Adeno-संबद्ध वायरस-रीढ़ की हड्डी की आनुवंशिक रूप से परिभाषित न्यूरॉन्स में मध्यस्थता Transgene अभिव्यक्ति

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Neuroscience

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Summary

recombinase आश्रित रिकॉमबिनेंट adeno-एसोसिएटेड वायरस (rAAV) का Intraspinal इंजेक्शन रीढ़ की हड्डी में किसी भी आनुवंशिक रूप से बला कोशिका प्रकार में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां हम वर्णन कैसे काठ का रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग में ंयूरॉंस transduce करने के लिए । इस तकनीक में हेरफेर ंयूरॉन उपप्रकार के कार्यात्मक पूछताछ सक्षम बनाता है ।

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Haenraets, K., Albisetti, G. W., Foster, E., Wildner, H. Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord. J. Vis. Exp. (135), e57382, doi:10.3791/57382 (2018).

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Abstract

स्पाइनल न्यूरॉन उपजनसंख्या के चयनात्मक हेरफेर मुख्य रूप से दो अलग तरीकों से प्राप्त किया गया है: 1) चौराहीय आनुवंशिकी, जिससे डबल या ट्रिपल ट्रांसजेनिक चूहों एक रिपोर्टर या प्रभाव के चयनात्मक अभिव्यक्ति प्राप्त करने के क्रम में उत्पन्न कर रहे हैं जीन (जैसे, Rosa26 लोकस से) वांछित रीढ़ की आबादी में । 2) Intraspinal इंजेक्शन ऑफ Cre-निर्भर रिकॉमबिनेंट adeno-एसोसिएटेड वायरस (rAAV); यहाँ Cre-निर्भर AAV वैक्टर कोडिंग के लिए रिपोर्टर या प्रभाव जीन पसंद की रीढ़ की हड्डी में चूहों Cre recombinase के वांछित न्यूरॉनी में व्यक्त करने के लिए इंजेक्ट कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे Cre-निर्भर rAAV वैक्टर उत्पंन करने के लिए और कैसे काठ का स्पाइनल गर्भनाल खंडों के पृष्ठीय सींग में transduce ंयूरॉंस को rAAVs के साथ L3-L5 । काठ का रीढ़ की हड्डी के रूप में L3-L5 उन परिधीय संवेदी न्यूरॉन्स कि hindlimbs से संवेदी जानकारी संचारित द्वारा innervated कर रहे हैं, सहज व्यवहार और hindlimb ipsilateral इंजेक्शन पक्ष करने के लिए लागू संवेदी परीक्षणों के लिए प्रतिक्रियाओं हो सकता है विश्लेषण के क्रम में संवेदी प्रसंस्करण में हेरफेर न्यूरॉन्स के समारोह में पूछताछ करने के लिए । हम कैसे इस तकनीक का आनुवंशिक रूप से परिभाषित रीढ़ की हड्डी ंयूरॉंस के सबसेट का विश्लेषण किया जा सकता है के उदाहरण प्रदान करते हैं । Cre ट्रांसजेनिक चूहों में शास्त्रीय रिपोर्टर माउस प्रेरित transgene अभिव्यक्ति की तुलना में वायरस की मध्यस्थता transgene अभिव्यक्ति का मुख्य लाभ निम्नलिखित हैं: 1) विभिन्न Cre-निर्भर rAAVs एंकोडिंग विभिंन रिपोर्टर या प्रभाव प्रोटीन हो सकता है एक एकल Cre ट्रांसजेनिक लाइन में इंजेक्शन, इस प्रकार कई एकाधिक ट्रांसजेनिक माउस लाइनों बनाने की आवश्यकता पर काबू पाने । 2) इंजेक्शन साइट के लिए और इंजेक्शन के बाद समय के लिए Cre-एक्सप्रेस कोशिकाओं के हेरफेर Intraspinal इंजेक्शन सीमा । मुख्य नुकसान हैं: 1) रिपोर्टर rAAVs से जीन अभिव्यक्ति अधिक परिवर्तनशील है । 2) शल्य चिकित्सा के लिए रीढ़ की हड्डी के न्यूरॉन्स को transduce करने की आवश्यकता होती है । जो दो तरीकों में से अधिक उपयुक्त है ंयूरॉन जनसंख्या और अनुसंधान प्रश्न पर निर्भर करता है को संबोधित किया जाएगा ।

Introduction

पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी शरीर और मस्तिष्क की परिधि के बीच जानकारी के आदान प्रदान के लिए आवश्यक है । ऐसी गर्मी, सर्दी, स्पर्श, या हानिकारक उत्तेजनाओं के रूप में संवेदी उत्तेजनाओं विशेष परिधीय ंयूरॉंस, जो रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग के न्यूरॉन्स के लिए इस जानकारी को व्यक्त द्वारा पता चला रहे हैं । यहां, निरोधात्मक और उत्तेजक न्यूरॉन्स का एक जटिल नेटवर्क संग्राहक और अंततः supraspinal साइटों1,2के लिए रीढ़ की हड्डी के प्रक्षेपण ंयूरॉंस के माध्यम से संवेदी जानकारी रिले । संगणना रीढ़ की हड्डी में अंतर और प्रक्षेपण न्यूरॉन्स गेट संवेदी जानकारी द्वारा किए गए, इस प्रकार जो जानकारी का निर्धारण या दबा दिया है जो तीव्रता पर relayed. संवेदी उत्तेजनाओं के एकीकरण में परिवर्तन, इस तरह के अवरोध और उत्तेजना के बीच एक बदल संतुलन के रूप में, अतिसंवेदनशीलता या allodynia के रूप में संवेदी रोग पैदा कर सकता है (सामान्य रूप से गैर दर्दनाक उत्तेजना के बाद दर्दनाक उत्तेजना). इन परिवर्तनों को विभिंन पुराने दर्द राज्यों के अंतर्निहित कारण होने लगा रहे है3,4। इस प्रकार, रीढ़ की हड्डी के सर्किट संवेदी प्रसंस्करण में उच्च महत्व के होते है और फलस्वरूप एक जीव पर्यावरण और स्व की धारणा में । हाल ही में आगमन और आणविक, आनुवंशिक, और शल्य चिकित्सा तकनीक है कि आनुवंशिक रूप से पहचान की रीढ़ की हड्डी ंयूरॉन उपआबादी के सटीक हेरफेर की अनुमति के संयोजन के साथ, वैज्ञानिकों को अब अंतर्निहित रीढ़ की हड्डी सर्किट को समझने की शुरुआत कर रहे है विशिष्ट संवेदी मोडलों के प्रसंस्करण के लिए जिंमेदार है ।

जंगली प्रकार या ट्रांसजेनिक चूहों में rAAV के Intraspinal इंजेक्शन बहुत हेरफेर करने के लिए योगदान दिया है, विश्लेषण, और रीढ़ की हड्डी ंयूरॉंस के विशिष्ट सबसेट के समारोह की समझ5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. यह तकनीक (जैसे GFP/GFP फ्यूजन प्रोटीन), रिपोर्टर प्रोटीन (जैसे GCaMP), या प्रभावक प्रोटीन (जैसे बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों, channelrhodopsin, या pharmacogenetic रिसेप्टर्स) के रूप में मार्कर प्रोटीन के वितरण की अनुमति देता है एक स्थानिक रीढ़ की हड्डी ंयूरॉंस को सीमित तरीके से । Cre-निर्भर rAAVs के स्थानीय इंजेक्शन ट्रांसजेनिक चूहों में Cre recombinase व्यक्त रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स के एक विशिष्ट सबसेट में संबंधित न्यूरॉन आबादी के विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति देता है. हम इस तकनीक के लिए लेबल, ablate, बाधित या सक्रिय स्पाइनल glycinergic ंयूरॉंस का प्रदर्शन है कि वे रीढ़ की हड्डी में दर्द और खुजली संचरण को नियंत्रित करने का एक अनिवार्य हिस्सा है7कार्यरत हैं । इन प्रयोगों में, Cre-निर्भर rAAV के intraspinal इंजेक्शन GlyT2 में:: Cre चूहों काठ का रीढ़ की हड्डी में glycinergic न्यूरॉन्स के चयनात्मक हेरफेर सक्षम होना चाहिए । जिससे, पशु के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण glycinergic न्यूरॉन्स होते हैं कि supraspinal सर्किट के एक साथ हेरफेर से बचा जा सकता है.

जबकि rAAVs की एक intraspinal इंजेक्शन इंजेक्शन की साइट के लिए संक्रमण की सीमा, वायरल transduction न केवल स्थानीय ंयूरॉंस में लेकिन यह भी ंयूरॉंस कि axonal अनुमानों के माध्यम से इंजेक्शन साइट को जोड़ने में हो सकता है । बाद अक्सर मस्तिष्क में एक विशेष नाभिक के लिए न्यूरॉन इनपुट उपलब्ध कराने के सीएनएस क्षेत्रों का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है. axonal अनुमानों के संक्रमण कर सकते हैं, तथापि, यह भी एक प्रकारक हो सकता है जब न्यूरॉन्स की एक निर्धारित जनसंख्या एक विशेष साइट पर अध्ययन किया जाएगा. इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, हम हाल ही में AAV serotypes और अभिव्यक्ति कैसेट का एक व्यापक विश्लेषण serotypes और प्रवर्तकों कि या तो कम या ज्यादा प्रतिगामी transduction को अधिकतम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की पहचान का आयोजन किया है । स्पाइनल सर्किट्स में इस विशिष्ट शोध के सन्दर्भ में हमने भिन्न serotypes और प्रवर्तकों की क्षमता का विश्लेषित transduce न्यूरॉन्स को पृष्ठीय रूट गैंग्लिया (डीआरजी), द rostral ventromedial मज्जा (RVM), और somatosensory प्रांतस्था में करने का विश्लेषण किया 12. इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीक इसलिए या तो इंजेक्शन साइट पर रीढ़ की हड्डी में ंयूरॉंस का विश्लेषण करने के लिए या प्रक्षेपण ंयूरॉंस कि रीढ़ की हड्डी के इंजेक्शन साइट के लिए इनपुट प्रदान का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, काठ रीढ़ की हड्डी के बाईं ओर में rAAV के तीन इंजेक्शन तीन काठ का खंड (L3-L5) में न्यूरॉन्स के transduction सक्षम करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । L3-L5 खंडों को इंजेक्शन साइट पर hindlimb ipsilateral से संवेदी इनपुट का बहुमत प्राप्त होता है । हम इस तरह के एक आनुवंशिक रूप से लेबल ंयूरॉन उपप्रकार के सर्किट समारोह के लिए कार्यात्मक सबूत प्रदान करने, मजबूत व्यवहार परिवर्तन पैदा करने के लिए पर्याप्त है L3 में आनुवंशिक रूप से लेबल ंयूरॉंस के कार्यात्मक हेरफेर है कि प्रदर्शन ।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों स्विस गुआंगज़ौ पशु चिकित्सा कार्यालय (ज्यूरिख) द्वारा अनुमोदित किया गया और अनुसार सभी प्रासंगिक विनियामक और संस्थागत दिशा निर्देशों के साथ अनुपालन कर रहे हैं ।

नोट: संबंधित निर्माताओं और/या विक्रेताओं के साथ सभी सामग्री सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं ।

1. Cre-आश्रित AAV वैक्टर की जनरेशन

नोट: विभिंन प्रवर्तकों के साथ Cre निर्भर वैक्टर की एक किस्म ( सामग्री की तालिकादेखें) खरीदा जा सकता है या, यदि वांछित अभिव्यक्ति का निर्माण उपलब्ध नहीं है, यह मौजूदा AAV constructs संशोधित करके उत्पंन किया जा सकता है । नोट, प्रमोटर और सीरोटाइप वायरल transduction के प्रसार पर असर पड़ सकता है ( 12देखें) । इस प्रोटोकॉल के पहले भाग संक्षेप में दो अलग Cre-निर्भर AAV लाभ और समारोह प्रयोगों के नुकसान के लिए उपयुक्त वैक्टर, क्रमशः की पीढ़ी का वर्णन करता है ।

  1. Pharmacogenetic सक्रियण (समारोह का लाभ)
    1. आदेश pAAV. hSyn. फ्लेक्स. hM3D (Gq)-mCherry ( सामग्री की तालिकादेखें) डिजाइनर रिसेप्टर्स विशेष रूप से डिजाइनर दवाओं (खतरनाक) द्वारा सक्रिय-मध्यस्थता सक्रियण के लिए.
    2. बैक्टीरियल छुरा संस्कृति प्राप्त करने पर, पौंड प्लेटों पर बैक्टीरिया बाहर लकीर (जीवाणु ग्रेड Luria में भंग-Bertani तरल मध्यम) उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ पूरक । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात में गर्मी और अगले दिन पर एक भी कॉलोनी उठाओ ।
      नोट: AAV वेक्टर जीनोम युक्त Plasmids वायरल जीनोम के अस्थिर और पुनर्संयोजन हो सकता है, विशेष रूप से वायरल उल्टे टर्मिनल दोहराने (आईटीआर) के भीतर, ई. कोलाईमें प्रवर्धन के दौरान हो सकता है । हम AAV जीनोम युक्त प्लाज्मिड के भीतर पुनर्संयोजन से बचने के लिए MDS42 या Stbl3 के रूप में recA की कमी/-दबा उपभेदों का उपयोग करने का सुझाव देते हैं ।
    3. जीवाणुओं को बढ़ाना चुना डीएनए के विक्रेता द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन-मैक्सी-किट और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए के साथ उच्च गुणवत्ता प्लाज्मिड डीएनए तैयार-मैक्सी-किट (जैसे, सामग्री की तालिकादेखें) । प्लाज्मिड डीएनए की एक aliquot के प्रतिबंध डाइजेस्ट के माध्यम से प्लाज्मिड डीएनए की अखंडता और पहचान की पुष्टि करके प्लाज्मिड डीएनए तैयारी का एक गुणवत्ता नियंत्रण करते हैं ।
      नोट: ITRs के भीतर SmaI endonuclease प्रतिबंध के लिए मान्यता साइट्स हैं । ITRs की अखंडता को सत्यापित करने के लिए गुणवत्ता नियंत्रण में एक SmaI डाइजेस्ट शामिल करें ।
    4. उच्च गुणवत्ता rAAV का उत्पादन करने के लिए एक वायरल वेक्टर कोर सुविधा के लिए डीएनए भेजें ।
      नोट: उच्च titer, उच्च गुणवत्ता वायरल प्रस्तुतीकरण वायरल तैयारी में संदूषण की वजह से phenotypes से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इसलिए हम एक स्थापित वेक्टर कोर सुविधा में उत्पादित पसंद के rAAV होने की सिफारिश, जब तक AAV उत्पादन अच्छी तरह से प्रयोगशाला में स्थापित है ।
  2. पृथक (समारोह की हानि)
    नोट: बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों या विष रिसेप्टर्स सेल पृथक या न्यूरॉन मुंह बंद करने मध्यस्थता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने pAAV. EF1α. फ्लेक्स. DTA को DTA-निर्भर ढंग से डिप्थीरिया विष अंश एक (Cre) व्यक्त करने के लिए उत्पन्न किया है.
    1. एक Cre-निर्भर वायरल वेक्टर उत्पंन करने के लिए, एक उपयुक्त प्रमोटर के साथ एक Cre-निर्भर वेक्टर चुनें (उदा, pAAV. ef1 α. फ्लेक्स. hChR2 (H134R)-eYFP) । पसंद की कोडिंग अनुक्रम बढ़ाना (जैसे, DTA) प्राइमरों के साथ पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया द्वारा कि एएससीआई और NheI या संगत अपने को फांसी में endonuclease मांयता साइटों को प्रतिबंधित (फोस्टर एट अल देखें । 7)
    2. मानक आणविक जीवविज्ञान तकनीकों का उपयोग करना, वेक्टर डीएनए (pAAV. ef1 α. फ्लेक्स. hChR2 (H134R)-eYFP) और पीसीआर-प्रवर्धित insert (NheI-DTA-एएससीआई) के प्रतिबंध के साथ endonucleases एएससीआई और NheI के प्रतिबंध डाइजेस्ट का प्रदर्शन । शुद्ध अंशों को Ligate ।
    3. उपयुक्त बैक्टीरिया में बंधाव प्रतिक्रिया रूपांतरण, विकल्प के सक्षम बैक्टीरिया के आपूर्तिकर्ता द्वारा दिए गए प्रोटोकॉल के अनुसार, और प्लेट पौंड प्लेटों पर बैक्टीरिया । recA-कमी/-दबा उपभेदों, जैसे MDS42 या Stbl3, क्लोनिंग और प्लाज्मिड डीएनए के बाद के प्रवर्धन के लिए उपयोग करें ।
    4. परिवर्तन के बाद दिन पर, क्लोन उठाओ और उंहें पौंड मध्यम में inoculate ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात उपयुक्त एंटीबायोटिक के साथ पूरक । अगले दिन पर, कल्चरल बैक्टीरिया से प्लाज्मिड डीएनए निकालें । प्रतिबंध डाइजेस्ट और निकाले प्लाज्मिड डीएनए के अनुक्रमण द्वारा सफल क्लोनिंग की पुष्टि करें ।
    5. बढ़ाना उच्च गुणवत्ता, बैक्टीरियल प्लाज्मिड डीएनए (कदम 1.1.3 देखें) । वायरस के उत्पादन के लिए एक वायरल वेक्टर कोर सुविधा के लिए प्रवर्धित डीएनए भेजें ।

2. स्पाइनल कोशिकाओं का Transduction

  1. वायरस समाधान की तैयारी
    चेतावनी: वायरस संक्रामक एजेंट हैं और प्रासंगिक दिशानिर्देशों के अनुसार हैंडल किए जाने चाहिए. ज्यादातर मामलों में, rAAVs को सुरक्षा स्तर 1 (BSL1) में संभाला जा सकता है ।
    1. इंजेक्शन के दिन, बर्फ पर वांछित शुद्ध वायरस के एक शेयर aliquot को ठंढ और इंजेक्शन से पहले सीधे जब तक बर्फ पर रखें । दोहराया फ्रीज-गल-चक्र से बचें, के रूप में इन वायरस के प्रभावी titer कम हो जाएगा ।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो 3 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर aliquot वायरस को रखा जा सकता है ।
    2. बाँझ में वायरस के कणों को पतला ०.९% NaCl या फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब).
      नोट: उपयुक्त titer प्रयोगात्मक उद्देश्य पर निर्भर करता है और प्रयोग किया जाना चाहिए । एक अच्छा कुल वायरल लोड के साथ शुरू करने के लिए 3x109 जीनोम प्रतियां है (3.33 x1012 जीसी/एमएल, 3x300 nL इंजेक्शन) । अतिरिक्त और कुछ नुकसान ले रही है, जबकि खाते में केशिका लोड हो रहा है, के बारे में २.५ वायरस समाधान के µ एल प्रत्येक माउस के लिए आवश्यक हो जाएगा ।
  2. Intraspinal इंजेक्शन के लिए Micropipettes की तैयारी
    1. ' खींचो ' पतली दीवार कांच केशिकाओं (बाहरी व्यास 1 मिमी) एक micropipette खींचने पर एक ~ ५.५ mm लंबे, उथले टांग बनाने के लिए । एक ३.० मिमी हीटर रेशा और पी के साथ कार्यक्रम 00 की सेटिंग्स का उपयोग करें (a) तालिका 1के रूप में अनुकूलित ।
      नोट: पुलिंग अग्रिम में किया जा सकता है । खींच केशिकाओं धूल से बचने के लिए क्ले मॉडलिंग पर एक बंद कंटेनर में संग्रहित किया जाना चाहिए, जो बाद में micropipette रोकना सकता है । Autoclaving micropipettes आवश्यक छैन ।
    2. laminectomy संदंश के साथ खींच केशिका की टांग क्लिप के बारे में ४.५ करने के लिए 5 मिमी की लंबाई के लिए 25-35 माइक्रोन के एक भीतरी व्यास के साथ एक टिप खोलने बनाने के लिए. एक माइक्रोमीटर पैमाने के साथ एक खुर्दबीन का प्रयोग, कई micropipettes के भीतरी व्यास उपाय करने के लिए कैसे बड़े खोलने होना चाहिए, या हर micropipette के लिए उपाय के लिए एक महसूस हो ।
      नोट: एक छोटी टिप कॉलेस्ट्रॉल के लिए नेतृत्व कर सकते हैं; एक बड़ा टिप ऊतक नुकसान और कठिनाइयों रीढ़ की हड्डी घुसना करने के लिए कारण हो सकता है ।
  3. सर्जिकल सेटअप और उपकरणों की तैयारी
    1. सुनिश्चित करें कि उपकरण साफ है और इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है । ७०% इथेनॉल के साथ पोंछते और autoclaving द्वारा उपकरण बाँझ या उंहें विशुद्ध करना द्वारा कार्य क्षेत्र को संक्रमित । microliter सिरिंज कि वायरल वेक्टर नुकसान होगा पर किसी भी संक्रमित छोड़ मत करो इस्तेमाल किया जाएगा ।
  4. संज्ञाहरण और सर्जरी के लिए पशु की तैयारी
    नोट: सर्जरी की कुल अवधि 60-90 मिनट है ।
    1. शल्य प्रक्रिया की सुविधा के लिए 6-10 सप्ताह पुराने चूहों चुनें ।
      नोट: यदि प्रयोगात्मक डिजाइन की आवश्यकता है, छोटे या पुराने पशुओं के इंजेक्शन संभव है । किसी भी तनाव और दोनों लिंगों के सिद्धांत में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक ही पृष्ठभूमि तनाव का उपयोग करें (जैसे, C57BL/6J) अलग ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के बीच व्यवहार की तुलना के लिए । यदि सेक्स मतभेदों की उंमीद कर रहे है या जांच की जानी है, अलग समूहों में पुरुषों और महिलाओं का विश्लेषण ।
    2. ~ 5% isoflurane का उपयोग संज्ञाहरण प्रेरित । stereotaxic फ्रेम में एक गर्मी चटाई पर पशु प्लेस और 1 पर संज्ञाहरण बनाए रखने-2.5% isoflurane (हवा का प्रवाह दर ९०० मिलीलीटर/ सर्जरी भर में श्वसन दर की निगरानी ।
    3. स्नेहक आंख मरहम लागू करने के लिए शल्य चिकित्सा के दौरान corneal सुखाने को रोकने ।
    4. जानवर की पीठ दाढ़ी और गीले ऊतकों के साथ ध्यान से बालों को हटाने । आयोडीन समाधान के साथ मुंडा त्वचा को संक्रमित और त्वचा शुष्क करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    5. एनाल्जेसिक उपचार (जैसे, 0.1-0.2 मिलीग्राम/किलो buprenorphine चमड़े के नीचे) दे ।
  5. काठ का रीढ़ की हड्डी के स्तर पर कशेरुका कॉलम के एक्सपोजर
    नोट: स्पाइनल कॉर्ड और कशेरुका कॉलम के विभेदक विकास के कारण संबंधित स्तरों पर गठबंधन नहीं हो पाता, लेकिन काठ के स्पाइनल कॉर्ड सेगमेंट L4 वक्ष बांस T13 के समान स्तर पर है ।
    1. कशेरुका स्तंभ के साथ टटोलने द्वारा सबसे caudal रिब पेयर की स्थिति जानें । एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक 1.5-2.5 सेमी अनुदैर्ध्य त्वचा में कटौती बस rostral से शुरू करने के लिए सबसे caudal रिब जोड़ी ।
    2. संदंश के साथ त्वचा लिफ्ट और यह कैंची के साथ अंतर्निहित मांसपेशी से अलग । शल्य चिकित्सा के दौरान उजागर ऊतकों बाँझ ०.९% NaCl के साथ नम रखें ।
    3. ठीक संदंश और छोटे कैंची का प्रयोग, अगले, पतली झिल्लीदार परत सही midline के बगल में एक चीरा बनाने के लिए और यह रीढ़ की प्रक्रियाओं से काट । यह अंतर्निहित paraspinous मांसपेशी से पृथक है, लेकिन स्पाइनल प्रक्रियाओं से जुड़ी है.
  6. काठ का रीढ़ की हड्डी के स्तर पर कशेरुकाओं की पहचान
    नोट: एक बार कशेरुका कॉलम उजागर होता है, intertransverse बंधन और पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी दिखाई जानी चाहिए । कई संरचनात्मक स्थलों (चित्र 1b) लक्ष्य करने के लिए सही बांस की पहचान करने में सहायता कर सकते हैं ।
    1. त्वचा को पूंछ की ओर वापस खींचने के लिए श्रोणि शिखा का पर्दाफाश । इसी स्तर पर, दिखाई intertransverse बंधन की सबसे caudal जोड़ी L6 रीढ़ की हड्डी में शामिल है । ब्याज की बांस की पहचान करने के लिए rostral दिशा में एक caudal में पिछड़ों की गिनती करें ।
    2. कशेरुका कॉलम के साथ टटोलना । सबसे caudal रिब जोड़ी बस T13 बांस करने के लिए rostral स्थित है और कूल्हे के स्तर पर श्रोणि हड्डी L6 बांस के स्तर पर है ।
    3. जगह का पता लगाएं, जहां कशेरुका कॉलम के पक्ष के साथ पट्टा कण और सबसे औसत दर्जे का है । T13 बांस स्थित बस rostral है । काठ का स्पाइनल कॉर्ड सेगमेंट L4 इस बांस के भीतर स्थित है ।
  7. कशेरुका कॉलम और काठ का रीढ़ की हड्डी के जोखिम के निर्धारण
    1. stereotaxic फ्रेम के रीढ़ की हड्डी clamps के लिए यह तरक्की करने के ऊतकों लुढ़का के एक तकिया पर पशु प्लेस ।
    2. श्वास के कारण कशेरुका स्तम्भ के आंदोलनों से बचने के लिए लक्ष्य बांस को ठीक करें । इस उद्देश्य के लिए, लक्ष्य बांस से सटे clamps संरेखित करें, स्थिति में एक दबाना तय है और Adson संदंश के साथ कशेरुका कॉलम पकड़ जबकि दूसरा दबाना फिक्सिंग ।
      नोट: कॉलम इंजेक्शन विमान के लिए सीधा किया जाना चाहिए और दृढ़ता से इतना तय है कि यह ऊपर से दबाव पर कदम नहीं है । यदि आवश्यक हो, clamps की एक दूसरी जोड़ी कशेरुका कॉलम के लिए तय किया जा सकता है । इस मामले में, यह लक्ष्य बांस के बगल में दो कशेरुकाओं के लिए clamps के दो जोड़े को ठीक करने के लिए उपयोगी है ।
    3. प् याज के कशेरुकाओं के ऊपर paraspinous मांसपेशी को हटा दें । एक स्केलपेल का उपयोग करना, एक समानांतर बस tendons कि कशेरुका कॉलम के समानांतर हैं, साथ ही सीधा चीरा rostral और लक्ष्य बांस को caudal के लिए औसत दर्जे का चीरा । सावधान रहना भी गहरी कटौती नहीं है । आंसू/दूर rongeurs का उपयोग कर मांसपेशी काट । बांस या intervertebral अंतरिक्ष में बाडी के ऊपर शेष ऊतक को हटाने के लिए आवश्यकतानुसार संदंश का प्रयोग करें ।
    4. intervertebral अंतरिक्ष में पृष्ठीय रक्त वाहिनियों में स्पाइनल कॉर्ड के midline अंकन दिखाई देना चाहिए. एकतरफा इंजेक्शन के लिए, बांस के लक्ष्य पक्ष के बीच में एक छेद ड्रिलिंग द्वारा एक आंशिक laminectomy प्रदर्शन करते हैं । एक ०.५ mm गोलाकार कटर के साथ एक ठीक दंत चिकित्सा ड्रिलिंग तंत्र का प्रयोग करें और विशेष रूप से ध्यान से जब रीढ़ की हड्डी आ ड्रिल । रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए एक 26G बेवल सुई के साथ किसी भी शेष हड्डी के टुकड़े को हटा दें ।
    5. एक 26G बेवल्ड सुई का प्रयोग, ड्रिल होल में बाडी छिद्र, और intervertebral अंतरिक्ष rostral और caudal लक्ष्य बांस करने के लिए, सभी लगभग २०० µm पृष्ठीय रक्त वाहिका को पार्श्व । मस्तिष्कमेरु द्रव छिद्र से बचने चाहिए और रीढ़ की हड्डी से थोड़ा उभार होना चाहिए ।
  8. इंजेक्शन सिरिंज की तैयारी
    नोट: इंजेक्शन सिरिंज micropipette कॉलेस्ट्रॉल धूल कणों के जोखिम को कम करने के लिए इंजेक्शन के शुरू होने से पहले तुरंत तैयार किया जाना चाहिए.
    1. एक microliter सिरिंज हटाने योग्य सुई संपीड़न फिटिंग किट का उपयोग करने पर कांच केशिका माउंट. एक तंग और सुरक्षित फिट सुनिश्चित करने के लिए कसकर अखरोट जकड़ना ।
    2. बाँझ आसुत पानी के साथ microliter सिरिंज भरें और गोताख़ोर के साथ इसे बाहर का उपयोग शुरू करते हैं ।
      नोट: यदि बहुत अधिक प्रतिरोध है जिससे कि पानी आसानी से टिप से बाहर नहीं आ पाता है, तो micropipette की संभावना अवरुद्ध हो जाती है और उसका आदान-प्रदान किया जाना चाहिए ।
    3. एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित microinjector से जुड़े micromanipulator पर सिरिंज माउंट. सावधान रहो micropipette के साथ कुछ भी नहीं छूने के लिए ।
    4. microinjector का उपयोग करना, पानी और वायरस के बीच एक बुलबुला बनाने के लिए हवा के बारे में 1 µ एल आकर्षित ।
    5. तेल फिल्म के एक टुकड़े पर एक वायरस समाधान के २.५ µ एल छोटी बूंद प्लेस, ध्यान से छोटी बूंद में micropipette की नोक stereotaxic फ्रेम का उपयोग कर और इसे आकर्षित चाल । तो ध्यान से प्रेस वितरण वायरस समाधान के एक बिट टिप पर उभर जब तक ।
    6. सिरिंज को वापस लें और, पेन का उपयोग करके micropipette को स्केल के साथ चिह्नित करें और वायरस समाधान के स्तर को नोट करें; यह है कि अर्क क्रमादेशित के रूप में प्रगति कर रहा है की निगरानी की सुविधा होगी ।
  9. Intraspinal इंजेक्शन
    1. बाडी में छेद में से एक के ऊपर micropipette की नोक ले जाएं और फिर थोड़ा सा सेंधा होने तक नीचे बाडी में नोट किया जाता है । रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग को इंजेक्शन लक्ष्य, १०० µm लगातार वेतन वृद्धि में ५०० µm नीचे ले जाएं (1 मिमी स्पीड/और फिर २०० µm ऊतक के यांत्रिक स्थिरीकरण के लिए अनुमति देते हैं ।
      नोट: टिप के अंतिम गहराई इस मामले में ३०० µm है, लेकिन लक्ष्य क्षेत्र के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है ।
      1. यदि ऊतक प्रवेश के लिए प्रतिरोधी है, micropipette बाडी पर पकड़ने जा सकता है । इस मामले में, वापस लेने और छेद overlie करने के लिए थोड़ा कदम, या सुई का उपयोग करने के लिए फिर से प्रवेश का प्रयास दोहराने से पहले बाडी ठीक से ।
    2. प्रोग्राम ३०० nL के एक लक्ष्य इंजेक्शन की मात्रा के लिए पंप ५० nL/मिनट की एक इंजेक्शन की गति पर और प्रारंभ बटन दबाएँ करने के लिए अर्क शुरू.
    3. इंजेक्शन के बाद पूरा हो गया है, यह देखने के पैमाने की जांच करें कि क्या वायरस का स्तर गिरा दिया गया है और एक अतिरिक्त 3 मिनट के लिए जगह में micropipette छोड़ने के लिए दबाव धीरे से पहले सिरिंज मुकर equilibrate करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    4. दोहराएँ चरण 2.9.1.-2.9.3. अंय दो इंजेक्शन साइटों के लिए ।
  10. Suturing और रिकवरी
    1. रीढ़ की हड्डी में अकड़न और माउस के नीचे तकिया निकालें ।
    2. बाधित stiches के साथ परतों में घाव बंद, अवशोषित टांके और गैर अवशोषित टांके के साथ त्वचा के साथ सतही ऊतक परतों suturing । टांका घाव पर आयोडीन विशुद्धीकरण लागू करें ।
    3. संज्ञाहरण समाप्त करने और गर्मी चटाई पर जानवर छोड़ जब तक यह अपने घर पिंजरे में लौटने से पहले ठीक हो जाती है ।
  11. पश्चात की देखभाल
    1. सर्जरी के दिन पशु के स्वास्थ्य की निगरानी, अगले दिन, और फिर हर 2-3 दिन । सुनिश्चित करें कि पशु एक सामांय चाल, एक स्वस्थ उपस्थिति (वजन, आंखें, फर, और व्यवहार) है, और है कि घाव चिकित्सा है ।
    2. एनाल्जेसिक उपचार जारी रखें (जैसे, 0.1-0.2 मिलीग्राम/किग्रा buprenorphine के रूप में आवश्यक, प्रति दिन तीन बार ।

3. व्यवहार और रूपात्मक िरा

  1. व्यवहार विश्लेषण
    नोट: जानवरों को शुरू करने के लिए उन्हें नए प्रयोगात्मक वातावरण के अनुकूल करने के लिए माप केसाथ पहले कम से 30 मिनट के लिए संबंधित सेटअप करने के लिए समायोजित करने की अनुमति दें.
    1. वॉन Frey टेस्ट
      1. एक धातु ग्रिड फर्श पर के बारे में 10 सेमी x 10 सेमी के व्यक्तिगत डिब्बों में व्यक्तिगत रूप से जगह जानवरों ।
      2. एक गतिशील वॉन Frey रेशा के साथ इंजेक्शन साइट के लिए hindpaw ipsilateral के तल की सतह को उत्तेजित । उस बल पर ध्यान दें जिस पर पशु उत्तेजना से अपना पंजा निकाल लेता है.
      3. पांच बार दोहराएँ और प्रत्येक जानवर के लिए छह माप से औसत वापसी दहलीज की गणना.
    2. पिन चुभन टेस्ट
      1. एक धातु ग्रिड फर्श पर के बारे में 10 सेमी x 10 सेमी की व्यक्तिगत डिब्बों में जानवरों प्लेस ।
      2. त्वचा के प्रवेश के बिना एक कुंद 26-जी सुई के साथ इंजेक्शन साइट के लिए hindpaw ipsilateral के तल की सतह को उत्तेजित । स्कोर शूंय के रूप में व्यवहार (कोई प्रतिक्रिया नहीं) या एक (प्रतिक्रिया) ।
      3. उत्तेजनाओं के बीच 3 मिनट के अंतराल के साथ 9 बार दोहराएँ और प्रत्येक जानवर के लिए 10 माप से प्रतिशत प्रतिक्रिया की गणना.
    3. खूंखार के इंजेक्शन-ligand clozapine-एन-ऑक्साइड (CNO)
      1. dimethyl sulfoxide (DMSO) में CNO भंग ०.२ मिलीग्राम/µ एल, जो कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है की एक शेयर समाधान बनाने के लिए ।
      2. प्रयोग के दिन, बाँझ में स्टॉक समाधान पतला ०.९% NaCl को ०.२ µ g/µ l और इंजेक्षन 10 µ l/जी शरीर का वजन intraperitoneally. वाहन के साथ नियंत्रण जानवरों इंजेक्षन (०.९% NaCl में ०.२% DMSO).
        ध्यान दें: अनुभव के अनुसार, व्यवहार पर पीक प्रभाव की उंमीद की जा सकती है 1-3 इंजेक्शन के बाद एच, और प्रभाव पूरी तरह से 24 घंटे के बाद की ओर होना चाहिए । glycinergic न्यूरॉन्स के सक्रियण के मामले में मनाया व्यवहार कम दर्द और खुजली प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं. न्यूरॉन्स के खतरनाक मध्यस्थता सक्रियण द्वारा पैदा व्यवहार रीढ़ की हड्डी ंयूरॉंस के लक्षित सबसेट पर निर्भर करेगा ।
    4. खुजली पैदा करने के लिए Pruritogens के इंजेक्शन
      1. भंग pruritogens में ०.९% NaCl के समाधान के लिए 8 मिलीग्राम/एमएल (क्लोरोक्वीन) या 10 मिलीग्राम/एमएल (हिस्टामिन) । 2 ज CNO प्रशासन के बाद, pruritogen या वाहन समाधान के 10 µ एल सुई रीढ़ की हड्डी इंजेक्शन साइट के लिए hindpaw ipsilateral के तल की सतह में चमड़े का इंजेक्शन । वैकल्पिक रूप से, pruritogen intradermally बछड़ा है, जो एक दिन पहले शेविंग ही aversive के कारण व्यवहार को कम करने के लिए किया गया है में सुई ।
    5. Videotaping सहज Nocifensive या Pruritogen प्रेरित खुजली व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए
      1. फर्श पर अपने संबंधित घर-पिंजरे से बिस्तर के एक बिट के साथ पारदर्शी डिब्बों (के बारे में 10 सेमी व्यास) में व्यक्तिगत रूप से जानवरों प्लेस ।
      2. pruritogen प्रेरित व्यवहार रिकॉर्ड करने के लिए सहज और 30 मिनट के लिए रिकॉर्ड करने के लिए 5 मिनट के लिए जानवरों वीडियो टेप । वीडियो बंद लाइन 5 मिनट के डिब्बे में विश्लेषण ।
    6. दर्द बनाम खुजली व्यवहार
      1. निरीक्षण और नोट बच निकलने, चाट, और काटने के व्यवहार ।
        नोट: बच निकलने और प्रभावित साइट के चाट दर्द को प्रतिक्रियाओं माना जाता है, जबकि काट खुजली के साथ जुड़ा हुआ है ।
      2. सामांय गति से वीडियो का विश्लेषण, समय है कि माउस चाट खर्च या प्रभावित साइट काट, या धीमी गति में ठोकर चाट और काटने सजगता के बीच एक और अधिक सटीक अंतर के लिए उपाय के उपाय । वैकल्पिक रूप से, चाट/काटने/बच निकलने डटकर की संख्या की गणना ।
  2. रूपात्मक विश्लेषण
    1. एक से तीन सप्ताह के वायरस के इंजेक्शन के बाद या एक व्यवहार प्रयोग के अंत में रूपात्मक विश्लेषण प्रदर्शन ।
      नोट: हम इंजेक्शन के बाद जैसे ही ४८ एच के रूप में eGFP अभिव्यक्ति का पता चला है, लेकिन यह भी पाया कि अभिव्यक्ति काफी अगले दिनों के भीतर और भी हफ्तों बढ़ जाती है । मजबूत रिपोर्टर अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के लिए, मशीन के एक सप्ताह (intraspinal इंजेक्शन से जब तक छिड़काव) पर्याप्त हो सकता है । कमजोर transgene अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं के लिए, कमजोर प्रवर्तकों या कमजोर fluorophores के साथ वायरस, एक लंबे समय तक अभिव्यक्ति का पता लगाने के स्तर को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    2. ऊतक निर्धारण
      1. Perfuse प्रत्येक माउस transcardially, पहले के साथ 20 मिलीलीटर की बर्फ ठंडा कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) समाधान (NaCl १२५ mM, NaHCO3 25 मिमी,2पीओ4 १.२५ मिमी, डी-ग्लूकोज 20 मिमी, KCl २.५ मिमी, और CaCl2 2 मिमी MgSO4 1 मिमी), तो १०० मिलीलीटर के साथ की 4% बर्फ ठंडा paraformaldehyde (०.१ एम सोडियम फास्फेट बफर में, पीएच ७.४) ।
        चेतावनी: Paraformaldehyde विषाक्त है और देखभाल के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
      2. तुरंत काठ का रीढ़ की हड्डी काटना, और बाद में 2 घंटे के लिए ऊतक बर्फ पर 4% paraformaldehyde के साथ ठीक । संक्षेप में ०.१ एम सोडियम फॉस्फेट बफर (पीएच ७.४) के साथ पोस्ट-फिक्स्ड ऊतक धो और फिर यह 25% सुक्रोज समाधान (०.१ मीटर सोडियम फॉस्फेट बफर, पीएच ७.४) में रात 4 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
      3. एक cryostat पर 30 माइक्रोन पर cryoprotected ऊतक काटें और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर वर्गों माउंट ।
    3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
      1. पंजाब में संक्षिप्त धोने के बाद, समाधान अवरुद्ध के ३०० μL लागू (10% ०.३% ट्राइटन-पंजाब में सामांय गधा सीरम) 1 के लिए वर्गों पर कमरे के तापमान पर एच ।
      2. समाधान अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी के संबंधित संयोजन के ३०० μL के साथ स्लाइड मशीन ( सामग्री की तालिकादेखें) पर रात में 4 ° c. 5 मिनट के लिए प्रत्येक पंजाब में वर्गों 3 बार धो लो ।
      3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए समाधान अवरुद्ध में माध्यमिक एंटीबॉडी के संबंधित संयोजन के साथ स्लाइड की मशीन । 5 मिनट के लिए प्रत्येक पंजाब में वर्गों 3 बार धो लो ।
      4. संक्षेप में ddH2हे में स्लाइड कुल्ला, तो coverslips माउंट फ्लोरोसेंट बढ़ते माध्यम का उपयोग कर ।
      5. एक 20x और एक 40x उद्देश्य से सुसज्जित एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर फ्लोरोसेंट छवियों का अधिग्रहण ।

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Representative Results

आदेश में अभिव्यक्ति का स्तर है कि एक मार्कर प्रोटीन एंकोडिंग rAAV के intraspinal इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है वर्णन करने के लिए, हम पहले AAV1 इंजेक्शन । सीएजी. जंगली प्रकार के चूहों की काठ की रीढ़ की हड्डी में eGFP । तीन इंजेक्शन लगभग 1 मिमी दूरी के अलावा काठ का रीढ़ की हड्डी में एक लगभग निरंतर संक्रमण का उत्पादन किया गया L5 (चित्र 1a-C) । रीढ़ की हड्डी की सतह से ३०० µm की गहराई पर वायरस इंजेक्शन रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग में कोशिकाओं के प्रमुख संक्रमण की ओर जाता है । हालांकि, संक्रमित कोशिकाओं को भी ventral सींग (चित्रा 1 डी) में पाया जा सकता है । अगले, लक्ष्य को rAAV में अंतर-मध्यस्थता अभिव्यक्ति जब एक Cre ट्रांसजेनिक माउस में एक Cre-निर्भर rAAV इंजेक्शन वर्णन था । इसलिए हमने Cre-आश्रित AAV1 को इंजेक्शन लगाया । सीएजी. फ्लेक्स. eGFP वेक्टर GlyT2 की रीढ़ की हड्डी में:: Cre ट्रांसजेनिक चूहों । पहले की तरह, eGFP अभिव्यक्ति पृष्ठीय और ventral सींग में मनाया गया । हालांकि, के रूप में की उंमीद है, eGFP की अभिव्यक्ति और अधिक प्रतिबंधित हो गया, GlyT2 के वितरण को प्रतिबिंबित + ंयूरॉंस, अर्थात् सतही पृष्ठीय सींग और गहरे पृष्ठीय सींग में घने अभिव्यक्ति में अपेक्षाकृत विरल अभिव्यक्ति (चित्रा 1E) ।

अगला, रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के सर्किट समारोह को संबोधित करने की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए, दो अलग Cre-निर्भर AAVs विभिन्न प्रभावक प्रोटीन के लिए कोडिंग (DTA और hM3Dq) GlyT2 में इंजेक्ट किया गया:: Cre ट्रांसजेनिक चूहों. वायरल अभिव्यक्ति के अनुरूप AAV1 के तीन इंजेक्शन के बाद मनाया । सीएजी. eGFP में जंगली प्रकार के चूहों, AAV1 के इंजेक्शन के बाद काठ का खंडों L3-L5 में निरोधात्मक न्यूरॉन्स (Pax2 +) की मजबूत पृथक था. Glyt2 में EF1a. फ्लेक्स. DTA:: Cre चूहों (चित्रा 2a, सी) । इन खंडों में glycinergic निरोधात्मक न्यूरॉन्स की हानि एक चिह्नित यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता (चित्रा 2d) और ipsilateral hindlimb (चित्रा 2E) की ओर निर्देशित सहज aversive व्यवहार पैदा किया. aversive व्यवहार आत्म-दण्डित घावों के लिए नेतृत्व किया, जो पंजे, बछड़ा, और जांघ पर देखा जा सकता है (डेटा के लिए, फोस्टर एट अल देखें. 7) विपरीत प्रभाव जब AAV1. hSyn. hM3Dq और intraperitoneal के बाद के CNO इंजेक्शन के इंजेक्शन के माध्यम से glycinergic न्यूरॉन्स सक्रिय (चित्रा 2 बी) मनाया गया । चूहों हानिकारक यांत्रिक उत्तेजना (चित्रा 2F) और अंय हानिकारक उत्तेजनाओं (फोस्टर एट अल देखने के लिए संवेदनशील बन गया । 7) इसके अलावा, जब pruritogens हिस्टामिन या क्लोरोक्वीन के साथ इलाज किया, hM3Dq-glycinergic ंयूरॉंस की मध्यस्थता सक्रियण कुशलतापूर्वक prurifensive प्रतिक्रियाओं (चित्रा 2g) दबा दिया । इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि काठ का रीढ़ की हड्डी में rAAV के तीन इंजेक्शन के लिए काठ का रीढ़ की हड्डी के एक क्षेत्र को मजबूत व्यवहार इसी hindlimb की उत्तेजना से पैदा परिवर्तन देखने के लिए पर्याप्त transduce कर सकते हैं ।

प्रयोगों के एक अंतिम सेट में, हम Cre रिपोर्टर वायरस की तुलना में Cre रिपोर्टर चूहों का उपयोग करने में संभावित मतभेदों को प्रदर्शित करना चाहता था । इसलिए, एक Cre ड्राइवर जीन चुना गया था जो पहले माउस रीढ़ की हड्डी में एक प्रतिबंधित अभिव्यक्ति पैटर्न प्रदर्शित करने के रूप में वर्णित किया गया है । जीन RORβ का सुझाव दिया गया है कि गहरी पृष्ठीय सींग13,14के निरोधात्मक ंयूरॉंस में मुख्य रूप से व्यक्त किया जाएगा । इस अध्ययन RORβCre दस्तक चूहों में इस्तेमाल किया और उंहें Rosa26लोक्स-STOP-लोक्स-tdTomato (R26टॉम) Cre रिपोर्टर चूहों को पार कर, जो tdTomato अभिव्यक्ति प्रदर्शित सभी कोशिकाओं में किसी भी समय बिंदु पर विश्लेषण से पहले Cre की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व ( चित्र 3ए) । RORβCreमें tdTomato + कोशिकाओं का लक्षण वर्णन; R26टॉम चूहों ंयूरॉंस में अभिव्यक्ति का पता चला और पृष्ठीय सींग (चित्र बी, सी) के astrocytes । वास्तव में, tdTomato के ठहराव + कोशिकाओं का सुझाव दिया है कि Cre-मध्यस्थता पुनर्संयोजन के दौर से गुजर कोशिकाओं के बहुमत (५८%) गैर-न्यूरॉन्ड थे. हम तो एक Cre-निर्भर tdTomato रिपोर्टर rAAV (AAV1 इंजेक्शन । सीएजी. फ्लेक्स. tdTomato) P40 RORβCre चूहों की रीढ़ की हड्डी में (चित्रा 3 डी) । R26टॉम-मध्यस्थता रिपोर्टर अभिव्यक्ति के विपरीत, हम सभी tdTomato + रिपोर्टर वायरस द्वारा लेबल कोशिकाओं ंयूरॉंस (चित्रा 3E, एफ) हो पाया । अंत में, tdTomato + न्यूरॉन्स की पहचान चूहों के दोनों सेट में विश्लेषण किया गया था (RORβCre; R26टॉम और RORβCre इंजेक्शन के साथ AAV1 । सीएजी. फ्लेक्स. tdTomato). दोनों ही मामलों में, न्यूरॉन्स के बहुमत निरोधात्मक थे (> 85%) और न्यूरॉन्स के अल्पसंख्यक उत्तेजक (< 20%) (चित्रा 3 जी मैं), जो RORβ की पहचान के पिछले आकलन के साथ समझौते में है + न्यूरॉन्स13,14.

Figure 1
चित्रा 1: AAV1 के Intraspinal इंजेक्शन-eGFP/AAV1-फ्लेक्स-eGFP
(क) एक AAV1 के एक intraspinal इंजेक्शन के योजनाबद्ध चित्रण । सीएजी. eGFP (AAV1-eGFP) काठ की रीढ़ की हड्डी में, जो hindlimb से innervated है । (ख) काठ का रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों L3-L4 के संरचनात्मक स्थान एक माउस के पीछे के एक शीर्ष दृश्य में देखा जा सकता है । त्वचा कशेरुका कॉलम को बेनकाब करने के लिए खोला गया था । कशेरुकाओं T13 की रीढ़ की हड्डी की प्रक्रिया-L6 संरचनात्मक संदर्भ के रूप में रंग का होता है और एक तीर श्रोणि शिखा इंगित करता है । (ग) एक पूरे माउंट काठ का रीढ़ की हड्डी के प्रतिनिधि छवि । ग्रीन प्रतिदीप्ति रीढ़ की हड्डी के वायरस-transduced क्षेत्रों को इंगित करता है । (घ) एक जंगली प्रकार माउस से एक AAV1-eGFP-transduced काठ का रीढ़ की हड्डी के माध्यम से एक क्रॉस सेक्शन की प्रतिनिधि छवि । (ङ) एक AAV1 के एक क्रॉस सेक्शन की प्रतिनिधि छवि । सीएजी. फ्लेक्स. eGFP-transduced रीढ़ की हड्डी के एक GlyT2:: Cre माउस । डैश्ड रेखाएं धूसर पदार्थ और रीढ़ की हड्डी की सतही पृष्ठीय हॉर्न की बाह्यरेखा का प्रतिनिधित्व करती हैं । स्केल बार्स C = 1 mm, D = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: रीढ़ की हड्डी Cre-व्यक्त Glycinergic न्यूरॉन्स के कार्यात्मक हेरफेर
(A + B) एक AAV1 के एक intraspinal इंजेक्शन के योजनाबद्ध चित्रण । EF1a फ्लेक्स  DTA (क) या आण AAV1 । EF1a. फ्लेक्स hM3Dq (ख) काठ का रीढ़ की हड्डी में । Cre-डिप्थीरिया विष टुकड़ा की अभिव्यक्ति पर निर्भर एक (DTA) glycinergic न्यूरॉन्स के पृथक के लिए नेतृत्व करेंगे (GlyT2 +) (क), जबकि Cre pharmacogenetic डिजाइनर रिसेप्टर hM3Dq के निर्भर अभिव्यक्ति GlyT2 ंयूरॉंस activatable प्रदान करेगा clozapine-एन-ऑक्साइड (CNO) (B). (ग) AAV1 के तीन इंजेक्शन. GlyT2 के L3-L5 क्षेत्रों में EF1a. फ्लेक्स. DTA:: Cre चूहों निरोधात्मक की ओर से नहीं बल्कि के संबंधित क्षेत्रों में ipsilateral न्यूरॉन्स के एक चिह्नित नुकसान के लिए नेतृत्व किया. (घ) GlyT2 न्यूरॉन्स की हानि GlyT2 के ipsilateral हिंद पंजा में यांत्रिक वॉन Frey उत्तेजना के लिए एक लंबे समय से स्थायी अतिसंवेदनशीलता पैदा:: Cre चूहों AAV1 के साथ इंजेक्शन. EF1a. फ्लेक्स. DTA, लेकिन कोई परिवर्तन नहीं मनाया अगर Cre-नकारात्मक चूहों इंजेक्शन थे । (ङ) GlyT2 ंयूरॉंस की हानि पुरानी खुजली की याद ताजा सहज aversive व्यवहार पैदा की । (च) GlyT2 न्यूरॉन्स के hM3Dq मध्यस्थता सक्रियण pinprick उत्तेजना द्वारा पैदा हानिकारक यांत्रिक दर्द को समाप्त. (छ) hM3Dq GlyT2 न्यूरॉन्स की मध्यस्थता सक्रियण कम pruritogen (क्लोरोक्वीन या हिस्टामिन)-aversive व्यवहार पैदा. डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. * * * p < ०.००१; * * p < ०.०१ । स्केल बार C = 1 mm. g = ग्राम । छवियां फिर से इस्तेमाल किया और फोस्टर एट अल से संशोधित कर रहे हैं । 7 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: आनुवंशिक और वायरस-RORβ-व्यक्त कोशिकाओं की मध्यस्थता लेबलिंग. (क) RORβCreमें फ्लोरोसेंट tdTomato रिपोर्टर के Cre-निर्भर अभिव्यक्ति के लिए रणनीति दिखा आरेख; Rosa26लोक्स-स्टॉप-लोक्स-tdTomato (R26टॉम) चूहों. (ख) RORβCreके रीढ़ की हड्डी के अनुभागों पर Immunostaining; R26टॉम चूहों से पता चला है कि NeuN + RORβ-टॉम न्यूरॉन्स laminae I-IV में पाया जा सकता है । (ग) tdTomato के Cre-आश्रित अभिव्यक्ति को भी RORβCreके GFAP + कोशिकाओं में मनाया गया; R26टॉम चूहों, सुझाव है कि RORβ astrocytes में विकास के दौरान व्यक्त की है । ऐरोहेड संकेत दोहरे-लेबल astrocytes लेमिना III में । (घ) AAV के intraspinal इंजेक्शन दिखा आरेख-फ्लेक्स-टॉम (rAAV1. सीएजी. tdTomato) वायरस RORβCre चूहों में Cre के स्थानीय tdTomato-निर्भर अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए. (ङ) RORβCre चूहों के रीढ़ की हड्डी वर्गों पर Immunostaining AAV-फ्लेक्स-टॉम वायरस के साथ इंजेक्शन । RORβ-टॉम न्यूरॉन्स रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय सींग और tdTomato की अभिव्यक्ति की सतही laminae के लिए स्थानीयकृत थे astrocytes से अनुपस्थित था । (च) RORβ-टॉम कोशिकाओं का प्रतिशत RORβCreके रीढ़ की हड्डी के वर्गों में न्यूरॉनी मार्कर NeuN व्यक्त; R26टॉम चूहों और RORβCre चूहों AAV-फ्लेक्स-टॉम वायरस के साथ इंजेक्शन । (G-H) Immunostaining के रीढ़ की हड्डी के वर्गों पर (छ) RORβCre; R26टॉम चूहों और (एच) RORβCre चूहों AAV-फ्लेक्स-टॉम वायरस colocalization-टॉम न्यूरॉन्स और RORβ मार्कर निरोधात्मक या Pax2 मार्कर उत्तेजक के बीच Lmx1b दिखा के साथ इंजेक्शन. (I) RORβ का प्रतिशत-टॉम न्यूरॉन्स व्यक्त Lmx1b और Pax2 में RORβCre; R26टॉम चूहों और RORβCre चूहों AAV-टॉम वायरस के साथ इंजेक्शन । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । डेटा 2-3 चूहों और माउस प्रति 1-3 वर्गों से हैं । स्केल बार्स १०० µm (B, e) और 20 µm (C, e में उच्च आवर्धन छवियां, G और H) का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चर मान सेट करें इकाई
हीट (एच) ४५० -(radiated गर्मी की शक्ति के लिए आनुपातिक मूल्य)
बल प्रारंभिक पुल (एफ (गु)) 20 -(करने के लिए बल का तार लागू वोल्टेज के लिए आनुपातिक मूल्य)
दूरी थ्रेशोल्ड (s (TH)) 25 ०.१२ एमएम
लंब heatstop (t (H)) 30 ०.५ ms
दूरी heatstop (एस (एच)) 0 ०.१२ एमएम
देरी खींचो 1 (टी (F1)) २०० ०.५ ms
सेना पुल 1 (F1) ३०० -(करने के लिए बल का तार लागू वोल्टेज के लिए आनुपातिक मूल्य)
दूरी खींचो 2 (s (F2)) 30 ०.१२ एमएम
फोर्स खींचो 2 (F2) ६०० -(करने के लिए बल का तार लागू वोल्टेज के लिए आनुपातिक मूल्य)
समायोजित करें (विज्ञापन) 0 -

तालिका 1: pulling सेटिंग्स

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Discussion

AAVs के Intraspinal इंजेक्शन एक अनुसंधान प्रयोगशाला में एक शक्तिशाली तकनीक बन सकता है, एक उच्च लौकिक और स्थानिक समाधान के साथ रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं के विश्लेषण को सक्षम करने से । यह प्रोटोकॉल संवेदी न्यूरॉन्स द्वारा innervated तीन मुख्य रीढ़ की हड्डी के transduction को hindlimb के लिए उनके परिधीय axons का विस्तार करने में सक्षम बनाता है । Transducing तीन सेगमेंट मजबूत और reproducible व्यवहार डेटा पैदा करते हैं. यह भी एक एकल intraspinal इंजेक्शन के बाद संभव से एक बड़ा संवेदी क्षेत्र के परीक्षण में सक्षम बनाता है । उदाहरण के लिए, एक ही इंजेक्शन शासन पंजा परीक्षण के लिए अनुमति देता है (वॉन Frey, Hargreaves, आदि) और जांघ (intradermal इंजेक्शन, mechano रिसेप्टर उत्तेजना), इस प्रकार संवेदी रूपरेखा कि संबोधित किया जा सकता है का विस्तार ।

महत्वपूर्ण कदम:

कई मजबूत रूपात्मक और व्यवहार डेटा प्राप्त करने के लिए और कलाकृतियों से बचने के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं । वायरल वेक्टर के डिजाइन और प्रमोटर और सीरोटाइप की पसंद transduction दक्षता और transduced क्षेत्र की सीमा पर एक मजबूत प्रभाव हो सकता है, और इसलिए व्यवहार परिणामों पर (वायरल प्रसार और transduction क्षमता पर विवरण के लिए, देखें 12). उच्च गुणवत्ता वायरल तैयारी वायरस इंजेक्शन के साइड इफेक्ट को कम करने के लिए आवश्यक हैं, जो हो सकता है अगर दूषित पदार्थों या कोशिका मलबे वायरस समाधान में मौजूद हैं । शल्य चिकित्सा के लिए रीढ़ की हड्डी इंजेक्षन करने के लिए आवश्यक है कि सर्जरी द्वारा शुरू की रूपात्मक और व्यवहार कलाकृतियों से बचने के क्रम में बड़ी सावधानी के साथ किया जाना है । विशेष रूप से ध्यान रीढ़ की हड्डी से निपटने में आवश्यक है, विशेष रूप से laminectomy के दौरान और सुई के साथ बाडी के वेध के दौरान । रीढ़ की हड्डी को क्षति दैहिक उत्तेजना और माउस के मोटर समंवय ख़राब सकता है, इस प्रकार किसी भी योजना बनाई व्यवहार प्रयोगों समझौता । इसके अलावा, यह सिरिंज को ध्यान से इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण है । micropipette के अनुचित विधानसभा या कॉलेस्ट्रॉल प्रयोग में बाधा आ सकती है । इंजेक्शन स्थल पर रीढ़ की हड्डी में ऊतक प्रयोग के अंत में जांच के लिए सफल इंजेक्शन और इंजेक्शन क्षेत्र के transduction को सत्यापित करने के लिए और शल्य चिकित्सा का एक परिणाम के रूप में अत्यधिक ऊतक क्षति को बाहर करने के लिए किया गया है । इस प्रोटोकॉल वायरल titers का इस्तेमाल किया है स्पष्ट विषाक्तता के बिना 1x1013 GC/एमएल की एकाग्रता के लिए, अभी तक वायरस के उच्च titers कुछ समय बिंदु पर विषाक्त हो सकता है । इसके अलावा, विषाक्तता सबसे अधिक संभावना भी इंजेक्शन AAV द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन पर निर्भर करेगा ।

संशोधन:

प्रोटोकॉल में कई मापदंडों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ंयूरॉन जनसंख्या और अनुसंधान के सवाल का अध्ययन किया जाएगा । ३०० nL वायरस समाधान के इंजेक्शन ३०० µm की गहराई में भर में न्यूरॉन्स की transduction की ओर जाता है, और मुख्य रूप से पृष्ठीय सींग में. यदि उद्देश्य ंयूरॉंस आगे ventral लक्ष्य है, गहराई समायोजित किया जा सकता है । वायरस की बड़ी मात्रा के इंजेक्शन (हम इंजेक्शन प्रति ५०० nL करने के लिए इस्तेमाल किया है) dorsoventral और rostrocaudal दिशाओं में एक बड़ा प्रसार करने के लिए नेतृत्व करेंगे । यह rostrocaudal हद में अतिरिक्त कोशिकाओं के लक्ष्यीकरण को प्राप्त करने के लिए फायदेमंद हो सकता है, लेकिन contralateral पक्ष के लिए spillover बढ़ सकता है, जो एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में contralateral पक्ष के उपयोग में बाधा हो सकती है. इसके अलावा, transduced कोशिकाओं की dorsoventral हद तक बढ़ जाएगी, जो वांछित प्रभाव हो सकता है या इससे बचना चाहिए । ३०० की गहराई पर ३०० nL के इंजेक्शन µm GlyT2 में मोटर नियंत्रण पर दुष्प्रभाव से बचा:: Cre चूहों, जबकि ५०० nL या इंजेक्शन का एक बड़ा गहराई पर इंजेक्शन के लिए कभी-कभार उत्पादित मोटर phenotypes, स्पास्टिक के hindlimb विस्तार के रूप में (डेटा नहीं दिखाया गया है). छोटे संस्करणों के इंजेक्शन भी अधिक सीमित क्षेत्रों के लिए लक्ष्यीकरण को प्रतिबंधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है5. वायरल titer एक और पैरामीटर है कि संशोधित किया जा सकता है और वास्तव में प्रत्येक वायरस के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए है । इस तरह के उच्च कुशल DTA के रूप में बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों, के लिए, कम अभिव्यक्ति का स्तर वांछित प्रभाव प्रेरित करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, जबकि फ्लोरोसेंट पत्रकारों और DREADDs के लिए, उच्च titers detectable या प्रभावी अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक हो सकता है ।

मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व:

तारीख करने के लिए, मुख्य रूप से दो तकनीकों कार्यात्मक संवेदी संकेतों के संचरण के लिए आवश्यक ंयूरॉंस सर्किट पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । कई शोधकर्ताओं ने intraspinal इंजेक्शन का इस्तेमाल किया है rAAV रिपोर्टर और प्रभाव के लिए कोडिंग में प्रोटीन recombinase-एक्सप्रेस चूहों में आदेश लेबल करने के लिए और स्पाइनल न्यूरॉन्स में हेरफेर. स्पाइनल कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए एक तकनीक के रूप में Intraspinal इंजेक्शन पहले15,16बताया गया है । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल विशेष रूप से काठ का रीढ़ की हड्डी के लगातार तीन खंडों में आनुवंशिक रूप से लेबल न्यूरॉन्स transduce करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि सर्जिकल हेरफेर को कम करने. यह intervertebral अंतरिक्ष rostral में तीन इंजेक्शन के दो और T13 कशेरुकाओं और दूसरे के caudal, तीसरे इंजेक्शन के बजाय T13 को हटाने के लिए कशेरुकाओं में एक छेद ड्रिलिंग द्वारा हासिल की है । लक्षित L3-L5 खंडों संवेदी न्यूरॉन्स innervating hindlimb के मुख्य समाप्ति क्षेत्र हैं । हम बताते है कि transduction के इस प्रकार glycinergic ंयूरॉंस के हेरफेर के बाद मजबूत व्यवहार परिवर्तन का उत्पादन करने के लिए पर्याप्त है और सुझाव है कि यह अलग आनुवंशिक रूप से लेबल रीढ़ की हड्डी ंयूरॉंस की एक किस्म के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है ।

दूसरी तकनीक है कि आदेश में रीढ़ की हड्डी ंयूरॉन सबसेट के समारोह में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है ट्रांसजेनिक पशुओं को पार करने पर आधारित है । यहां, रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स के एक विशिष्ट सबसेट में एक recombinase व्यक्त चूहों को रिपोर्टर चूहों को पार किया जाना है ताकि वांछित मार्कर या प्रभावक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए संबंधित ंयूरॉंस सबसेट17,18, 19. के लिए मतभेद है कि जब रिपोर्टर चूहों या intraspinal वायरस इंजेक्शन का उपयोग करके प्राप्त परिणामों की तुलना हो सकता है की कुछ वर्णन करने के लिए हम या तो RORβCre दस्तक-पशुओं में एक Cre-निर्भर रिपोर्टर माउस या इंजेक्शन RORβ को पार कर एक Cre-आश्रित रिपोर्टर rAAV के साथ Cre चूहे । हम रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति rAAV से रिपोर्टर जीन RORβCreमें प्राप्त अभिव्यक्ति से प्राप्त की तुलना में; R26टॉम चूहों । रिपोर्टर जीन अभिव्यक्ति एक Cre के intraspinal इंजेक्शन से प्राप्त निर्भर rAAV रीढ़ की हड्डी के ंयूरॉंस को प्रतिबंधित किया गया था, जबकि R26टॉम रिपोर्टर माउस-tdTomato अभिव्यक्ति पैदा astrocytes में भी पाया जाता है । यह पता चलता है कि RORβ क्षणिक astrocytes में व्यक्त की है । इसी तरह, एबल-Mecinas एट अल. Tac1Cre चूहों20में माउस की रिपोर्टर अभिव्यक्ति की तुलना में वायरल इंजेक्शन के बाद एक और अधिक प्रतिबंधित रिपोर्टर अभिव्यक्ति (स्थानिक और सेल-प्रकार के विशिष्ट) मिला । वयस्क चूहों, रिपोर्टर और/या प्रभाव जीन अभिव्यक्ति की रीढ़ की हड्डी में एक rAAV रिपोर्टर के intraspinal इंजेक्शन का उपयोग करके कुशलतापूर्वक कोशिकाओं की आबादी के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है कि वयस्क में जीन एक्सप्रेस और इस तरह से बचने के पुनर्संयोजन/ पहले क्षणिक जीन गतिविधि के साथ उन आबादी ।

intraspinal rAAV इंजेक्शन का एक दूसरा मुख्य लाभ इंजेक्शन साइट के लिए rAAV-एनकोडेड जीन की अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने की क्षमता है । ट्रांसजेनिक चूहों में, Cre चालक की मध्यस्थता अभिव्यक्ति अक्सर न केवल ब्याज की ंयूरॉन उपजनसंख्या में पाया जाता है, लेकिन यह भी तंत्रिका तंत्र के भीतर अन्य आबादी में. Dymecki और सहकर्मियों, के रूप में अच्छी तरह से एमए और Goulding के समूहों के रूप में, एक उपरिपोर्टर माउस आधारित दृष्टिकोण है कि तंत्रिका तंत्र है कि अनछुए17रहेगा के कुछ हिस्सों में पुनर्संयोजन से बचने का उपयोग कर के सुरुचिपूर्ण तरीके विकसित किया है, 18,19,21,22,23. का उपयोग कर चूहों में माउस मार्कर या प्रभाव की अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए प्रोटीन भी कम चर माना जा सकता है, के रूप में वहां केवल एक सेल प्रति संबंधित अभिव्यक्ति कैसेट की जीनोमिक कॉपी और अभिव्यक्ति कैसेट ब्याज के क्षेत्र में सभी कोशिकाओं में मौजूद है . इसके विपरीत, एक संबंधित अभिव्यक्ति कैसेट की उपस्थिति और भी वायरल transduction के बाद अभिव्यक्ति कैसेट की नकल संख्या transduction क्षमता है, जो सेल से सेल के लिए भिंन हो सकता है पर निर्भर है, इंजेक्शन से इंजेक्शन के लिए, और पर निर्भर करता है वायरस बहुत । अंत में, पारंपरिक आनुवंशिक तरीकों पर वायरस की मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति की मुख्य नुकसान सर्जरी की आवश्यकता है । सर्जरी-मध्यस्थता चोट/सूजन न्यूरॉन्स और सर्किट को सीधे प्रभावित कर सकते हैं । नियंत्रण चूहों कि एक ही सर्जरी आया है का समावेश इसलिए अनिवार्य है ।

भविष्य अनुप्रयोगों:

Intraspinal इंजेक्शन का विश्लेषण और हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किसी भी आनुवंशिक रूप से पहचाना मार्कर और प्रभाव प्रोटीन के माध्यम से रीढ़ की हड्डी में उपजनसंख्या । इसलिए यह भविष्य में संभावना है कि कई इस तकनीक को अपनाने के लिए उनके विशिष्ट ध्यान में ंयूरॉंस आबादी का अध्ययन करेंगे । इसके अलावा, rAAVs के intraspinal इंजेक्शन का उपयोग करने के अलावा exogenous प्रभाव प्रोटीन की अधिकता प्राप्त करने के लिए, इस तकनीक को भी मौन या अंतर्जात प्रोटीन को व्यक्त किया जा सकता है और इसलिए उच्च स्थानिक के साथ किसी भी जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए और लौकिक संकल्प ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस काम को उदारता से समर्थन के लिए Ulrich Zeilhofer का शुक्रिया अदा करते हैंं । Hendrik Wildner ने ओल्गा Mayenfisch फाउंडेशन का समर्थन किया था. हम Lmx1b एंटीबॉडी के लिए कारमेन Birchmeier धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
micropipette puller: DMZ-Universal-Electrode-Puller Zeitz NA
anesthesia unit: Oxymat3 oxygen concentrator Weinmann NA
anesthesia unit: VIP 3000 Veterinary Vaporizer Midmark NA
Heat mat: Mio Star Thermocare 100 Migros 717614700000
Electric shaver Philips BT9290
surgical microscope (OPMI pico) Zeiss NA
Small animal stereotaxic apparatus Kopf NA
Neurostar StereoDrive (optional) Neurostar NA
Model 51690 Cunningham mouse spinal adaptor Harvard Apparatus 72-4811
PHD Ultra syringe pump with nanomite Harvard Apparatus 70-3601
Hamilton 701 RN 10 μl glass microliter syringe Hamilton 7635-01
Hamilton Removable needle (RN) compression fitting 1 mm Hamilton 55750-01
fine dentistry drilling apparatus: Osada success 40 Osada OS-40
spherical cutter, 0.5mm Busch 12001005B
electronic von Frey anesthesiometer IITC 23905
flexible von Frey hairs IITC #7
LSM710 Pascal confocal microscope Zeiss NA
0.8 NA × 20 Plan-apochromat objective Zeiss NA
1.3 NA × 40 EC Plan-Neofluar oil-immersion objective Zeiss NA
Name Company Catalog Number Comments
Surgical Tools
Scalpel Handle #4, 13cm Fine Science Tools 10004-13
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Adson forceps, 1 x 2 teeth, 12 cm Fine Science Tools 11027-12
Friedman-Pearson rongeurs, curved, 0.7 mm cup Fine Science Tools 16121-14
Dumont #2 laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20
Olsen-Hegar needle holders, serrated, 8.5 mm clamp length Fine Science Tools 12002-12
Fine forceps #5 Fine Science Tools 11254-20
Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Chemicals
Thin-wall glass capillary, 1mm outside diameter World Precision Instruments TW 100-3
Syringes (1, 5 and 20 ml) B. Braun (9166917V, 4606051V, 4606205V)
26G beveled needle B. Braun 4665457
Sterile scalpel blades B. Braun BB523
Surgical sutures Safil Quick+ 4/0, absorbable B. Braun C1046220
Surgical sutures Premilene 5/0, non-absorbable B. Braun C0932191
Sterile PBS or saline (0.9%) NA
Ethanol, 70% (disinfectant) NA
Iodine solution (e.g. Braunol) B. Braun 18380
Anaesthetics (e.g. Attane isoflurane) Provet 2222
Aldasorber Provet 333526
analgesics (e.g. buprenorphine: temgesic) Indivior GTIN: 7680419310018
Ophthalmic ointment (e.g. vita-pos) Pharma medica GTIN: 4031626710635
Cotton swabs (e.g. from) IVF Hartmann 1628100
Facial tissues (e.g. from) Uehlinger AG 2015.10018
Superfrost plus microscope slides ThermoScientific J1800AMNZ
Name Company Catalog Number Comments
Mice
C57BL/6J mice (wildtype) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:000664
Rorbtm1.1(cre)Hze/J mice (RORβCre) The Jackson Laboratory RRID:IMSR_JAX:023526
Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J mice (R26Tom) The Jackson Laboratory RRID: IMSR_JAX:007914
Name Company Catalog Number Comments
Viral vectors
AAV1.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG (AAV1.CAG.eGFP) Penn Vector Core AV-1-PV1963
AAV1.CAG.flex.eGFP.WPRE.bGH (AAV1.CAG.flex.eGFP) Penn Vector Core AV-1-ALL854
AAV1.CAG.flex.tdTomato.WPRE
.bGH (AAV1.CAG.flex.tdTomato)
Penn Vector Core AV-1-ALL864
AAV1.EF1a.flex.DTA.hGH (AAV1.EF1a.flex.DTA) Penn Vector Core Custom production
AAV1.hSyn.DIO.hM3D(Gq)-mCherry.hGH (AAV.flex.hM3D(Gi)) Penn Vector Core Custom production
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pAAV.hSyn.flex.hM3D(Gq)-mCherry Addgene 44361
pAAV.EF1α.flex.hChR2(H134R)-eYFP Addgene 20298
Name Company Catalog Number Comments
Bacteria
MDS42 ScarabGenomics
Stbl3 ThermoScientific C737303
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
EndoFree Plasmid Maxi Kit Quiagen 12362
NucleoBond PC 500 Machery & Nagel 740574
clozapine-N-oxide (CNO) Enzo Life Sciences BBL-NS105-0025
chloroquine diphosphate salt Sigma C6628
histamine Sigma H7125
Dapi Invitrogen D3571
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies (dilution)
Rabbit anti-GFP (1:1000) Molecular Probes RRID:AB_221570
Rabbit anti-NeuN (1:3000) Abcam RRID:AB_10711153
Goat anti-Pax2 (1 : 200) R & D Systems RRID:AB_10889828
Guinea pig anti-Lmx1b (1 : 10 000) Dr Carmen Birchmeier Muller et al. 2002
Rabbit anti-GFAP (1 : 1000) DakoCytomation RRID:AB_10013382
Secondary antibodies raised in donkey (1:800) Jackson ImmunoResearch Laboratories NA

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References

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