Retrospektiv mikroRNA sekvensering: Kompletterande DNA bibliotek förberedelse protokoll använder Formalin-fast Paraffin-inbäddat RNA exemplar

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Formalin-fast paraffin-inbäddat exemplar representerar en värdefull källa av molekylära markörer av mänskliga sjukdomar. Här presenterar vi ett laboratoriebaserade cDNA bibliotek förberedelse protokoll, ursprungligen utformad med färsk fryst RNA och optimerad för analysen av arkiverade mikroRNA från vävnader lagras upp till 35 år.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Loudig, O., Liu, C., Rohan, T., Ben-Dov, I. Z. Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens. J. Vis. Exp. (135), e57471, doi:10.3791/57471 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

– Arkiveras, kliniskt klassificeras formalin-fast kan paraffin-inbäddat (FFPE) vävnader ge nukleinsyror för retrospektiv molekylära studier av cancerutveckling. Med hjälp av icke-invasiva eller pre-maligna lesioner från patienter som senare utvecklar invasiv sjukdom, kan gen uttryck analyser identifiera tidiga molekylära förändringar som predisponerar för cancerrisk. Det har beskrivits väl att nukleinsyror återhämtat sig från FFPE vävnader har genomgått allvarliga fysiska skador och kemiska modifieringar, vilket försvårar deras analys och allmänt kräver anpassade analyser. MikroRNA (Mirna), dock som föreställer en liten klass av RNA-molekyler som spänner endast upp till ~ 18 – 24 nukleotider, har visat sig tåla långvarig lagring och framgångsrikt har analyserats i FFPE prover. Här presenterar vi en 3' barcoded kompletterande DNA (cDNA) bibliotek förberedelse protokoll specifikt optimerad för analys av små RNAs utvinns ur arkiverade vävnader, som visades nyligen för att vara robust och mycket reproducerbara när använda arkiveras kliniska prover lagras i upp till 35 år. Detta bibliotek preparat är väl anpassade till multiplex analysen av nedsatt/försämrad material där RNA prover (upp till 18) är sammanskrivna med enskilda 3' barcoded adaptrar och sedan poolade tillsammans för efterföljande enzymatisk och biokemiska preparat före analys. Alla reningar utförs av polyakrylamid gelelektrofores (sidan), som tillåter storlek-specifika val och rikedomar av barcoded små RNA arter. Detta cDNA bibliotek preparat är väl anpassade till minuten RNA ingångar, som en pilot polymeras-kedjereaktion (PCR) tillåter bestämning av en specifik amplifiering cykel att producera optimala mängder material för nästa generations sekvensering (NGS). Detta tillvägagångssätt var optimerad för användning av försämrade FFPE RNA från prover som sparas i upp till 35 år och ger mycket reproducerbara NGS data.

Introduction

MicroRNA är anmärkningsvärt väl bevarad i formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) exemplar1,2,3. Tidigare arbete har visat att uttrycket av dessa kort reglerande icke-kodande enda stranded RNA-molekyler kan utvärderas framgångsrikt använder total-RNA från FFPE prover och tillhandahålla relevanta gen uttryck data jämfört med det ursprungliga färskt vävnaderna4,5,6,7,8. Jämfört med stora messenger RNAs, som har visat sig påverkas kritiskt av FFPE vävnad behandling (formaldehyd, värme, uttorkning, etc.), endogena RNaser och ålder av exemplar, den lilla storleken på MicroRNA (~ 18 – 24 nukleotider) visas att göra dem resistenta mot nedbrytning och motståndskraftig till långsiktig lagring, också visat genom miRNA uttryck studier som överträffar högt dataflöde mRNA studier i arkiverade exemplar9. miRNA uttryck studier med arkiverade kliniska prover, som har mestadels utförts i småskaliga analyser, har visat att enstaka eller multiplexed kvantitativa PCR-analyser, olika typer av microarray technologies, och mest nyligen NGS kan användas för att utvärdera uttrycket av bevarade MicroRNA efter optimering av dessa analyser10,11,12,13,14.

Med tanke på att dysreglering av miRNA uttryck har associerats med utvecklingen av en mängd mänskliga maligniteter och att det finns potentiellt ett enormt utbud av kliniskt kommenterad arkiverade exemplar, det har blivit uppenbart att dessa små RNA molekyler utgör en lovande potentiell cancer biomarkörer15,16,17,18. Användning av en hög genomströmning gen uttryck teknik såsom NGS har fördelen av att ge en global utvärdering av alla miRNA avskrifter jämfört med riktade teknik såsom PCR eller microarrays19. Av denna anledning, var en optimerad, prisvärt och enkelt tillämpliga protokoll för cDNA bibliotek beredning av små RNAs från äldre arkiverade prover för NGS optimerad för att möjliggöra storskalig retrospektiva studier20.

Tidigare etablerade vi ett samtidiga RNA/DNA extraktion protokoll för separat återvinning av RNA och DNA från äldre arkiverade exemplar, som vi hittade för att överträffa modern kommersiella kit21. Använder detta extraktion protokoll, för att få total-RNA från FFPE-vävnad arkiveras under längre tider, optimerat vi utarbetandet av cDNA bibliotek för NGS av MicroRNA bevaras i kliniska prover för upp till 35 år. Dessutom i en nyligen publicerad studie var vi beredda cDNA bibliotek från kliniskt sekretessbelagda ductal carcinoma i situ (DCIS) exemplar, identifierade vi Differentiellt uttryckta MicroRNA som validerades av kvantitativa PCR, som anges att specifika miRNA uttryck förändringar kan upptäckas i DCIS lesioner från patienter som utvecklar bröstcancer jämfört med DCIS lesioner från patienter som inte utvecklar bröstcancer.

Med tanke på kostnaden för kommersiella kit för beredning av små RNA cDNA bibliotek, potentialen för deras utsättning, samt användningen av upphovsrätt/patentskyddade reagenser som inte kan optimeras, beslutade vi att anpassa en tidigare publicerade laboratoriebaserade och kit-gratis 3' barcoded cDNA bibliotek förberedelse protocol for NGS av små RNAs arkiveras i FFPE exemplar som möjliggör samtidig analys av 18 prover22. Detta protokoll ger en idealisk och robust stegvisa förfarande med visuella och tekniska utvärderingen kontrollpunkter, som var kritiska för anpassning till FFPE RNA exemplar, och har en stor tillväxtpotential för att andra källor till komprometterad eller svårt att använda RNA material. Ursprungliga protokollets tillämpning förbättrades genom att ersätta radioaktivt märkta storlek markörer med lysrör (t.ex., SYBR guld) detekterbara RNA storlek-markörer som används vid urval av sammanskrivna bibliotek på stora polyakrylamidgeler. Optimerad protokollet bygger på ligering av 3' barcoded adaptrar för 18 enskilda FFPE RNA exemplar, som utgör då poolade tillsammans för att genomgå 5' adapter ligatur, omvänd-Transkription, och en pilot PCR analys för skräddarsydda förstärkning av den slutliga cDNA bibliotek före storskaliga PCR-amplifiering, rening och NGS på en hög genomströmning sequencer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av alla reagenser och grundfärger

  1. Beställ alla primers och adaptrar som beskrivs i figur 1.
  2. Förbereda kalibratorn cocktail materiel, som kommer att bli spetsade i varje enskild ligering.
    1. Återsuspendera den bärare oligonukleotiden (figur 1) till 0,5 µM med RNase-gratis vatten. Återsuspendera de 10 kalibrator oligonukleotider (figur 1) till 100 µM med 0,5 µM carrier oligonukleotiden lösningen.
    2. Kombinera 10 µL av varje av de 10 kalibratorer i en silikoniserad mikrocentrifug att erhålla en 100 µM cocktail kalibrator lager, och förbereda en 0.026 nM lösning ska förvaras vid-20 ° C.
  3. Späd de 20 unika, frystorkat, adenylated 3' adaptrarna med RNase-fritt vatten till en slutlig koncentration på 50 µM (figur 1).
    Obs: Det rekommenderas att förbereda 2,5 µL portioner från varje adapter i enskilda silikoniserat rör och lagra dem vid-80 ° C i upp till 2 år.
  4. Återsuspendera desalted 19 nt-3' adapter och 24 nt-3' adapter storlek markör oligonukleotider till 250 ng/mL (figur 1).
  5. Återsuspendera HPLC renat 5' adaptern till 100 µM med RNAse-gratis vatten. Återsuspendera 5' och 3' PCR primers till 100 µM med hjälp av RNase-fritt vatten (figur 1).
    Obs: Alikvot alla oligonukleotider i mängder som krävs för 1 – 2 experiment och förvaras vid-80 ° C.
  6. Förbereda den polyakrylamid denatureringen (PAA) gel lastning dye genom att kombinera 98,8% formamid, 1% (v/v) 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 och 0,2% bromophenol blå och ange 1 mL alikvoter vid-80 ° C.
    1. Förbereda 0,5 M Na2H2 EDTA-lösningen genom att lägga till 18,6 g Na2H2 EDTA pulver 50 mL nuclease-gratis vatten. Tillsätt NaOH pellets för att nå pH 8,0. Justera volymen till 100 mL för att få en 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 stamlösning.
    2. Väg 15 mg bromofenolblått som i en separat 15 mL tub. Tillsätt 600 µL nuclease-gratis vatten. Tillsätt 14.25 mL avjoniserat formamid. Tillsätt 150 µL av den 0,5 M Na2H2 EDTA, pH 8,0 lösning.
    3. Alikvot PAA Finallösningen av 15 mL i 1 mL alikvoter vid-80 ° C.
  7. Förbereda 5 x agarosgel lastning dye genom att kombinera 0,2% bromophenol blå, 0,2% xylen cyanol FF, 50 mM Na2H2 EDTA, pH 8,0 och 20% Ficoll typ-400.
    1. Återsuspendera 1,86 g Na2H2-EDTA i 50 mL nuclease-fritt vatten i en 400 mL-bägare på en magnetomrörare i rumstemperatur (RT). Tillsätt NaOH pellets för att nå ett pH 8,0. Tillsätt nuclease-fritt vatten för att nå 100 mL för att få en 50 mM Na2H2 EDTA-lösning.
    2. Väger 20 mg bromofenolblått pulver, 20 mg xylen cyanol FF pulver och 2 g Ficoll typ-400 pulver och blandas i 5 mL 50 mM Na2H2 EDTA.
    3. Vortex röret som innehåller de tre färgämnen och tillsätt 5 mL av 50 mM Na2H2 EDTA. Blanda 5 x agarose gel lastning färgämnet, förbereda 1 mL portioner och lagra vid-80 ° C.

2. Ställ in de 3' Barcoded Adapter nering med 18 enskilda RNA-prover

  1. Identifiera 18 enskilda RNA-prover (pre-aliquoted på 100 ng i 9,5 µL nuclease-fritt vatten i 1,5 mL silikoniserad mikrocentrifugrör), och Ställ in rören på is att Tina i 10 min.
  2. Förbereda 10 x RNA Ligase buffert (utan ATP) färska.
    1. I ett 1,5 mL silikoniserad mikrocentrifug rör, kombinera 343 µL RNase-gratis vatten, 500 µL av Tris 1 M pH 7.5, 100 µL av 1 M MgCl2, 50 µL av 20 mg/mL bovint serumalbumin och 7 µL av 14 M 2-merkaptoetanol. Mix av snärta röret, centrifug för 2 s 2 000 x g och RT, och Ställ in på isen.
      Obs: Alla steg i detta protokoll som anger ”centrifug för 2 s” utförs i en bänkmonterade mikrocentrifug på RT och en toppfart på 2 000 x g samla lösningar på botten av rören.
  3. Förbereda 50% vattenlösning DMSO lager genom att tillsätta 1 mL RNase-fritt vatten till 1 mL av DMSO i en 2 mL silikoniserad mikrocentrifug rör, Linda in röret i aluminiumfolie och förvaras vid RT.
  4. Frosta 0.026 nM kalibrator cocktail på is för 10 min. Förbered Ligation Master Mix genom att kombinera i följande ordning i ett 1,5 mL silikoniserad mikrocentrifug rör: 40 µL 10 x RNA Ligase buffert och 120 µL av 50% vattenlösning DMSO med 200 mL pipett , och tillsätt 10 µL av 0.026 nM kalibrator cocktail med 10 µL pipett. Snärta 1,5 mL röret att blanda, Centrifugera i 2 s och Ställ in det på is.
  5. Tillsätt 8,5 µL Ligation Master Mix i varje 18 individuellt aliquoted FFPE RNA prov, knacka försiktigt rören, centrifug för 2 s och store på is.
  6. Avfrostning 2,5 µL portioner från samtliga 18, 3' barcoded kort och placera dem på isen att Tina i 20 min.
    1. Använd en 3-µL pipetten för att överföra 1 µL av varje adapter till de motsvarande FFPE RNA-prover som innehåller RNA och Ligation Master Mix (dvs, 9,5 µL + 8,5 µL).
    2. Pipettera upp och ned inte, helt enkelt fördela i vätskan och dra. Se till att ändra tips mellan FFPE RNA-prover. Nära varje tub, svep för att blanda, centrifug för 2 s, och på isen.
  7. Denaturera reaktioner genom att placera 18 rören på en värme block vid 90 ° C i 1 min och sedan placera omedelbart på is.
  8. Bered den ligering enzymet genom att späda 10 µL trunkerade K227Q T4 RNA Ligase 2 med 10 µL RNase-gratis vatten i ett färskt 1,5 mL silikoniserad mikrocentrifug rör.
  9. Använd en 3 µL pipetten för att överföra 1 µL utspädda ligering enzymet i varje 18 RNA prov (inte Pipettera upp och ner och ändra tips mellan varje tub). De 18 nering på is och placera i ett kallt rum för 4 ° C för en övernattning inkubering av 18 h.

3. rening av Ligated små RNASEN

  1. Inaktivera ligering reaktioner genom att placera 18 rören för 1 min på en värme block vid 90 ° C, och sedan återgå till is i minst 2 min att svalna.
  2. Förbereda nederbörd Master Mix genom att lägga till 1 µL blått färgämne kovalent kopplade till glykogen till 26 µL 5 M RNase-gratis NaCl i en färsk silikoniserat mikrocentrifug rör.
    1. Över 1,2 µL av nederbörd Master Mix i var och en av de 18 rören. Tillsätt 63 µL av 100% etanol till var och en av de 18 rören. Nära varje tub, svep till blanda, Centrifugera i 2 s och plats rören på is. Kombinera innehållet i alla 18 rör i en enda 1,5 mL silikoniserad tub.
    2. Nära röret, Invertera tre gånger för att blanda, centrifug för 2 s och plats på is för 60 min utfällning.
  3. Förbereda en stor (16 x 20 cm2) 15% polyakrylamidgel för sidan.
    1. Gjuten två silikoniserad exponeringsglas pläterar (behandlas med ett säkert alternativ till silan ytbeläggningar) med 0,1 cm distanser.
    2. Kombinera 9 mL system spädningsvätska, 18 mL system koncentrat, 3 mL system buffert, 240 µL av APS (9%) och 12 µL av TEMED i en 50 mL tub.
    3. Överföra sida gellösningen mellan glasskivor med 30 mL pipett, infoga en 14-bra kam (0.1 cm tjock) och låt gelen stelna på RT i 30 min.
  4. Centrifugera 1,5 mL röret med de poolade nering på 16 000 x g och 4 ° C i 60 min.
  5. Ta bort kammen. Ren brunnarna rikligt med RNase-fritt vatten med en sprutande flaska med 200 µL spets vid dess slut att nå inuti brunnarna och tvinga un-polymeriserat akrylamid ut (en brunn i taget) ovanför en diskbänk. Ställ in 15% sida på en gel apparatur, Fyll behållarna med 0,5 x Tris-Borat EDTA (TBE) lösning, och pre kör gelen för 30 min vid 450 V.
  6. Återställa röret med poolade nering från centrifugen och noggrant torka RNA pelleten.
    1. Avlägsna supernatanten med en 1 mL pipettspetsen men lämna lite vätska i botten. Tilt röret och använder 20 mL pipett för att avlägsna återstående supernatanten utan att vidröra pelleten. Vakuum sug röret med en Pasteur-pipett med ett 10-µL tips på högkant, utan att vidröra pelleten.
    2. Återsuspendera pelleten RNA i 20 µL av RNase-fritt vatten genom att snärta röret. Tillsätt 20 µL av PAA gel buffertlösning att resuspendera RNA, svep för att blanda, centrifug för 2 satt RT, och Ställ röret vid 90 ° c i 1 min och sedan placera omedelbart på is.
  7. Ersätt 0,5 x TBE av gel apparater med färska 0,5 x TBE och lasten stegen, storlek markörer och sammanskrivna MicroRNA i mitten av gelen, lämnar 2-tomma brunnar på båda sidor (figur 2).
  8. Kör gelen vid 450 V (35 mA) för 60 min, pausa körningen för 10 min att svalna och kör igen på 520 V (25 mA) för en annan 60 min. Uncast 15% sida genom att ta bort en av glasplattorna.
  9. Spraya lätt gelen sitter på glasskivan med fluorescerande färg lösning (10 µL) i 25 mL 0,5 x TBE, och låt det sitta platt för 5 min i mörker.
  10. Lägg glaset med gelen på en blå ljus transilluminator, och justera båda 19 nt och 24 nt storlek markörer med en linjal att rikta excision av ligated små RNASEN (figur 2). Punktskatt gelen.
  11. Placera exciderad gelen i en 0,5 mL tub, designad att fragmentera gel skivor, säkert placerad i ett 1,5 mL silikoniserat mikrocentrifug rör. Centrifugera vid 16 000 x g i 3 min vid RT. Omsuspendera fragmenterade gelen med 300 µL av 400 mM NaCl-lösning, stänga röret och försegla det med paraffin filma.
  12. Ställ röret på agitation på en thermomixer vid 1100 rpm i ett kallt rum för 4 ° C för en övernattning inkubation (16-17 h).

4. ligering av adaptern 5'

  1. Överför lösningen och fragmenterade gel till ett 5 µm filter röret sitter i en 1,5 mL silikoniserad tub, försegla med paraffin filma och Centrifugera i 5 min vid 2300 x g och RT.
  2. Lägga till 950 µL av 100% etanol i den filtrerade lösningen, stänga röret, Invertera att blanda, Centrifugera i 2 s, tätning röret med paraffin filma, och på isen för 1 h.
  3. Förbereda en 12% sida gel som beskrivs i steg 3.3, men kombinera 12,6 mL spädningsvätska, 14,4 mL koncentrat, 3 mL buffert, 240 µL APS och 12 µL av TEMED i en 50 mL tub. Förväg kör på 12% sida gel för 30 min vid 450 V (~ 35 mA) i 0,5 x TBE.
  4. Centrifugera renat små RNA lösningen vid 16 000 x g under 60 minuter vid 4 ° C.
  5. Pipettera omsorgsfullt ut supernatanten med 1 mL pipett ta bort huvuddelen av lösningen och använda 200-mL pipett ta bort återstående lösningen, utan att vidröra pelleten.
  6. Använder en Pasteur-pipett med en 10 mL spets vid dess slut ansluten till en termoskanna, noggrant torka pelleten utan att röra den.
  7. Återsuspendera pelleten i 9 µL RNase-fritt vatten utan pipettering upp och ner, men av lätt snärta röret, Centrifugera i 2 s och Ställ röret på is.
  8. Förbered 10 x RNA Ligase buffert (med ATP) färsk genom att kombinera 500 µL 1 M Tris pH 7,5, 100 µL av 1 M MgCl2, 50 µL 20 mg/ml acetylerade BSA, 200 µL 10 mM ATP, 7 µL av 2-merkaptoetanol 14 M , och 143 µL RNase-gratis vatten.
  9. Blanda 10 x RNA Ligase buffert (med ATP) genom att snärta röret och Centrifugera i 2 s att samla in lösningen på botten av röret.
  10. Ställ in de 5' adapter ligering av lägga 2 µL 10 x RNA Ligase buffert (med ATP), 1 µL 100 µM 5' adapter och 6 µL 50% vattenlösning DMSO till de 9 µL, 3' barcoded små RNA lösning.
  11. Snärta röret lätt att blanda, Centrifugera i 2 s att samla in lösningen, placera röret på en värme block vid 90 ° C i 1 min och tillbaka på isen i minst 2 min.
  12. Tillsätt 2 µL av T4 RNA Ligase 1 i lösningen (Pipettera inte upp och ner), svep röret, centrifug för 2 s och sit röret i flytande rack i 37 ° C vattenbad för 60 min.
  13. Samtidigt, ställa in två nering mellan den 19 nt-3' adapter och 5' adaptern, och två nering mellan den 24 nt-3' adapter och 5'-adaptern.
    1. Kombinera 2 µL av 19nt-3' adapter (250 ng/µL) eller 24 nt-3' adapter (250 ng/µL) med: 2 µL 5' adaptern (100 µM), 2 µL 10 x RNA Ligase buffert (med ATP), 6 µL av 50% vattenlösning DMSO, 6 µL RNase-gratis vatten , och 2 µL av T4 RNA Ligase 1 i ett 1,5 mL silikoniserad mikrocentrifug rör.
    2. Snärta rören för att blanda, Centrifugera i 2 s och Ställ in rören vid 37 ° C i 60 min.
  14. Tillsätt 20 µL av PAA denatureringen buffert till alla nering (renat små RNAs, 2 ningsförbindelser med 19nt-3' adapter och 2 nering med 24nt-3' adapter).
    1. Mix av snärta rören, centrifug för 2 s, inkubera rören på en värme block vid 90 ° C i 1 min. överföring alla rör till is och förbereda en stege (3 mL av stege med 20 µL av PAA).
  15. Töm den övre reservoaren av gel apparaten med före kör 12% sidan gel och tillsätt färska 0,5 x TBE lösning under nivån för brunnarna (brunnar töms med en lång, tunn spets pipett).
    1. Ladda proverna med en tunn pipettspetsen, som beskrivs i figur 3.
    2. Använd färska 0,5 x TBE att fylla enskilda brunnar till toppen av gelen.
    3. Lägga till färska 0,5 x TBE till reservoaren ovanför brunnar och start av elektrofores av 12% sida för 60 min vid 450 V (~ 35 mA).
    4. Pausa körningen genom att stänga av den generator för 10 min att svalna av gelen. Starta om generatorn och kör gelen för 60 min vid 520 V (~ 25 mA).
  16. Stoppa generatorn, Töm behållarna genom att vända apparaten ovanför en diskbänk och uncast på 12% sida genom att ta bort en av glasplattorna.
  17. Sitter glaset med den platta gel, spray gel med 10 µL av den fluorescerande färgämnen i 25 mL 0,5 x TBE, inkubera i mörkret för 5 min. Lägg glaset med gelen på en blå ljus transilluminator och justera båda 19 nt och båda 24 nt storlek markörer med en linjal att rikta excision av ligated små RNASEN (figur 3).
    1. Punktskatt gelen och överför exciderad gel lappa till en 0,5 mL gel breaker tube. Stäng locket på gel breaker röret, set i ett 1,5 mL silikoniserad mikrocentrifug rör, och säkert med paraffin film. Ta bort gel breaker röret, lägga 300 µL av 300 mM NaCl och 1 µL 100 µM 3' PCR primer till krossade gel bitarna i en 1,5 mL tub.
    2. Förslut röret med paraffin film på agitation på en thermomixer på 1.100 rpm vid 4 ° C, över natten (17 – 18 h) i ett kallt rum.

5. omvänd Transkription av de 5' sammanskrivna och 3' Barcoded renas små RNAs

  1. Hämta röret från thermomixer och filter rena lösningen med en 5 µM filter tube.
    1. Använd en 1 mL pipett till överför lösningen till en 5 µM filterröret infogas i en 1,5 mL silikoniserad RNase-fri samling tube. Centrifugera röret för 3 min vid 2300 x g och RT.
    2. Kassera filterröret och tillsätt 950 µL 100% etanol i 1,5 mL mikrocentrifug samling röret som innehåller filtrerade lösningen. Vänd röret till mix, centrifug för 2 s och plats på is för 60 min. fällningen RNA pellet genom centrifugering röret på 16 000 x g och 4 ° C för 1 h.
  2. Torka den RNA pelleten.
    1. Öppna locket och ta försiktigt bort supernatanten med 1 mL pipett, lämnar lite vätska i botten.
    2. Använd 20 µL pipett för att avlägsna alla återstående supernatanten utan att vidröra pelleten. Vinkla röret för att tillåta någon lösning att sitta på motsatt sida av pelleten.
    3. Använda en Pasteur-pipett med en 10 mL ofiltrerade pipettspetsen att Aspirera supernatanten och torka pelleten med en dammsugare.
  3. Återsuspendera pelleten RNA i 5,6 µL RNase-gratis vatten.
    1. Frosta omvänd Transkription reagenserna på isen för 15 min. Ställ upp en omvänd Transkription reaktion genom att lägga till 3 µL av 5 x buffert, 4,2 µL 10 x deoxynucleotide trifosfat (dNTP) (varje 2 mM) och 1,5 µL av Ditiotreitol (DTT) till den 5,6 µL RNase-gratis återsuspenderad pellet.
    2. Knacka försiktigt röret för att blanda reaktionen, och Centrifugera i 2 s att samla lösningen. Ställa in reaktionen på en värme block vid 90 ° C under exakt 30 s och överför sedan direkt på en thermomixer vid 50 ° C.
    3. Lämna röret på thermomixer för 2 min så att temperaturen utjämnar. Lägg till 0,75 µL av enzymet omvänd Transkription direkt i den lösning, flick försiktigt för att blanda och Ställ röret tillbaka på thermomixer vid 50 ° C i 30 min omedelbart.
  4. Efter 30 min, överföra röret till en värme block vid 95 ° C i 1 min att stoppa omvänd Transkription. Lägga till 95 µL RNase-fritt vatten direkt i den omvänd transkriptionen, svep röret till blanda och ställ den direkt på is i 2 min.
  5. Märk röret med cDNA lager och biblioteket-ID.

6. pilot PCR och storskaliga PCR-amplifiering

  1. Förbereda färska 10 x PCR buffert genom att lägga till 304 µL RNase-gratis vatten, 125 µL av 2 M KCl, 50 µL 1 M Tris pH 8,0, 10 µL av 1 M MgCl2, 5 µL av 1% Triton X-100 och 6 µL av 1 M 2-merkaptoetanol i en silikoniserad mikrocentrifug rör , och hålla på RT.
  2. Montera Pilot PCR-reaktionen genom att kombinera 67 µL RNase-gratis vatten, 10 µL 10 x PCR Buffer, 10 µL 10 x dNTPs, 0,5 µL av 100 µM 5' PCR primer, 0,5 µL av 100 µM 3' PCR primer, 10 µL av cDNA papperstypsbibliotek och 2 µL av 50 x Taq polymeras.
    1. Ställa in två PCR cyklar på en termocykler enligt följande: fil 1: 94 ° C i 45 s, 50 ° C för 85 s och 72 ° C för 60 s för 10 cykler, håll vid 4 ° C; Fil 2: 94 ° C i 45 s, 50 ° C för 85 s och 72 ° C för 60 s för 2 cykler, håll vid 4 ° C. Ställa in Pilot PCR-reaktionen i termocyklern och börja fil 1.
    2. I slutet av filen 1, öppna PCR-röret, och med 20 µL pipett överföring 12 µL från Pilot PCR-reaktionen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 3 µL av 5 x gel lastning färgämne, blanda genom pipettering upp och ner, Stäng tuben , och etiketten ”10 cykler”.
    3. Stäng Pilot PCR-röret och starta filen 2 på en termocykler. I slutet av filen 2, öppna PCR-röret och använder 20 mL pipett överföra 12 µL lösning i 1,5 mL mikrocentrifug rör med 3 µL av 5 x gel lastning färgämne och etiketten ”12 cykler”.
    4. Upprepa stegen som beskrivs i steg 6.2.2 och 6.2.3 samla 12 µL PCR produkter från Pilot PCR-reaktionen vid PCR-cykler 14, 16, 18 och 20. Tillsätt 3 µL 5 x gel lastning färgämne i vart och ett av de 12 µL PCR alikvoter, och till de 20 nt stegen som innehåller 3 µL av stege och 9 µL RNase-gratis vatten.
  3. Förbereda en 2,5% agarosgel med 0,5 x TBE.
    1. Väg in 2,5 g av agaros i en ren bägare och tillsätt 100 mL 0,5 x TBE. Hetta upp lösningen i en mikrovågsugn tills det kokar. Ta bort lösningen från mikrovågsugn, snurra på flaskan för att blanda Agarens, tillsätt 4 μL av etidiumbromid (10 mg/mL) och överför lösningen till en 7 x 10 cm2 elektrofores bricka, stängt på båda ändarna med tejp.
    2. Ställ in en 8-bra kam och låt det agarosgel stelna på RT. överföringen den stelnad agarosen gel i en elektrofores-apparat fylld med 0,5 x TBE.
  4. Ladda stege och PCR-prov på agarosgel och köra den för 30 min vid 120 V.
  5. Utvärdera gelen på ett UV-rutan för att identifiera den optimala PCR-cykeln (figur 4A).
    Obs: Storleken på de förväntade PCR-band visas i figur 4B.
    1. Observera de två PCR banden i varje av de olika brunnarna (övre band: DNA bibliotek, lägre bandet: primer dimerer).
    2. Identifiera lämpliga PCR-cykeln för cDNA förstärkning genom att välja cykeln där cDNA biblioteket är synliga, men de primer dimerer är knappt observerbara.
      Obs: I allmänhet tillräcklig PCR cykeln väljs mellan 12 – 16 cykler. På figur 4Aär adekvat PCR-cykeln för det här biblioteket 14.
  6. Ställ in de storskaliga PCR-reaktionerna (6 x 100 µL) för agaros gel bibliotek rening.
    1. Förbered en ny tub 10 x PCR Buffer följande steg 6.1.
    2. Förbereda den storskaliga PCR Master Mix i en 1,5 mL tub genom att kombinera 435.5 µL RNase-gratis vatten, 65 µL 10 x PCR buffert, 65 µL 10 x dNTPs, 3.25 µL 5' PCR primer, 3.25 µL av PCR-primer 3' och pipettering upp och ner för att blanda.
    3. Över 88 µL av PCR-Master Mix in sex 0,5 mL PCR-rören. Överför 10 µL av cDNA papperstypsbibliotek (lagrade på is), tillsätt 2 µL av 50 x Taq-polymeras i var och en av de 6 PCR-rören och pipett för att blanda.
    4. Förbereda en negativ PCR reaktionsröret genom att kombinera 77 µL av RNase-gratis vatten, 10 µL 10 x PCR buffert, 10 µL 10 x dNTPs, 0,5 µL av PCR-primer 5', 0,5 µL av PCR-primer 3' och 2 µL av 50 x Taq polymeras och pipetten att blanda.
    5. Placera PCR-rören i den termocyklern använder PCR cykeln beskrivs i steg 6.2.1 och ange det optimala antalet förstärkning cykler. Bered en 2,5% agarosgel med 0,5 x TBE, enligt beskrivningen i steg 6.3.
  7. Efter PCR-amplifiering, överföra 9 µL från varje PCR-rör i sex 1,5 mL mikrocentrifugrör innehållande 3 µL av 5 x gel lastning färgämne.
    1. Förbereda 20 nt stege genom att kombinera 3 mL av stege till 9 µL RNase-gratis vatten och lägga 3 µL gel laddar färgämne i en 1,5 mL tub.
    2. Fyll på stegen, negativa PCR-kontroll och 6 PCR-produkter på agarosgel och kör gelen för 30 min vid 120 V.
    3. Verifiera likformigheten av de PCR-kompletteringar mellan körfält på en UV låda (ta en bild).
    4. Kombinera 3 PCR-reaktioner i två 1,5 mL silikoniserad mikrocentrifug rör (3 x 91 µL), lägga till 27 µL 5 M NaCl och 950 µL av 100% etanol. Invertera rören för att blanda och ställ dem på-20 ° C över natten för att fälla de PCR-produkterna.

7. cDNA bibliotek rening och utvärdering

  1. Centrifugera båda rören med PCR-reaktioner vid 16 000 x g under 60 minuter vid 4 ° C.
  2. Avlägsna supernatanten med 1 mL pipett, sedan luta röret med pelleten på ovansidan och vätska på undersidan och använda en Pasteur-pipett som är ansluten till en Termoskanna med badkar och aspirera vätska med en 10 mL spets i slutet av den Pasteur-pipetten.
  3. Ställa in PmeI digest.
    1. Återsuspendera en av PCR-pellets med 17,5 µL nuclease-gratis vatten och överföra den återsuspenderade pelleten till andra PCR-pelleten. Lägg till 2 µL 10 x buffert och 0,5 µL av PmeI enzym, och ange smälta i vattenbad för 2 h vid 37 ° C.
    2. Bered en 2,5% agarosgel med 0,5 x TBE (steg 6.3). Tillsätt 6 µL 5 x gel lastning färgämne i digest. Överför 13 µL av varje sammanfattad i två intilliggande brunnar av agarosgel, Ladda 20 nt storlek stegen på slutet brunnarna och kör gelen för 90 min på 150 V (figur 4 d).
    3. Punktskatt övre PCR banden från gelen på rutan UV, överför gel bitar i ett nymalet vägde 1,5 mL mikrocentrifug rör och väga gel bitar på en skala.
  4. Rena exciderad PCR förstärkta cDNA biblioteket använder en gel utvinning kit följa tillverkarens instruktioner. Kvantifiera cDNA biblioteket med hjälp av ett instrument, efter tillverkarens anvisningar och DNA kvantifiering assay.
  5. Utvärdera storlek och renhet av cDNA biblioteket med en högkänslig DNA chip på en Bioanalyzer (figur 5). Sekvens cDNA biblioteket med ett högt dataflöde system. Överföra filen FASTQ till rörledningen RNAworld för adapter trimning och anpassningen till det mänskliga genomet att identifiera miRNA sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som beskrivs i metoden här, sammanlagt 18 enskilda FFPE RNA-prover (100 ng varje) ställs in i separat rör genomgå 3' adenylated barcoded oligonukleotiden T4 ligering över natten. Nästa dag, är de enzymatiska reaktionerna värme-avaktiveras, kombineras och fälls ut i ett enda rör. RNA pelleten är resuspended och de ligated RNA-molekylerna är separerade på 15% denatureringen Polyakrylamidgelen (sida), där RNA oligonukleotiden storlek markörer som migrerats i intilliggande brunnar sida gel, används för att välja den lämplig storlek 3' barcoded liten RNAs (figur 2). Exciderad gel bit inkuberas i en NaCl-lösning över natten att eluera de ligated RNA-molekylerna. Nästa dag, den eluerade RNA fälls ut, och en 5' adapter ligering utförs. Sedan är de 5' adapter sammanskrivna små RNA-molekylerna migreras och separeras på en 12% akrylamid gel, där igen migrerade RNA storlek markör oligonukleotider tillåter storlek excision av små RNASEN som innehåller både de barcoded oligonukleotider 3' och 5' adaptern ( Figur 3). Exciderad gelen inkuberas över natten i en NaCl-lösning att låta eluering av RNA. Nästa dag, de ligated små RNA-molekylerna fälls och pelleten är resuspended i RNase-gratis vatten, följt av omvänt-transkription; en alikvot av cDNA molekylerna genomgår en pilot PCR-reaktion (figur 4A). Storskaliga PCR-reaktioner använder samma ingång av cDNA bibliotek ställs in och utvärderas på en 2,5% agarosgel att verifiera att alla reaktioner var tillräckligt PCR amplifieras (figur 4B), före sammanslagning och övernattning etanol nederbörd. Nästa dag, förstärkta cDNA biblioteket som innehåller alla 18 enskilda bibliotek för 18 unika FFPE RNA exemplar, migreras på en 2,5% agarosgel och topp PCR-bandet, kör på 100 nt är censurerade och renat (figur 4 c). CDNA bibliotek rening utvärderas sedan på en högkänslig DNA chip (figur 5) att bestämma att renat PCR-produkten inte innehåller ett överskott av primer dimerer eller andra biprodukter av PCR-reaktionen. PCR-produkten analyseras sedan på en hög genomströmning sekvensering system. Den adaptern trimning och generering av 18 enskilda filer för var och en av 18 exemplar utförs med rörledningen RNAworld (tillträde lämnades till oss av Dr Thomas Tuschl). Biostatistiska analyser utförs sedan för att utvärdera miRNA innehållet av FFPE RNA exemplar.

Att validera detta optimerade förfarande, matchade färsk fryst och FFPE bröst tumör prover användes för analyser (figur 6). Två liknande invasiv duktal bröstcancer carcinom (IDC) tumörer har valts för att utvärdera känsligheten av förfarandet och avgöra om miRNA uttryck skillnader identifieras mellan de två färska frysta vävnaderna kan också upptäckas i den avstämda arkiverade FFPE RNA-prover. För detta experiment utvärderas kvaliteten på den totala RNA som erhållits från de 2 färska frysta och de matchade två FFPE RNA-proverna var (figur 6A). Som förväntat minskade kraftigt RNA storleken och kvaliteten på FFPE exemplaren jämfört med matchade färsk fryst RNASEN (jämför körfält 1 och 3 och körfält 2 och 4). En av FFPE RNA hade arkiverats på RT för 4 år (invasiv bröstcancer Cancer 1, (IBC1)) och den andra hade arkiverats på RT i 8 år (IBC2), medan de färska frysta motsvarigheterna hade sparats vid-80 ° C. De fyra individuella RNA-proverna analyserades i ett enda bibliotek, med hjälp av 4 individuella streckkoder och den miRNA Läs distribution tomter visas i figur 6B. De två översta skärmar miRNA uttryck korrelation mellan två färska frysta tumören RNAs och deras specifika FFPE RNA preparatet motsvarigheter. Tomterna mellan matchade färsk fryst och FFPE MicroRNA indikerar att cDNA bibliotek preparatet ger en bra reproducerbarhet som en hög korrelation kan observeras mellan den MicroRNA detekteras i exemplar behandlas annorlunda (fryst vs. FFPE). De två lägsta panelerna visar sambandet mellan miRNA uttrycket data från två olika frysta tumörer och mellan de två olika FFPE tumörerna. Som anges i figur 6 c, var miRNA uttryck skillnaderna mellan de två färska frysta tumörerna korrelerade med de skillnader som konstaterats mellan två matchade FFPE tumör exemplaren. Betydelse miRNA uttryck skillnaderna var detekterbar både i färsk fryst och FFPE tumörer.

För att ytterligare utvärdera känsligheten i denna strategi, miRNA uttrycket data från 12 arkiverade FFPE-prov och 4 färska frysta RNA-prover användes (figur 6 d). 16 olika RNA exemplaren var individuellt 3' barcoded och alla används för beredning av ett enda cDNA-bibliotek. De RNA-prover som används i detta bibliotek ingår två bröst cellinjer, MCF10A (normal-liknande cell linje) och MCF7 (breast cancer cellinje) med RNA från färska celler och deras arkiverade FFPE motsvarigheter23, matchade färsk fryst och FFPE RNA prover från de två bröstcancer prover analyseras självständigt (IBC1 och IBC2 i figur 6A och 6B) och matchade färsk fryst och FFPE RNA prover från normala cervikala prover (Cx). Dessutom analyserades arkiverade FFPE prover från normal (normal Br1, normala Br2 och normala Br3) och cancer bröstvävnad (IBC 5, IBC 6 och IBC 7), utan deras färska frysta motsvarigheter. Som observerats på heatmap, oavsett färsk fryst eller FFPE RNA ursprung, miRNA uttrycket profiler av samma celler (MCF10 eller MCF7), eller samma vävnader (IBC1, IBC2 eller Cx) klustrade tillsammans. Dessutom, som nämnts i oövervakade klustret, från vänster till höger, normala bröst celler och vävnader klustrade tillsammans medan brösttumörer och tumörceller klustrade till höger. Cervikal vävnad, visas en annan miRNA uttryck profil, klustrade på rätten av heatmap.

Med tanke på att de flesta av de kliniskt arkiverade FFPE-exemplar inte har färska frysta motsvarigheter men att de kan hämtas efter olika lagring varaktighet, det avsåg att avgöra om protokollet optimerad cDNA bibliotek förberedelse var tillämpliga och reproducerbara med allt äldre FFPE exemplar. Som visas i figur 7, miRNA uttrycket profiler från FFPE-vävnad arkiveras för 18, 20, 22, 27, erhölls 30 och 35 år. RNA extraherades med hjälp av de optimera samtidiga RNA/DNA förfarandet21, och fyrling RNA alikvoter från varje enskild FFPE-prov var beredd på samma dag och lagras vid-80 ° C före bibliotek preparat. Totalt 9 olika FFPE-prov analyserades i två exemplar, där varje enskild RNA alikvot var sammanskrivna med olika barcoded oligonukleotider (totalt 18 streckkoder), inom samma bibliotek. Experimentet upprepades under två på varandra följande veckor (vecka 1 och vecka 2). Detta tillät utvärdering av cDNA bibliotek förberedelse reproducerbarhet med samma RNA exemplaren använda två olika streckkoder inom ett enda bibliotek, och mellan två olika bibliotek med en veckas intervall. Som observerats på figur 7, förblev korrelationskoefficienten ovan 0,96 oavsett ålder exemplaret eller bibliotek förberedelser veckan; Därför protokollet optimerad cDNA bibliotek beredning ger ett robust verktyg för reproducerbara analys av FFPE exemplar oavsett deras arkivens tid, till exempel den 35-åriga arkiverade FFPE RNA (se bröst #9) visas hög reproducerbara åtgärder motsvarar dem noterade med 20-åriga FFPE RNA proverna (se bröst #3).

Figure 1
Figur 1: oligonukleotider. Alla oligonukleotiden sekvenser, deras motsvarande kemiska modifieringar och koncentrationer som används i detta protokoll beskrivs. Vilka typer av kemiska modifieringar beskrivs i rutan modifiering och förkortad ändringar visas i oligonukleotiden sekvenser. Kalibratorn cocktail visar listan över de 10 individuella RNA oligonukleotiden kalibratorer, som var resuspended i en lösning som innehåller den bärare oligonukleotiden (0,5 µM). De arton 3' barcoded oligonukleotiden adaptrarna är detaljerad med grå skuggning över streckkodens sekvens. Den RNA-sekvensen av adaptern 5' och de DNA-sekvenserna av 3' PCR och 5' PCR primers är detaljerade. De RNA-sekvenserna av de två storlek markör oligonukleotider, nämligen refereras i protokollet som 19 nt-3' adapter och 24 nt-3' adapter storlek markörer, tillhandahålls. Alla DNA och RNA oligonukleotider köptes kommersiellt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: sida rening av de barcoded RNA-proverna 3'. Efter sammanslagning och utfällning av de 18 barcoded RNA-proverna, den återsuspenderade pelleten RNA är migreras och avgränsade med elektrofores på en 15% akrylamid gel (se väl 8). Röda torget belyser det område som innehåller de 3' barcoded mikroRNA, som var utskurna med en skalpell blad och överföras till en nuclease-fri silikoniserat mikrocentrifug rör. Sammanlagt fyra brunnar, med två som innehåller de 19 nt-3' adapter och två som innehåller den 24 nt-3' adapter sattes en väl bort, på varje sida av biblioteket (se brunnar 5, 6, och 10, 11, respektive). Som ett test för den T4 RNA ligase 1 och för rening av ligated storlek markörer vara avslutade den nästa dag, ligatur reaktioner som innehåller de 19 nt-3' adapter storlek markör med adaptern 5' och 24 nt-3' adapter storlek markör med adapter 5' kördes i brunnar 2 en d 3, respektive. De gula rutorna Visa exciderad band som representerar de sammanskrivna storlek markör RNA oligonukleotider med adapter 5'. Dessa band är renat, fälls ut och springa under 12% sida rening (se figur 3 nedan). Brunnar 1 och 13 innehåller 20 nt storlek stegen, vilket bidragit till att bekräfta de förvänta storlekarna av ligated produkter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: sida rening av renat biblioteket efter ligering av adaptern 5'. Renat RNA biblioteket var sammanskrivna med adapter 5' och förväntade Produktstorlek var censurerade från 12% sida med sammanskrivna storlek märkpennor (se Röda torget). Produkter av de T4 RNA nering mellan den 19 nt-3' adapter och 5'-adaptern (brunnar 4 och 9) och mellan den 24 nt-3' adapter och 5'-adaptern (brunnar 5 och 10) kördes parallellt, på varje sida av den brunn innehållande RNA biblioteket. De högsta band (se vita asterisker) är produkter av de 5' adapter ligering och adaptern används som guide för de gel bandet excision som innehåller de 5' och sammanskrivna RNA bibliotek. Ligatur storlek markör ligering produkterna renas på föregående sida körs i väl 3. Som observerats i brunnarna 1 och 12, kördes också 20 nt storlek stegen för att validera den förvänta storleken av RNA biblioteket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Pilot PCR och storskaliga förstärkning av cDNA biblioteket. Storlek och förhållandet mellan PCR produkterna utvärderades på en 2,5% agarosgel i närvaro av etidiumbromid. (A) efter omvänd Transkription av barcoded RNA bibliotek, en alikvot av cDNA biblioteket förstärktes med 5' och 3' PCR primers i en enda pilot PCR-reaktion. Alikvoter av pilot PCR reaktioner erhålls vid 10, 12, 14, 16, 18 och 20 cykler och migrerat på en 2,5% agarosgel. Som observerats mellan brunnarna 1 och 7, förekomsten av de cDNA bibliotek och adapter dimerer var exponentiellt observerbara (se gröna rektanglar). För det här biblioteket var PCR cykeln valts för förstärkning av cDNA biblioteket 15. (B), detta schema visar position och längden på de olika oligonukleotider och de resulterande RNA och DNA produkter, som kan identifieras på sidan och agaros gel. (C) alikvoter av 6 storskaliga PCR-reaktioner (identifieras i A) analyserades separat på en 2,5% agaros gel (se wells 3 till 8). De två typerna av PCR-produkter, nämligen biblioteket (övre band) och de primers dimerer (lägre band) är synliga på denna gel (se gröna rektanglar). Tom PCR-reaktionen utan cDNA visar ingen PCR-amplifiering (se väl 2). 20 nt storlek stegen kan verifiering av produktstorlekar (se väl 1). (D) Gel bilden på en blå ljus transilluminator 2,5% Agarens gel som innehåller de poolade PCR-reaktionerna sprang i två intilliggande brunnar. Som påpekat, högsta bandet i båda brunnarna ligger inom beräknade bibliotek storlek och adapter dimer bandet ligger nedanför. De övre PCR-banden var censurerade och renas med en gel extraction kit. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: utvärdering av renat PCR amplifieras DNA bibliotek. En liten alikvot (1 µL) av PCR-förstärkta cDNA biblioteket analyseras med en högkänslig DNA chip på en mikrofluidik-baserad plattform. (A) denna panel visar migration av storlek markörer för kalibrering av instrument. (B) denna panel visar migration av renat PCR förstärkta cDNA biblioteket. Den högsta toppen mäts vid en storlek på 100 bp (se asterisk) och representerar cDNA biblioteket. Den lilla toppen utvärderas vid 72 bp av instrumentet representerar de primer adapter dimerer. 100 bp toppen upptäckt av mikrofluidik baserat plattform avslöjar den uppskattade storleken för förstärkt cDNA-bibliotek, som innehåller 18 enskilda barcoded RNA-prover för efterföljande NGS på en hög genomströmning sekvensering system. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: cDNA bibliotek förberedelse och nästa generations sekvensering med matchade färska frysta och formalin-fast paraffin inbäddade exemplar. (A) Total-RNA extraherade från matchade färsk fryst och FFPE invasiv duktal cancer (IDC) tumörer analyserades på ett totalt RNA chip på en mikrofluidik baserat plattform. (B) Total-RNA från matchade fresh frysta och FFPE exemplar (IBC 1 och IBC2) genomgick protokollet cDNA bibliotek förberedelse och miRNA sekvensering data var ritade. (C) DifferentialmiRNA uttryck mellan IBC1/IBC2 exemplar och korrelation mellan fryst och FFPE Parade prover. miRNA uttryck visas i loggen antal per miljon (CPM), från hög till låg läsningar (röd till blå färg). Betydelsen av uttrycket skillnaden mellan de två vävnad par, per miRNA, visas som grå cirklar, med höga och låga uttryck MicroRNA identifierats i färska och FFPE prover. (D) Total-RNA extraherade från matchade friska och FFPE RNA exemplar av cell linjer (MCF10A och MCF7), mänskliga invasiv bröstcancer cancer (IBC 1 och IBC2), livmoderhalscancer bröstvävnad (Cx), arkiverade normal bröstvävnad (normal Br1, normala Br2 och normala Br 3), och arkiverade invasiv bröstcancer (IBC 5, IBC 6 och IBC7) genomgick cDNA bibliotek beredning inom samma körning. NGS data av den MicroRNA detekteras i biblioteken visas i en intensitetskarta konfiguration. Denna siffra har ändrats från Loudig et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: cDNA bibliotek förberedelse och miRNA uttryck korrelation mellan replikat med äldre arkiverade FFPE exemplar. Total RNA från 18, 20, 22, 27, 30 och 35 år gamla arkiverade FFPE bröst vävnadsprover genomgick vår optimerade cDNA bibliotek förberedelse protokoll. Replikera RNA-prover från 9 olika FFPE-prov var sammanskrivna med olika 3' barcoded oligonukleotider och analyseras inom samma bibliotek vecka 1 (w1). Samma experiment upprepades inom ett intervall på en vecka (vecka 2 eller w2). Reproducerbarhet åtgärder av duplicerade miRNA uttrycket data mellan samma arkiverade RNA exemplaren visas i heatmaps och med korrelationskoefficienterna utvärderas mellan 0,93 och 0,99. Denna siffra har ändrats från Loudig et al. 20 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett mycket reproducerbara och robust cDNA bibliotek förberedelse protokoll för NGS av små RNAs arkiveras i FFPE RNA exemplar presenteras i detta protokoll, som är en modifierad och optimerad version av det förfarande som beskrivs av Hafner o.a. 22

Alla steg i detta protokoll har optimerats för användning med äldre arkiverade och komprometterad total-RNA återhämtat sig från FFPE exemplar. Det viktigaste steget i detta protokoll, för bearbetning av små mängder av FFPE RNA, bosatt i sammanslagningen av alla RNA-prover (dvs, 18 enskilda 100 ng FFPE RNA prov) efter enskilda nering med 18 unika 3' barcoded adaptrar. Detta kritiska steg möjliggör de 18 FFPE RNA-proverna jämnt genomgå alla efterföljande biokemiska och enzymatiska steg som krävs för beredning av små RNA cDNA biblioteket. Dessutom detta steg maximerar mängden RNA som genomgår nederbörd och gel reningar genom att förbättra carrier effekten av de små RNA-molekylerna och genom att underlätta pellet observation och gel val. En annan viktig funktion av detta protokoll, som ytterligare belyser dess mångsidighet när du arbetar med små mängder av FFPE RNA, är att en pilot PCR-reaktion används för att identifiera optimal förstärkning cykeln av cDNA biblioteket. Detta steg ger också insikter i dynamiken i biblioteket förstärkning kontra primer dimer förstärkning, vilket är kritiskt när förbereder storskaliga PCR-reaktionen och renande små RNA biblioteket på Agarens gel. Uppgifterna till detta protokoll visar reproducerbarheten för detta tillvägagångssätt mellan matchade frysta och FFPE exemplar, och även markera dess tillämplighet på äldre FFPE RNA prover från exemplar arkiveras för upp till 35 år.

Detta protokoll ändrades från dess ursprungliga version, så den är optimerad för beredning av små RNA bibliotek gjorda av lägre kvalitet och kvantitet av kemiskt modifierade och komprometterad FFPE RNA. En aspekt av detta förfarande som ändrades för att framgångsrikt ligera och förstärka små RNAs från FFPE exemplar avser mängden kalibrator cocktail spetsade under den inledande 3' barcoded adapter ligering, som reducerades input till 0,026 nM att förhindra konkurrens med ligering av låg abundancy små RNAs presenterar i FFPE RNA-prover. En annan viktig ändring det ursprungliga förfarandet var avlägsnande av alla radioaktivt märkta storlek-markörer som används vid urval av ligated små RNASEN på sidan gelerna. Användning av dessa radiomärkt storlek-markörer begränsas inte bara tillämpligheten av detta tillvägagångssätt till laboratorier certifierade för användning av radioaktiva isotoper men också förhindrade observation av RNA produkter på gelerna. Istället i detta optimerade protokoll, är storlek markörer kör i anslutning till biblioteket, på sidan gel, brunnar och visualiseras direkt med ett fluorescerande färgämne direkt excision av ligated små RNASEN. Ännu viktigare, den fluorescerande färgen lätt sprayas på gelen att förhindra spridningen av de RNA-produkterna och sedan visualiseras på en blå ruta. Därefter, som en försiktighetsåtgärd och att förbättra spridningen av ligated små RNASEN i exciderad sida gel fragment, används gel-breaker rör enhetligt krossa gelen före inkubering i en NaCl-lösning över natten vid 4 ° C under agitation. Alla dessa steg utvärderades noggrant för att arbeta med mindre mängder material.

Detta protokoll tillämpades FFPE RNA-prover från olika källor (organ och institutioner) som hade lagrats för olika mängder av tid. Analyserna visade hög reproducerbarhet sekvensering små RNAs från färska och frysta prover, när använder detta optimerade tillvägagångssätt. Ytterligare analyser med hjälp av äldre arkiverade FFPE exemplar, lagras i upp till 35 år, visade ytterligare protokollets stor tillämplighet på kliniska prover. FFPE RNA ingående minimikravet för FFPE prover visade sig vara 100 ng. Detta låga krav tillåter tillämpligheten av detta protokoll till en mängd olika lesioner i olika storlekar och tillgänglighet, men den skulle inte tillåta analys av enstaka cell FFPE RNA. Det är viktigt att notera, dock, att detta optimerade protokoll har också använts med total-RNA extraherade från cirkulerande exosomes med ingångar på mindre än 1 ng och visat sig ge mycket reproducerbara små RNA uttrycket profiler (inga data anges). Här låg input antyder att små RNAs i FFPE-prov, även om det är representativt för den ursprungliga färsk vävnaden, är närvarande i mycket lägre proportioner än i total-RNA från cirkulerande exosomes.

I senaste arbete, där var optimerad protokollet tillämpas kliniskt sekretessbelagda DCIS FFPE exemplar, konstaterades det att miRNA uttryck skillnader identifieras av NGS av cDNA biblioteket kunde verifieras med kvantitativ PCR. Detta arbete visade möjligheten att använda DCIS lesioner från arkiverade vävnader från olika institutioner för storskaliga retrospektiva studier [20]. Denna studie belyste också robustheten av cDNA bibliotek preparatet när det utförs vid olika tidpunkter (mellanrum av flera veckor), utan att äventyra reproducerbarhet och känslighet för analys.

Med tanke på den stora mängden kliniskt sekretessbelagda arkiverade FFPE exemplar ger detta optimerade protokoll ett robust verktyg för beredning av cDNA bibliotek i storskaliga retrospektiva analyser och för potentiella identifiering av miRNA biomarkörer i samband med cancer utveckling21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna vill avslöja att en publikation som innehåller vissa av de uppgifter som presenteras i detta manuskript publicerades i International Journal of Molecular Sciences av Loudig et al. 21.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. Thomas Tuschl, chef för laboratoriet för RNA molekylärbiologi, samt medlemmar i hans laboratorium för deras stöd och för att dela den teknik som utvecklats i hans laboratorium och ger tillgång till rörledningen RNAworld. Vi tackar också Dr. Markus Hafner för att dela hans protokoll och ge detaljerade beskrivningar på alla biokemiska och enzymatiska steg som används i hans ursprungliga förfarandet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Triton x-100 Invitrogen HFH10
10mM ATP Ambion AM8110G
10X dNTPs Ambion AM8110G
10x TBE Thermofisher Scientific 15581044
14M Mercaptoethanol Sigma O3445I-100
20 nt ladder Jena Bioscience M-232S
20mg/ml Bovine Serum Albumine Sigma B8894-5ML
50X Titanium Taq Clontech Laboratories 639208
Ammonium Persulfate Fisher Scientific 7727-54-0
BRL Vertical Gel Electrophoresis System with glass plates and combs GIBCO V16
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D9170-5VL
Eppendorf microcentrifuge 5424R USA scientific 4054-4537Q
Eppndorf Thermomixer USA scientific 4053-8223Q
Fisherbrand™ Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5ml Fisher Scientific 02-681-320
Gel Breaker Tube 0.5 ml IST Engineering Inc, 3388-100
Gel electrophoresis apparatus 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT with gel trays and combs Biorad 1704446
Glycoblue Ambion AM9516
Jersey-Cote LabScientific, Inc 1188
KcL 2M Ambion AM9640G
MgCl2 1M Ambion AM9530G
Minifuge dual rotor personal centrifuge USA scientific 2641-0016
Model V16 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus, glasses, combs, and spacers Ciore Life Science 21070010
Oligonucleotides IDT Defined during order
Owl EasyCast B2 mini electrophoresis system- with gel trays and combs Thermofisher Scientific B2
Qiaquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Restriction enzyme PmeI NEB R0560S
RNase-free water Ambion AM9932
Safe Imager 2.0 Life Technologies G6600
Safe Imager 2.0 blue light transilluminator Thermofisher G6600
SeaKem LE agarose Lonza 50002
Superscript III reverse transcription kit Invitrogen 18080-044
SybrGold Life Technologies S11494
T4 RNA Ligase 1 NEB M0204S
T4 RNA Ligase 2 Truncated K227Q NEB 0351L
TEMED Fisher Scientific O3446I-100
Themocycler with heated lid Applied Biosystem 4359659
Tris 1M pH 7.5 Invitrogen 15567027
Tris 1M pH8.0 Ambion AM9855G
UltraPure Sequagel system concentrate, diluent, and buffer National Diagnostics EC-833

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality. Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).
  3. Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients. PLoS One. 10, (6), e0129338 (2015).
  4. Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity. J. Pathol. 226, 108-119 (2012).
  5. Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues. Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).
  6. Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples. J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).
  7. Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues. PLoS One. 8, e52517 (2013).
  8. Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues. PLoS One. 8, (5), e64393 (2013).
  9. Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).
  10. Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls. J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).
  11. Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR. J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).
  12. Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays. BMC Genomics. 12, 144 (2011).
  13. Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples. Methods. 50, (4), S6-S9 (2010).
  14. Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance. Genomics. 102, 8-14 (2013).
  15. Visone, R., Croce, C. M. MiRNAs and cancer. Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).
  16. Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435, 834-838 (2005).
  17. Cho, W. C. MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).
  18. Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies. BMC Cancer. 11, 500 (2011).
  19. Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies. Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).
  20. Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens. Int J Mol Sci. 18, e627 (2017).
  21. Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens. PLoS One. 7, (4), e34683 (2012).
  22. Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing. Methods. 58, (2), 164-170 (2012).
  23. Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma. Hum. Pathol. 42, (12), 1911-1922 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics