticale materasso per impedire che l'animale mastica i punti di sutura (Figura 1H).
  9. Iniettare 1 x 108 UFC/mL delle soluzioni di S. aureus (30 µ l per 100 g di peso corporeo) con un iniettore di asepsi 1 mL (Figura 1ho). Assicurarsi che gli aghi penetrano la cera dell'osso e iniettare lentamente la soluzione di S. aureus nel midollo osseo.
  10. Mantenere l'animale in condizioni di caldo e pulite per evitare la perdita di calore dopo la modellazione. Monitorare la frequenza respiratoria e cardiaca. Dopo il risveglio, casa conigli in gabbie individuali con libero accesso al cibo e acqua.

3. valutazione del modello di infezione dell'osso

  1. A giorni 7, 14, 21 e 28 dopo l'infezione, è necessario posizionare conigli nel fissatore di coniglio con la testa e orecchio fuori il fissatore.
  2. Disegnare 2 mL di sangue dalle vene auricolare in un contenitore di sangue dell'anticoagulante di dipotassio Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA-K2). Disegnare 1 mL di sangue da un vaso sanguigno in un contenitore di sangue. Centrifugare il siero per 10 min con una velocità di 651 x g e a temperatura ambiente.
    1. Determinare il numero di globuli bianchi (WBC) nel sangue intero utilizzando un analizzatore di biochimica del sangue, e proteina C - reattiva (CRP) di un enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) metodo16del test.
  3. Ai giorni 7, 14, 21 e 28 dopo l'infezione, anestetizzare un coniglio modello con sodio pentobarbital al dosaggio di 3 mg per peso corporeo di 100 g. Tagliare la tibia pelle usando un bisturi n. 11 e praticare un'incisione di 2 cm nel periostio (Figura 2A).
  4. Pulire la cera dell'osso. Sbrigliare osso necrotico di punzonatura due adiacenti 4,8 mm diametro fori utilizzando un'unità di trapano elettrico dell'osso (Figura 2B). Sbrigliare necrotico del midollo osseo e del tessuto di granulazione con un cucchiaio di osso (Figura 2C).
    Nota: Pulire tessuto osseo durante lo sbrigliamento per evitare tessuto osseo restanti nel midollo osseo.
  5. Raschiare e pulire il tessuto osseo tra i due fori (Figura 2D).
  6. Spread 1 mL di midollo osseo su piastre di agar sangue di pecora. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C. Piastre di 30 – 300 colonie di selezionare e calcolare il numero di colonie.
  7. Alla fine del giorno 28 dopo l'infezione, estrarre campioni di tibia lungo i bordi delle articolazioni del ginocchio e della caviglia. Difficoltà gli esemplari di tibia in paraformaldeide al 4% per 24 h. DECALCIF gli esemplari di tibia in 10% EDTA per 8 settimane.
  8. Disidratare gli esemplari di tibia in una serie graduata di diluizioni di etanolo e quindi incorporare in paraffina. Tagliare 4 consecutivi 5 µm sezioni dai piani coronale. Macchia di sezioni con ematossilina ed eosina (H & E) colorazione kit.
  9. Utilizzare un microscopio per visualizzare le sezioni macchiate e registrare immagini trasmesse luce con software standard.

4. preparazione del VCS perline

  1. Aggiungere 1 g di vancomicina cloridrato polvere a 9,5 g di solfato di calcio di grado medico e quindi aggiungere 3 mL di soluzione salina normale per l'alimentazione mista. Mescolare accuratamente con una spatola per 30-45 s.
  2. Posizionare il prodotto miscelato in uno stampo flessibile gel di silice (cilindro di diametro 4,8 mm e 4,8 mm di altezza) e asciugare a temperatura ambiente per 15 minuti, rimuovere le perline VCS flettendo la muffa.

5. antibiotici e l'impianto di osso autologo

  1. Anestetizzare conigli modello con sodio pentobarbital al dosaggio di 3 mg per peso corporeo di 100 g al 28° giorno dopo l'infezione. Radere l'area di tibia prossimale utilizzando un rasoio elettrico. Disinfettare la pelle applicando soluzione povidone-iodio.
    Nota: Assicurarsi che la procedura di modellazione è meno di 1 h.
  2. Radere la regione di coda utilizzando un rasoio elettrico e disinfettare la coda applicando soluzione povidone-iodio.
  3. Tagliare la coda utilizzando forbici chirurgiche. Tagliare la coda della pelle usando un bisturi n. 11 e rivelare l'osso della coda. Cucire la pelle in corrispondenza della regione di coda con suture assorbibili chirurgiche in una sutura verticale materasso per impedire all'animale di masticare le suture.
  4. Rimuovere qualsiasi muscolo, il tessuto molle e il periostio. Staccare l'osso della coda ad ogni giunto e trasferire il frammento di osso per un piatto di plastica di 100 mm contenente soluzione fisiologica sterile.
  5. Impianto 4 pezzi di perline VCS (cilindro di diametro 4,8 mm e 4,8 mm di altezza, vancomicina 1,25 mg al pezzo del branello) nella cavità del midollo con Pinzette curve (Figura 2E).
  6. Riempire il difetto osseo con 8 pezzi di ossa autogena (cilindro del diametro di 2 mm e 4 mm di altezza per ogni pezzo) usando curve pinzette (Figura 2E).
  7. Cucire il periostio e pelle con suture chirurgiche assorbibili in maniera di sutura materasso (Figura 2F).
    Nota: Mantenere la temperatura a 25 ° C durante la chirurgia.
  8. Mantenere l'animale in condizioni di caldo e pulite per evitare la perdita di calore dopo la chirurgia. Monitorare la frequenza respiratoria e cardiaca. Dopo il risveglio, casa conigli in gabbie individuali con libero accesso al cibo e acqua.

6. Le valutazioni di attività antibiotica

  1. Mettere i conigli in un fissatore di coniglio e posizionare l'orecchio fuori il fissatore e testa a 2, 4, 6 e 8 settimane dopo il trattamento.
  2. Prelevare il sangue dalle vene auricolare con vaso sanguigno dell'anticoagulante EDTA K2. Disegnare 1 mL di sangue da un vaso sanguigno in un contenitore di sangue. Centrifugare il siero per 10 min con una velocità di 651 x g e a temperatura ambiente.
  3. Determinare il conteggio di globuli bianchi (WBC) nel sangue intero mediante Analizzatore di biochimica del sangue e la proteina C - reattiva (CRP) di un metodo di ELISA16.

7. Le valutazioni di rigenerazione ossea

  1. Eutanasia conigli iniettando con un over dosaggi di sodio pentobarbital, alla fine di 8 o 12 settimane dopo il trattamento.
  2. Estrarre i campioni di tibia, lungo i bordi delle articolazioni del ginocchio e della caviglia. Sbrigliare i muscoli e strati fasciali.
  3. Analizzare la struttura della tibia utilizzando micro-tomografia (micro-CT). Scegliere un diametro di 4,8 mm di area ovale e 9.6 mm di lunghezza come la regione di interesse (ROI). Ricostruire le immagini del modello 3D utilizzando dati bitmap.
  4. Scegliere punteggi del rapporto del volume volume/tessuto osseo (BV/TV), spessore trabecolare (Tb.Th), trabecola numero (Tb.N) e trabecular separazione (Tb.Sp)from the3D modelli per valutare la rigenerazione ossea.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Valutazione del modello di infezione dell'osso
Dopo l'infezione con S. aureus, le manifestazioni patologiche dei conigli erano simili al sintomo rappresentativo di osteomielite cronica nella clinica. Nel nostro studio, 30 conigli sono stati infettati e sottomesso come un gruppo di modello, e 10 conigli sono stati sottoposti come animali di controllo. Tutti i conigli di modello hanno infettato i seni del sito locale di tibia, con pus bianco e giallo sul flusso dai seni (Figura 3A). I risultati di macchiatura di H & E indicano che aggregazioni batteriche si trovano intorno osso morto nel gruppo modello e osteociti normale non possono essere identificati. I livelli di CRP e WBC sono più alti nel gruppo modello rispetto al gruppo di controllo (Figura 3B). I lisati di midollo osseo necrotico sono striature sulle piastre di agar, che si tradurrà in un aumento del numero di colonie per il gruppo di modello dopo l'infezione (Figura 3C). Alla fine della modellazione, c'erano 3 conigli morti a causa di grave infezione. I restanti conigli infettati sono stati identificati come il modello di infezione dell'osso e sono stati divisi in 3 gruppi: gruppo, gruppo di VCS e VCS-AB gruppo di modello.

Valutazioni di attività antibiotica e rigenerazione ossea
A 2, 4, 6 e 8 settimane dopo il trattamento con VCS o VCS-AB, i livelli di CRP e WBC sono ridotti significativamente (Figura 4A). Dopo 12 settimane di impianto del VCS e osso allogenico, difetti tibiali del gruppo VCS-AB sembravano completamente coalescenti. Superfici del plateau tibiale del gruppo VCS-AB sono più piatta rispetto a quella del gruppo di VCS. Immagini di ricostruzione 2D indicano un aumento progressivo in un volume osseo durante il periodo di 12 settimane dopo il trattamento con VCS-AB e VCS, mentre la perdita dell'osso è significativa nel gruppo del modello (Figura 4B). Per analizzare gli indici quantitativi di rigenerazione ossea, una zona ovale 4,8 mm di diametro e lunghezza 9,6 mm è stato scelto come la regione di interesse (ROI) (Figura 4C), e modello 3D immagini sono state ricostruite utilizzando dati bitmap. Gli indici di micro-CT BV/TV nel gruppo modello erano significativamente più bassi che nel VCS e VCS-AB gruppi. I punteggi Tb.N e Tb.Th nel gruppo VCS-AB erano significativamente più alti rispetto a quelli del modello e del gruppo di VCS. Inoltre, i punteggi di Tb.Sp nel gruppo VCS-AB sono nettamente inferiori a quello del modello gruppo e gruppo di VCS (Figura 4D).

Questi risultati indicano che l'infezione con S. aureus cause aumentando WBC e CRP nel gruppo modello, che può essere diminuito utilizzando il VCS. L'impianto di VCS è considerato come il trattamento antibiotico ottimo. Tuttavia, il difetto osseo è osservabile nel gruppo di VCS. Il VCS e trattamento di osso autogeno aumentare lo spessore di trabecole e numero di trabecole e diminuire la separazione trabecular. Il trattamento di VCS-AB ha mostrato capacità di promuovere la guarigione ossea.

Figure 1
Figura 1 . Preparazione chirurgica del modello di infezione dell'osso. (A) Mostra la punzonatura posizione sulla tibia. La distanza tra la posizione del foro di perforazione per iniezione con S. aureus all'estremità superiore della tibia è 1,5 cm. (B) incisione fatta nella pelle per esporre il periostio. (C) Mostra incisione fatta attraverso il periostio per esporre la tibia. (D) Punch un foro di diametro di 2 mm nella tibia. (E) riempire il foro di diametro di 2 mm completo di cera dell'osso. (F) tagliato fuori cera di ricambio osseo. (G) mostrano la cera dell'osso riempimento del difetto osseo. (H) Sew il periostio e la pelle. (io) iniettare con soluzione di S. aureus . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Preparazione del osso allogenico e antibiotico trattamento. (A) incisione nella pelle per esporre il periostio. (B) due adiacenti 4,8 mm diametro fori di perforazione. (C) sbrigliare osso necrotico e infiammatorio del midollo osseo. (D) raschiare e pulire il tessuto osseo tra i due fori per fare un lungo giro di 4,8 mm di diametro e lunghezza 9,6 mm. (E), riempire il buco con VCS e osso allogenico. (F) Sew il periostio e la pelle. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Valutazione del modello di infezione dell'osso. (A) caratteristiche estetiche delle gambe coniglio infettate da Staphylococcus aureuse immagini di istopatologia tipica della tibia di coniglio nel modello e controllo nei gruppi. Freccia blu: Osteocita; freccia rosa: osso trabecole; freccia gialla: aggregazioni batteriche; freccia verde: morto dell'osso. (B) il WBC e CRP risultati nel siero di coniglio allo tempo punti di prima della modellazione, 7, 14, 21 e 28 giorni dopo l'infezione. Le colonne rappresentano la media ±SE, *p < 0.05 vs il gruppo di controllo. (C) il numero di colonie batteriche nel midollo tibia contato dopo incubazione overnight. Le colonne rappresentano la media ±SE, *p < 0.05 vs la colonia conta al giorno 0. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Le valutazioni di rigenerazione dell'osso e attività antibiotica. (A) i risultati di WBC e di CRP nel siero di coniglio intervalli di tempo di 2, 4, 6 e 8 settimane dopo l'impianto di VCS e VCS-AB, i punti rappresentano la media ±SE, n.p < 0.05 e *p < 0,05 rispetto al gruppo di modello. (B) la sezione coronale immagini della tibia analizzati dal micro-CT. (C) la posizione del ROI. Volume di volume/tessuto (D), lo spettacolo di istogrammi l'osso (BV/TV), spessore trabecolare (Tb.Th), trabecola numero (Tb.N) e punteggi trabecular separazione (Tb.Sp) di ROI da cinque conigli per ogni gruppo. Le colonne rappresentano la media ±SE, *p < 0.05 vs il gruppo di controllo o il gruppo di modelli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Il diario di tutte le procedure. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Negli studi precedenti, sono stati costruiti vari tipi di modelli animali per studiare sia l'infezione acuta e cronica dell'osso; Tuttavia, la ricerca per il modello ideale persiste ancora17,18. Inoltre, il modello di infezione ossea ideale è previsto per simulare le caratteristiche patologiche di infezione ossea in ambiente clinico, mentre i periodi di modellazione, rimanere basso costo e facile da realizzare. Finora, il modello di infezione dell'osso di coniglio è il modello più comune nella ricerca di malattia infiammatoria dell'osso, come i conigli sono concrete, fattibili e poco costoso. Nel nostro studio precedente, abbiamo confrontato il tasso di mortalità e il tasso di infezione dei conigli con diversi pesi corporei. I risultati hanno mostrato che il peso corporeo dovrebbe essere più di 3 kg; in caso contrario, non ci sarebbe un alto tasso di mortalità o un'alta incidenza di haematosepsis e un più alto tasso di mortalità dopo la chirurgia.

A differenza dei precedenti studi, i modelli di infezione dell'osso di coniglio e trattamento antibiotico nel nostro studio sono coerenti con le caratteristiche patologiche della malattia umana e la terapia chirurgica. Nello studio precedente, animali iniettati con sodio morruato e S. aureus non hanno avuto lo stato patologico più di 60 giorni. Inoltre, il tasso di mortalità era più di 20%12,19. L'overflow soluzione di S. aureus da difetti ossei aveva dimostrato di indurre un tasso basso di infezione. Abbiamo usato cera dell'osso per riempire il buco di 2 mm sulla tibia, al fine di bloccare la soluzione di S. aureus nel midollo osseo e assicurato che i fori erano pieni di cera dell'osso controllando il foro con o senza troppo pieno di sangue. Come lo spessore di una tibia di coniglio era di 2 mm, abbiamo premuto un cilindro del diametro di 2 mm e cera dell'osso altezza 2 mm nei fori diametro 2 mm, che garantiva la cera dell'osso riempito il buco e non potrebbe infiltrarsi nel midollo osseo. Inoltre, come la cera dell'osso era flessibile e stabile, riempito i fori e potrebbe non sciogliersi o reagire con midollo osseo. Nel nostro studio, il giorno 28 dopo l'infezione, la cera dell'osso era ancora completa e completamente riempito i fori. Come i pesi dei conigli erano più di 3 kg e meno di 3,2 kg, il volume della sospensione di batteri era 900 µ l a 960 µ l. A causa della bassa velocità di iniezione e funzione di blocco di cera dell'osso, questo volume della sospensione di batteri potrebbe essere iniettato nel midollo osseo senza alta pressione. I risultati hanno mostrato che questo protocollo garantisce la quantità di S. aureus infettati nel midollo osseo. Un foro di diametro di 2 mm è stato perforato nella tibia per garantire che la distanza all'estremità superiore della tibia è 1,5 cm, che individua il foro al plateau tibia, assicurare uno spazio sufficiente per sbrigliare e impianto perline VCS e osso autologo nel trattamento seguente. Durante il processo di modellizzazione, 3 conigli morirono a causa di grave infezione. I conigli sono rimasti identificato come conigli infezione dell'osso, e il tasso di infezione nei conigli restanti era al 100%. Rispetto ad altri protocolli di infezione dell'osso, quali l'impianto di spugne imbevuto con S. aureus o l'impianto di corpi estranei, nostri protocolli strettamente simulare l'infezione dell'osso nella regolazione clinica e hanno scarso effetto sulle procedure, tali come sbrigliamento dell'osso necrotico ed il trattamento antibiotico.

Diagnosi di infezione dell'osso è una sfida per i chirurghi. I risultati del test di laboratorio, tra cui siero infiammazione indicatore rilevamento, analisi di microbiologia e istopatologia analisi sono stati utilizzati per valutare l'infezione dell'osso nelle regolazioni cliniche20. Inoltre, diagnostica per immagini, come l'ecografia, radiologia, tomografia computerizzata, risonanza magnetica o spettroscopia Raman sono state applicate per rilevare osso infezione21. Purtroppo, la diagnosi di osteomielite attraverso metodi di imaging è spesso ritardata perché necrosi ossea è difficile per rilevare dalla radiografia normale fino alla settimana 3 di infezione. Nel nostro studio, abbiamo usato analisi rilevamento e istopatologia dell'indicatore del siero infiammazione per valutare modelli di infezione dell'osso, come questi metodi erano efficaci, operabile e gli indici sono stati sensibili. Di seguito sono stati i passaggi più importanti della procedura chirurgica per creare un modello di infezione dell'osso nel nostro studio. Scegliere i conigli hanno un peso appropriato per eseguire l'intervento chirurgico e trattamento. Mantenere un ambiente sterile durante la procedura chirurgica e sensibilizzazione e assicurare condizioni di caldo seguendo il protocollo di procedura chirurgica. Effettuare un foro di diametro di 2 mm nella tibia e garantire che la distanza all'estremità superiore della tibia è di 1,5 cm. riempimento del foro con la cera dell'osso e cucire il periostio e la pelle al fine di bloccare la soluzione di batteri. I passi più importanti del trattamento antibiotico sono i seguenti. Garantire l'infezione ossea patologica dei conigli rilevando WBC nel sangue intero e di CRP nel siero. Sbrigliare osso necrotico completamente, due adiacenti 4,8 mm diametro fori di perforazione e raschiare e pulire il tessuto osseo tra i 2 fori. Impiantare 4 pezzi di perline VCS e 8 pezzi di osso autologo nel midollo osseo e difetto osseo.

Dopo il trattamento antibiotico, abbiamo osservato che i conigli nel gruppo VCS-AB avevano un potenziale osteogenico più alto di quello del gruppo di VCS. Questo può essere perché l'osso autogeno contiene attivato osteocytes e fattori di crescita di formazione dell'osso, che producono matrice ossea su tutta la superficie dell'innesto, mentre induce la degradazione di VCS scarso bone matrix presso la regione di difetto. I nostri risultati indicano che l'osso autogeno ha la superiore capacità osteogeniche. Anche se il prelievo osseo autogeno è limitata in volume e comporta morbilità del sito donatore, l'importanza di osso autologo non è trascurabile22,23,24. Nel nostro studio, l'osso autologo è stata acquisita dall'osso della coda, che evita lesioni sistemiche e diminuisce il tasso di mortalità rispetto ai guadagnando l'osso autogeno da osso iliaco. L'autoinnesto osso dall'osso della coda è potrebbe essere il materiale di innesto preferito nello studio animale dell'infezione dell'osso.

In conclusione, un modello di coniglio migliorata dell'infezione dell'osso è stato stabilito in questo studio. Indici di infiammazione e gli indici biochimici del sangue sono stati utilizzati per stimare il modello di infezione dell'osso. Inoltre, dopo il trattamento antibiotico, multi-livelli analisi sono state effettuate per rilevare la capacità di rigenerazione dell'osso e attività antibiotica. La modellazione, protocolli di trattamento e metodi di valutazione sono fattibile e affidabile. Ulteriori studi saranno puntati su approfittando della multi-modalità dispositivi di segnalazione visiva per monitorare il processo patologico dell'infezione dell'osso e il processo di riparazione dell'osso.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal National Foundation Natural Science of China (81803808, 81873062), Zhejiang Provincial Medical Health Science e Technology Fund (2017KY271) e scienza e tecnologia progetto della provincia del Zhejiang (2017 37181).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable surgical suture Jinghuan 18S0604A
asepsis injector Jinglong 20170501
bone wax ETHICON JH5CQLM
CCD camera Olympus DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel XINGE 20170802
Electric bone drill unit Bao Kang BKZ-1
Electric shaver Codos 3800
flexible silica gel mold  WRIGHT 1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Beyotime 20170523
Luria-Bertani culture medium Baisi Biothchnology 20170306
Medical-grade calcium sulphate WRIGHT 1527745
microcomputed tomography (micro-CT) Bruker SkyScan 1172 
Microscope Olympus CX41
New Zealand white rabbits Zhejiang Experimental Animal Center  SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel  Yuanlikang 20170604
normal saline Mingsheng 20170903
PBS TBD(Jingyi) 20170703-0592
pentobarbital sodium Merk 2070124
povidone-iodinesolution Lierkang 20170114
S. aureus freeze drying powder China General Microbiological Culture Collection Center ATCC 6538
sheep blood agar HuanKai Microbial 3103210
tryptic soy agar plates HuanKai Microbial 3105697
tryptic soy broth tubes HuanKai Microbial 3104260
Vancomycin Lilly C599180

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malizos, K. N. Global Forum: The Burden of Bone and Joint Infection: A Growing Demand for More Resources. Journal of Bone and Joint Surgery-American Volume. 99, 20 (2017).
  2. Peeters, O. Teicoplanin - based antimicrobial therapy in Staphylococcus aureus bone and joint infection: tolerance, efficacy and experience with subcutaneous administration. BMC Infectious Diseases. 16, 622 (2016).
  3. Sugaya, H., et al. Percutaneous autologous concentrated bone marrow grafting in the treatment for nonunion. European Journal of Orthopeadic Surgery and Traumatology. 24, 671-678 (2014).
  4. Birt, M. C., Anderson, D. W., Bruce, T. E., Wang, J. Osteomyelitis: Recent advances in pathophysiology and therapeutic strategies. Journal of Orthopeadics. 14, 45-52 (2017).
  5. Walter, G., Kemmerer, M., Kappler, C., Hoffmann, R. Treatment algorithms for chronic osteomyelitis. Deutsches Arzteblatt International. 109, 257-264 (2012).
  6. Henriksen, K., Neutzsky-Wulff, A. V., Bonewald, L. F., Karsdal, M. A. Local communication on and within bone controls bone remodeling. Bone. 44, 1026-1033 (2009).
  7. Mendoza, M. C., et al. The effect of vancomycin powder on bone healing in a rat spinal rhBMP-2 model. Journal of Neurosurgery Spine. 25, 147-153 (2016).
  8. Cohn Yakubovich, D., et al. Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts. Journal of Visualized Experiments. (106), e53459 (2015).
  9. Brecevich, A. T., et al. Efficacy Comparison of Accell Evo3 and Grafton Demineralized Bone Matrix Putties against Autologous Bone in a Rat Posterolateral Spine Fusion Model. Spine Journal. 17, 855-862 (2017).
  10. Jensen, L. K., et al. Novel porcine model of implant-associated osteomyelitis: A comprehensive analysis of local, regional, and systemic response. Journal of Orthopeadic Research. 35, 2211-2221 (2016).
  11. de Mesy Bentley, K. L., et al. Evidence of Staphylococcus Aureus Deformation, Proliferation, and Migration in Canaliculi of Live Cortical Bone in Murine Models of Osteomyelitis. Journal of Bone and Mineral Research. 32, 985-990 (2017).
  12. Norden, C. W., Kennedy, E. Experimental osteomyelitis. I: A description of the model. Journal of Infectious Diseases. 122, 410-418 (1970).
  13. Mistry, S., et al. A novel, multi-barrier, drug eluting calcium sulfate/biphasic calcium phosphate biodegradable composite bone cement for treatment of experimental MRSA osteomyelitis in rabbit model. Journal of Controlled Release. 239, 169-181 (2016).
  14. Bernthal, N. M., et al. Combined In vivo Optical and µCT Imaging to Monitor Infection, Inflammation, and Bone Anatomy in an Orthopaedic Implant Infection in Mice. Journal of Visualized Experiments. (92), e51612 (2014).
  15. Koeth, L. M., DiFranco-Fisher, J. M., McCurdy, S. A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. Journal of Visualized Experiments. (103), e53028 (2015).
  16. Uttra, A. M., et al. Ephedra gerardiana aqueous ethanolic extract and fractions attenuate Freund Complete Adjuvant induced arthritis in Sprague Dawley rats by downregulating PGE2, COX2, IL-1β, IL-6, TNF-α, NF-kB and upregulating IL-4 and IL-10. Journal of Ethnopharmacology. 224, 482-496 (2018).
  17. Harrasser, N., et al. A new model of implant-related osteomyelitis in the metaphysis of rat tibiae. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 152 (2016).
  18. Abedon, S. T. Commentary: Phage Therapy of Staphylococcal Chronic Osteomyelitis in Experimental Animal Model. Frontiers in Microbiology. 7, 1251 (2016).
  19. Tan, H. L., Ao, H. Y., Ma, R., Lin, W. T., Tang, T. T. In vivo effect of quaternized chitosan-loaded polymethylmethacrylate bone cement on methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis infection of the tibial metaphysis in a rabbit model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 6016-6023 (2014).
  20. Chiara, L., et al. Detection of Osteomyelitis in the Diabetic Foot by Imaging Techniques: A Systematic Review and Meta-analysis Comparing MRI, White Blood Cell Scintigraphy, and FDG-PET. Diabetes Care. 40, 1111-1120 (2017).
  21. Khalid, M., et al. Raman Spectroscopy detects changes in Bone Mineral Quality and Collagen Cross-linkage in Staphylococcus Infected Human Bone. Scientific Reports. 8, 9417 (2018).
  22. Putters, T. F., Schortinghuis, J., Vissink, A., Raghoebar, G. M. A prospective study on the morbidity resulting from calvarial bone harvesting for intraoral reconstruction. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44, 513-517 (2015).
  23. Yin, J., Jiang, Y. Completely resorption of autologous skull flap after orthotopic transplantation: a case report. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7, 1169-1171 (2014).
  24. Takehiko, S., et al. Preliminary results of managing large medial tibial defects in primary total arthroplasty: autogenous morcellised bone graft. International Orthopaedics. 41, 931-937 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics