成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

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Bioengineering

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Summary

このプロトコルは、CD133 を変更する安全で効率的な手順を示しています+造血幹細胞。提示された非ウイルス性、磁気 polyplex ベースのアプローチ治療幹細胞効果だけでなく磁気共鳴イメージ投射を介して投与細胞製品を監視の最適化のための基礎があります。

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Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

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Abstract

一方、CD133+造血幹細胞 (SCs) は、再生医療の分野で高い可能性を提供するために証明されている、負傷者の組織として観察された大規模な細胞の死亡率への注入後、低定着率が非常につながる制限された治療効果。これらの制限を克服するために我々 は、投与前に適切な細胞工学のための非ウイルス性ベースのプロトコルを確立しようと思う。人間の CD133 の変更+吸収効率と安全性、細胞のターゲットの可能性に関して対処されたマイクロ Rna (ミール) 読み込まれた磁気 polyplexes を利用した SCs を表現します。我々 のプロトコルに依存している、CD133 80-90% の高いミール取り込み率を達成できる+幹細胞特性に影響はありません。さらに、これらの変更されたセルは、磁気ターゲットのオプションを提供しています。我々 は CD133 の修正のため安全かつ非常に効率的な手順をここに記述する+ SCs。幹細胞の治療効果の最適化および磁気共鳴画像 (MRI) を介して投与細胞製品のモニターの標準技術を提供するためにこのアプローチを見込んでいます。

Introduction

CD133+ SCs は再生医療の可能性を有望な異種幹・前駆細胞の人口を表します。CD133 を有効に、造血、血管内皮、筋分化ポテンシャル1,2,3 +の細胞、例えば、差別化による血管新生のプロセスに貢献するには新しく成形容器とプロ新生パラクライン機構4,5,6,7シグナル伝達の活性化。

以上 30 承認された臨床試験 (ClinicalTrails.gov) に示す彼らの高可能性にもかかわらずその治療成績は物議を醸す議論4中です。確かに、SCs の臨床応用は、関心と大規模な初期細胞死5,8,9器官の低保持によって妨げられています。CD133 のエンジニア リング追加+ SCs 事前移植は、これらの課題を克服を助けることができます。

効率的な細胞療法のための 1 つの前提条件を治療関連細胞10の生着を強化する大規模な初期細胞死の減少となります。現在研究が最初 1-2 h、移植細胞型の独立の間に高い脳や心臓など臓器の 90-99% の巨大なセル損失を実証またはアプリケーション ルート11,12,13 14,15,16,17,18,19,20,21。関心22,23,24,25,26 のサイトに標的細胞に革新的な非侵襲的戦略により、SC は、磁性ナノ粒子 (MNPs) を使用したラベリングと同時に携帯の MRI27と磁性粒子 (MPI) をイメージングを使用して監視できます。生体内で最も効率的な静脈注射23,24,28 後セル指導に優先してローカル投与後に使用されるセルの保持を対象と適用の磁化細胞を研究します。.したがって、私たちのグループには、超常磁性酸化鉄ナノ粒子の29から成る配信システムが設計されています。この手法では、CD133 で+ SCs とひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) をターゲット効率的に、体外30,31の試みによって示されるように。

SC 療法のもう一つのハードルは、影響を受ける組織の敵対的な炎症性環境を初期細胞死32に貢献、移植後です。いくつかの前処理研究に加えて治療関連 miRs のアプリケーションはテスト33;抗アポトーシス miRs体外アポトーシスを阻害させ、体内細胞の生着33正常に実証されています。20-25 のヌクレオチドの構成これらの小さい分子はメッセンジャー Rna (Mrna) の転写調節因子として重要な役割を果たすし、幹細胞の運命や行動34影響を及ぼします。また、miRs の外因性の導入は望ましくない安定したホストのゲノム34統合を避けてください。

プライマリ SCs に核酸 (NAs) の効率的な導入のため現在試行は組換えウイルス8,35に大抵基づいています。にもかかわらず高いトランスフェクション効率組換えウイルス操作提示ベンチ-ベッドサイド翻訳、例えば、手に負えない遺伝子発現、病原性、免疫原性、および挿入変異35 の主要な障害 ,36。したがって、ポリマー ベースの構成などの非ウイルスの伝達システムの開発にとって重要です。中でもポリエチレンイミン (PEI) は、miRs 細胞取り込みの劣化から保護するために NA 結露などのメリットを提供する有効な配信手段を表し、エンドソームを介して細胞内放出脱出37,38。さらに、ミール PEI 錯体は、臨床試験第39高い生体親和性を示した。したがって、当社の配信システムから成って、ビオチン標識ストレプトアビジン コーティング MNP コア30,31,40行きの分岐 25 kDa プリンスエド ワード島。

本稿では, (i) CD133 の手動分離を記述する包括的なプロトコルを提案する+ SC SC 製品および (ii) の効率的かつ穏やかなトランスフェクション戦略の詳細な特性解析とひと骨髄 (BM) 寄付金から、CD133 の遺伝子工学のための磁気的非ウイルス性ポリマー ベース配信システム+ SCs miRs を使用します。CD133+ SCs 隔離され、人間胸骨 BM 吸引、表面抗体を用いた磁気活性化細胞選別 (MAC) システムを使用して磁気濃縮しました。その後、細胞と細胞の純度によっては、フローサイトメトリー分析されます。ミール/プリンスエド ワード島/MNP 錯体の調製後、CD133+ SCs が transfected。トランスフェクション後 18 h、吸収効率とトランスフェクション SC マーカーの発現と細胞の生存率に与える影響を分析します。また、トランスフェクションの複雑な化合物の細胞内の分布の評価は、4 色ラベルと構造化照明顕微鏡を用いて (SIM) を使用して実行されます。

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Protocol

細胞分離のための胸骨の人間 BM は、ヘルシンキ宣言によると研究のためにサンプルを使用する彼らの書面による同意を与えたインフォームド ドナーから得られました。ロストック大学の倫理委員会は、研究から開発された (登録第 A 2010 23 2015 年に延長) を承認しました。

1. セル準備

注: は、BM の検査のための血液凝固を防ぐためにヘパリン ナトリウム (250 IU/mL BM) を使用します。

  1. CD133+ SC 分離
    1. 必要な溶液の調製
      1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の準備/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 貯蔵液 (2 mM) 4 ml の EDTA (0.5 M) の 996 の mL の 1x PBS を混合することによって。積極的にソリューションをミックスし、0.45 μ m フィルターでろ過します。常温 (RT) を格納します。
      2. ウシ血清アルブミン (BSA) の 5 g で 2 mM PBS/EDTA の 995 mL を混合することによって MAC バッファーを準備します。積極的にソリューションをミックスし、0.45 μ m フィルターでろ過します。4 ° C でのストア
      3. コラゲナーゼ B 原液 (40 mg/mL) を準備するには、12.5 mL の PBS のコラゲナーゼ (クロストリジウム histolyticum) から B の 500 mg を希釈します。積極的にソリューションをミックス 350 μ L の因数を作る、-20 ° C で保存
      4. デオキシリボヌクレアーゼ (DNAse) DNase の 100 mg を希釈してソリューション (10 mg/mL) を在庫を準備 10 mL の PBS で私 (ウシ膵臓) から。積極的にソリューションをミックス 350 μ L の因数を作る、-20 ° C で保存
    2. 人間 BM の酵素の消化力
      1. 事前 RT に人間のリンパ球の中を温めるし、酵素 (1 因数各コラゲナーゼ B と DNAse の 20 mL BM あたり) を解凍します。
      2. 50 mL コニカル チューブに注射器から BM を収集、軽く混ぜます。任意の既存の血栓を破棄します。
        メモ: は、後続フローサイトメトリーによる解析を 1.5 mL チューブに原液の BM を 200 μ l 添加を転送します。使用するまで 4 ° C で保存します。
      3. 新しい 50 mL の円錐管に 10 mL の BM を転送、DNAse の PBS/EDTA (2 mM)、20 mL、ヒトリンパ球中コラゲナーゼ B (40 mg/mL) の 175 μ L 175 μ L の 6 mL を追加私 (10 mg/mL)。優しくソリューションをミックスし、シェーカーで室温で 30 分間インキュベートします。残りの BM サンプルに対して繰り返します。
    3. 密度勾配遠心法
      1. 50 mL のチューブに培地を分割する人間のリンパ球の 15 mL を用いて 50 mL の密度勾配の遠心分離の管を首相します。1,000 × gで遠心する 30 秒。
      2. 慎重に層の密度勾配遠心チューブ フィルターと室温 35 分 445 × gで遠心分離機の上に希釈した BM の 35 mL
        注: 遠心設定は、低加速度 (3) とないブレーキ (1)。
      3. 遠心分離機から振ることがなくチューブを慎重に取り外します。慎重にフィルターの上に直接曇りの層に触れることがなく上部の透明な溶液から ~ 20 mL を破棄します。
      4. 慎重に新しい 50 mL の円錐管に曇り層 (これは、フィルターの上に直接と単核細胞 (多国籍企業) が含まれています) を転送し、50 mL の最終巻に PBS/EDTA でいっぱい。
        注: は、1 つの新しいチューブに BM 患者サンプルを 1 つからすべての多国籍企業を組み込みます。
      5. 1.5 mL チューブに 50 mL の細胞懸濁液の 10 μ L を転送することによって多国籍企業をカウントします。3% 酢酸へのメチレン ブルーの 10 μ L を追加します。優しくミックスし、カウント室に 10 μ L を適用します。多国籍企業の数を計算します。
      6. 10 分間遠心する 300 x gで多国籍企業のサスペンションは、上澄みを廃棄します。
        注: 遠心分離中に 4 ° C に RT から遠心分離機を冷やす
    4. CD133 の磁気選択+ SCs 人間 CD133 抗体リンク超常磁性鉄デキストラン粒子を用いた
      注: この手順では、氷の上動作します。4 ° C での使用までのストア ソリューションMAC 永久磁石、分離カラム、および事前色分解フィルター 4 ° C で保存します。
      1. 列のサイズを選択します。< 1.2 多国籍企業8 10、使用 MS 列 x > 108 MNCs x 1.2 使用 LS 列 (テーブルの材料を参照してください)。
      2. 磁気選択 1 x 10 の8細胞数のための準備として、慎重に 300 μ L MAC バッファー (4 ° C) の多国籍企業を再懸濁します。100 μ L FcR ブロッキング試薬 (4 ° C) および 100 μ L CD133 抗体リンク超常磁性鉄デキストラン粒子 (4 ° C) を追加します。
      3. 優しく細胞懸濁液を混合し、4 ° C で 30 分間インキュベート潜伏 (2-3 x) の間に細胞懸濁液を軽く振る。
      4. 1 x 108合計 MNCs。 優しくミックスは、細胞懸濁液と 300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心するあたり 2 mL の MAC バッファー (4 ° C) を追加します。
      5. MAC のマグネット ホルダーを設定、MAC の永久磁石を取り付けます。MAC 列をインストールし、上事前色分解フィルターを適用します。
      6. 最初の MAC MS/LS 列と事前色分解フィルター 0.5 ml (MS) または 3 mL (LS) の MAC バッファー (4 ° C) を平衡します。
        注: は、平衡の後乾燥する MAC 列を許可しないでください。
      7. 上澄みを廃棄し、1 × 108総細胞量あたり 500 μ L の MAC バッファー (4 ° C) で得られたペレットを再懸濁します。プレ分離フィルターに細胞懸濁液を適用します。
      8. 3 mL (LS) MAC のバッファー (4 ° C) または 3 回を使用して、各洗浄のため 0.5 mL (MS) MAC 列と事前色分解フィルターを洗います。
        注: 3 番目の洗濯手順の中には、MAC の永久磁石に MAC 2 列目をインストールし、0.5 mL (MS) または 3 mL (LS) MAC バッファー (4 ° C) と 2 番目の MAC MS/LS コラムを平衡させ。
      9. プレ分離フィルターを破棄します。
      10. 2 列目の MAC に直接細胞画分の溶出: 1 mL (MS) または最初の MAC 列に 5 mL (LS) MAC バッファー (4 ° C) を追加し、MAC の永久磁石から MAC の列を削除します。すぐに上記の MAC 2 列目最初の MAC 列を転送し、指定されたプランジャーを使用して MAC コラムを通して細胞懸濁液をプッシュします。
      11. 洗うたび 0.5 mL (MS) を用いた 3 回 MAC コラムを洗浄または 3 mL (LS) MAC バッファー (4 ° C)。
      12. 1 mL (MS) または MAC 2 列目に 5 mL (LS) MAC バッファー (4 ° C) を追加し MAC 永久磁石から MAC 列を削除する列からセル画分を溶出します。すぐに 1.5 mL チューブ (MS) または 15 mL コニカル チューブ (LS) の上 2 番目の MAC 列を転送し、指定されたプランジャーを使用して MAC コラムを通して細胞懸濁液をプッシュします。
      13. 300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心慎重に上澄みを廃棄し、MAC バッファー (4 ° C) の 100 μ L で得られたペレットを再懸濁します。
      14. カウント、CD133+細胞: 1.5 mL チューブに細胞懸濁液の転送 6 μ L。6 μ L トリパン ブルー溶液 (0.4%) を追加します。優しくミックスし、カウント室に 10 μ L を適用します。CD133 の数を計算+細胞。
      15. CD133 を保存+細胞播種までの氷の上。
  2. 新鮮単離 CD133 の特性+ SCs
    注: 次の仕事が (薄暗い照明だけ) 明るい光から保護部屋で実施している必要があります。特に明記しない限り、チューブ、バッファー、および氷の上抗体を維持します。
    1. フローサイトメトリーによる解析のための SCs の準備
      1. 2 つのサンプル (各 10 μ L) の BM 因数と新鮮単離 CD133 の 1 つのサンプルを使用して、+ SCs (最小、1 x 10 の4セル) 分析のため。1.5 mL チューブにセルを転送します。FcR のブロッキング試薬を 10 μ l 添加し、33 μ L のボリュームに MAC バッファー (4 ° C) でいっぱいに。
      2. それぞれの内側に次の抗体を追加 (表 1参照) をチューブ: 抗 CD34 かに (FITC) (クローン: AC136)、反-CD133/2-フィコエ リスリン (PE) (クローン: 293 3)、アイソタイプ コントロール マウス IgG 2b-PE、アンチ-CD45-アロフィコシアニン(APC)-H7 (クローン: 2 D 1)、および 7-aminoactinomycin (AAD)。全ての抗体を追加すると、ダウン チューブの抗体側横に振る。優しくソリューション (最終巻 50 μ L) を混合し、4 ° C で 10 分間インキュベート
      3. 1 x 赤血球 (RBC) 換散バッファーの 1 つの mL を追加、穏やかに、懸濁液をミックスし、氷上 4 ° C で 10 分間遠心懸濁液 300 x gで 10 分間加温
      4. 上澄みを廃棄し、100 μ L の PBS (4 ° C) で得られたペレットを再懸濁します。フローサイトメトリーによる解析まで氷の上保存します。
    2. CD133 フローサイトメトリー解析+ SCs
      1. 細胞生存率及び CD133 の純度を調べる+ SC、Hematotherapy 適応国際社会と移植工学 (ISHAGE) 流れ cytometry ゲーティング戦略41 (図 1に代表的な描写を参照) を使用します。次の順序を使用します。
        ステップ 1: 選択セルの人口 (図 1 a) の
        ステップ 2: 選択 CD45 の細胞 (図 1 b) の+
        手順 3: 選択可能な CD45 の細胞 (図 1) の+
        ステップ 4: 選択可能な CD45 の+/CD34+細胞 (図 1)
        ステップ 5: 選択可能な CD45 の+/CD34+/CD133+細胞 (図 1E)
        流れの cytometer を実行 (材料表参照) 製造元の指示に従って。
      2. 細胞生存率及び純度次の方程式を使用して計算します。

Equation 1   式 1

Equation 2   方程式 2

  1. 新鮮単離 CD133 の培養+ SCs
    1. 遺伝子組換えヒト サイトカイン x 分注 100 100 μ 因数で補完し、-20 ° C で保存培地の準備する前に 1 つの雪解け 100 x 因数。
    2. 準備、CD133+ SC 培、組換えヒト サイトカイン サプリメント (最終 1 x) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン無血清造血細胞拡張培。
    3. シード 5 x 10 の4たて CD133 を分離+ SCs 500 μ L の培養液中で 24 ウェル プレートでの transfection のため。37 ° C、5% CO2と 20% O2セルを孵化させなさい。
      メモ: シード 5 x 10 の4たて分離 CD133+ SCs フローサイトメトリーによる解析のコントロールとして。

2. トランスフェクション錯体の合成

注: この手順では、全体の仕事スペース リボヌクレアーゼ (RNAse) を維持-無料の RNAse 除染液を使用して、RNAse フリーの消耗材のみを使用します。

  1. ミールの準備
    注: 次の仕事が (薄暗い照明だけ) 明るい光から保護部屋で実施している必要があります。
    注: ミール標本の: 3 部シアニン色素標識前駆体ミールとラベル前駆体ミール。
    1. ミール原液 (50 μ M) の準備、ヌクレアーゼ フリー水 (例えば、100 μ L の水でミールの希釈 5 nmol) の適切なボリュームでミールの所望量を希釈します。優しくミール株式 (5 μ L)、ソリューション、因数をミックスし、-20 ° C 以下ストア
  2. PEI の準備
    1. 次の標準のプロトコルとメモ、PEI ストック濃度31,42 PEI を準備します。
  3. MNP の準備
    1. 次の標準的なプロトコル MNPs を準備し、MNP ストック濃度31,42に注意してください。
  4. ミール/プリンスエド ワード島の複合体の作製
    1. D-(+) 希釈して 5% ブドウ糖溶液を準備-ヌクレアーゼ フリー水にブドウ糖。優しく株式 (1.5 mL)、ソリューション、因数をミックスし、4 ° C で保存
      注: 次の仕事が (薄暗い照明だけ) 明るい光から保護部屋で実施している必要があります。
    2. 3024 ウェル プレートのウェルあたり 20 pmol ミールを使用します。ミールを最終濃度 0.25 pmol ミール/μ L の 5% ブドウ糖溶液で希釈します。
    3. プリンスエド ワード島ストック濃度に基づく (N/P) 比ミール量 (20 pmol, ステップ 2.3.1) と (ミール) のリン酸 (PEI) の最適窒素に基づいて必要な PEI の量計算 (2.2.1; ステップ比 7.5 がここでは、使用された)30。方程式に基づく 5% ブドウ糖溶液の同量の PEI を希釈するには。
      Equation 3
      再配置します。
      Equation 4    式 3
      PEI ボリュームが μ L と [ペイ] は mM で、N ・ P (このプロトコル用に最適化) は 0.75。0.12 はミールに固有の変換係数です。
    4. 希釈ミールと 30 の渦に希釈の PEI を追加 s。
    5. 室温 30 分間複雑なミール/PEI を孵化させなさい
  5. ミール/プリンスエド ワード島/MNP 錯体の合成
    注: 次の仕事が (薄暗い照明だけ) 明るい光から保護部屋で実施している必要があります。
    1. 抱卵中のミール/PEI 錯体準備、MNPs sonicating 懸濁液中の粒子を確実にする RT で sonicating 湯せんで 35 kHz で 20 分間 MNPs とない集計します。
    2. MNP 原液 (ステップ 2.3.1) に基づいて必要な MNPs (3 μ g 鉄/mL) の数を計算します。
    3. 熱量 MNPs ミール/PEI 錯体と渦に 30 s. 加温のため 30 分のミール/プリンスエド ワード島/MNP 錯体に追加 RT。
  6. トランスフェクション錯体の調製 4 色 SIM を使用したラベリング
    注: ラベル前駆体ミールを使用します。
    1. シアニン 5 5 シアニン色素ミール ラベリング キット (材料の表を参照) を使用する染料とミールのラベル メーカーの指示に従います。記載されている分光光度計を使用して最終的なミール濃度の測定 (材料の表を参照してください) (核酸 RNA 40) の製造元によって提供される事前設定に従って。因数ミール (5 μ L) とストア-80 ° C で光から保護します。
    2. 適切なタンパク質ラベリング キット (材料の表を参照) を使用して明るい緑色蛍光色素と PEI のラベル メーカーの指示に従います。ニンヒドリン試金 (ステップ 2.2.1) を使用して最終的な PEI 濃度を定義します。ペイの約数 (ボリュームの計算に基づいて式 3) し、光から保護 4 ° C で保存します。
    3. ローダミン色素縮尺 w/w 比率を使用してビオチンに活用、MNPs のラベル、MNP する染料します。ミール/PEI の複合体形成の準備と並行してローダミン色素と MNPs をミックスし、暗闇の中で 30 分のためのソリューションを孵化させなさい。ラベル付き MNPs を直接使用します。

3. CD133 のトランスフェクション+ SCs

注: この手順では、全体の仕事スペース リボヌクレアーゼ (RNAse) を維持-無料の RNAse 除染液を使用して、RNAse フリーの消耗材のみを使用
注: 次の仕事が (薄暗い照明だけ) 明るい光から保護部屋で実施している必要があります。

  1. 新鮮単離の CD133 を含む適切な井戸に直接滴下準備の miRNA/プリンスエド ワード島/MNP コンプレックスを追加+培地の SCs。
  2. ロッキング プレートを前後で軽く混ぜます。37 ° C、5% CO2および 20% O2で 18 時間のセルを孵化させなさい。

4. ミール トランスフェクションの解析

  1. ミール吸収効率とトランスフェクション錯体の毒性試験
    注: ミール標本のため: シアニン 3 染料前駆体吸収評価と非導入の CD133 のミールをラベルを使用して+ SCs の流れ cytometry コントロール ゲート。
    注: 次の仕事が (薄暗い照明だけ) 明るい光から保護部屋で実施している必要があります。
    注意: 注意管、バッファー、および氷の上抗体特に明記しない限り。
    1. 4 g PFA 100 mL PBS で希釈し、80 ° C に加熱してパラホルムアルデヒド (PFA, 4%) 原液を準備します。積極的にソリューションをミックスし、7.3 に pH 値を調整します。分注、PFA (1.5 mL) を在庫し、-20 ° C で保存
    2. トランスフェクション後 18 時間は、収集各ウェル別 1.5 mL のチューブします。それぞれよく一度 500 μ L の PBS を洗浄し、この細胞懸濁液を同じ管に転送します。
    3. 300 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上澄みを廃棄し、4 ° C MAC バッファーの 100 μ L で得られたペレットを再懸濁します。
    4. ライブとデッド細胞を区別、穏やかに、懸濁液をミックスし、4 ° C で 10 分間インキュベートするアミン反応性染料の 0.5 μ L を追加します。4 ° C で 10 分間 300 x gで 1 mL の PBS (4 ° C) および遠心分離機を追加します。
    5. 上澄みを廃棄、100 μ L の PBS で得られたペレットを再懸濁します、33 μ l 添加 PFA (4%)、およびフローサイトメトリー解析前の氷の上や 4 ° C で保存します。
    6. 図 2に代表的な描写によるとゲートの戦略を配置します。流れの cytometer でサンプルを実行 (材料表参照) 製造元の指示に従って。
  2. ミール transfected CD133 の特性+ SCs
    注: 使用ラベル前駆体ミールとして非 transfected CD133+ SCs の流れ cytometry コントロール ゲート。
    1. 収集別 1.5 mL チューブにもそれぞれ、4 ° C で 10 分間 300 × gで遠心分離
    2. 手順 1.2 ゲーティングの戦略を使用します。
  3. SIM によってトランスフェクション複合体の細胞内分布の検討
    1. 複合体の準備し、セクション 2 と 3 のセクションで説明したように、細胞を transfect します。
    2. 後 18 時間収集別 1.5 mL の各井戸管です。それぞれよく一度 500 μ L の PBS を洗うし、井戸のそれぞれの管に洗浄を転送します。300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心
    3. 上澄みを廃棄、PBS で 2% 牛胎児血清 (FBS) 1 mL で得られたペレットを再懸濁します、優しく、懸濁液を混ぜるし、4 ° C で 10 分間 300 × gで遠心
    4. 上澄みを廃棄、100 μ L の PBS で得られたペレットを再懸濁します、20 分の 33 μ PFA (4%) を追加します。
    5. 細胞懸濁液を滅菌ガラス coverslips と 300 x gで 4 ° C で 10 分間遠心を含む新しい 24 培養プレートに転送します。
    6. 上澄みを廃棄し、PBS を 500 μ l 添加します。優しくプレートを振るし、PBS を破棄します。
    7. 蛍光を保持し、少なくとも 1 時間常温乾燥水土台媒体を使用して顕微鏡のスライド準備 coverslips を配置します。
    8. 100 倍油浸対物レンズを使用して画像を取得します。SIM の設定: 405、488、561、633 nm レーザー ライン励起と 3 の角度、3 相、4、レーザー ラインごとのグリッドを平均で 16 ビットの深度と z スタック: 23 μ m-405、34 μ m-488, 42 μ m-561、51 μ m-633。

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Representative Results

提案するプロトコルは、手動分離とひと骨髄由来 CD133 の磁気濃縮について説明します+ SCs エンジニア リング戦略、体外細胞操作とのための非侵襲的技術としてその後ウイルス独立セルvivo監視ツール。

この 3 つのステップの分離技術は、密度勾配遠心法による事前消化胸骨 BM から多国籍企業の分離を許可しません。その後、CD133+細胞画分は適切な分離技術を使用して磁気濃縮することができます。これにより、CD133 の濃縮+ SCs 生存率とフローサイトメトリー (図 1) によって決定することができます 80% 以上の高純度。以下、要件に一致する SC 製品のみは、さらに実験に使用されました。

ここで説明したトランスフェクション法により、これらのミールの非常に効果的な導入は新鮮な人間 CD133 を分離+ SCs の実行可能な約 80% の吸収性細胞 (図 2)30。さらがない重要な毒性明らか 18 h コントロールに比べてトランスフェクション細胞 (図 2)30後。また、十分な配信とトランスフェクション複雑な化合物 (ミール、プリンスエド ワード島、および MNPs) の通常の流通は、SIM (図 3) を使用して細胞の細胞質内で観察できます。

Figure 1
図 1: 代表者ブール値 CD133 の戦略をゲート+ SC 評価します。(A ~ E)細胞生存率の厳密な評価との純度のための 5 ステップの選択戦略の描写は CD133 を分離した+ SC 適切な未処理の BM のサンプルを使用して (F) CD133 アイソタイプ コントロールだけでなく。(A) (B) CD45 の淘汰に続いて前方・側方散乱 (FSC/SSC) ドット プロットそのままセルの人口からの破片を除く+人口、(C) 実行可能な CD45 の細胞+セルの人口、(D)実行可能な二重肯定的な CD45+/CD34+細胞の人口と (E) 実行可能なトリプル正 CD45+/CD34+/CD133+セルの人口。オレンジ: CD45+/CD34+/CD133+セル各選択ステップ内でハイライト表示されます。凡例: APC Cy7: 抗 CD45、FITC: FSC、抗 CD34: 前方散乱チャネル、PE: アンチ CD133、SSC: 散布の側面チャネル、7 AAD: 7 aminoactinomycin。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 代表的な複雑なトランスフェクションの細胞毒性およびミール吸収効率の評価のための戦略をゲートします。(A, B) のゲーティング戦略 transfected CD133+ SCs 同様 (C, D) 非導入 CD133、+ SCs (A, C) の解析に Cyanine3 色素標識前駆体 miRNA 吸収効率 (赤: 実行可能な Cy3+細胞) と (BD) ライブとデッドの細胞を区別するアミン反応性色素による毒性トランスフェクション プロシージャのマーク (青: 死んだ細胞)。凡例: SSC: 散布の側面チャネル、細胞: 非 transfected CD133+ SCs、miRNA、プリンスエド ワード島、MNP: CD133+ SCs をトランスフェクトした Cy3 標識ミールこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 複雑なトランスフェクション細胞内可視化。CD133+ SCs ミール/プリンスエド ワード島/MNP 複雑なラベルの付いた 3色を導入させた (ミール: 20 pmol、PEI: N ・ P 比 7.5、MNP: 3 μ g/mL)。代表的な可視化は、構造化照明顕微鏡を用いてトランスフェクション後 18 h を行った。ミールは Cyanine5 色素 (赤) (緑) 明るい緑色蛍光染料でペイが付いていたし、MNPs ローダミン色素 (黄)、ビオチンに共役核を DAPI (青) と counterstained だった。スケール バー = 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

サンプル FCR ブロッキング試薬 [μ] MAC バッファー [μ] 抗体 [μ] 合計 [μ]
番号 試験片 セル [μ] CD133 PE アイソタイプ CD133 PE CD34 FITC CD45 APC Cy7 追加
1 BM 10 10 12.5 5 - 5 2.5 5 50
2 BM 10 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 x 10 の4) 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50

表 1: CD133 のピペッティング レイアウト+SCs

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Discussion

近年では、CD133+ SCs 有望な細胞集団として登場した SC 基づかせていた療法のいくつかによって証明されるようフェーズ I、II、および III の臨床43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54です。 ここでは、我々 は人間胸骨 BM から標準化されたマニュアル精製と流れフローサイトメトリー評価これらの細胞のための詳しいプロトコルを提示します。説明の MAC ベースの分離のプロシージャは、高純度、実行可能な造血 SC 分数を得るために穏やかな、高速、効率的な戦略を表します。セルの並べ替えに使用される co 注入した MAC マイクロ ビーズの急速な低下と組み合わせて良い互換性は、私たちグループ55,56以前に実証されています。

この分離のプロシージャは、ソースの材料として人間胸骨 BM を使用して開発された、ため、プロトコル現在非臨床研究における使用目的と造血の SCs の浄化ができます。場合 CD133+の Sc は他の組織 (例えば、腸骨稜から得られる BM) から分離、酵素組織消化と密度遠心分離などのプロトコルのいくつかの手順は、適応を必要があります。細胞治療用には、当社グループはさらに GMP 準拠のオンサイト製造手順を確立を使用して、臨床に代わって追加の要求を満たすために自動システムは、57を必要があります。

応用の前に SCs の工学は、SC 療法、低細胞の保持と大規模な細胞死などの特定の障害を克服する新たな戦略です。現在のプロトコル構成 MNPs とその効率的な導入、CD133 行き分岐のペイに基づくウイルス無料多機能トランスフェクション システムの生産のための指示+ SCs30。このシステムの適用により、遺伝的セルの修正、磁場制御細胞ガイダンス、および MRI または MPI30,31,40,42,58を介してトレースを非侵襲的な細胞,59,60

重要なは、説明のトランスフェクション条件は CD133 の一時的な遺伝子組み換えに最適化されている+ BM から派生した SCs30。以前の作品、このトランスフェクション システムも正常に適用されているプラスミド DNA の配信とミールの他の細胞のタイプの31,40,60。これらの実験は、トランスフェクション効率だけでなく、細胞毒性細胞型依存が実証しています。したがって、NAs、プリンスエド ワード島、および MNPs の最適組成はセル タイプごとに定義する必要があります。

により高効率、プリンスエド ワード島は61をエンジニア リング非ウイルス性遺伝子細胞の最も一般的に使用されるポリマーの 1 つです。しかし、プリンスエド ワード島の臨床応用61,62ではその一般毒性61,63のためこれまで非常に限られました。興味深いことに、私たちのグループは最近 MNPs PEI 毒性トランスフェクション システム31,60に含まれる場合を減らすことを示した。同時に活性酸素種 (ROS) の生産が原因による酸化鉄ナノ粒子の可能な毒性は用量依存性と MRI64,65 超常磁性ナノ粒子のいくつかの種類が認められて.ただし、システムの in vitroin vivoの毒性には注意が必要があります。

全体的に、プロトコルが複雑であり、非常に慎重に対処する必要がある多くの重要なステップを含みます。この目的のため、我々 はノートのプロトコル セクションでこれらの点を強調しています。特に、私たちは、完全に RNAse フリー環境および応用の蛍光染料を処理するときに任意の光暴露を避けることの重要性を指摘したいです。

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Disclosures

著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgments

この仕事は、連邦教育省とドイツ研究 (FKZ 0312138A、FKZ 316159)、EU 構造基金 (ESF/IVWM-B34-0030/10 と ESF/IVBM-B35-0010/12) と状態 Mecklenburg 西部の Pomerania、DFG (DA1296/2-1) に支えられ、ドイツ心臓財団 (F/01/12)、(VIP + 00240) BMBF と湿気がある財団。さらに、f. H. と午後は、FORUN プログラムのロストック大学医療センター (889001) でサポートされます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

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