Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier stellen wir zwei Protokolle, um die Phagozyten -Mycobacterium Abscessus Interaktionen zu untersuchen: das Screening ein Transposon mutierten Bibliothek für bakterielle intrazellulären Mangel und die Bestimmung der bakteriellen intrazellulären Transkriptom von RNA Sequenzierung. Beide Ansätze geben Einblick in die genomische vor- und transkriptomischen Anpassungen intrazelluläre Bakterien Fitness verbessern.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Was aus anderen saprophytischen Mykobakterien Mycobacterium Abscessus unterscheidet, ist die Fähigkeit, durch menschliche Makrophagen Phagozytose widerstehen und die Fähigkeit, innerhalb solcher Zellen vermehren. Diese Virulenz Eigenschaften Rendern M. Abscessus pathogenen, vor allem in gefährdeten Hosts mit zugrunde liegenden strukturellen Lungenerkrankungen wie Mukoviszidose, Bronchiektasen oder Tuberkulose. Es bleibt unklar, wie Patienten mit M. Abscessus infiziert werden. Im Gegensatz zu vielen Mykobakterien M. Abscessus findet sich nicht in die Umwelt aber befinden sich vielleicht innen Amöben, ökologische Phagozyten, die eine potenzielle Reservoir für M. Abscessusdarstellen. In der Tat M. Abscessus ist resistent gegen amöbenzelle Phagozytose und der Intra-Amöben Leben scheint M. Abscessus Virulenz in einem experimentellen Modell der Infektion erhöhen. Über M. Abscessus Virulenz an sich ist jedoch wenig bekannt. Um die Gene ein Vorteil zum M. Abscessus intrazellulären Leben zu entschlüsseln, war eine Vorführung einer M. Abscessus Transposon mutierten Bibliothek entwickelt. Parallel entwickelte eine Methode der RNA-Extraktion aus intrazellulären Mykobakterien nach kokultur mit Amöben. Diese Methode wurde validiert und erlaubt die Sequenzierung des gesamten M. Abscessus Transkriptom innerhalb der Zellen; zum ersten Mal eine globale Sicht auf M. Abscessus Anpassung an intrazelluläre Leben vorsieht. Beide Ansätze geben uns einen Einblick in M. Abscessus Virulenzfaktoren, mit denen M. Abscessus , die Atemwege des Menschen besiedeln.

Introduction

Die Gattung umfasst Mycobacterium Arten von harmlosen saprophytischen Organismen bis hin zu großen menschlichen Krankheitserreger. Bekannte pathogene Arten wie Mycobacterium Tuberculosis, Mycobacterium Marinum und Mycobacterium Ulcerans gehören zur Untergruppe der langsam wachsende Mykobakterien (SGM). Im Gegensatz dazu die Untergruppe der schnellsten wachsenden Mykobakterien (RGM) zeichnet sich durch ihre Fähigkeit, in weniger als 7 Tagen auf Agar Medium sichtbare Kolonien bilden. Die RGM Gruppe umfasst mehr als 180 Arten, vor allem nicht-pathogenen Mykobakterien saprophytischen. Studien zur RGM Interaktionen mit ihren Gastgebern konzentrierten sich hauptsächlich auf Mycobacterium Smegmatis und zeigen, dass diese Mykobakterien schnell durch die bakterizide Wirkung von Makrophagen beseitigt werden.

Mycobacterium Abscessus ist eines der seltenen RGM, die für den Menschen pathogen sind und ist verantwortlich für eine Vielzahl von Infektionen von Haut- und Weichteilinfektionen bis hin zu Lungen- und disseminierten Infektionen. M. Abscessus , zusammen mit Mycobacterium Avium, gilt die wichtigsten mykobakteriellen Erreger von Mukoviszidose-Patienten1.

Verschiedene Studien durchgeführt auf M. Abscessus zeigen, dass diese Mycobacterium verhält sich wie eine intrazelluläre Erreger, die in der Lage, zu überleben die bakterizide Antwort von Makrophagen und Fibroblasten in den Lungen und Haut, die in der Regel keine in RGM beobachtet wird 2 , 3 , 4. M. Abscessus Genomanalyse identifizierte Stoffwechselwege, die typischerweise in ökologischen Mikroorganismen in Kontakt mit dem Boden, Pflanzen und aquatischen Umgebungen, wo freie Amöben oft sind5. Sie haben auch gezeigt, dass M. Abscessus , mit mehreren Virulenz-Gene in die saprophytischen und nicht-pathogenen RGM ausgestattet ist, wahrscheinlich erworben durch horizontalen Gentransfer in einer Nische günstig zu genetischen Austausch, der sammeln könnte nicht gefunden verschiedene Amöben resistenter Bakterien.

Experimentell, war eines der ersten markanten Ergebnisse der Beobachtung des intrazellulären Zunahme von M. Abscessus Makrophagen sowie für M. Tuberculosis6. M. Abscessus widersteht auch die Versauerung von Phagosom, Apoptose und Autophagie, drei wesentliche Mechanismen der zellulären Widerstand zur Infektion2. Es hat auch gezeigt, dass M. Abscessus ist in der Lage, eine unmittelbare Kommunikation zwischen den Phagosom und Zytosol, einer mehr nährstoffreiche Umgebung, die bakterielle Vermehrung2begünstigen könnte. Sehr wenig bekannt über die genomische Vorteile, die M. Abscessus besitzt oder erwirbt Überleben in einer intrazellulären Umgebung zu ermöglichen. Amöbe-Coculture ist eine effiziente Methode, die die Isolation von vielen neuen Amöbe resistenten Bakterien wie Mycobacterium Massiliense7,8erlaubt. Die Fähigkeit, innerhalb Amöben vermehren wurde beobachtet, in einem Modell der Aerosolization von M. Abscessus bei Mäusen, die eine höhere Virulenz, M. Abscessus4verleihen können. Eine Hypothese ist, dass M. Abscessus genetische Merkmalen begegnet in dieser Umgebung überleben in phagocytic Zellen, die sich von anderen nicht-pathogenen RGM entwickelt hatte. Diese Akquisitionen könnten die Fähigkeit, zu verbreiten und seine Virulenz im menschlichen Wirt begünstigen.

Dieser Bericht beschreibt Werkzeuge und Methoden, um die genomische Vorteile, M. Abscessus in Amöben Umgebung überleben übertragen wurden. Zu diesem Zweck ist das Screening von M. Abscessus Transposon Mutanten, auf dem Acanthamoeba Castellanii Typ Stamm erstbeschrieben ermöglicht die Identifizierung von Mutant defekt für intrazelluläre Wachstum. Eine zweite Überprüfung in Makrophagen wird auch berichtet, zu bestätigen, wenn dieser Mangel in der menschlichen Wirt fortbesteht. Zweitens entwickelt um zu verstehen, welche Mechanismen in M. Abscessus zur Anpassung an das Leben in phagocytic genutzt werden Zellen und erhöhen Sie seine Virulenz im tierischen Wirt, eine Methode, die speziell für M. Abscessus war, nach kokultur in Anwesenheit von Amöben, die die Gewinnung von Gesamt-RNS aus Intra-amöbenzelle Bakterien erlaubt. Infolgedessen entwickelte sich ein umfassender Überblick über M. Abscessus Gene, die für eine intrazelluläre Leben erforderlich sind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

(1) Bibliothek Screening

  1. Aufbau der Tn mutierten Bibliothek
    1. Erhalten Sie eine Transposon-Bibliothek.
      Hinweis: Für dieses Experiment wurde eine Transposon mutierten Bibliothek von e.j. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA erhalten. Die Bibliothek wurde aus einem glatten klinischen Stamm (43) aus der M. Abscessus Komplex (M. Abscessus subspecies Massiliense) mit einem Phagemid in M. Abscessus erlaubt die zufällige Einfügung eines einzigen Tn eingeführt gebaut. in einer TA-Dinucleotide (91.240 TA-Sequenzen im Genom M. Abscessus ). Weitere Informationen finden Sie unter Referenz der Rubin Et al. 9 und Laencina Et al. 10.
  2. Titration der Bibliothek und der Erhaltung der M. AbscessusTn Mutanten in Platten
    Hinweis: Dies dauert eine Woche.
    1. Die Bibliothek auf dem Eis Auftauen. Bestimmen Sie die Bakterienkonzentration von Verdünnungsreihen in 1 mL Wasser (10-1 bis 10-15) durchführen. Einen Tropfen von jeder Verdünnung auf eine Petrischale mit 7H 11 Agar Medium mit 250 mg/mL Kanamycin-Platte. 3 – 4 Tagen inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C.
      Hinweis: Hier eine Titrierung von 1011 Bakterien/mL wiederhergestellt wurden.
    2. Nach Bestimmung der Konzentration der Bibliothek, die Bibliothek, um eine Endkonzentration von 3.000 Bakterien/mL in 10 mL 25 % Glycerin-Wasser zu verdünnen. Aliquot der Bibliothek in 10 Cryoröhrchen mit 1 mL der Bibliothek in jedem Röhrchen. Speichern der Aliquote bei-80 ° C.
    3. Wenn Sie bereit sind, zu verwenden, tauen Sie ein Aliquot der verdünnten Bibliothek im Eis auf und 10 Quadratmeter Mueller-Hinton (MH)-Agarplatten (Größe 12 cm) fügen Sie 100 µL der Bibliothek hinzu, um 200 bis 300 einzelnen Kolonien nach 3 – 4 Tagen Inkubation bei 37 ° c zu erholen
    4. Mit sterilen Zahnstocher, Übertragung der einzelnen Kolonien (etwa 6.000 Kolonien in 60 x 96-Well Platten) in 96-Well-Platten mit 200 µL 7 H 9 Medium ergänzt mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose, 250 mg/mL Kanamycin gefüllt. 5 Tage ohne schütteln bei 37 ° C inkubieren.
    5. Übertragen von 100 µL der Kultur (Schritt 1.2.4) auf einer 96-Well-Platte mit 100 µL 7H 9 mittlere mit 40 % Glycerin. Speichern der bestellten Bibliothek bei-80 ° C.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3. auf 1.2.5. mit dem Rest der Bibliothek bis 10.000 einzelnen Klone werden (ca. 100 x 96-Well-Platte und 30 MH Platten) wiederhergestellt.
  3. Vorbereitung der Amöben
    1. Kultur-Amöbe Acanthamoeba Castellanii (AC) in 75 cm2 Gewebe Kulturflaschen bei Raumtemperatur (RT) in 30 mL PYG Medium (Tabelle 1) zur Verstärkung der Zelle Zeile11.
      Hinweis: Reife Trophozoiten von große anhaftende Zellen mit zahlreichen Verdauungs Vakuolen sind gut sichtbar am Mikroskop. Die Verdopplungszeit Zelle wird geschätzt, um 25 h. Zellen werden alle 3 Tage durch die Verbreitung ein Drittel der ursprünglichen Kultur in 75 cm2 Gewebe Kulturflaschen verstärkt wurden.
    2. Entfernen Sie das PYG Medium mit einem 25-mL-Pipette. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL AC Puffer (Tabelle 2), die keiner Kohlenstoff oder Stickstoff Quellen12enthält. Wiederholen Sie die Wäsche noch zweimal.
      Hinweis: AC Puffer, keine Kohlenstoff oder Stickstoff Quellen enthält, vermeidet das extrazelluläre Wachstum von Mykobakterien. Diese minimale Medium führt zu die halbgefrorenen Amöben. Um dies zu begrenzen, Hitze-inaktivierten e.coli hinzugefügt wurden als Substrat (Schritt 1.4) Amöben und sehr kurze kulturzeiten (48 h für Mutant screening) und 4 h oder 16 h Kultur für RNAseq Experimente gefördert wurden. Alternativ können Sie dieses Medium aber angereichert mit PYG Medium (in der Regel 10 %).
    3. Lösen Sie die Amöbe von der Unterseite des Kolbens mit einem einzigen kräftigen Schütteln der Gewebekultur-Küvette.
    4. Anzahl Zellen mit eine Hemocytometer Anpassung der Zellkonzentration bis 5 x 105 Amöben/mL verdünnt in AC-Puffer.
  4. Vorbereitung von Hitze-inaktivierten Escherichia coli Bakterien, Amöben nach der Infektion zu ernähren
    1. Wachsen Sie die E. Coli klinische isolate Belastung aus einem Glycerin-bestand in 100 mL von der Brühe Luria (LB) über Nacht bei 37 ° C.
    2. Ernten Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 1.835 X g für 10 min in 50 mL-Tuben. Verwerfen Sie den überstand. Das Pellet mit 10 mL 10 % Glycerin-Wasser aufschwemmen. Wiederholen Sie das Waschen noch zweimal.
    3. Das Pellet mit 5 mL 10 % Glycerin-Wasser aufschwemmen. Aliquoten 0,5 mL in 1,5 mL Röhrchen. Bestimmen Sie die Menge an Bakterien/mL durch serielle Verdünnungen und Hinzufügen von Verdünnungen auf LB-Agar-Platten. Speichern der Aliquote bei-80 ° C.
    4. Am Vortag der Amöben-Infektion, tauen Sie eine Aliquote auf Eis auf und fahren Sie mit Hitze-Tötung durch das Rohr bei 70 ° C für 60 min Inkubation.
      Hinweis: Überprüfen Sie die Inaktivierung durch Ausplattieren 100 µL inaktivierte Bakterien auf LB-Agar-Platten über Nacht bei 37 ° C. Keine Kolonien sollte nach einer Nacht der Kultur sichtbar sein.
    5. Die Hitze getötet Bakterien zu einer Konzentration von 107 Bakterien in 50 µL AC Puffer verdünnen und die verdünnten Bakterien bei 4 ° C nicht mehr als eine Woche lang zu speichern.
  5. Kokultur Amöben -M. Abscessus Tn Mutante: erster Bildschirm
    Hinweis: Dies dauert 3 – 4 Monate für das Screening von 6.000 Mutanten.
    1. 5 x 104 Amöben/gut zu einer 96-Well-Platte in 100 µL des AC-Puffers zu verbreiten. Inkubation für 1 h bei 32 ° C ohne schütteln. Lassen Sie die schwimmenden Amöbe Trophozoïtes Zeit zur Einhaltung der Brunnen.
      1. Während der Inkubation, tauen Sie Bakterien auf Eis für 1 h.
    2. Fügen Sie 5 µL der aufgetauten Bakterienkulturen mit einem elektronischen Mehrkanal-Pipette. Für 1,5 h Bildschirm um 6.000 individualisierte Klone aus der 96-Well-Platte Tn Mutanten Lager zu infizieren.
      Hinweis: Die MOI ist bei diesem Schritt des Protokolls unbekannt; jedoch wurden alle 96-Well-Platten mit Tn -Mutanten in genau der gleichen Weise angebaut. Diese ersten Bildschirm soll intrazelluläre mangelhafte Mutanten, schnell zu identifizieren, ohne Rücksicht auf die Variationen im Inokulum Dichte.
    3. Invertieren Sie nach einer Infektion die 1,5 h die 96-Well-Platte auf sterile Gazen gelegt in eine sterilisierte metalltablett, AC Medium unter einem Abzug zu entfernen. Füllen Sie mit 200 µL AC Medium. Wiederholen Sie diese zweimal waschen.
    4. Fügen Sie 200 µL frisches Medium ergänzt mit 100 µg/mL Amikacin, restlichen extrazelluläre Mykobakterien zu beseitigen.
    5. Inkubieren Sie für 2 h vor dem Fortfahren mit 3 zusätzlichen Waschungen (wie in Schritt 1.5.3 beschrieben). Nach dem Waschen, pflegen Sie die Kulturen mit 50 µg/mL Amikacin in 200 µL des AC-Puffers.
    6. Fügen Sie 5 x 107 Hitze-inaktivierten Escherichia-coli -Bakterien (aus Schritt 1.4) am Ende der Infektion und alle 24 h, halbgefrorenen der Amöben zu verhindern.
    7. Lösen Sie nach 48 h kokultur die Zellen durch Zugabe von 10 µL 10 % SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 30 min bei 32 ° C. Führen Sie die serielle Verdünnung und add-on Columbia Agarplatten mit 5 % Schafe Blut (COS-Platten), um die Anzahl der intrazellulären Mykobakterien zu bewerten. Dichtplatte mit der Parafilm und bei 37 ° c inkubieren
    8. Wenn Kolonien auf den Agarplatten nach 3-4 Tagen, Foto der Platte erscheinen und identifizieren die Mutanten durch Beobachtung der Einlagen mit der niedrigsten Anzahl der Bakterienkolonien für intrazelluläre Wachstum beeinträchtigt.
      Hinweis: Habe nichts dagegen Sie, über Form, Höhe und Dichte der Kolonie (Abb. 1A). 136/6000 Mutanten wurden identifiziert.
  6. Kokultur Amöben -M. AbscessusTn mutierte: Zweitbildschirm von Mutanten, die bei dem ersten Bildschirm erkannt
    Hinweis: Dies dauert 2 Wochen. Ein zweiter Bildschirm muss mit 136 abgeschwächten Mutanten erhalten nach dem ersten Bildschirm zu quantifizieren, gerade die Zahl der Bakterien beimpft und die Anzahl der intrazellulären überleben Bakterien 2 Tage nach der Infektion durchgeführt werden.
    1. Gewachsen 1 Kolonie von jedem betroffenen Mutante in 50 mL Tuben gefüllt mit 20 mL 7H 9 Medium ergänzt mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose und 250 mg/mL Kanamycin. Die Bakterien, die exponentielle Phase zu erreichen (0,6 < OD < 0,8).
    2. Waschen Sie die Kultur durch Zentrifugieren (1.835 X g für 10 min.) in AC Medium. Verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie das Waschen zweimal mit 20 mL 7H 9 Medium mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose und 250 mg/mL Kanamycin ergänzt.
    3. Die Bakterien in 5 mL AC Puffer aufzuwirbeln.
    4. Bestimmen Sie die koloniebildenden Einheit (KBE) Konzentration der Mutanten. Fügen Sie in 24-Well-Platten 1 mL Wasser auf die zwei ersten Zeilen. Die erste Bohrung 100 µL der Bakteriensuspension hinzufügen. Mischen Sie mit einer Mikropipette dreimal. Aspirieren Sie dann gut 100 µL und Einzahlung in die zweite.
    5. Wiederholen Sie mit einer neuen Spitze Schritt 1.6.4 aus dem zweiten Brunnen auf der dritten, usw. bis zum zwölften gut.
    6. Aspirieren Sie 30 µL 10-12 Verdünnung und fügen Sie es ein COS-Platte. Wiederholen Sie für die anderen Verdünnungen.
    7. Die COS-Platte mit Parafilm wickeln und 3 – 4 Tage bei 37 ° c inkubieren Bestimmen Sie die Konzentration durch das zählen der Kolonien.
    8. Führen Sie kokultur Assays, wie oben beschrieben in dreifacher Ausfertigung in einer 24-Well-Platte mit 5 x 104 Amöbe pro Bohrloch in 1 mL AC kokultur Medium. Impfen Sie mit einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 10.
    9. Fahren Sie nach 48 h kokultur mit der Lyse der Zelle wie in Schritt 1.5.7 beschrieben. Führen Sie serielle Verdünnungen in Wasser (10-1 bis 10-6) und der COS-Platten fügen Sie 30 µL hinzu. 4 Tage bei 37 ° C, bevor Sie fortfahren mit KBE zählen inkubieren Sie die Platten.
      Hinweis: Nach diesem zweiten Bildschirm wurden 60 von 136 Mutanten konserviert.
    10. Speichern Sie die Mutanten, die für ihr Überleben in den Zellen beeinflusst. Fügen Sie eine Kolonie zu einem Cryotube mit LB-Medium mit Glycerin (20 % final) oder in eine kommerzielle Lösung mit Microbeads zugunsten einer langfristigen Erhaltung und künftige Impfung zu erleichtern und dann speichern bei-80 ° c cryotube
    11. Bewertung der in-vitro- mutierte Wachstum durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm alle 2 Tage.
      1. 1 wachsen Kolonie von jedem betroffenen Mutante in 50 mL Röhrchen gefüllt mit 20 mL 7H 9 Medium mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose und 250 mg/mL Kanamycin ergänzt. Die Bakterien, die exponentielle Phase zu erreichen (0,6 < OD < 0,8) vor der Einstellung der OD auf 0,01 um die Kinetik zu beginnen.
      2. Schließen Sie Mutanten mit einem in-vitro- Wachstum defekt im Vergleich mit dem WT-Stamm aus dem Satz von intrazellulären mangelhaft Mutanten aus.
  7. KokulturM. Abscessus Tn Mutante Makrophagen - defekt für eine Intra-Amöben Leben
    Hinweis: Dies dauert 1 Monat.
    1. Verbreiten Sie 5 x 104 J774.2 murine Makrophagen pro Bohrloch einer 24-Well-Platte in 1 mL reichen Medium, DMEM mit 10 % des fetalen Kalb Serum (FCS) ergänzt. Inkubieren Sie die Platten für 24 h bei 37 ° C und 5 % CO2 zu Makrophagen Haftung ermöglichen. Geben Sie 3 Wiederholungen.
    2. Führen Sie die Infektion. Tn -Mutanten mit einer MOI von 10, in DMEM mit 10 % FCS in einem Volumen von 100 µL verdünnt zu impfen.
    3. Führen Sie nach 3 h der Infektion drei Wäschen mit 1 mL DMEM (eine Vakuumpumpe kann verwendet werden). Dann gönnen Sie sich 250 µg/mL Amikacin (in DMEM mit 10 % FCS) für 1 h, restlichen extrazelluläre Mykobakterien zu beseitigen.
      1. Nach 3 weiteren mit 1 mL DMEM wäscht, pflegen Sie die Kulturen in 250 µg/mL Amikacin (in DMEM mit 10 % FCS) zu einem Endvolumen von 1 mL, extrazelluläre mykobakteriellen Multiplikation zu verhindern.
    4. 72 h nach kokultur, entfernen Sie das Medium und die Makrophagen durch Zugabe von 1 mL kaltem Wasser lösen. 30 min bei 4 ° c inkubieren
    5. Führen Sie KBE-Assays auf COS Platten zum Auswerten der Anzahl von intrazellulären Bakterien.
      1. Fügen Sie in einer 24-Well-Platte 1 mL Wasser auf die zwei ersten Zeilen. Die erste Bohrung 100 µL der Co Zelle lysate hinzufügen. Mischen Sie mit einer Mikropipette dreimal. Aspirieren Sie 100 µL und hinterlegen sie in der zweiten gut.
      2. Wiederholen Sie mit einer neuen Spitze die Verdünnung aus dem zweiten Brunnen auf der dritten, usw. bis zum zwölften gut. Dann Aspirieren Sie 30 µL 10-12 Verdünnung und fügen Sie es ein COS-Platte.
      3. Wiederholen Sie für die anderen Verdünnungen. Wickeln Sie die COS-Platte mit Parafilm und warten Sie 3-4 Tage zu beobachten und zählen der Kolonien.
  8. Identifizierung und Sequenzierung des Standortes der Einfügung des Tn in M. Abscessus Mutanten
    Hinweis: Dies dauert 1,5 Monate für 60 Mutanten.
    1. Genomische Extraktion der identifizierten M. Abscessus Mutanten
      1. Wachsen die Mutanten in der 50 mL-Tube mit 20 mL 7H 9 Medium ergänzt mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose und Kanamycin 250 mg/mL zur exponentiellen Phase (OD600= 0,8).
      2. Sammle 10 mL der Kulturen (2.396 X g, 5 min). Verwerfen Sie den überstand. Aussetzen der Bakterien in 500 µL Lösung I (25 % Saccharose, 50 mM Tris pH 8, 10 mg/mL Lysozym, 40 mM Thioharnstoff). Übertragen Sie die Lösung in 2 mL Röhrchen mit Schraubverschluss und 2 h bei 37 ° c inkubieren
      3. Fügen Sie 500 µL Lösung II (25 % Saccharose, 50 mM Tris pH 8, 50 mM EDTA). Nach pipettieren und unten fügen Sie 5 - 10 mal hinzu, Zirkonium Perlen bis zu einem Volumen von 500 µL in der Röhre.
      4. Fahren Sie mit der Lyse der Zelle mit einem Homogenisator (3 x 6.000 u/min, 45 s) mit einer 1 min Inkubation auf Eis zwischen jeder Runde.
      5. Fügen Sie 5 µL von 20 mg/mL Proteinase K (100 µg/mL Final) und inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 55 ° C.
      6. Fügen Sie 1 mL kaltes Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohol (25:24:1) unter einem Abzug. Mischen Sie die Proben durch Vortexen bevor mit Zentrifugation bei RT und 16.500 X g für 30 min..
      7. Erholen Sie nach Zentrifugation die wässrige Phase zu, und fügen Sie ein gleiches Volumen kaltes Phenol/Chloroform/Isoamyl-Alkohol-Lösung unter einer Haube. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.500 X g für 30 min in der wässrigen Phase wieder zu erholen.
      8. Die wiederhergestellten wässrige Phase unter einem Abzug 0,7 Volumen von RT Isopropanol hinzufügen. Kehren Sie langsam die Rohre, damit DNA Niederschlag und 5 min bei RT inkubieren Zentrifugieren Sie dann für 10 min bei 16.500 X g und RT.
      9. Entfernen Sie den überstand zu und waschen Sie das Pellet mit 500 µL 70 % Ethanol unter einer Haube. Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 min bei 16.500 X g bei RT vor dem Entfernen des Ethanols. Inkubieren Sie für 10 min bis zum restlichen Alkohol verdampfen lassen.
      10. Schließlich hängen Sie das DNA-Pellet in 100 µL DNase/RNase freies Wasser. Bestimmen Sie die DNA-Ausbeute und Reinheit-DNA mit einem Spektrophotometer.
      11. 1 µg genomische DNA und verdauen mit 10 U ClaI für eine Nacht für die Tn Einstichstelle vor-Klonen zu entfernen. Protokoll des Herstellers zu verwenden.
        Hinweis: Die Claich Enzym ist eines der stärksten vertretenen Restriktionsenzyme in M. Abscessus Genome (2.173 Restriktionsschnittstellen). Eine Claich Einschränkung Website findet sich auch in der Tn-Sequenz stromaufwärts der Kanamycin Resistenz Kassette Tn mutierte. Die Cla-vermittelten subcloning ermöglicht somit, um die Tn Insertionsstelle zu identifizieren.
    2. Vor-Klonen in ein Plasmid genomic DNA mit der Tn
      Hinweis: Bevor mit den Tn-subcloning in der 2.686 bp pUC19 Ampicillin-resistente Plasmid, fügen Sie ein Claich Einschränkung Standort in die Site mit mehreren Klonen des Plasmids. Die Reihenfolge der das Plasmid pUC19 finden Sie unter diesem Link https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Folgen Hersteller ist Protokoll zu verdauen das Plasmid pUC19 mit EcoRich und HindIII, die ein Fragment von 51 releases bp und ein Fragment von 2635 BP. reinigen den doppelte verdauten Vektor mit einem kommerziellen PCR Reinigung Kit zur Beseitigung der 51 bp Fragment veröffentlicht.
      2. Mix 1 µL (Konzentration 25 Pmol/µL) von zwei komplementären Oligonukleotiden (5 'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3' und 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') von 28 bp jeweils die Claich Einschränkung Website und an den Enden der HindIII und EcoR Ich Restriktionsschnittstellen. Bei 100 ° C für 10 min erhitzen Sie und kühlen Sie ab, um sie zu binden.
      3. Die gepaarten Primer von EcoRverdauen ich und HindIII laut Protokoll des Herstellers.
      4. Verbinden von 150 ng EcoRich /HindIII-eingeschränkten pUC19 Plasmid mit unterschiedlicher Konzentration von gekoppelten Primer (25 Pmol/µL, 50 Pmol/µL, 2,5 Pmol/µL) für 1 h bei RT mit 1 U T4 DNA-Ligase in einem Endvolumen von 20 µL. Überprüfen Sie das Klonen von einem anderen enzymatische Verdauung.
      5. Das modifizierte Plasmid mit Clazu verdauen ich für 2 h bei 37 ° C.
      6. Verbinden von 50 ng der Cla-eingeschränkt pUC19Plasmid und 50 ng genomic DNA von Cla verdautich für 1 h bei RT mit 1 U T4 DNA-Ligase in 10 µL.
      7. Fahren Sie mit E. Coli Electrocompetent Bakterien Transformation mit 5-10 µL der Ligatur (2500 V, 200 Ohm, 25 µF). Wählen Sie die Klone auf Agarplatten LB ergänzt mit 50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL Ampicillin die Bakterien tragen Plasmide mit Anteilen von Tn-Sequenzen auswählen.
      8. Wachsen Sie resistente Klone in LB-Flüssigmedium mit den entsprechenden Antibiotika Auswahl (50 µg/mL Kanamycin und 50 µg/mL Ampicillin) über Nacht.
      9. Extrahieren Sie Plasmid DNA. Überprüfen Sie das Vorhandensein des Einsatzes durch enzymatische Einschränkung und 3' Ende der Tn der gestörte gen zu identifizieren, mit einer Oligonukleotid (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') entspricht die letzten 17 Basenpaare der Tn Kanamycin-Sequenz Widerstand-Kassette.
      10. Richten Sie die Sequenz gegen M. Abscessus gehen 06 Belastung durch Ausführen einer Nukleotid-Explosion (BLAST-N).

2. RNA-Extraktion von intrazellulären Mykobakterien für Rnaseq Analyse

Hinweis: Dies dauert 4 Monate für Experimente und 4 Monate für die RNAseq Analyse.

  1. Kokulturen von Amöben-M. Abscessus in Chargen
    Hinweis: Im folgenden Experiment erfolgt kokultur in 50 mL Röhrchen mit Agitation, Bakterien zellkontakte zu bevorzugen.
    1. Wachsen M. Abscessus in 7 H 9 Medium mit 0,2 % Glyzerin, 1 % Glukose in die Mitte-exponentielle Phase bei 120 u/min ergänzt.
    2. Waschen Sie die Bakterien zweimal mit 10 mL des AC-Puffers.
    3. Schätzen Sie die Bakterien-Konzentration durch die Messung der OD600nm (1 OD600= 4 x 108 Mykobakterien). 8,5 x 106 Amöben in 10 mL AC Medium 8,5 x 108 Mykobakterien hinzufügen.
    4. Inkubation für 1 h bei 30 ° C mit sanften Agitation (ca. 80 u/min).
    5. Ernte der Zellen durch Zentrifugieren bei 253 X g für 12 min. Überstands entfernen und hängen Sie die Zellen in 10 mL AC Puffer. Wiederholen Sie diese zweimal waschen.
    6. Aufzuwirbeln Sie die Zellen in 10 mL AC-Puffer mit 50 µg/mL Amikacin zur Beseitigung extrazellulärer Bakterien und 4 h bei 30 ° C mit sanften Agitation (80 u/min) inkubieren. Waschen Sie die Zellen noch zweimal.
  2. Extraktion von Gesamt-RNS von intrazellulären M. abscessus
    Hinweis: Führen Sie Schritte 2.2.1–2.2.3 unter dem Abzug durch den Einsatz von toxischen Reagenzien.
    1. Nach der endgültigen Wäschen Aufschwemmen der infizierten Amöben in 4 mL kalte Lösung III (Tabelle 3) mit aus dem Stegreif 280 µL der β-Mercaptoethanol, Amöben zu stören. Dies ist der Guanidinium-Thiocyanat (GTC)-Schritt. Pflegen Sie die Suspension auf Eis für 10 min. Zentrifuge der Zelle lysate für 30 min bei 2.396 X g und 4 ° C um die freigesetzten intrazellulären Bakterien pellet.
    2. Entfernen des Überstands und Aussetzen der bakteriellen Pellets in 1 mL kalte Lösung III. Ernten Sie die Bakterien bei 2396 X g für 30 min bei 4 ° C. Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL Extraktionspuffer und Überführung in eine 2 mL Schneckenrohr mit Zirkonium-Perlen (bis 500 µL Abstufung des Rohres). Speichern Sie die Rohre für mindestens 24 h bei-80 ° C.
      Hinweis: Lagerung in der Lyse-Reagenz ermöglicht die Inaktivierung von RNases und Zelle Auflösung.
    3. Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, Proben auf Eis Auftauen und lösen sie mit einem Homogenisator durch Ausführen von zwei Runden bei 6.000 u/min für 25 s, gefolgt von einer Runde bei 6.000 u/min für 20 s mit einem 1 min Inkubation auf Eis zwischen jeder Runde.
    4. Um die Probe abkühlen, inkubieren sie für 10 min auf Eis. Dann fügen Sie 200 µL Chloroform in Isoamyl Alkohol verdünnt. Nach dem aufschütteln Zentrifugieren die Proben 1 min für 15 min bei 16.500 x g und 4 ° C.
    5. Die wässrige Phase 0,8 mL kaltem Isopropanol hinzu und inkubieren Sie die Proben für 2 – 3 h bei 20 ° C. Zentrifugieren Sie Proben für 35 min bei 16.500 x g und 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
    6. Waschen der RNA-Pellet durch Zugabe von 500 µL kaltem 70 % igem Ethanol (nicht zu verwechseln).
    7. Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.500 X g für 10 min, das Ethanol zu entfernen. Aspirieren Sie die Lösung und Trocknen in einem zentrifugalen Konzentrator.
    8. Sobald getrocknet, Aufschwemmen der Pellets in 100 µL DNase/RNase freies Wasser.
      Hinweis: Proben müssen zweimal DNasen DNA Verunreinigungen gemäß den Empfehlungen des Herstellers entfernen behandelt werden.
    9. Bewerten der Integrität der RNA auf einem Agarosegel und bestätigen durch die Messung der RNA-Integrität-Anzahl (RIN) und die ribosomale Verhältnis mit einer Chip-basierte Kapillarelektrophorese-Methode.
      Hinweis: Der RIN berücksichtigt die gesamte elektrophoretische Spur. Die RIN Softwarealgorithmus ermöglicht die Klassifizierung von Gesamt-RNS, basierend auf eine Nummerierung von 1 bis 10, wobei 1 die meisten degradierten Profil und 10 ist der am besten erhaltenen. Zum Fortsetzen der cDNA Bibliothek Vorbereitung muss die RINs über 8 und die ribosomale Verhältnis [28 s/18] so hoch wie möglich, den idealen Wert 2, je nach Organismus und seine Besonderheiten.
    10. Lagern Sie RNA-Proben bei-80 ° C bis zur Vorbereitung der cDNA-Bibliothek für die Sequenzierung.
  3. Vorbereitung der cDNA-Bibliothek
    1. Zum Fortsetzen der Bibliothek Vorbereitung verwenden Sie eine handelsübliches cDNA Synthese Kit (Table of Materials) mit der Hersteller-Protokoll.
    2. Überprüfen Sie die Bibliothek für Konzentration und Qualität auf einem DNA-Chip.
      Hinweis: Genaue Quantifizierung kann sensible Leuchtstoff-basierte Quantifizierung Tests durchgeführt werden.
  4. Bibliothek-Sequenzierung
    1. Normalisieren Sie die Proben bis 2 nM und gehen Sie zum Multiplexen entsprechend der Organisation des Flows Zelle.
    2. Denaturieren die Proben in einer Konzentration von 1 nM mit 0,1 N NaOH für 5 min bei RT
    3. Verdünnen Sie die Proben an 22:00. Laden Sie jede Probe auf die Messzelle an 22:00.
    4. Sequenzierung mit Hochdurchsatz-Sequenzierung System große Genomics können fortsetzen. Hier wurde der Lauf einer SRM-Ausführung (SR: einzelne lesen, PE: gepaart Ende liest, M: gemultiplext Proben) 51 Zyklen mit 7 Index-Grundlagen zu lesen.
    5. Die Qualität der Sequenzierung mit dem externen FastQC Programm13zu bewerten.
    6. Nach dem Trimmen des Adapter-Sequenzen, fahren Sie mit lesen Sie Achsen gegen ein Referenz-Genom. Richten Sie sich gegen die eukaryotic Zelle Genom zu bewerten Kontamination der Probe und wenn nötig, gehen mit dem Beschneiden von der nicht-bakteriellen liest.
  5. Statistische Analyse
    1. Verschiedene Software-Programme online verwenden, um Gruppen von differentiell exprimierten Genen definieren: R-Software, Bioconductor Pakete einschließlich DESeq2 und das PF2tools-Paket (Version 1.2.12) entwickelt, die auf der Plattform "Transkriptom et Epigénome" (Pasteur Institut, Paris).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

M. Abscessus hat die Fähigkeit zu widerstehen und die bakteriziden Antworten von Makrophagen und Umwelt Einzeller wie Amöben zu entkommen. M. Abscessus drückt Virulenzfaktoren bei Kontakt mit Amöben, gewachsen, wodurch es mehr virulent in Mäusen4. Das erste Ziel dieser Methoden war, die im M. Abscessus , so dass seine überleben und die Vermehrung in Amöben Gene zu identifizieren.

Dafür lief eine mutierte Bibliothek von M. Abscessus subspecies Massiliense, Tn Lieferung9, erzielten nach kokultur in Anwesenheit von Amöben, Ermittlung von Mutanten mit einem abgeschwächten Wachstum in diesem intrazellulären Umwelt (Abbildung 1). Auch wurde das Verhalten der gleichen Mutanten bewertet nach kokultur mit Makrophagen zu analysieren, ob diese Abschwächung des Wachstums in Mäusen Makrophagen erhalten blieb.

Diese blinde Transposon-Bibliothek screening-Ansatz, bestätigt einen fehlerhafte Replikation Phänotyp für 47 von 6.000 Mutanten, die hatte eine Überlebensrate von 50 % oder weniger in Amöben und/oder Makrophagen, im Vergleich zu10steuert. Um auszuschließen, wurden Mutanten mit attenuierten intrazelluläre überleben, die mangels einer inneren Wachstum von Mycobacterium, das Wachstum Kurven alle ausgewählten Tn Mutanten möglicherweise in einem in-vitro- Flüssigkultur bereichert Medium (1 % bewertet. Glukose - 7 H 9). In-vitro- Wachstum aller Mutanten wurde überwacht, indem Sie die folgenden OD600 Kulturen alle 2 Tage. Die verschiedenen Mutanten, die einen in-vitro- Wachstum-defekt im Vergleich zu den entsprechenden Wildtyp Stamm angezeigt wurden aus der Studie ausgeschlossen.

Es war von entscheidender Bedeutung für diesen blind Test jeden Tag mit genau dem gleichen Protokoll wiedergegeben werden. Die Einschränkung dieser Technik war bei der ersten visuellen Vorführung, fotografiert wurde von jedem KBE, ein genaues Bild als Referenz zur Verfügung. In dieser Gruppe von Mutanten wurden 12 M. Abscessus Mutanten (inklusive Duplikate) identifiziert, in denen das Transposon in Gene gehören zu den ESX-4-Locus des Typs VII Sekretion System seine Bedeutung in der intrazellulären unterstreicht eingefügt wurde Wachstum von M. Abscessus10.

Bis jetzt hat die Analysen von M. Abscessus Virulenz im Wesentlichen auf die vergleichende Analyse des Genoms von M. Abscessus , M. Chelonae, ein Mycobacterium zu derselben Gruppe gehören aber nur Infektionen verursachen basieren der Haut beim Menschen. Ziel war es, einen Katalog der Gene bei verschiedenen kokultur um besser zu verstehen, die Anpassung und potenziell Virulenzmechanismen während kokultur im Beisein von Umwelt-Profi beteiligt zu erhalten Phagozyten. Analyse dieser erhöhte Virulenz durch einen umfassenden Ansatz der Totalsequenzierung Messenger-RNAs von M. Abscessus, wurde durchgeführt, um die RNAs induziert oder unterdrückt während Amöbe ko-Kulturen im Vergleich zu der transkribiert unter RNAs erkennen in-vitro- Bedingungen. Die differentielle Expression von diesen RNAs verleihen kann, M. Abscessus eine verbesserte "Virulenz", erklären die Besiedlung der oberen Atemwege beim Menschen.

Diese ko-Kulturen wurden wieder in einem minimalen Medium (keine Quelle von Kohlenstoff oder Stickstoff) durchgeführt wie oben beschrieben, um zu verhindern das extrazelluläre Wachstum von M. Abscessus und repräsentativ für die ökologischen Bedingungen, unter denen diese Mykobakterien und unter dem Druck der Auswahl eines Antibiotikums während der gesamten Dauer der kokultur intrazelluläre Mykobakterien auswählen.

Daher wurde eine Technik entwickelt, um die RNA von intrazellulären Mykobakterien zu isolieren. Die größte Schwierigkeit mit dieser mykobakteriellen RNA-Extraktion wurde Kontamination mit amöbenzelle RNA (Eukaryote Typ) vermeiden. Um dies zu vermeiden, erfolgte die Lyse der Amöbe zu unterschiedlichen Zeiten Post kokultur mit Guanidinium-Thiocyanat (GTC); Da intrazelluläre Mykobakterien resistent sind. Nach diesem Schritt wurde eine mechanische Extraktion der mykobakteriellen RNAs mit einer Zelle-Homogenisator in Anwesenheit von Zirkonium Perlen durchgeführt. Diese Technik erlaubte es uns mykobakteriellen RNA von guter Qualität, mit verschiedensten RIN von hoher Qualität, wesentliche Verbesserung die Fähigkeit, eine vollständige Analyse des transkriptoms M. Abscessus verpflichten sich mit der Sequenzierung der Boten-RNA (mRNA) zu erhalten Technik (Abbildung 2). Dies hat nie zuvor getan und gab uns eine grundlegende Vorstellung von Genfamilien induziert oder unterdrückt, indem sie abhängig von ihrer Funktion gruppieren: die Antwort von M. Abscessus zu einer Umgebung, in der Quelle der Nährstoffe und Mineralien, zu einem hypoxischen eingeschränkt oder saures Milieu und Widerstand von M. Abscessus , oxidative und Nitrosative Stress, und schließlich Ausdruck die Virulenz von M. Abscessus in ökologischen Amöbe.

Figure 1
Abbildung 1 : A. ersten Bildschirm des M. Abscessus Tn Mutanten in Amöben. (A) großen Bildschirm von Tn -Mutanten auf Amöben erfolgt in 96-Well-Platten mit einer zufälligen Vielzahl von Infektion, abgeschwächte Mutanten schnell zu identifizieren. (B) Identifizierung der abgeschwächten Tn Mutanten gestört Gene. TN -Mutanten genomischer DNA ist mit Clafragmentiert ich Tn Insertionsstelle zu klonen. M. Abscessus Genome birgt 2500 Claich Einschränkung Websites welche begünstigt die Erlangung kurze DNA-Fragmente aber senkte die Wahrscheinlichkeit die Tn Insertionsstelle (1/2500) Klonen. Die Klone sind mit Kanamycin, Widerstand Bären durch das Transposon ausgewählt. Das gestörte Gen wird durch Sequenzierung mit einem Primer in der Tn Kanamycin-Resistenz-Kassette (schwarzer Pfeil) identifiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Analyse der mykobakteriellen RNA Extraktion. (A) RNA-Extraktion von intrazellulären M. Abscessus während Amöben -M. Abscessus kokultur. Amöben-ko-Kulturen mit M. Abscessus werden an eine hohe Vielzahl von Infektion (z. B. 100), in großen Mengen, mit sanften Agitation, zugunsten der Zelle Bakterien Kontakte durchgeführt. Nach Ko-Kulturen Zellen geerntet und mit einer Kombination von GTC und ß-Mercaptoethanol lysiert. Mit GTC wieder zu schwächen, die Zellwand von Bakterien um Bakterien Mechaniker Lyse vor RNA-Extraktion zu erleichtern ist die Zelle lysate enthalten Bakterien behandelt. (B) RNA Qualität und Integrität Bewertung mit einem Bioanalyzer. Eine Elektrophorese Gel erhält auf die rRNA (23 s, 16 s und 5 s) beobachtet wird. RIN muss 8 zum Bibliothek-Vorbereitung auf die Sequenzierung rRNA Verhältnis zu (16 23 s/s) so hoch wie möglich, abhängig von dem Organismus, den Idealwert 2 fortsetzen kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Das Verhalten von M. Abscessus ist das Verhalten der pathogenen SGM wie M. Tuberkulose viel ähnlicher als jede andere Mykobakterien, RGM2angehören. Das zentrale Element in der Pathogenität der SGM ist ihre Fähigkeit zu überleben oder sich sogar in Antigen-präsentierenden Zellen wie Makrophagen und dendritischen Zellen vermehren.

M. Abscessus hat gewisse genomische Vorteile erworben, dargestellt durch die gesamtsequenz der Genom-14 um zu überleben in einer eukaryotischen Zelle phagocytic. Das Genom von M. Abscessus hat gezeigt, dass sich schnell entwickelnden und sehr Kunststoff, mit vielen vor kurzem eingeführt Einfügung Sequenzen wie Prophages und neuen Genen15. Zwar gibt es weniger Daten auf Virulenz Faktoren in M. Abscessus verglichen mit M. Tuberculosis, scheint M. Abscessus schnell und aktiv in Richtung erhöhter Virulenz weiterentwickeln zu können. Bislang basierte die Analyse von M. Abscessus Virulenz im Wesentlichen auf die vergleichende Analyse des Genoms von M. Abscessus , M. Chelonae, ein Mycobacterium zu derselben Gruppe gehören, aber beschränkt auf Infektionen verursachen die Haut des Menschen. Einige Gene haben nicht in M. Chelonae , sondern präsentieren in M. Abscessus, wie Phospholipase C, teilweise den Widerstand des M. Abscessus nach Phagozytose durch ökologische Amöben4erklärt.

Die Entwicklung einer Amöbe kokultur Technik ergänzt mit Umweltproben hat eindeutig Amöbe mykobakteriellen Interaktionen16,17gezeigt. So Mykobakterien isoliert von Lysaten Co in Anwesenheit von Amöben in ein Wasser-Behandlung-Pflanze-18kultiviert werden konnte, und M. Massiliense wurde von den Auswurf eines Patienten isoliert nach kokultur mit Amöben, während die Kultur allein nicht lassen Sie die Isolation dieser Mykobakterien-8. Amöben gelten zunehmend als Inkubator für Mykobakterien4 und Acanthamoebasp. als natürliche Umwelt Gastgeber für viele nicht-tuberkulösen Mykobakterien. Amöbe plus Mykobakterien kokultur Systeme zunehmend als einfache und schnelle Modelle zur Charakterisierung Faktoren in der intrazellulären Wachstum von Mykobakterien19,20,21vorgeschlagen werden, 22,23,24.

In der Umgebung ist das Zusammenspiel von Mykobakterien und Amöben schlecht dokumentiert. Der erste Artikel beschreibt Belege für einen Zusammenhang zwischen Mykobakterien und Amöben im Feld im Jahr 2014 herauskam, und diese Studie konzentriert sich auf eine Analyse der eine Trinkwasser-Netz-25.

Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Vorführung während einer kokultur mit Amöben beschrieben. Dieser Studie konnten wir die Rolle der Umwelt Phagozyten in den Erwerb von Virulenz von einem opportunistischen Erreger auf den Menschen zu zeigen. Um diese Gene für die intrazelluläre Überleben von M. Abscessuserforderlich zu unterstreichen, wurde ein Bildschirm einer mutierten Bibliothek durch Umsetzung in eine Unterart von M. Abscessus komplex und in einem klinischen Stamm durchgeführt. Diese mutierten Bibliothek lief mit Amöben, diese letzten haben nachgewiesen als "Trainingsplatz" zur Steigerung der Virulenz des M. Abscessus in Mäusen4, ähnlich wie bei M. Avium26beobachtet. Das wichtige Ergebnis wurde die Entdeckung zum ersten Mal in der wichtigen Rolle der ESX-4-Locus Codierung ein Typsystem VII Sekretion und Vorfahr von der ESX-1-Lokus als wesentlich für die Virulenz und intrazelluläre Überleben der M. Tuberkulose Mykobakterien Mycobacterium Microti und M. Marinum27,28,29,30,31.

Das zweite Ziel war es, einen Katalog der Gene bei verschiedenen kokultur um besser zu verstehen, die Anpassung und die potentielle Virulenzmechanismen während kokultur in Anwesenheit von Umwelt zu erhalten professionelle Phagozyten. Analyse dieser erhöhte Virulenz durch einen umfassenden Ansatz der Totalsequenzierung des Messenger-RNAs von M. Abscessus, wurde durchgeführt, um die RNAs induziert oder unterdrückt während Amöbe ko-Kulturen im Vergleich zu der transkribiert unter RNAs erkennen in-vitro- Bedingungen. Die differentielle Expression von diesen RNAs verleihen kann, M. Abscessus eine verbesserte "Virulenz", erklären die Besiedlung der oberen Atemwege beim Menschen. Unter RGM Pflanzenarten ist M. Abscessus eine Ausnahme von der nicht-pathogenen Phänotyp zusammen mit M. Chelonae. Die Fähigkeit von M. Abscessus , ähnliche Krankheiten tuberkulösen Mykobakterien verursachen macht es noch mehr einzigartig. Viele Studien haben die intrazellulären Anpassungen von M. Tuberkulose zum Leben innen Makrophagen32,33 berichtet aber keine konzentrierten sich auf M. Abscessus Anpassungen in Vivo. Transcriptional Antwort von M. Abscessus , Hypoxie wurde beschrieben34 , Hervorhebung der Rolle des Mycobactins und der DosR Regulon wie in M. Tuberculosisbeschrieben. Analyse des transkriptoms M. Abscessus in Amöben und Makrophagen gibt einen Einblick in die bakterielle Anpassungen an intrazelluläre Leben schlechthin. Ein Vergleich dieser Transkriptom erlaubt die Beurteilung der Rolle der Amöben bei der Auslösung von M. Abscessus Virulenz in den Menschen und der Entzifferung der spezifische Anpassungen für phagocytic Säugerzellen. Eine Mutmaßung wurde gemacht, dass die amöbenzelle Umwelt "Trainingsplatz" für M. Abscessus darstellen könnte, bevor die Übertragung auf menschliche Zellen, um zu beschreiben, M. Abscessus Virulenz in Bezug auf die evolutionären Anpassungen dieser Ansatz macht original .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wir erkennen deutlich PR. e.j. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) für das kostbare Geschenk des mutierten Bibliothek und Dr. Ben Marshall (Faculty of Medicine, University of Southampton, UK) für die Korrekturen des Manuskripts. Für ihre finanzielle Unterstützung (RF20150501377) wird stark der französischen Patientenverband für Mukoviszidose "Vaincre la Mucoviscidose" und "L'Association Gregory Lemarchal" anerkennen. Wir danken auch der nationalen Agentur für Forschung (ANR-Programm DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) und der Region Ile de France (Domaine d'Intérêt Gewalt Maladies Infectieuses et Emergentes) für die Finanzierung des postdoctoral Fellowship V.L-m. L. L. ist ein Doktorand aus der "Ministère de L'Enseignement Supérieur et De La Recherche".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Qvist, T., et al. Comparing the harmful effects of nontuberculous mycobacteria and Gram negative bacteria on lung function in patients with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 15, (3), 380-385 (2016).
  2. Roux, A. -L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6, (11), 160185 (2016).
  3. Castañeda-Sánchez, J., et al. Defensin Production by Human Limbo-Corneal Fibroblasts Infected with Mycobacteria. Pathogens. 2, (4), 13-32 (2013).
  4. Bakala N'Goma, J. C., et al. Mycobacterium abscessus phospholipase C expression is induced during coculture within amoebae and enhances M. abscessus virulence in mice. Infection and Immunity. 83, (2), 780-791 (2015).
  5. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4, (6), 5660 (2009).
  6. Tailleux, L., et al. Constrained intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis in human dendritic cells. Journal of Immunology. 170, (4), 1939-1948 (2003).
  7. Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches. Journal of Visualized Experiments. (80), e51055 (2013).
  8. Adékambi, T., et al. Amoebal coculture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia. Journal of Clinical Microbiology. 42, (12), (2004).
  9. Rubin, E. J., et al. In vivo transposition of mariner-based elements in enteric bacteria and mycobacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, (4), 1645-1650 (1999).
  10. Laencina, L., et al. Identification of genes required for Mycobacterium abscessus growth in vivo with a prominent role of the ESX-4 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (5), 1002-1011 (2018).
  11. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila from clinical specimens via amoebae, and the interaction of those and other isolates with amoebae. Journal of Clinical Pathology. 36, (9), 978-986 (1983).
  12. Moffat, J. F., Tompkins, L. S. A quantitative model of intracellular growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii. Infection and Immunity. 60, (1), 296-301 (1992).
  13. FastQC program. Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2018).
  14. Ripoll, F., et al. Non mycobacterial virulence genes in the genome of the emerging pathogen Mycobacterium abscessus. Public Library of Science One. 4, (6), 5660 (2009).
  15. Choo, S. W., et al. Genomic reconnaissance of clinical isolates of emerging human pathogen Mycobacterium abscessus reveals high evolutionary potential. Science Reports. 4, (2015).
  16. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms Resistant to Free-Living Amoebae. Clinical Microbiology Reviews. 17, (2), 413-433 (2004).
  17. Kicka, S., et al. Establishment and Validation of Whole-Cell Based Fluorescence Assays to Identify Anti-Mycobacterial Compounds Using the Acanthamoeba castellanii - Mycobacterium marinum Host-Pathogen System. Public Library of Science One. 9, (1), 87834 (2014).
  18. Thomas, V., Loret, J. -F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environmental Microbiology. 10, (10), 2728-2745 (2008).
  19. Lamrabet, O., Medie, F. M., Drancourt, M. Acanthamoeba polyphaga-enhanced growth of mycobacterium smegmatis. Public Library of Science One. 7, (1), (2012).
  20. Cosson, P., Soldati, T. Eat, kill or die: when amoeba meets bacteria. Current Opinion in Microbiology. 11, (3), 271-276 (2008).
  21. Lelong, E., et al. Role of magnesium and a phagosomal P-type ATPase in intracellular bacterial killing. Cellular microbiology. 13, November 2010 246-258 (2011).
  22. Ouertatani-Sakouhi, H., et al. Inhibitors of Mycobacterium marinum virulence identified in a Dictyostelium discoideum host model. Public Library of Science One. 12, (7), 0181121 (2017).
  23. Trofimov, V., et al. Antimycobacterial drug discovery using Mycobacteria-infected amoebae identifies anti-infectives and new molecular targets. Science Reports. 8, (1), 3939 (2018).
  24. Cardenal-Muñoz, E., Barisch, C., Lefrançois, L. H., López-Jiménez, A. T., Soldati, T. When Dicty Met Myco, a (Not So) Romantic Story about One Amoeba and Its Intracellular Pathogen. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 529 (2017).
  25. Delafont, V., et al. First evidence of amoebae-mycobacteria association in drinking water network. Environmental Science & Technology. 48, (20), (2014).
  26. Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S., Bermudez, L. E. Interaction of Mycobacterium avium with environmental amoebae enhances virulence. Infection and Immunity. 65, (9), (1997).
  27. Stamm, L. M., et al. Mycobacterium marinum escapes from phagosomes and is propelled by actin-based motility. Journal of Experimental Medicine. 198, (9), 1361-1368 (2003).
  28. Groschel, M. I., Sayes, F., Simeone, R., Majlessi, L., Brosch, R. ESX secretion systems: mycobacterial evolution to counter host immunity. Nature Reviews Microbiology. 14, (11), 677-691 (2016).
  29. Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nature Medicine. 9, (5), 533-539 (2003).
  30. Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, (21), 12420-12425 (2003).
  31. Smith, J., et al. Evidence for pore formation in host cell membranes by ESX-1-secreted ESAT-6 and its role in Mycobacterium marinum escape from the vacuole. Infection and Immunity. 76, (12), 5478-5487 (2008).
  32. Schnappinger, D., et al. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis. within Macrophages. Journal of Experimental Medicine. 198, (5), 693-704 (2003).
  33. Fontan, P., Aris, V., Ghanny, S., Soteropoulos, P., Smith, I. Global Transcriptional Profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 Human Macrophage Infection. Infection and Immunity. 76, (2), 717-725 (2008).
  34. Miranda-CasoLuengo, A. A., Staunton, P. M., Dinan, A. M., Lohan, A. J., Loftus, B. J. Functional characterization of the Mycobacterium abscessus genome coupled with condition specific transcriptomics reveals conserved molecular strategies for host adaptation and persistence. BMC Genomics. 17, (1), 553 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics