Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Flow Cytometrisk analyse af mitokondrie reaktive oxygen arter i murine hæmatopoietiske stamceller og Progenitorcellerne og MLL-AF9 drevet leukæmi
Chapters
Summary September 5th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en metode til brug af multiparametrflow cytometri til at detektere mitokondrie reaktive oxygenarter (ROS) i murine sund hæmatopoietisk stamcelle-og progenitorceller (Hspc'er) og leukæmiceller fra en musemodel af akut myeloid leukæmi (AML) drevet af MLL-AF9.
Transcript
Reaktive ilt arter eller ROS, er meget reaktive ilt arter, der er produceret af celler, og påvirker deres adfærd. Selvom overskydende ROS også kan forårsage udbredt cellulære ravage, og i alvorlige tilfælde, celledød. Således er vedligeholdelsen af ROS homøostase af grundlæggende betydning for cellulære funktion og overlevelse.
Protokollen præsenteres her, fokuserer på at måle en bestemt type ROS, der er genereret af mitokondrier, primært som en metabolisk biprodukt i levende, normal, eller sund hæmatopoietisk stamceller og stamfader cellepopulationer, samt i leukæmi celler fra musemodellen af blodkræft, Akut Myeloid leukæmi eller AML. Denne protokol kan også bruges til at vurdere, hvordan genetisk manipulation, såsom gensletning eller overekspression, påvirker mitokondriel ROS i flere sunde og ondartede hæmatopoietiske populationer. Og som et resultat, potentielt give indsigtsfulde oplysninger om redux tilstand og muligvis metabolismen af cellerne.
Denne teknik tillader flow afregne metrisk analyse af en protogen sonde til at overvåge mitokondrielle ROS produktion i levende sunde og ondartede hæmatopoietiske stilk og stamfader sub-populationer. Denne protokol er ligetil og kan udfyldes i et par timer. Desuden er det velegnet til levende celle analyse og giver mulighed for at skelne og analysere mitokondrielle ROS i stamcellepopulationen i knoglemarven, ved hjælp af overflade mærke farvning.
Efter indsamling mononukleare knoglemarvsceller fra vilde stramme mus og leukæmiske MLL-AF9 mus, ifølge manuskriptet, aliquot 200 mikroliter af cellen suspension i hver af ni enkelt farve kontrol rør. Aliquot de resterende celler i andre eksperimentelle rør, 200 mikroliter hver. Derefter anbringes i en centrifuge to eksperimentelle rør, der indeholder knoglemarvsceller og leukæmiske celler henholdsvis, og en kontrol rør.
Centrifuge ved 300 gange G i fem minutter. Dernæst dekantere supernatant, og re-suspendere cellerne i stuetemperatur F-PBS med en levende / død celle plet, i henhold til producentens anvisninger. Inkuber på is i 30 minutter.
Derefter tilsættes 1 milliliter rumtemperatur F-PBS til de tre levende/ døde farvede rør og et enkelt farvekontrolrør til mitokondriel ROS farvefarvning. Rørene anbringes i centrifugen ved 300 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter opnås en 5 millimolar mitokondrie ROS farvestof lager opløsning ved re-suspension 50 mikrogram mitokondrielle ROS farvestof i 13 mikroliter af DMSO.
Derefter tilsættes 13 milliliter rumtemperatur F-PBS til det 13 mikroliter mitokondrielle ROS farvestof for at fortynde til en endelig koncentration af fem mikromolar. Om nødvendigt tilsættes 13 mikroliter på 50 millimolar Verapamil til opløsningen for at hæmme mitokondrielle efflux pumper. Rør fra centrifugen udsugning, og indsugning af vask af den levende/døde celleplet.
Der tilsættes 200 mikroliter F-PBS i den levende/døde farvningskontrol, og den opbevares i is, indtil de er klar til at starte analysen. Tilsæt 200 mikroliter af mitokondrielle ROS farvestof plet, der indeholder Verapamil, til hver eksperimentel tube, samt mitokondrielle ROS farvning kontrolrør. Vortex at blande og inkubere i 10 minutter ved 37 grader Celsius i mørke.
Derefter tilsættes 1 milliliter rumtemperatur F-PBS til kontrol og eksperimentelle rør. Centrifuge fem minutter ved 300 gange G ved stuetemperatur. Inspirer supernatenten af og vask cellerne med yderligere en milliliter rumtemperatur F-PBS.
Centrifuge igen i fem minutter ved 300 gange G, ved stuetemperatur. Først forberede to antistof cocktails til sunde og leukæmi knoglemarvsceller. Inspirer supernatanten fra forsøgsrøret, der indeholder sunde knoglemarvsceller, og tilsæt 200 mikroliter af antistofcocktail nummer et til røret.
Vortex at blande. Forbered også enkelt farvekontrolrørene ved at tilsætte 200 mikroliter F-PBS og en mikroliter af det tilsvarende antistof. Inkuber i 60 minutter på is i mørke.
Inspirer supernatanten fra det eksperimentelle rør, der indeholder leukæmi knoglemarv, og tilsæt 200 mikroliter af antistofcocktail nummer to, til røret. Vortex at blande. Inkuber i 60 minutter på is i mørke.
Derefter vaskes alle rørene med 1 ml kold F-PBS og centrifuge i fem minutter ved 300 gange G ved stuetemperatur. Re-suspendere cellerne i 500 mikroliter af koldt F-PBS. Cellesuspension overføres til hvert flowcytometerrør med et 40 mikrometerfilter, der ikke er aggregater.
Først skal du indsætte en ingen pletkontrolrør i flow cytometri maskinen og starte erhvervelsen for at kompensere flow cytometri maskine. Gentag for andre kontrolrør. Derefter skal du læse de eksperimentelle rør for at oprette portene.
Hvis du vil analysere størrelsen og kompleksiteten af cellepopulationen, skal du først for at sikre en sund HSPC indstille populationerne for det fremadrettede scatterområde og side scatter-områdeområder. Tryk på Square Gate-knappen for at fjerne uvedkommende snavs fra det fremadrettede og sidespr.-plot. Så på en fremad scatter område og højde plot, skal du bruge en dobbelt diskriminator til gate out doublets.
Vælg levende celler, afstamning lave celler, og de forskellige sunde HSPC. For hver population af interesse, analysere median fluorescens intensitet af TRPE kanal i en histagram plot, at vurdere forskelle i mitokondrielle ROS signal. Gentag den samme procedure for størrelse analyse, gating og histogram plotte for leukæmi populationer.
Knoglemarvsceller isoleret fra raske mus blev plettet med en levende / død farvestof og et mitokondrielt ROS farvestof, og efterfølgende farves med antistoffer anerkende afstamning markører:plus CD48, C-kit, Sca-1, CD34 og CD150. Desuden blev knoglemarvsceller fra leukæmi mus også farves med CD45.2 at skelne mellem MLL-AF9 leukæmi celler fra raske modtager knoglemarvsceller plettet med CD45.1. En sammenligning af mitokondriel ROS farvning, mellem sunde CD48 negative LSK, og myeloid stamfader, viser, at myeloid stamfader vise betydeligt højere niveauer af mitokondrielle ROS farvning.
Desuden c-Kit høj leukæmi stamfader vise betydeligt højere niveauer af mitokondrielle ROS farvning, sammenlignet med c-Kit mellemliggende lav leukæmi celler, sunde CD48 negative LSK og myeloid stamfædre. C-Kit mellemliggende lav leukæmi celler, også vist en betydeligt højere værdi i forhold til CD48 negative LSK celler, men ikke til myeloid stamfader. Mitokondrielle ROS farvestoffer er meget reaktive og passende vask trin er nødvendige for at sikre, at eventuelle overskydende af farvestoffet er blevet fjernet, før du starter følgende trin.
Der er flere kemisk adskilte ROS fluorogene farvestoffer, der kan bruges i denne protokol, for at opnå en smule viden om redux status i levende hæmatopoietiske celler. Denne teknik er blevet flittigt brugt i litteraturen, og kan give nyttige indsigter på metaboliske og signalering veje, der er differentieret reguleret i leukæmi celler, hvis man sammenligner med deres normale kolleger.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
