Vancomycin 치료 로드 칼슘 염 및 뼈 감염의 향상 된 토끼 모델에서 자생 뼈

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Summary

이 연구는 향상 된 토끼 선물 모델 같은 양의 골 수에서 박테리아를 차단 하 여 황색 포도상구균 에 감염. Vancomycin 로드 칼슘 염 및 자생 뼈 항생제와 뼈 복구 처리를 위해 사용 됩니다. 프로토콜 뼈 감염 및 재생을 공부에 대 한 도움이 될 수 있습니다.

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Zhang, Y., Shen, L., Wang, P., Xi, W., Yu, Z., Huang, X., Wang, X., Shou, D. Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection. J. Vis. Exp. (145), e57294, doi:10.3791/57294 (2019).

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Abstract

뼈 감염 임상, 정형 외과, 외상 외과에 치료 하기가 매우 세균성 내 습에서 유래한 다. 뼈 감염 도왔습니다, 지속적인 염증과 최종 뼈 비 조합 될 수 있습니다. 가능한, 재생 가능한 동물 모델의 설립은 뼈 감염 연구 및 항생제 치료에 중요 합니다. Vivo에서 모델로 서 토끼 모델은 뼈 감염 연구에서 널리 이용 된다. 그러나, 토끼에 대 한 이전 연구 뼈 감염 모델 박테리아의 양을 변수 되면서 감염 상태 일치 하지 했다. 이 연구는 골 수에서 박테리아를 차단 하 여, 토끼에 뼈 감염을 유도 하는 향상 된 수술 방법을 선물 한다. 다음, 다단계 평가 모델링 방법 확인 하 실행 될 수 있습니다.

일반적으로 debriding 괴 사 성 조직 및 vancomycin 로드 칼슘 염 (VCS)의 주입은 항생제 치료에 우세. VCS에 칼슘 염 혜택 크롤링 osteocyte와 새로운 뼈 성장, 비록 대규모 뼈 결함 debriding 후 발생 합니다. 자생 뼈 (AB)은 후에 회 저 성 뼈 debriding 대규모 뼈 결함의 치료에 대 한 뼈 결함을 극복 하는 매력적인 전략 이다.

이 연구에서 우리는 자생 뼈 이식 뼈 결함으로 꼬리 뼈를 사용. 뼈 수리 동물 희생 후 마이크로--단층 촬영 (마이크로 CT) 및 조직학 분석을 사용 하 여 측정 했다. 그 결과, VCS 그룹에서 뼈 비-연합 지속적으로 얻은 했다. 대조적으로, 뼈 결함 영역 VCS AB 그룹에서 크게 감소 했다. 현재 모델링 방법 뼈 감염 모델을 준비 하는 재현, 실현, 안정적인 방법 설명. VCS AB 치료 항생제 치료 후 낮은 뼈 연방 비 비율에 있는 결과. 향상 된 뼈 감염 모델 및 VCS와 자생 뼈의 조합 치료 뼈 감염 뼈 재생 관련 학 정형 응용 프로그램의 기본 메커니즘을 공부 하는 데 도움이 수 있습니다.

Introduction

뼈 감염 세균 이나 다른 미생물 침입 후 외상, 뼈 골절, 또는 다른 뼈 질환1에서 일반적으로 유래한 다. 뼈 감염 염증 및 뼈 조직 파괴의 높은 수준의 유도 수 있습니다. 클리닉, 황색 포도상구균 (S. 구 균)에서는 뼈 감염2,3의 주된 원인이 에이전트입니다. 뼈 감염 고통, 쇠 약, 그리고 종종 매우4치료 하기 어려운 만성 과정을 걸립니다. 현재, 회 저 성 직물의 debridement 그리고 vancomycin 로드 칼슘 (VCS) 구슬의 이식 로컬 감염5,6를 제어 하기 위한 효율적인 전략으로 확인 되었습니다 있다. 그러나, 10% ~ 15%의 환자는 항 감염 치료7후 장기간된 뼈 복구 프로세스, 지연된 연합, 또는 비-연합을 경험. 뼈의 결함의 큰 세그먼트는 정형 외과 대 한 가장 어려운 문제입니다. 자가 뼈 이식 뼈 비 조합 치료8,9에 최적의 뼈 대체를 간주 됩니다.

날짜 하려면, 뼈에 대 한 연구의 대부분 감염 및 자가 뼈 이식 동물 모델, 쥐, 토끼, 개, 돼지 및 양10,11의 다양 한 종류에서 실시 되었습니다. 토끼 모델으로 뼈 감염 연구, 가장 많이 사용 되 첫번째 197012,13Norden와 케네디에 의해 수행. 우리의 이전 연구에서 우리 Norden의 방법을, 토끼 모델을 사용 하 고 우리는 S. 구 균 골 수 주입의 수량 수 없습니다 측정할 수 정확 하 게,로 골 수에서 혈액 새 박테리아 솔루션 오버플로 발견.

이 문서에 토끼 뼈 감염 유도 대 한 향상 된 수술 방법을 제공 합니다. 프로시저의 끝에, 혈액 생화학 검사, 세균 검사 및 조직 검사는 뼈 감염 모델을 확인 하려면 수행 했다. 그리고, VCS, 감염을 억제 하기 위해 이식 했다 자생 뼈 뼈 재생 촉진 이식 했다.

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Protocol

현재 연구에 사용 된 토끼는 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 따라 취급 했다. 모든 실험 절차 규칙의 생명 윤리 위원회의 절 강 아카데미의 전통 중국 의학 순 이었다.

1입니다. 세균 현 탁 액의 준비

  1. S. 구 균 동결 분말 (ATCC 6538)와 Luria Bertani 문화 매체의 0.3 mL의 0.5 mg을 디졸브. 완전히 정지를 혼합.
  2. 줄무늬가 tryptic 간장 한 천 격판덮개에 박테리아 중단 하 고 16 h 37 ° C에서 세균성 식민지를 품 어.
  3. 단일 세균성 식민지 형성 단위 (CFU)과 tryptic 간장 국물 관 24 h. 수행 37 ° C에서 약 24 h에 대 한 하위 문화를 선택 하 고 얻을 중반 대 수 성장 단계 박테리아 후 16 ~ 18 h, 광학 밀도 (OD) 값이 600에서 0.6 nm 14.
  4. 원심 분리기 튜브로 박테리아 서 스 펜 션의 1 mL를 전송 합니다. 825 x g 와 4 ° C에서 5 분 동안 centrifuge 그리고 삭제는 상쾌한. Resuspend 및 버퍼링 하는 인산 염 (PBS);의 100 µ L로 박테리아를 씻어 3 번이이 단계를 반복 합니다. 마지막으로, PBS의 3 mL와 박테리아 resuspend.
  5. 맥 팔 랜드의 turbidimetry15를 사용 하 여 박테리아 농도 견적 한다.
    1. 탁도 0.5 맥 팔 랜드 표준에 해당 될 때까지 100 ~ 500 µ L 세균 현 탁 액의 색도계 튜브를 전송 합니다.
    2. 박테리아의 콘텐츠는 약 10에 도달 하면 0.5 맥 팔 랜드에 시각적인 비교 하 여 탁도 평가8 CFU/mL.
      참고: 박테리아 서 스 펜 션의 볼륨은 다음 프로토콜에 대 한 충분 한 다는 것을 확인 하십시오. 모든 토끼 박테리아 서 스 펜 션의 볼륨 1 mL 미만입니다.
  6. 한 천 배지 세균 현 탁 액의 0.2 mL를 전송 하 고 그것을 균등 하 게 적용. 박테리아 식민지 박테리아 서 스 펜 션의 CFU를 확인 하려면 16 헤 수 37 ° C에서 접시를 품 어.

2입니다. 뼈 감염 모델의 준비

  1. 남성 뉴질랜드 백색 토끼, 세 공기 제어 조건 (20 ± 1 ° C) 및 12 h/12 h 빛 어두운 조명 사이클에서 개별 장에 3 개월 유지. 일상적인 식단을 제공 하 고 매일 수돗물.
  2. 되도록 수술의 때에 토끼 3 kg 이상의 무게.
  3. Pentobarbital 나트륨 (체중 100 g 당 3 밀리 그램)와 복 주사로 토끼를 anaesthetize. 토끼는 발 핀치에 응답 하는 실패에 의해 anesthetized 완전히 다는 것을 확인 하십시오. 작업 절차 동안 운영 테이블에 토끼를 수정.
    참고: 되도록 모델링 절차 기간은 1 시간 미만.
  4. 머리 성장의 방향에 대 한 전기 면도기를 사용 하 여 근 위 경골 영역을 면도. Povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 피부를 소독.
  5. 펜 및 통치자 S. 구 균 (경골의 위쪽 끝 까지의 거리는 1.5 cm)로 분사에 대 한 드릴링 구멍 위치와 경골의 위쪽 끝을 표시 합니다. 드릴링 구멍 위치는 tibial 고원 중간 수평 다는 것을 확인 (그림 1A).
  6. 11 호 메스를 사용 하 여 경골 피부를 잘라내어 (그림 1B, C)과에 1 cm 절 개를 하 게. 전기 뼈 드릴 단위 (그림 1D)를 사용 하 여 경골에 2 m m 직경 구멍 펀치.
  7. 2mm 직경 및 높이 2 m m (그림 1E)의 뼈 왁 스의 실린더와 tibial 고원에서 2 m m 직경 구멍을 누릅니다. (그림 1F) tibial 고원의 수평 평면 여분의 뼈 왁 스를 제거 합니다. 2 m m 구멍 뼈 왁 스 (그림 1G)의 가득 차 있는지 확인 합니다.
    참고: 또는 혈액 오버플로 없이 구멍을 선택 하 여 구멍 뼈 왁 스의 전체 인지 확인 합니다.
  8. 과을 꿰 매십시오와 씹는 봉합 (그림 1H)에서 동물을 방지 하기 위해 수직 매트리스 봉합에 흡수 되기 쉬운 외과 봉합 사를 피부.
  9. (그림 1) 1 mL 무 균 상태 인젝터와 1 x 108 미 균 솔루션 (체중 100 g 당 30 µ L)의 CFU/mL를 주사. 바늘 뼈 왁 스를 관통 하 고 주입 S. 구 균 솔루션 골 천천히 다는 것을 확인 하십시오.
  10. 모델링 후 열 손실을 피하기 위해 따뜻하고 깨끗 한 상황에서 동물을 유지. 호흡 속도 심장 박동을 모니터링 합니다. 일어나, 후 음식과 물에 대 한 무료 액세스와 개별 장에 토끼 집.

3입니다. 뼈 감염 모델의 평가

  1. 7, 14, 21, 감염 후 28 일, 토끼 토끼 위해 머리와 귀를 위해 밖으로 장소.
  2. Dipotassium ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA-K2) 항 응 혈 약 혈액 용기에 귀의 정 맥에서 혈액의 2 개 mL를 그립니다. 혈액 용기에 혈관에서 혈액의 1 mL를 그립니다. 실 온에서 651 x g 의 속도와 10 분 동안 혈 청 원심
    1. C-반응성 단백질 (CRP)에 의해 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 방법16및 혈액 생화학 분석기를 사용 하 여 전체 혈액에서 백혈구 (WBC)을 결정 합니다.
  3. 7, 14, 21, 감염 후 28 일, 한 모델 토끼 pentobarbital 나트륨 100 g 체중 당 3 밀리 그램의 복용량에서 anaesthetize. 11 호 메스를 사용 하 여 경골 피부 고과 (그림 2A)에서 2 cm 절 개를 하 게.
  4. 본 왁 스 청소. 전기 뼈 드릴 단위 (그림 2B)를 사용 하 여 두 개의 인접 한 4.8 m m 직경 구멍을 펀칭으로 회 저 성 뼈를 debride. Debride 회 저 성 골 수 및 알갱이 만듦 조직 뼈 숟가락 (그림 2C)를 사용 하 여.
    참고: 골 수에 남아 있는 뼈 조직을 피하려고 debridement 동안 뼈 조직을 청소.
  5. 긁 고 두 구멍 (그림 2D) 사이의 뼈 조직의 청소.
  6. 양 혈액 한 천 배지 위에 골의 1 mL를 확산. 37 ° c.에 하룻밤 번호판을 품 어 30-300 식민지의 접시를 선택 하 고 식민지의 수를 계산 합니다.
  7. 감염 후 28 하루의 끝에, 무릎 및 발목 관절의 가장자리를 따라 경골 표본 추출. 수정 24 h. Decalcify에 대 한 4 %paraformaldehyde 경골 표본 경골 표본 10 %EDTA 8 주 동안.
  8. 에탄올 희석의 등급된 시리즈에 경골 표본 탈수 하 고 후 파라핀 왁 스에 포함. 코로나 비행기에서 4 연속 5 µ m 단면을 잘라. 섹션 장비로 hematoxylin과 오신 (H & E) 얼룩 얼룩.
  9. 현미경을 사용 하 여 스테인드 섹션 보기와 기록 표준 소프트웨어로 가벼운 이미지를 전송.

4입니다. VCS 구슬의 준비

  1. 의료 학년 칼슘 염의 9.5 g vancomycin 염 산 염 분말 1 g을 추가 하 고 혼합된 힘에 정상적인 염 분의 3 mL를 추가 합니다. 믹스 그들을 철저 하 게 30-45에 대 한 주걱으로 s.
  2. 유연한 실리 카 젤 금형 (4.8 m m 직경 4.8 m m 높이의 실린더), 혼합된 제품을 놓고 금형을 flexing 하 여 VCS 비즈를 제거 하는 15 분 동안 실 온에서 건조 합니다.

5. 항생제 치료 및 자생 뼈의 이식

  1. 감염 후 28 하루에 체중 100 g 당 3 밀리 그램의 복용량에서 pentobarbital 나트륨과 모델 토끼를 anaesthetize. 면도 전기 면도기를 사용 하 여 근 위 경골 지역. Povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 피부를 소독.
    참고: 모델링 절차 1 시간 미만 있는지 확인 합니다.
  2. 면도 전기 면도기를 사용 하 여 꼬리 영역 고 povidone-요오드 솔루션을 적용 하 여 꼬리를 소독.
  3. 수술가 위를 사용 하 여 꼬리를 줄이려고. 11 호 메스를 사용 하 여 꼬리 피부를 잘라내어 꼬리 뼈를 공개. 흡수 수술 봉합은 봉합을 씹는에서 동물을 방지 하기 위해 수직 매트리스 봉합 꼬리 지역에서 피부를 바느질.
  4. 모든 근육, 연 조직 및과 제거 합니다. 각 합동에 꼬리 뼈를 분리 하 고 메 마른 염 분을 포함 하는 100 m m 플라스틱 접시 뼈 조각을 전송.
  5. 곡선된 핀셋 (그림 2E)를 사용 하 여 골 수 구멍에 VCS 구슬 (4.8 m m 직경 및 높이 4.8 m m, 구슬의 조각 당 1.25 mg vancomycin의 실린더)의 4 개를 이식.
  6. 뼈 결함을 채우기 자생 뼈의 8 조각으로 핀셋 (그림 2E) 곡선 (2 mm 직경 및 각 작품 당 4 m m 높이의 실린더)를 사용 하 여.
  7. 과을 꿰 매십시오와 매트리스 봉합 방식 (그림 2F) 흡수 수술 봉합 피부.
    참고: 수술 하는 동안 25 ° C에 온도 유지.
  8. 수술 후 열 손실을 피하기 위해 따뜻하고 깨끗 한 상황에서 동물을 유지. 호흡 속도 심장 박동을 모니터링 합니다. 일어나, 후 음식과 물에 대 한 무료 액세스와 개별 장에 토끼 집.

6입니다. 항생제 활동의 평가

  1. 토끼 해결사에 토끼를 넣고 2, 4, 6, 8 주 치료 후에 머리와 귀를 위해 외부 장소.
  2. K2 EDTA 항 응 혈 약 혈관과 귀의 정 맥에서 혈액을 그립니다. 혈액 용기에 혈관에서 혈액의 1 mL를 그립니다. 실 온에서 651 x g 의 속도와 10 분 동안 혈 청 원심
  3. ELISA 방법16혈액 생화학 분석기와 C-반응성 단백질 (CRP)를 사용 하 여 전체 혈액에는 백혈구 (WBC)를 결정 합니다.

7입니다. 뼈 재생의 평가

  1. 이상으로 주입 하 여 토끼를 안락사 pentobarbital 나트륨, 8 또는 12 주 치료 후의 끝의 복용량.
  2. 무릎과 발목 관절의 가장자리를 따라 경골 표본 추출. 근육과 fascial 레이어 debride.
  3. 마이크로 계산 된 단층 촬영 (마이크로 CT)를 사용 하 여 경골의 구조를 분석 합니다. 선택 타원형 지역 4.8 m m 직경 9.6 m m 만큼 관심 (ROI)의 지역. 비트맵 데이터를 사용 하 여 3D 모델 이미지를 재구성 합니다.
  4. 뼈 볼륨/조직 볼륨 (BV/TV), 배수 두께 (Tb.Th)의 비율의 점수를 선택 trabecula 번호 (Tb.N)와 배수 분리 (뼈 재생을 평가 하기 위해 Tb.Sp)from the3D 모델.

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Representative Results

뼈 감염 모델의 평가
S. 구 균감염, 후 토끼의 병 적인 발현 클리닉에서 만성 도왔습니다의 대표적인 증상에 유사 했다. 우리의 연구에서 30 토끼 했다 감염, 모델 그룹, 대상 및 10 토끼 제어 동물으로 복종 되었다. 모든 모델 토끼는 sinuses(그림 3)에서 흐름 흰색과 노란색 고름으로 경골 로컬 사이트의 sinuses 감염. H & E 염색의 결과 세균성 집계 모델 그룹에서 죽은 뼈 주위에 있는 정상적인 osteocytes 식별할 수 없는 나타냅니다. CRP와 WBC의 수준을 모델 그룹에서 제어 그룹 (그림 3B) 보다 높다. 회 저 성 골 lysates 모델 그룹에 대 한 식민지의 수를 증가 (그림 3C) 감염 후 발생 한 천 배지에서 줄무늬는. 모델링의 끝에, 심각한 감염 때문에 죽은 3 토끼 있었습니다. 나머지 감염 된 토끼 뼈 감염 모델으로 확인 된 고 3 그룹으로 나눠 지었다: 그룹, VCS 그룹, 및 VCS AB 그룹.

항생제 활동 및 뼈 재생의 평가
VCS 또는 VCS AB 치료 후 2, 4, 6, 및 8 주, CRP와 WBC의 레벨은 크게 감소(그림 4). 12 주 후 VCS 및 뼈 이식의 이식, VCS AB 그룹의 tibial 결함이 완전히 coalescent 같았다. VCS AB 그룹의 tibial 고원 서피스는 VCS 그룹 보다 아첨. 뼈 손실 모델 그룹 (그림 4B)에 2D 재건 이미지 VCS AB와 VCS, 치료 후 12 주 기간 동안 뼈에 진보적인 증가 나타냅니다. 뼈 재생 양적 인덱스를 분석 하는 타원형 지역 4.8 m m 직경 및 긴 9.6 m m (ROI) (그림 4C), 관심 지역으로 선정 되었다 하 고 3D 모델 이미지 비트맵 데이터를 사용 하 여 재구성 했다. 마이크로-CT 인덱스 BV/TV 모델 그룹에서 현저 하 게 낮은 보다는 VCS에 VCS AB 그룹 했다. VCS AB 그룹에서 Tb.N 및 Tb.Th 점수 모델 그룹과 VCS에 비해 크게 높았다. 또한, VCS AB 그룹에서 Tb.Sp 점수 모델 그룹과 VCS 그룹 (그림 4D)에서 보다 현저 하 게 낮은 있습니다.

이러한 결과 S. 구 균 원인 VCS를 사용 하 여 감소 될 수 있는 모델 그룹에서 WBC와 CRP 증가 함께 그 감염을 건의 한다. VCS의 주입 최적의 항생제 치료로 간주 됩니다. 그러나, 뼈 결함 VCS 그룹에서 관찰 이다. VCS 및 자생 뼈 치료 trabeculae 두께 trabeculae 번호를 증가 하 고 배수 분리 감소. VCS AB 치료 홍보 뼈 치유의 능력을 보여주었다.

Figure 1
그림 1 . 뼈 감염 모델의 수술 준비. (A)는 경골에 위치는 펀치를 보여줍니다. 시추 구멍 위치 사이의 거리 S. 구 균 경골의 위쪽 끝을 가진 주입은 1.5 cm. (B) 절 개에 게는 피부에는 노출. (C) 절 개 경골을 노출 하는 통해 만든 보여줍니다. (D) 펀치는 경골에 2 m m 직경 구멍. (E) 작성 2 m m 직경 구멍 뼈 왁 스의 전체. (F)는 여분의 뼈 왁 스를 잘라. (G) 표시 뼈 왁 스 뼈 결함을 작성 합니다. (H) Sew과 피부. () 넣기 S. 구 균 솔루션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 . 뼈 이식 및 항생제 치료의 준비. (A) 절 개 노출과 피부에 게. (B) 두 개의 인접 한 4.8 m m 직경 구멍을 펀치. (C) Debride 회 저 성 뼈와 골 수 염증. (D) 긁어 4.8 m m 직경의 긴 원형 수 있도록 두 개의 구멍 사이 9.6 m m 긴 뼈 조직을 청소. (E) 작성 VCS와 뼈 이식 구멍. (F) Sew과 피부. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 . 뼈 감염 모델의 평가. (A) S. 구 균및 모델 및 제어 그룹에서 토끼 경골의 전형적인 histopathology 이미지 감염 토끼 다리의 외관 특징. 파란색 화살표: osteocyte; 분홍색 화살표: 뼈 trabeculae; 노란색 화살표: 세균성 집계; 녹색 화살표: 죽은 뼈. (B) WBC와 CRP 결과의 시간 지점에서 토끼 혈 청에서 모델링, 전에 감염 후 7, 14, 21, 28 일. 열 대표 평균 ±SE *p < 0.05 제어 그룹. (C) 경골 골 수에서 세균성 식민지의 수 계산 다음 하룻밤 부 화. 열 대표 평균 ±SE *p < 0.05 식민지를 0에서 계산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 . 항생제 활동 및 뼈 재생의 평가. (A) 2의 시간 포인트에서 토끼 혈 청에서 WBC와 CRP의 결과 VCS와 VCS-AB, 포인트의 이식 후 4, 6 및 8 주 대표 말은 ±SE, #p < 0.05와 *p < 0.05 모델 그룹에 비해. 경골의 (B) 코로나 섹션 이미지 마이크로-ct. (C)에 의해 투자 수익의 위치를 분석 했다. (D) 히스토그램 표시 뼈 볼륨/조직 볼륨 (BV/TV), 배수 두께 (Tb.Th), trabecula 수 (Tb.N), 및 그룹 당 5 토끼에서 ROI의 배수 분리 (Tb.Sp) 점수 열 대표 평균 ±SE *p < 0.05 컨트롤 그룹 또는 모델 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 . 타임 라인의 모든 절차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이전 연구에서 다양 한 종류의 동물 모델 둘 다 급성과 만성 뼈 감염; 공부 건설 되었다 그러나, 이상적인 모델에 대 한 검색은 여전히17,18을 지속합니다. 또한, 이상적인 뼈 감염 모델 예상 시뮬레이션 모델링 기간 동안 임상 설정에서 뼈 감염의 병 적인 특성, 유지 수행 하기 쉽고 저렴 한 비용. 지금까지, 토끼 뼈 감염 모델은 염증 성 뼈 질병 연구에 가장 일반적인 모델으로 토끼 사용할 수 있고, 가능한 저렴 한. 우리의 이전 연구에서 우리는 사망률 및 다양 한 몸 무게와 토끼의 감염 속도 비교. 체중 3 kg 이상; 해야 했다 결과 그렇지 않으면, 있을 것입니다 높은 사망률 또는 haematosepsis 및 더 높은 사망 율의 발생률이 높은 수술 후.

이전 연구와는 달리 토끼 뼈 감염 모델 및 우리의 연구에서 항생제 치료는 인간의 질병과 수술 치료의 병 적인 특성으로 일관. 이전 연구에서 동물 나트륨 morrhuate 및 S. 구 균 주사 하지 않았습니다 pathologic 상태 60 일 이상. 또한, 사망률 2012,19보다 더했다. 오버플로 뼈 결함에서 미 균 솔루션 낮은 감염률을 유도 하기 위해 입증 되었습니다 했다. 우리 골에서 미 균 솔루션을 차단 하기 위해, 경골에 2mm 구멍을 채우기 위해 뼈 왁 스를 사용 하 고 구멍 또는 혈액 오버플로 없이 구멍을 확인 하 여 뼈 왁 스 가득 했다 보장. 토끼 경골의 두께 2mm, 우리 누를 2 mm 직경의 실린더 그리고 뼈 왁 스를 보장 2 m m 직경 구멍으로 2mm 높이 뼈 왁 스 구멍 가득 골에 침투 하지 수 있습니다. 또한, 본 왁 스는 유연 하 고 안정적인, 그것은 구멍 가득 고 수 하지 녹아 또는 골 수 반응. 우리의 연구, 감염, 후 28 일에 뼈 왁 스 여전히 완료 되었고 완전히 구멍을 가득. 토끼의 무게 3 kg 이상 되었고 3.2 kg 미만, 박테리아 서 스 펜 션의 볼륨 960 µ L 900 µ L 이었다. 주입의 느린 속도 때문에 뼈 왁 스의 차단 기능, 박테리아 서 스 펜 션의이 볼륨 높은 압력 없이 골에 주입 수 있습니다. 결과이 프로토콜은 S. 구 균 골 수에 감염의 수량을 보여주었다. 2 m m 직경 구멍은 경골의 위쪽 끝에 거리는 1.5 c m, debride 하 고 VCS 구슬과 다음 치료에 자생 뼈 이식에 충분 한 공간을 보장 하는 tibial 고원에 있는 구멍을 찾아내는 되도록 경골에 구멍 뚫은 것. 모델링 과정 3 토끼는 심각한 감염으로 인해 사망 했다. 남아 토끼 뼈 감염 토끼로 식별 하 고 나머지 토끼에서 감염 율은 100%. 스폰지에 적셔 미 균 이나 이물질, 이식의 이식 등 다른 뼈 감염 프로토콜에 비해 우리의 밀접 하 게 임상 설정에서 뼈 감염 시뮬레이션 프로토콜과 절차에 거의 영향 등 debriding 회 저 성 뼈 및 항생제 치료.

뼈 감염을 진단 하는 것은 외과 의사를 도전 이다. 혈 청 염증 마커 검출, 미생물학 분석 및 histopathology 분석을 포함 하 여 실험실 테스트 결과 임상 설정20뼈 감염을 평가 하기 위해 사용 되었다. 또한, 영상 진단, 초음파, 방사선, 컴퓨터 단층 촬영, 자기 공명 영상 또는 라만 분광학 등 뼈 감염21감지에 적용 했다. 불행히도, 진단 이미징 방법을 통해 도왔습니다는 종종 지연 뼈 괴 사 difficult 감염의 3 주까지 일반 방사선으로 검출 하기 때문에. 우리의 연구에서 우리 사용 혈 청 염증 마커 검출 및 histopathology 분석 뼈 감염 모델, 이러한 방법은 효과적이 고, 작동 되었고 인덱스 했다 중요 한. 다음 모델을 만드는 뼈 감염 우리의 연구에서 수술의 가장 중요 한 단계 이었다. 수술 및 치료를 수행 하기 위해 적절 한 몸 무게와 토끼를 선택 합니다. 모금 및 수술 절차 동안 무 균 환경을 유지 고 수술 프로토콜 다음 따뜻한 상태를 확인 합니다. 경골에 2 m m 직경 구멍을 펀치 하 고 경골의 위쪽 끝 까지의 거리는 1.5 cm. 채우기 뼈 왁 스로 구멍 확인 하 고과와 피부 박테리아 솔루션을 차단 하기 위해 바느질. 항생제 치료의 가장 중요 한 단계는 다음. 혈 청에 있는 전체 혈액과 CRP에 WBC를 감지 하 여 토끼의 병 적인 뼈 감염을 확인 합니다. 회 저 성 뼈를 완전히 debride, 두 개의 인접 한 4.8 m m 직경 구멍 펀치 고 긁어 2 구멍 사이의 뼈 조직의 청소. VCS 구슬의 4 개 및 8 자생 뼈의 골 수와 뼈 결함으로 이식.

항생제 치료 후, 우리는 VCS AB 그룹에서 토끼 VCS 그룹에서 보다 높은 osteogenic 잠재력을 했다 관찰 했다. 이 때문에 자생 뼈 포함 활성화 osteocytes VCS의 유도 부족 한 반면 이식 표면에 걸쳐 뼈 매트릭스를 생성 뼈 형성 성장 인자, 뼈 매트릭스 결함 영역에서 있을 수 있습니다. 우리의 결과 자생 뼈 우수한 osteogenic 기능을 나타냅니다. 자생 뼈 수확 볼륨에서 제한 하 고 있지만 기증자 사이트에 병 적 상태를 수반, 자생 뼈의 중요성은 무시할 수22,,2324하지. 우리의 연구에서 자생 뼈 조직의 상해를 방지 하 고 자생 뼈 장 골 뼈에서 얻고에 비해 사망률 감소는 꼬리 뼈에서 인수 되었다. 꼬리 뼈에서 Autograft 뼈는 뼈 감염의 동물 연구에서 선호 이식 재료 수 있습니다.

결론적으로, 뼈 감염의 향상 된 토끼 모델은이 연구에서 설립 되었다. 염증 인덱스 및 혈액 생화학 인덱스 뼈 감염 모델을 견적 하기 위하여 사용 되었다. 또한, 항생제 치료 후 다단계 분석 실행 되었다 항생제 활동 및 뼈 재생 기능을 감지 하. 모델링, 치료 프로토콜 및 평가 방법 가능 하 고 신뢰할 수 있습니다. 더 연구 멀티 모달 뼈 감염의 pathologic 과정 및 뼈 복구 프로세스를 모니터링 하려면 시각적 장치 활용에 집중 될 것 이다.

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Disclosures

저자는이 작품에 관심의 없습니다 충돌 보고합니다.

Acknowledgments

이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81803808, 81873062), 절 강 지방 의료 및 건강 과학 및 기술 기금 (2017KY271)는 과학 및 기술 프로젝트의 강성 (2017C 37181)에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable surgical suture Jinghuan 18S0604A
asepsis injector Jinglong 20170501
bone wax ETHICON JH5CQLM
CCD camera Olympus DP72
EDTA-K2 anticoagulant blood vessel XINGE 20170802
Electric bone drill unit Bao Kang BKZ-1
Electric shaver Codos 3800
flexible silica gel mold  WRIGHT 1527745
Hematoxylin and Eosin Staining Kit Beyotime 20170523
Luria-Bertani culture medium Baisi Biothchnology 20170306
Medical-grade calcium sulphate WRIGHT 1527745
microcomputed tomography (micro-CT) Bruker SkyScan 1172 
Microscope Olympus CX41
New Zealand white rabbits Zhejiang Experimental Animal Center  SCXK 2014-0047
No. 11 scalpel  Yuanlikang 20170604
normal saline Mingsheng 20170903
PBS TBD(Jingyi) 20170703-0592
pentobarbital sodium Merk 2070124
povidone-iodinesolution Lierkang 20170114
S. aureus freeze drying powder China General Microbiological Culture Collection Center ATCC 6538
sheep blood agar HuanKai Microbial 3103210
tryptic soy agar plates HuanKai Microbial 3105697
tryptic soy broth tubes HuanKai Microbial 3104260
Vancomycin Lilly C599180

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References

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