Method Article

成人骨髄由来造血幹細胞が細胞工学磁気ターゲッティングと結合を有効にするにマイクロ Rna の転送のためのプロトコル

DOI:

10.3791/57474

⸱

June 18th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、CD133 を変更する安全で効率的な手順を示しています+造血幹細胞。提示された非ウイルス性、磁気 polyplex ベースのアプローチ治療幹細胞効果だけでなく磁気共鳴イメージ投射を介して投与細胞製品を監視の最適化のための基礎があります。

Abstract

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一方、CD133+造血幹細胞 (SCs) は、再生医療の分野で高い可能性を提供するために証明されている、負傷者の組織として観察された大規模な細胞の死亡率への注入後、低定着率が非常につながる制限された治療効果。これらの制限を克服するために我々 は、投与前に適切な細胞工学のための非ウイルス性ベースのプロトコルを確立しようと思う。人間の CD133 の変更+吸収効率と安全性、細胞のターゲットの可能性に関して対処されたマイクロ Rna (ミール) 読み込まれた磁気 polyplexes を利用した SCs を表現します。我々 のプロトコルに依存している、CD133 80-90% の高いミール取り込み率を達成できる+幹細胞特性に影響はありません。さらに、これらの変更されたセルは、磁気ターゲットのオプションを提供しています。我々 は CD133 の修正のため安全かつ非常に効率的な手順をここに記述する+ SCs。幹細胞の治療効果の最適化および磁気共鳴画像 (MRI) を介して投与細胞製品のモニターの標準技術を提供するためにこのアプローチを見込んでいます。

Introduction

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CD133+ SCs は再生医療の可能性を有望な異種幹・前駆細胞の人口を表します。CD133 を有効に、造血、血管内皮、筋分化ポテンシャル1,2,3 +の細胞、例えば、差別化による血管新生のプロセスに貢献するには新しく成形容器とプロ新生パラクライン機構4,5,6,7シグナル伝達の活性化。

以上 30 承認された臨床試験 (ClinicalTrails.gov) に示す彼らの高可能性にもかかわらずその治療成績は物議を醸す議論4中です。確かに、SCs の臨床応用は、関心と大規模な初期細胞死5,8,9器官の低保持によって妨げられています。CD133 の....

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Protocol

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細胞分離のための胸骨の人間 BM は、ヘルシンキ宣言によると研究のためにサンプルを使用する彼らの書面による同意を与えたインフォームド ドナーから得られました。ロストック大学の倫理委員会は、研究から開発された (登録第 A 2010 23 2015 年に延長) を承認しました。

1. セル準備

注: は、BM の検査のための血液凝固を防ぐためにヘパリン ナトリウム (250 IU/mL BM) を使用します。

  1. CD133+ SC 分離
    1. 必要な溶液の調製
      1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の準備/エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 貯蔵液 (2 mM) 4 ml の EDTA (0.5 M) の 996 の mL の 1x PBS を混合することによって。積極的にソリューションをミックスし、0.45 μ m フィルターでろ過します。常温 (RT) を格納します。
      2. ウシ血清アルブミン (BSA) の 5 g で 2 mM PBS/EDTA の 995 mL を混合することによって MAC バッファーを準備します。積極的にソリューションをミックスし、0.45 μ m フィルターでろ過します。4 ° C でのストア
      3. コラゲナーゼ B 原液 (40 mg/mL) を準備する....

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Results

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提案するプロトコルは、手動分離とひと骨髄由来 CD133 の磁気濃縮について説明します+ SCs エンジニア リング戦略、体外細胞操作とのための非侵襲的技術としてその後ウイルス独立セルvivo監視ツール。

この 3 つのステップの分離技術は、密度勾配遠心法による事前消化胸骨 BM から多国籍企業の分離を許可しません。その後、CD133+細胞画分は適切な分離技術を使用して磁気濃縮することができます。これにより、CD133 の濃縮+ SCs 生存率とフローサイトメトリー (図 1) によって決定することができます 80% 以上の高純度。以下、要件に一致する SC 製品のみは、さらに実験に使用されました。

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Discussion

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近年では、CD133+ SCs 有望な細胞集団として登場した SC 基づかせていた療法のいくつかによって証明されるようフェーズ I、II、および III の臨床43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,

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Disclosures

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著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

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この仕事は、連邦教育省とドイツ研究 (FKZ 0312138A、FKZ 316159)、EU 構造基金 (ESF/IVWM-B34-0030/10 と ESF/IVBM-B35-0010/12) と状態 Mecklenburg 西部の Pomerania、DFG (DA1296/2-1) に支えられ、ドイツ心臓財団 (F/01/12)、(VIP + 00240) BMBF と湿気がある財団。さらに、f. H. と午後は、FORUN プログラムのロストック大学医療センター (889001) でサポートされます。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
7-AADBD Biosciences559925
Acetic Acid with Methylene BlueStemcell Technologies70603%
anti-CD133/2-PE (クローン: 293C3)Miltenyi Biotec GmbH130-090-853
anti-CD34-FITC (クローン: AC136)Miltenyi Biotec GmbH130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1)BD Biosciences
560178ローダミン染料;Atto 565 色素をビオチンに結合ATTO-TEC GmbHAD 565-71
BD FACS LSRII フローサイトメーターBD Biosciences
BD FACSDiva ソフトウェア 6.1.2BD Biosciences
BSASigma-Aldrich GmbHA7906
CD133 抗体結合超常磁性鉄デキストラン粒子;CD133 MicroBead KitMiltenyi Biotec GmbH130-097-049
コラゲナーゼ BRoche Diagnostics GmbH11088831001
計数室Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 色素標識前駆体 miR;Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1AmbionAM17120
Cyanine 5 色素 miR ラベリングキット;Cy5色素 ラベル IT miRNA ラベリングキットMirus BioMIR 9650
DNAse IRoche Diagnostics GmbH10104159001(100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 共焦点顕微鏡Carl Zeiss Jena GmbH
FcR ブロッキング試薬、ヒトMiltenyi Biotec GmbH130-059-901
明るい緑色のタンパク質ラベリングキット;Oregon Green 488 Protein Labeling KitサーモフィッシャーサイエンティフィックO10241
水性封入剤;FluoroshieldSigma-Aldrich GmbHF6182
密度勾配遠心分離チューブ;ロイコセップ遠心分離管Greiner Bio-One89048-932
MACSマグネットホルダー;MACS MultiStandMiltenyi Biotec GmbH130-042-303
MACS事前分離フィルターMiltenyi Biotec GmbH130-041-40730 & micro;m
MACS分離カラム(MS / LS)Miltenyi Biotec GmbH130-042-201 / 130-042-401
MACS永久磁石;MACSセパレーターMiltenyi Biotec GmbH130-042-302
Millex-HV PVDFフィルタークSLHV013SL0.45 μm
マウスIgG 2b-PEMiltenyi Biotec GmbH130-092-215
アミン反応性色素;Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain KitサーモフィッシャーサイエンティフィックL10119
ヒトリンパ球分離培地;PancollPan Biotech GmbHP04-60500密度: 1.077 g/mL
PBSPan Biotech GmbHP04-53500CaおよびMg なし
PEISigma-Aldrich GmbH408727分岐; 25 kDa
ペニシリン/ストレプトマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック15140122100 U/mL, 100 μg/mL
PFAMerck Schuchardt OHG1040051000
非標識前駆体 miR;Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1AmbionAM17110
RBC Lysis buffereBioscience00-4333-57
RNAse 除染液;RNaseZapThermo Fisher ScientificAM9780
ヒトリンパ球培地;ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640ミディアムPan Biotech GmbHP04-16500
組換えヒトサイトカインサプリメント。StemSpan CC100Stemcell Technologies2690
無血清造血細胞増殖培地。StemSpan H3000Stemcell Technologies9800
Streptavidin MagneSphere 常磁性粒子Promega CorporationZ5481
Trypan Blue solutionSigma-Aldrich GmbHT81540.4 %
UltraPure EDTAThermo Fisher Scientific155750200.5 M; pH 8.0
ZEN2011ソフトウェアCarl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000分光光度計サーモフィッシャーサイエンティフィック
Sonorex RK 100 SH超音波水浴バンデリン電子超音波公称出力:80 W;超音波周波数:35 kHz
メル

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S.

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Hematopoietic Stem CellsMicroRNA TransferMagnetic TargetingCD133 Positive CellsBone Marrow IsolationFlow Cytometry AnalysisMagnetic Activated Cell SortingPolymer Nanoparticle TransfectionStructured Illumination MicroscopyCell Viability Assessment

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