Evaluering af rollen mitokondriel funktion i Cancer-relaterede træthed

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vores mål var at udvikle en praktisk protokol for at vurdere mitokondriel dysfunktion associeret med træthed hos cancerpatienter. Denne innovative protokol er optimeret til klinisk brug der involverer kun standard tapning og grundlæggende laboratorieprocedurer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feng, L. R., Nguyen, Q., Ross, A., Saligan, L. N. Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue. J. Vis. Exp. (135), e57736, doi:10.3791/57736 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Træthed er en fælles og invaliderende tilstand, der påvirker de fleste kræftpatienter. Til dato, test træthed forbliver dårligt karakteriseret med ingen diagnostiske til objektivt foranstaltning sværhedsgraden af denne tilstand. Her beskriver vi en optimeret metode til vurdering af mitokondrie funktion af PBMC indsamlet fra trætte kræftpatienter. Ved hjælp af en kompakt ekstracellulære flux system og sekventiel injektion af respiratorisk hæmmere, undersøgte vi PBMC mitokondrie funktionelle status af måling af basal mitokondrie respiration, respiratorisk overskudskapacitet og energy fænotype, som beskriver den foretrukne energi pathway til at reagere for at understrege. Frisk PBMC er let tilgængelige i de kliniske omgivelser ved hjælp af standard tapning. Hele analysen i denne protokol beskrevne kan være afsluttet i mindre end 4 timer uden inddragelse af komplekse biokemiske teknikker. Derudover beskriver vi en normalisering metode, der er nødvendige for at opnå reproducerbare data. De enkle procedure og normalisering metoder præsenteres giver mulighed for gentagen prøvetagning fra den samme patient og generation af reproducerbare data, der kan sammenlignes mellem tidspunkter at vurdere potentielle virkninger og behandling.

Introduction

Træthed er en udbredt og sørgelig tilstand, som har en negativ indvirkning på livskvaliteten for kræft patienter1. Til denne dato, kræft træthed forbliver dårligt defineret og beror kun på subjektive rapportering af patienter2. Derfor er der et presserende behov for at identificere en let at tilpasse diagnoselaboratorium test for at objektivt karakterisere træthed i kliniske omgivelser3,4.

Flere underliggende mekanismer, herunder mitokondrier dysfunktion, er blevet foreslået til at forårsage træthed5. Mitokondrier er kraftcenter organeller, leverer 95% af cellulære energibehov via oxidativ fosforylering, og spiller en vigtig rolle i calcium signalering apoptose, immun signalering og regulering af andre intracellulær signalering begivenheder6 . Derfor kan nedsat mitokondriel bioenergetik og fejl i energiproduktion bidrage til træthed. Understøtter denne hypotese, har tidligere undersøgelser observeret mutationer i mitokondrie-DNA i patienter med kronisk træthed syndrom7. Mens det er uklart, hvorvidt træthed patofysiologiske oprindelse ligger inden for det centrale nervesystem eller perifere væv, såsom skeletmuskulatur8,9, er der i øjeblikket ingen direkte metode til præcist at vurdere mitokondriel dysfunktion relateret til træthed i live, respiring celler.

Ved hjælp af perifert blod mononukleære celler (PBMC) for at studere mitokondrie funktion giver flere fordele. Først, PBMC er let tilgængelige i de kliniske omgivelser ved hjælp af standard tapning og kan være isolerede hurtigt ved hjælp af grundlæggende laboratoriemetoder. Andet er blod samling mindre invasiv end indsamling af andre væv som en muskel biopsi. Således kan blodprøver indsamles fra den samme patient flere gange over tid, som letter langsgående vurdering af behandling effekter. Interessant, syntes mitokondrie funktion i PBMC at være godt korreleret med nyre mitokondrie status i en dyremodel10. Desuden har immun celle mitokondrier været brugt som en proxy for opdage systemændringer under forskellige sygdom betingelser11,12. Mitokondrier i cirkulerende immunceller er særligt følsomme over for ændringer i immun funktioner og immun signalering molekyler såsom cytokiner13,14,15. For eksempel, er blevet observeret, at PBMC fra patienter med akut inflammatoriske gigtsygdomme udviser høj baseline ilt forbrug14. Derimod blev iltforbrug reduceret i PBMC isoleret fra patienter med systemiske betændelsestilstande, herunder sepsis16. Under betændelsestilstande, kan frie radikaler produceret af dysfunktionelle mitochondrier yderligere bidrage til forhøjede oxidativ stress og langvarig betændelse17. Den centrale rolle af mitochondrier i energiproduktion såvel som i oxidativ stress antyder den potentielle nytte af ved hjælp af mitokondrie funktion som en proxy for at studere træthed i kræft patienter 13.

Tidligere studier undersøger mitokondrie funktion udnyttet biokemiske teknikker, mitokondrielle membran potentielle måling eller isolation af specifikke cellepopulationer, der ikke kan let kan tilpasses i de kliniske omgivelser5, 14,18. I de seneste år, udviklingen af ekstracellulære flux assays har tilladt forskere til let og undersøge præcist ændringer i ilt forbrugssats (OCR) i svar til automatiseret injektioner af respiratorisk hæmmere19,20 , 21 , 22. dog de fleste af disse undersøgelser er designet til specifikke celletyper og høj overførselshastighed storformat kan ikke anvendes i kliniske omgivelser. I dette manuskript beskriver vi en optimeret protokol for behandlingen af mitokondrie-funktion til klinisk brug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den nuværende undersøgelse (NCT00852111) blev godkendt af det institutionelle Review Board (IRB) af National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Deltagerne i denne undersøgelse var euthymic mænd, 18 år eller ældre, der blev diagnosticeret med ikke-metastatisk prostatakræft med eller uden forudgående prostatektomi og var planlagt til at modtage ekstern strålebehandling strålebehandling (EBRT). Potentielle deltagere var udelukket, hvis de havde en fremadskridende sygdom, der kan forårsage betydelig træthed, havde psykiatrisk sygdom inden for de seneste fem år, havde ukorrigeret hypothyreoidisme eller anæmi, eller havde en anden malignitet. Personer, der brugte sedativer, steroider, eller non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler blev også udelukket. Sund kontrol blodprøver blev indhentet på NIH afdeling af Transfusion medicin fra raske donorer under en IRB-godkendte protokol (NCT00001846). Alle deltagerne er rekrutteret på Magnuson Clinical Research Center på NIH. Underskrevet skriftlig informeret samtykke blev opnået før undersøgelse deltagelse.

1. mitokondrie funktion måling forberedelse (dag 1 i eksperimentet)

  1. Hydrat Sensor patron (Se Tabel af materialeranslået varighed: 5 min).
    1. Fjerne sensoren patron fra pakken. Tilføje 200 μl kalibratoren løsning i hver brønd af nytte plade, derefter udfylde hver voldgrav med 400 μL kalibratoren løsning.
    2. Returnere Sensor plade til nytte plade, som nu har kalibratoren løsning i den. Hydrat patronen i en ikke-CO2 37 ° C inkubator natten over.
      NOTAT: Sensoren patron skal være hydreret for et minimum af 4 h og et maksimum på 72 h.

2. klinisk Prøveforberedelse (dag 2 af forsøget)

  1. Måler træthed ved hjælp af den 13-vare funktionel vurdering af kronisk sygdom terapi - træthed (FACIT-F)2,23,24 ved baseline (før EBRT indledning), midtpunkt og færdiggørelse af EBRT og 1 års post-EBRT.
    1. Bruge en 0 - 4 skala for hver vare svar, hvor 0 repræsenterer "slet ikke" og en 4 angiver at respondenten relaterer til den tilsvarende sætning "ret meget." Samlede score bør spænder fra 16-53, med lavere score afspejler høje træthed intensitet.
    2. Definer træthed som en FACIT-F score lavere end 43, med et FACIT-F score på ≥43 med angivelse af fravær af eller ikke klinisk meningsfulde træthed2.
      Bemærk: En FACIT-F score på 43 bedste opdeler træthed snesevis af kræftpatienter og den almindelige befolkning2.
    3. Omfatter følgende 13 elementer i FACIT træthed skala: 1) jeg føler trætte; 2) Jeg føler mig svag over det hele; 3) Jeg føler mig sløv ("vaskes ud"); 4) Jeg føler mig træt; 5) Jeg har problemer med at starte ting, fordi jeg er træt; 6) Jeg har problemer med efterbehandling ting, fordi jeg er træt; 7) Jeg har energi; 8) Jeg er i stand til at gøre min sædvanlige aktiviteter; 9) Jeg har brug at sove i løbet af dagen; 10) Jeg er for træt til at spise; 11) Jeg skal have hjælp gør min sædvanlige aktiviteter; 12) Jeg er frustreret over at være alt for træt til at gøre de ting, jeg ønsker at gøre; og 13) jeg er nødt til at begrænse min social aktivitet, fordi jeg er træt.
  2. Isolere PBMC fra frisk indsamles blodprøver (omtrentlig varighed: 1 time).
    1. Saml 8 mL blod ind i en mononukleære celler forberedelse rør (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Blodprøver skal behandles inden for 2 h af samling. Kvaliteten af PBMC kan blive kompromitteret, hvis blodprøver behandles mere end 2 timer efter prøvetagning.
    2. Der centrifugeres ved 1.750 x g i 30 min. ved stuetemperatur (18-25 ° C). Overføre det overskyede lag til en 15 mL konisk slange. Tilføje op til 15 mL PBS og invertere 5 gange.
    3. Der centrifugeres ved 300 x g i 15 min. ved 4 ° C. Forsigtigt fjerne og supernatanten uden forstyrrende pellet. Genopslæmmes pellet ved at tilføje op til 10 mL PBS, og vend 5 gange.
    4. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Kassér væske supernatanten og genopslæmmes celler i 1 mL PBS. Overføre PBMC til en 1,5 mL mikrofuge tube.
    5. Der centrifugeres ved 610 x g i 10 minutter. Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspend pellet i komplet RPMI-1640 (RPMI-1640 suppleret med 10% FBS, 10 mM Penicillin/Streptomycin).
  3. Coat celle plader til ikke-tilhænger celler (omtrentlig varighed: 30 min).
    1. Forberede celle og væv klæbende løsning (Se Tabel af materialer) ved fortynding af stamopløsningen i 0,1 M natriumbikarbonat pH 8,0. Fungerende løsning bør være på 3,5 μg/cm2 overfladeareal.
      Bemærk: Denne løsning indeholder polyphenolic proteiner udvundet fra den marine muslinger, Mytilus edulis. Disse proteiner er vigtige komponenter i limen udskilles af muslinger til at forankre sig på overflader. Vi finder, at celle-Tak virker bedst med PBMC.
    2. Tilsæt 100 μl af de fortyndede klæbende løsning til hver brønd og Inkuber i mindst 20 min. ved stuetemperatur. Vaskes tre gange med Deioniseret vand og luft tørre.

3. mitokondrie funktion måling

  1. Forberedelse af Assay medier (omtrentlig varighed: 10 min).
    Bemærk: Assay medier skal være frisk fremstillede på dagen af forsøget.
    1. Tilføje L-glutamin, pyruvat og glukose for at basere medier (de samme bestanddele som Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM), men uden natriumbikarbonat, glukose, glutamin, eller natrium pyruvat) for at gøre analysen medier. Varme medier op til 37 ° C, derefter justere pH 7,4.
      Bemærk: Koncentrationen af L-glutamin, pyruvat og glukose er normalt det samme som koncentrationer i normal vækst medier, men kan justeres baseret på analysen.
  2. Forberede Mito stresstesten PBMC (omtrentlig varighed: 2 h).
    1. Plade nok PBMC fra trin 2 i hver brønd at nå 80-90% confluency. Vores erfaring gav 1.5 x 105 celler/brønd de mest konsekvente resultater.
      Bemærk: Wells A og H er baggrunden brønde og bør kun indeholde assay medier med ingen celler. I brønde B til G anbefaler vi plating mindst 3-6 wells pr. patient prøve for at tage højde for outliers.
    2. Spin plader ned på 200 x g for 2 min til at tillade celler til at holde sig til bunden af brøndene. Vaske cellerne en gang med Assay medier. Dette trin fjerner serum og natriumbikarbonat fra vækst medier.
      Bemærk: Vores erfaring, trinnet vask typisk fjerner 20-30% af celler.
    3. Tilføj 180 μL Assay medier i hver brønd, herunder baggrunden wells A og H. Incubate i en ikke-CO2 37 ° C inkubator i 45-60 min.
  3. Kører Mito stresstest
    1. Rekonstruere narkotika i Mito Stress Kit med assay medier som følger:
      1. Oligomycinets: Tilføj 252 μL assay medier i hætteglas til at generere en stamopløsning i 50 μM.
      2. FCCP: Tilføj 288 μL af assay medier i hætteglas til at generere en stamopløsning i 50 μM.
      3. Antimycin A / rotenon: tilføje 216 μL af assay medier i hætteglas til at generere en stamopløsning på 25 μM.
    2. Vortex rekonstitueres narkotika i ca 1 minut. Fortyndes i orden løsninger.
      Bemærk: Koncentrationer af de arbejdende løsninger bør titreres og forudbestemt før eksperimentet afhængigt af hvilken celle. For PBMC, finder vi denne 1 μM af oligomycinets, 1 μM FCCP og 0,5 μM antimycin A / rotenon fungerer bedst.
    3. Der afpipetteres narkotika i hver havn i sensor patron sekventielt:
      1. Port A: Pipette 20 μL 10 μm oligomycinets, til en endelig koncentration i hver brønd 1 μm.
      2. Port B: Pipette 22 μl af 10 μM FCCP, til en endelig koncentration i hver brønd 1 μm.
      3. Port C: Pipette 25 μL af 5 μM antimycin A / rotenon til en endelig koncentration i hver brønd på 0,5 μM.
  4. Vælg "Mito Stress Test" på en ekstracellulære flux instrument. Følg instrument lynhurtig og indsætte sensor patron. Instrumentet vil automatisk udføre sensor-kalibrering. Indsæt celle plade efter sensor-kalibrering, og instrumentet vil afslutte resten af analysen. Ilt dynamics måles på 530 nm (excitation) / 650nm (emission), og proton koncentration måles på 470 nm (excitation) / 530 nm (emission).

4. normalisering af mitokondrie funktion Data

  1. Forberede celle spredning Assay løsning (anslået varighed: 5 min).
    1. Tilføje 48 μL nukleinsyre pletten (500 x) og 240 μL baggrund suppressor at 11.7 mL PBS (2 x). Nukleinsyre pletten er en celle-permeant DNA-bindende farvestof, og baggrunden suppressor er en maskering farvestof, som blokerer døde celler eller celler med kompromitteret celle membran integritet fra at være plettet. Kombinationen af DNA-bindende farvestof og baggrunden suppressor sikrer, at kun levende celler er plettet.
    2. Tilføj lige saa stort volumen af 2 x brugsopløsning (180 μL) direkte ind i medium i hver brønd, efter Mito Stress Test har afsluttet.
  2. Inkuber celler i overværelse af celle spredning assay løsning i et 37 ° C inkubator i 45-60 min. tal antallet af levende celler (lysstofrør) på en Pladelæser på 508 nm (excitation) / 527 nm (emission) og normalisere OCR data (omtrentlig varighed: 10 min) .
    Bemærk: ud over de antal levende celler, brugere kan også vælge at normalisere deres data med det samlede antal celler, mængden af nukleinsyre, protein fusioner, osv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mito Stress Test bygger på måling af ilt forbrugssats (OCR) efter sekventielle injektion af forskellige respiratorisk hæmmere tilknytte en komplet mitokondrie profil. OCR målinger efter hver enkelt drug injektion kan bruges til at beregne følgende parametre relateret til mitokondrie sundhed: Basal OCR måles først før enhver stof injektion til at vurdere iltforbrug skulle opfylde hvile niveau ATP efterspørgsel. Basal respiration er beregnet ved at fratrække ikke-mitokondrie åndedræt sats fra baseline OCR før oligomycinets injektion. Dernæst sprøjtes oligomycinets for at hæmme proton kanalen af ATPsyntase (komplekse V). Det efterfølgende fald i OCR efter oligomycinets injektion repræsenterer ATP produktion-relaterede iltforbrug. FCCP (Carbonyl cyanid 4-[trifluormethoxy] phenylhydrazone), en ionophor bruges til at afbryde proton gradient og mitokondrielle membran potentiale, bruges derefter til at fremkalde maksimal iltforbrug. Maksimal respiration er beregnet ved at fratrække ikke-mitokondrie respiration fra den maksimale OCR efter FCCP injektion. Respiratorisk overskudskapacitet er forskellen mellem maksimal og basal respiration. Endelig, antimycin en (komplekse III hæmmer) og rotenon (komplekse jeg hæmmer) injiceres på samme tid at slukke elektron transportkæden. Pr. definition er ikke-mitokondrie respiration er uafhængig af elektron transportkæde (f.eks. ikke-mitokondrie NADPH stavbakterier i makrofager, osv.) og er repræsenteret som OCR værdier efter antimycin A / rotenon injektion. Kobling effektivitet beskriver brøkdel af basal mitokondrie iltforbrug anvendes til ATPsyntesen, og beregnes som 100% x (ATP produktion-relaterede OCR) /(basal respiration rate).

Celle tæthed for hver dyrkningsbaserede betingelse bør optimeres før du udfører en mito stresstest. Vores erfaring opnås 80-90% confluency ved plettering 1.5 x 105 celler/brønd af frisk isolerede PBMC fra humant blod (fig. 1A). Dette plating tæthed tegner sig for vask trin beskrevet taktfast 3.2.3. Ud over at fastslå den optimale plating massefylde, skal FCCP titrering udføres for at bestemme den koncentration, der er nødvendige for at generere maksimal OCR. På FCCP testet koncentrationer - 0,125 μM, 0,25 μM, 0,5 μM, 1 μM og 2 μM - OCR steg med FCCP koncentration at nå et plateau på 1 μM, men faldt på 2 μM (figur 1B). Dette indikerer, at 1 μM er den optimale FCCP koncentration, der skal bruges til at undersøge PBMC mitokondrie-funktion.

Vi testede mitokondrie funktion af det samme parti af celler fra samme blodprøve indsamlet fra en sund donor på forskellige tidspunkter efter PBMC isolation. Basal iltforbrug samt maksimal OCR faldt så tidligt som 3 h og fortsatte med at falde på 5 og 8 h efter PBMC isolation (fig. 2A). Efter 3 h overstiger maksimal respiration fremkaldes ved FCCP injektion (tid punkt 7-9) ikke basal OCR, tyder på, at selv i levende celler, mitokondrier Skåne respiratorisk kapacitet falder hurtigt over tid. Ekstracellulære forsuring sats (ECAR) blev samtidig målt på ekstracellulære flux instrument. Da oligomycinets hæmmer mitokondrie ATPsyntase, er glykolyse ansat inden for få minutter til at opfylde efterspørgslen efter energi og til at kompensere for manglen ATP produktion via oxidativ fosforylering, hvilket fremgår af den hurtige stigning i ECAR efter oligomycinets injektion. Så tidligt som 3 h efter PBMC isolation, var der et fald i ECAR samt OCR (figur 2B). Selv om vi ikke har overholdt alle bemærkelsesværdige ændringer i cellernes levedygtighed på 1, 3, 5 og 8 h efter PBMC isolation, mitokondrie funktion faldt hurtigt, hvilket tyder på, at timingen er nøglen til at fange levende, respiring PBMC mitokondrie profil.

Patienten prøve samlinger har tendens til at forekomme på forskellige tidspunkter på forskellige dage; Det er således afgørende at normalisere dataene for at sammenligne forskellige prøver og tidspunkter. Mens andre normalisering metoder såsom protein assay og nukleinsyre kvantificering kan anvendes, finder vi, at farvning levende celler med en DNA-bindende farvestof og kvantificering af grønt-fluorescerende celler i hver brønd er den mest effektive og pålidelige normalisering metode. Repræsentative data af PBMC indsamlet fra to forskellige raske donorer på to separate dage er vist i figur 3. Inset er et repræsentativt billede af en celle plade godt viser samlede celler (fasekontrast) og levende celler farves med DNA-bindende farvestof (grøn fluorescerende) efter mito stresstest. Basal ilt forbrugssats, som iltforbrug efter hver enkelt drug injektion normaliseret til levende celler var ens i to forskellige sunde ikke trætte donorer (figur 3).

Repræsentants mitokondrie funktion data af en trætte emne (FACIT-F score < 43) med prostatakræft (rød) og en alder/køn/race-matchede ikke trætte sund donor (blå) er vist i figur 4. Selv om vi ikke konstatere nogen forskel i den basale OCR (fig. 4B), faldt trætte emnet udstillet maksimal iltforbrug samt reservedele respiratorisk kapacitet i forhold til kontrol (figur 4C, D). Træthed syntes at være relateret til en reduktion i respiratoriske ekstrakapacitet, fordi der ikke var nogen forskelle findes i ikke-mitokondrie iltforbrug (figur 4E), ATP-relaterede iltforbrug (figur 4F), eller kobling effektivitet (figur 4G). Baselinedata (før enhver stof injektion) og maksimal respiration efter FCCP injektion kan visualiseres ved hjælp af en energi fænotype plot, som afslører den foretrukne vej (OCR oxidativ fosforylering versus ECAR glykolyse) i øget energiefterspørgslen (figur 4H). Tomme felter angiver basal energi fænotype og solid firkanter angiver energi fænotype som svar på maksimal ATP efterspørgsel. Afstanden mellem basal (tom firkant) og maksimal (solid square) angiver overskudskapacitet, der henviser til, at hældningen angiver cellulære præference mod oxidativ fosforylering versus glykolyse. Som vist i figur 4H, overskudskapacitet i træthed omfattet faldt i forhold til den ikke-trætte sund kontrol. Hertil kommer, øget energi fænotype som svar på ATP efterspørgsel skæv i retning af glykolyse i trætte emnet i forhold til den sunde kontrol (figur 4H).

Figure 1
Figur 1 : PBMC plating tæthed og FCCP dosis-respons kurve. (A) frisk isoleret var PBMC belagt på 1.5 x 105 celler/brønd i CellTak-belagt celle kultur miniplates. Efter vask og medier ændre, celler var jævnt fordelt på 80-90% confluency. Skalalinjen = 100 μm. (B) OCR steg med stigende koncentrationer af FCCP på 0,125 μM, 0,25 μM, 0,5 μM, til at nå peak OCR på 1 μM. OCR faldt på 2 μM, der angiver, at 1 μM er den optimale dosis til at fremkalde maksimal respiration i PBMCs.Error barer angiver standardafvigelsen af 3 sekventielle målinger efter den oprindelige stof injektion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 2
Figur 2 : Mitokondrie respiration aftager over tid i frisk isolerede PBMC. OCR (A) samt ECAR (B) faldt hurtigt over tid efter PBMC isolation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 : Repræsentants mitokondrie respiration data med normalisering. Mito stresstest blev udført ved hjælp af friske PBMC isoleret fra to forskellige sunde frivillige på forskellige dage og normaliserede ved hjælp af en fluorescerende nukleinsyre pletten kvantificeres på en fluorescerende pladelæseren. Indsatser: et repræsentativt billede af levende celler (grønne) og total celler (fasekontrast) i en brønd. Skalalinjen = 1.000 μm venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 4
Figur 4 : Repræsentative analyse af en trætte emne i forhold til en sund kontrol. (A) repræsentative Mito Stress test OCR grafen for en træt emne i forhold til en alder/køn/race-matchede ikke trætte sund kontrol. Søjlediagrammer af basal OCR (B), maksimal respiration (C), spare respiratorisk kapacitet (D), ikke-mitokondrie iltforbrug (E), ATP produktion (F)og kobling effektivitet (G) er vist. Energi fænotype plot af trætte emne og sund kontrol er vist (H). Tomme felter angiver baseline energi fænotype, solid firkanter repræsenterer stresset energi fænotype målt efter FCCP injektion. Fejllinjer angiver standardafvigelsen af 3 forskellige brønde for hver undersøgelse deltager. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Træthed hos cancerpatienter er en invaliderende tilstand, der ikke er klart defineret eller præget1. Diagnosticering af træthed afhængig helt af subjektive rapportering og der er ingen aktuelle diagnostiske standard eller behandling for denne tilstand, hovedsagelig på grund af manglende forståelse i sin pathobiology2. Af de foreslåede mekanismer bag træthed hos cancerpatienter, er nedskrivninger i mitokondrie-funktion en af de mest terapeutisk markedssegment veje. Derfor udviklede vi en hurtig og praktisk metode til måling af mitokondrie-funktionen i kliniske prøver, der kan bruges til proaktiv identificering af patienterne udsatte for at udvikle kræft behandling-relateret toksicitet herunder træthed, så det tidligt forvaltningen kan anlægges.

Den ekstracellulære flux teknologi i kombination med sekventiel injektion af respiratorisk hæmmere giver mulighed for vurdering af mitokondrie funktionelle status og har været brugt i både in vitro- og i vivo modeller19, 20,21. Vi udvidet den eksisterende organ for arbejde og udviklet en metode, der er optimeret til undersøgelse af mitokondriel dysfunktion i kliniske prøver. En fordel ved undersøgelsen er udnyttelsen af kompakte ekstracellulære flux analyzer. Som vi har påvist, er timingen af eksperimentet afgørende efter isolering af frisk PBMC fra humant blod. Mens det større format (96-brønd eller 24-godt format) er det ideelle valg for en høj overførselshastighed eksperiment, kompakt ekstracellulære flux system, som indeholder 8 brønde, giver mulighed for individuel vurdering af hver patient prøve19. Denne metode er mere praktiske og omkostningseffektiv (både med hensyn til selve apparatet og at de reagenser, der anvendes til at udføre analysen), fordi prøvetagning fra forskellige patienter har tendens til at forekomme på forskellige tidspunkter på forskellige dage.

Udnyttelsen af PBMC at evaluere mitokondrie funktion i trætte kræftpatienter har flere fordele: 1) biopsi af væv som muskler kan være upraktisk til tider; 2) PBMC er let tilgængelige og kan let isoleres ved hjælp af celle forberedelse rør, som tilbyder en praktisk fordel i en klinisk indstilling; og 3) vi har vist, at mitokondriel funktion aftager efter frisk isolerede celler har været i kultur i mere end 3 timer og isolere bestemte celletyper typisk tager flere timer (mere end 3 timer). PBMC kan være forberedt inden for en time, hvilket sikrer nøjagtighed i måling real-time mitokondrie-funktionen. Mens vi anbefaler at bruge PBMC ved den første kliniske undersøgelse i tidligere uncharacterized patientgrupper, i andre celletyper såsom T-lymfocytter, blodplader, neutrofile og monocytter kan også bruges med den nuværende protokol efter optimering af plating tæthed og respiratoriske hæmmer koncentrationer15,25,26.

Inden prøvningen mitokondrie funktion i et nyt system, er det vigtigt at først fastslå den optimale celle tæthed og FCCP koncentrationer. Vores erfaring sikrer plating 1.5 x 105 celler pr. brønd, at celle tæthed efter plating og vask skridt er stadig 80-90% sammenflydende. Det er derudover afgørende at fastslå de optimale FCCP koncentrationer til enhver celletype. En vifte af FCCP koncentrationer bør testes og den FCCP koncentration, der producerer maksimal OCR uden at gå på kompromis for en celle sundhed bør anvendes. Ved koncentrationer testet, resulterede 1 μM af FCCP i maksimal respiration i PBMC. En anden kritisk trin er timingen af eksperimentet, som mitokondrielle respiration dråber stejlt 3 timer efter PBMC isolation. Heraf, mito stresstest bør udføres inden for 3 timer efter prøvetagning til præcist indfange mitokondrie-funktionen i en klinisk prøve. Det er værd at påpege, at mange forskere har kun adgang til frosne prøver. Vi har tidligere testet PBMC efter nedfrysning og optøning, og de mitokondrielle funktioner af disse celler er stærkt kompromitteret. Vi anbefaler derfor, ved hjælp af frisk isoleret PBMC i kliniske undersøgelser, når det er muligt.

Et andet vigtigt aspekt af produktionsanlæggene reproducerbare data er metoden for yderligere oplysninger om datanormalisering. Mens nogle laboratorier har haft succes med BCA protein kvantificering til at normalisere mitokondrie respiration data, finde vi, at det ikke er altid muligt især på en lav celle tæthed. Normalisering i denne protokol beskrevne metode bygger på en lineær korrelation mellem celle numre og fluorescens emission af de dye-nucleic acid komplekser, og kan nøjagtigt kvantificere 10 til 50.000 celler27. Derudover normalisering ved hjælp af en kombination af fluorescerende nukleinsyre pletten og en fluorescerende Pladelæser giver mulighed for hurtig kvantificering af levende celler efter afslutningen af forsøget. Denne metode kræver derudover ikke trypsinization af vedhængende celler eller ved hjælp af en celle skraber.

En advarsel i protokollen er, at vi ikke adskille PBMC i specifikke celletyper før du udfører mitokondrie funktionalanalyse. Som vi har påvist, aftager mitokondrie respiration hurtigt over tid efter PBMC isolation. Dette tyder på, at forskellene mellem patienter kan være unøjagtig, hvis eksperimentet blev udført efter isolere forskellige cellepopulationer, som normalt tager et par timer. Selv om at studere blandede befolkninger såsom PBMC ikke afslører vigtigt celle type-specifikke oplysninger, kan oplysninger fra eksperimenter ved hjælp af PBMC hjælpe guide fremtidige Mekanistiske undersøgelser fokuseret på specifikke celletyper. PBMC tjene som en proxy for systemisk mitokondriel dysfunktion, som er relevante for systemiske sygdomme såsom kræft træthed10,28. Protokollen beskrev i det aktuelle manuskript kun giver en grov måling af mitokondriel dysfunktion uden indkredse årsagen til observation. Derfor resultaterne ved hjælp af denne teknologi og procedure bør fortolkes med forsigtighed og skal overveje multifaktoriel arten af træthed, som dens samtidig forekomst med andre adfærd (fx depression, søvn, kognitiv svækkelse) og betingelser (fx, kardiopulmonale status, Polyfarmaci). Fremtidige studier bør undersøge ændringer i mitokondriets funktioner i specifikke celletyper (fx, natural killer celler, T-lymfocytter og monocytter) og i forskellige kliniske populationer (f.eks. træthed/ikke-trætte kræftpatienter og raske kontrolpersoner). Mens det er uden for rammerne af det aktuelle manuskript, vil vi bestemme sammenslutninger mellem kræft træthed sværhedsgraden og mitokondriel dysfunktion og sammenhængen mellem mitokondriel funktion målinger og fysiske tests af træthed som en 6-minutters gang test, i fremtidige undersøgelser. Derudover vil fremtidige studier også undersøge mitokondriel dysfunktion i andre kræft typer for at afgøre, om træthed på tværs af forskellige kræft typer er forbundet med mitokondriel dysfunktion. Afslutningsvis har vi udviklet en protokol optimeret til en hurtig vurdering af generelle mitokondrie dysfunktioner ved hjælp af kliniske prøver. Yderligere kan Mekanistiske undersøgelser udføres for at lokalisere inddragelse af specifikke omsætningsveje i denne invaliderende tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne undersøgelse er fuldt understøttet af Division af murene forskning af det nationale Institut for sygepleje forskning af NIH, Bethesda, Maryland.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CPT Mononuclear Cells Preparation Tube  BD Biosciences 362761 For isolating PBMCs following phlebotomy
RPMI-1640  Corning 10-040 For making growth media for PBMCs
Fetal bovine serum (FBS) Corning 35-010-CV For making growth media for PBMCs
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher 15140122 For making growth media for PBMCs
Cell-Tak Corning 354240 Cell and Tissue adhesive solution; allows suspension cells to adhere to the surface
Seahorse XF Calibrant Solution Agilent 103059-000 For hydrating cartridges
XFp Fluxpak (miniplates and sensor cartridges) Agilent 103022-100 Contains XFp cell culture miniplates and sensor cartridges
XF base media Agilent 103335-100 For making XF assay media
45% cell culture D-(+)-Glucose solution Corning 25-037-CI For making XF assay media
Sodium pyruvate solution Corning  25-000-CI For making XF assay media
L-glutamine solution ThermoFisher 25030081 For making XF assay media
Seahorse XFp Mito Stress Test Kit Agilent 103010-100 Contains oligomycin, FCCP, antimycin A/rotenone
CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay ThermoFisher C35011 For quantification of live cells and data normalization
Seahorse XFp Analyzer Agilent S7802AEA For measuring mitochondrial function in live cells
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (or any instrument that can quantify fluorescent cells in a plate) BioTek BTCYT5PV For quantification of live cells and data normalization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, A. M., et al. Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13, (8), 1012-1039 (2015).
  2. Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy. Journal of Pain and Symptom Management. 52, (6), 832-840 (2016).
  3. Feng, L. R., et al. Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy. Clinical Journal of Oncology Nursing. 19, (6), 744-750 (2015).
  4. Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy. Cancer Nursing. 40, (3), 184-193 (2017).
  5. Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2, (1), 1-16 (2009).
  6. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function. Annual Review of Physiology. 78, (1), 505-531 (2016).
  7. Vecchiet, L., et al. Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome. Neuroscience Letters. 208, (2), 117-120 (1996).
  8. Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome. Journal of Internal Medicine. 267, (4), 394-401 (2010).
  9. Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy. Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).
  10. Karamercan, M. A., et al. Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation. Shock. 40, (6), (2013).
  11. Ijsselmuiden, A. J. J., et al. Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811 (2008).
  12. Kong, C. -W., et al. Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations. Shock. 21, (4), 315-319 (2004).
  13. Straub, R. H. The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing. Nature Reviews Rheumatology. 13, 743 (2017).
  14. Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 62, (2), 133-139 (2003).
  15. Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).
  16. Garrabou, G., et al. The Effects of Sepsis on Mitochondria. The Journal of Infectious Diseases. 205, (3), 392-400 (2012).
  17. Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury. Antioxidants & Redox Signaling. 20, (7), 1126-1167 (2014).
  18. Adrie, C., et al. Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164, (3), 389-395 (2001).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
  20. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2511 (2010).
  21. Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis. Journal of Visualized Experiments. (105), e53424 (2015).
  22. Boutagy, N. E., et al. Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments. (104), e53216 (2015).
  23. Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system. Journal of Pain and Symptom Management. 13, (2), 63-74 (1997).
  24. Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients. Journal of Clinical Epidemiology. 64, (5), 507-516 (2011).
  25. Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. Methods in Enzymology. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).
  26. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Laboratory Investigation. 93, (6), 690-700 (2013).
  27. Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay. Journal of Immunological Methods. 254, (1), 85-98 (2001).
  28. Hartman, M. -L., et al. Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus. Vascular Medicine. 19, (1), London, England. 67-74 (2014).

Comments

1 Comment

  1. Dear authors,

    I read this with a lot of interest as I work on PBMC mitochondrial function in neurodegeneration. I use the XFp and get good results but have had trouble with normalisation. I don't feel protein quantification is accurate. As such I've been trying to find a way to quantify DNA. I attempted the standard cyquant kit but on washing the media away I am sure cells are being detached from the cell tak. The direct kit seems to overcome this but I wanted to clarify a couple of things. In the text you say to add an equal volume of cyquant reagent mix (180ul) but you would have 247ul of media at the end of the run after addition of oligomycin, FCCP and rot/aa. Can you clarify how much reagent you added? Also, I would think that if 247ul was added to would overflow the XFp plate wells. You also state that cyquant is linear from 10-50,000 cells but you load 1.5x10^5 per well so do you find the relationship is still linear at such high cell numbers as I have had some problems non-linearity at high cell numbers with picogreen staining?

    Many thanks,

    Philip Campbell
    (MRC Fellow, UCL Queen Square Institute of neurology, London, UK)

    Reply
    Posted by: Philip C.
    October 11, 2018 - 3:20 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics