Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Automatisk adskillelse og indsamling af kræftrelaterede stoffer fra kliniske prøver
Chapters
Summary January 13th, 2023
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dette papir beskriver anvendelsen af automatiseret udstyr til nemt og effektivt at adskille og indsamle stoffer, såsom cellefrit DNA og cirkulerende tumorceller, fra fuldblod.
Transcript
Vores protokol er brugervenlig. Ved hjælp af denne teknik kan enhver let isolere komponent fra blodet. Kontaminering kan minimeres, og materialer kan adskilles nøjagtigt.
Med automatisering og etablering af denne protokol kan forskere let få kræftrelaterede stoffer med høj renhed, hvilket er nyttigt for forskellige nedstrømsundersøgelser. Det forventes især at give vigtige fordele for slutbrugerforskning. Demonstrere deres procedure vil være Jay Jeong, seniorforsker og assisterende leder ved Cancer Genomics Research Institute.
For at begynde skal du indlæse LBx 1-patronen ved at vælge patrontypen på instrumentets berøringsskærmpanel. Tryk på pileknappen for at ændre antallet af prøver. Åbn derefter instrumentdækslet, og indsæt alle de patroner, der skal bruges, i rækkefølge efter nummeret på patronholderen.
Hvis der er tale om i alt fire cylinderampulenter, skal prøvedukkepatronen placeres i det tomme rum på patronholderen. Brug støttehjulet til at montere patronen, og stram låsemøtrikken for at fastgøre den. Luk døren, og tryk på kør-knappen på touchpad-skærmen.
Instrumentet lukker ventilerne på patronerne, hvilket tager ca. 30 sekunder. Følg meddelelsen for at åbne døren. Fjern støttehjulet, og fjern den ventillukkede patron fra patronholderen.
Der pipetteres højst 10 ml fuldblodsprøve ved hjælp af en serologisk pipette. Sæt pipettespidsen dybt ind i cylinderampullens prøveindgang, og injicer langsomt hele blodprøven. Når du har indsat patronerne i instrumentet, skal du lukke døren til instrumentet og trykke på knappen OK.
Plasma og buffy coats adskilles automatisk fra fuldblod, hvilket tager cirka 30 minutter. Når plasma og buffy coat er adskilt, vises en meddelelse på skærmen ledsaget af en alarmlyd. Stop alarmen ved at åbne døren eller trykke på stopknappen.
Åbn døren. Fjern patronen, og læg den på bordet. Genvind tre milliliter plasma fra plasmaudløbet ved hjælp af en pipettespids på en milliliter.
Derefter genvindes tre milliliter af buffy coaten fra buffy coat-udløbet ved hjælp af en pipettespids på en milliliter. Ilæg derefter LBx 2-patronen ved at vælge patronnavnet på instrumentets berøringsskærmpanel. Tryk på pileknappen for at ændre antallet af prøver, og følg den samme procedure, der blev vist for LBx 1-cylinderampullen, for at indsætte patronen i patronholderen.
Når du har indsat patronen og lukket døren, skal du trykke på kør-knappen på touchpad-skærmen. Følg den tidligere viste procedure for at fjerne den ventillukkede patron fra patronholderen og placere den på bordet. Densitetsgradientopløsningen pipetteres ved hjælp af en serologisk pipette.
Sæt pipettespidsen dybt ind i cylinderampullens indløb, og injicer langsomt opløsningen. Derefter pipetteres hele blodprøven, og den injiceres langsomt i prøveindløbet. Når cylinderampullen er iført og fastgjort, skal du lukke døren og trykke på knappen OK.
Når plasma og PBMC automatisk adskilles fra fuldblod, vises en meddelelse ledsaget af en alarmlyd. Åbn døren, og fjern patronen. Gendan tre milliliter plasma fra plasmaudløbet ved hjælp af en pipettespids på en milliliter, og genvind derefter tre ml PBMC fra PBMC-udløbet.
På samme måde injiceres seks ml PBS-opløsning i PBS-indgangen til cylinderampullen, efter at den ventillukkede patron er fjernet fra patronholderen. Derefter pipetteres tre ml fuldblod eller buffy coat opnået fra LBx 1 eller PBMC-prøve opnået fra LBx 2, og injicer langsomt prøven i prøveindgangen til cylinderampullen. Når du har indsat patronen og fastgjort den, skal du lukke døren og trykke på knappen OK.
Når den automatiske berigelse af CTC'er er fuldført, skal du stoppe alarmen. Fjern patronen, og sæt bagpladefjerneren, eller BPR, i de fire huller på forsiden af patronen. Tryk på den mørkeblå vinge med tommelfingrene på begge hænder, og tryk derefter på den lyseblå krop, indtil den klikker.
Fjern forsigtigt patronhuset ved at løfte det. Tag forsigtigt filtermembranen op ved kanten ved hjælp af en pincet, og læg membranen i et 1,5 ml rør til nukleinsyrepræparation eller på et glideglas til farvning. Genvind om nødvendigt det filtrerede blod til blodudløbet ved hjælp af en pipettespids på en milliliter.
De ekstraherede cfDNA'er blev evalueret ved hjælp af Bioanalyzer, og cfDNA-skærmbånd blev brugt sammen med en elektronisk stige. Den grønne linje blev brugt til at justere stigen og prøven. Trekantmærkerne angiver DNA-båndet.
De fleste cfDNA har en længde på 166 basepar, og nogle findes i heltalsmultipla af længde. Normalt måler koncentrationen af cfDNA op til størrelsen 50 til 700 basepar. Selvom der er en forskel i mængden opnået fra hver enkelt prøve, såsom 8,47 nanogram pr. milliliter og 5,2 nanogram pr. milliliter, var resultaterne af cfDNA-ekstraktion gode for både koncentration og størrelsesfordeling i alle tilfælde.
Disse resultater indikerer, at LBx 1-metoden nøjagtigt adskiller plasma indeholdende cfDNA. I FAST-auto blev membranen fjernet og farvet med fluorescerende antistoffer til påvisning af CTC'er og hvide blodlegemer. Den farvede membran, anbragt på glasglas, blev observeret under et fluorescensmikroskop.
Efter membranfarvning viser celler DAPI eller nukleare-positive signaler i blåt, mens EpCAM og CK eller CTC'er positive fremhæves med grønt, og CD45 eller WBC-positive fremhæves med rødt. Det er ikke svært at fjerne membranen. Det er dog nødvendigt at være forsigtig med tab og forurening af CTC'er.
Hele blod, PBMC og buffy frakke er alle tilgængelige. I stedet skal du bare indstille hele lydstyrken. Andre væsker kan også anvendes, selvom test vil være påkrævet.
Denne teknik kan betjenes direkte på hospitaler, og stoffet kan opnås hurtigt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
