셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

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Bioengineering

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Summary

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

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Jiang, T., Munguia-Lopez, J., Flores-Torres, S., Grant, J., Vijayakumar, S., De Leon-Rodriguez, A., Kinsella, J. M. Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation. J. Vis. Exp. (137), e57826, doi:10.3791/57826 (2018).

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Abstract

기본 종양 microenvironment의, 생화학, 세포 및 생물이 하지 성장 불멸 하 게 암 세포 선을 사용 하 여 기존의 2 차원 (2D) 세포 배양 하 여 지는. 다른 종류의 세포에 의하여 포함 된 다른 유형의 3 차원 (3D) 종양 모델을 만들 bioprinting 기술을 사용 하 여 이러한 문제를 극복할 수 있습니다. Alginate와 젤라틴은 bioprinting 그들의 생체 적합성, biomimicry, 및 기계적 특성 때문에 가장 일반적인 생체 재료의 두. 두 고분자를 결합해 서, 우리는 네이티브 종양 stroma의 미세한 구조 유사성과 bioprintable 복합 하이드로 겔을 달성. 우리는 유동성을 통해 복합 하이드로 겔의 전이성 공부 하 고 얻은 최적의 인쇄 창. 유방암 세포 및 섬유 아 세포는 hydrogels에 포함 되었고 vivo에서 microenvironment를 흉내 낸 3D 모델을 형성 하. Bioprinted 이종 모델 장기 세포 배양 (> 30 일)에 대 한 높은 생존 능력을 달성 하 고 추진 하 고 있는 다세포 종양 spheroids (MCTS)으로 유방암 세포의 자기 조립. 마이그레이션 및 암 관련 fibroblast 세포 (CAFs)의이 모델에는 MCTS 상호 작용 관찰합니다. Bioprinted 셀 문화 플랫폼, 공동 문화 시스템을 사용 하 여 기질 구성 tumorigenesis의 의존도 공부 하는 독특한 도구를 제공 합니다. 이 기술은 높은 처리량, 저렴 한 비용, 및 높은 재현성, 기능 그리고 그것은 또한 기존의 세포 단층 배양을 다른 모델 및 암 생물학 연구를 동물 종양 모델을 제공할 수 있습니다.

Introduction

2 차원 세포 배양은 암 연구에서 널리 이용 된다, 비록 제한 영양분과 산소의 동일한 농도로 단층 형태로 재배 되 고 세포 존재 합니다. 이러한 문화는 중요 한 셀 부족과 상호 작용 세포-매트릭스 네이티브 종양 microenvironment (TME)에 제시. 따라서, 이러한 모델 제대로 탈 셀 동작, 등 부자연 스러운 형태학, 불규칙 한 수용 체 조직, 막 분극, 다른 비정상적인 유전자 발현의 결과로 생리 조건 정리 조건1,2,,34. 다른 한편으로, 3 차원 세포 배양, 어디 집계, spheroids, 또는 organoids로 체적 공간에서 세포를 확장 수 더 정확한 생체 외에서 근본적인 세포 생물학과 생리학을 공부 하는 대안 기술을 제공 합니다. 3D 세포 배양 모델 수 또한 네이티브 TME 생체 외에서1,,45의 중요 한 생리 적 특성은 세포-ECM 상호 작용을 격려 한다. 신흥 3D bioprinting 기술은 이기종 TME를 모방 하는 모델을 만들 가능성을 제공 합니다.

3D bioprinting 신속한 프로토 타입에서 파생 되 고 생활의 복잡 한의 일부를 흉내 낸 수 있는 3 차원 마이크로 구조 제조 조직 샘플6,7. 현재 bioprinting 방법 등 잉크젯, 압출 성형, 레이저를 이용한 인쇄8. 그 중, 압출 메서드는 정확 하 게 다른 초기 위치에서 다른 유형의 자료를 배치 하 여 인쇄 된 매트릭스 내에서 제어 하려면이 수 있습니다. 따라서, 모델 유형이 다른 시험관에 관련 된 여러 종류의 셀 이나 행렬 조작 하 가장 좋은 접근 이다. 압출 bioprinting는 성공적으로 구축 하는 귀의 모양된 건설 기계9, 혈관 구조10,,1112, 및 조직13, 높은 인쇄 충실도 셀에 결과 피부 사용 되었습니다. 생존 능력입니다. 기술 또한 다양 한 소재 선택, 알려진된 밀도와 높은 재현성14,,1516,17 포함 하는 셀 자료를 예금 하는 능력을 갖추고 . 천연 및 합성 hydrogels 자주 그들의 생체 적합성, bioactivity, 및 그들의 친수성 네트워크 ECM7,18 를 구조적으로 설계 될 수 있다 3D bioprinting bioinks로 사용 된다 19,20,21,,2223. 이후 그들은 셀, 구조 요소, 영양소 및 가스, 침투성 접착 사이트를 포함할 수 있습니다 및 장려 하기 위해 적절 한 기계적 속성 셀 개발24Hydrogels 유리한도 있습니다. 예를 들어, 콜라겐 hydrogels 세포를 연결 하는 데 사용할 수 있는 앵커리지 사이트 integrin를 제공 합니다. 젤라틴, 변성된 콜라겐, 유사한 세포 접착 사이트를 유지합니다. 반면, alginate bioinert 이지만 divalent 이온25,26,,2728와 crosslinks를 형성 하 여 기계적 무결성을 제공 합니다.

이 작품에서는, 우리는 bioink, alginate과 젤라틴, 네이티브 종양 stroma의 미세한 구조 유사성으로 이루어진 복합 하이드로 겔 개발. 유방암 세포 및 섬유 아 세포는 hydrogels에 포함 했다 그리고 vivo에서 microenvironment을 모방 하는 3D 모델을 만드는 입체 기반 bioprinter 통해 인쇄. 설계 된 3D 환경 세포 배양 (> 30 일)의 오랜 기간 동안 높은 생존 능력으로 다세포 종양 spheroids (MCTS)를 암 세포 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 복합 hydrogels 합성, 재료의 미세 및 전이성, bioprinting 세포 유형이 다른 모델, 특성화 고 MCTS 형성 관찰의 방법론을 보여 줍니다. 이러한 방법론은 약물 검사, 셀 마이그레이션 분석 실험, 및 기본적인 셀에 집중 하는 연구에서 잠재적인 응용 프로그램 뿐만 아니라 다른 유형의 조직 모델의 다른 디자인으로 압출 bioprinting에 다른 bioinks에 적용 될 수 있습니다. 생리 적 기능입니다.

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Protocol

1. 재료, 하이드로 겔, 셀 문화 자료의 준비

  1. 소재와 솔루션 준비
    1. 세척 하 고 건조 한 250 mL 및 100 mL 유리 비 커, 자석 교 반기, 주걱, 10 mL 카트리지, 25 G (0.5의 길이)와 250 µ m의 내경 원통 노즐. 압력가 마로 소독 하 여 자료를 소독 그들에서 121 ° C/15 분/1 atm. 사용까지 무 균 조건 하에서 재료를 유지.
      참고: 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    2. (여기서 부터는 A3G7로 표기) 3 세대 alginate (3 %w / v)과 젤라틴 (7 %w / v)의 7 g 무게.
    3. 4 h: alginate와 젤라틴 분말, 파라핀 필름, 알루미늄 호 일 조각 5 cm2, 및 1 mL와 5 mL 주사기에 대 한 자외선 아래에서 다음 항목을 소독. 적어도 4 h 70% 에탄올에 그들을 immersing 하 여 끝 모자, 팁 모자, 및 피스톤을 소독 하 고 그들을 씻어 소독된 울트라 순수 물으로 2 배.
      참고: 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    4. 4g 울트라 순수 물 agarose 녹이 고 압력가 마로 소독 하 여 소독.
      참고:는 agarose는 완전히 압력가 마로 소독 과정 후 해산 된다.
    5. 사용 전에 100 m m 솔루션 무수 칼슘 염화 물 (CaCl2) 멸 균된 초 순수한 물에 살 균 필터의 (0.22 μ m의 기 공 크기)를 준비 합니다.
    6. Agarose 코팅 6-잘 접시, 녹아 액체 솔루션;를 전자 레인지에 살 균 agarose 그런 다음, Biosafety 내각 (BSC) 및 1 mL micropipette를 사용 하 여, 잘 당 2 mL를 추가 하 고 부드럽게 만들려고 유니폼 레이어 우물의 바닥에 그것을 혼합 키를 누릅니다. 진정 하 고 인감 파라핀 영화와 잘 둬. 실 온 (RT)에서 사용 될 때까지 계속.
  2. A3G7 히드로 전조의 준비
    1. BSC 내에서 250 mL 비 커에 3 세대 alginate와 젤라틴 파우더 7 g을 혼합. 자력 및 DPBS의 100 mL를 추가 합니다. 살 균 파라핀 필름 및 알루미늄 호 일 (5 c m2) 오염 방지와 비 커를 봉인.
    2. 1 시간 60 ° C에서와 RT는 추가 2 h 600 rpm으로 자석/핫 플레이트에 지속적인 동요에서 분말을 디졸브.
    3. 젤은 액체 상태로 상전이 겪 습 때까지 37 ° C에 있는 자료를 열 (재고 젤 솔루션의 100 mL에 대 한이 약 45 분 소요). 살 균 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브로 솔루션을 전송 하 고, 그들을 봉인 834 x g 자료에서 어떤 가스 거품을 제거 하 5 분에 튜브 원심.
    4. 10 mL 주사기로 히드로 전조를 발음. 모자와 파라핀 영화 주사기 인감입니다. 4 ° C에서 사용까지 그들을 저장 합니다.
  3. 세포 배양
    참고:이 섹션의 단계는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.
    1. 대비 기저 DMEM 매체 다음과 같습니다 (1 L): BSC, 혼합 소 태아 혈 청 (FBS)의 100 mL의 항생제/antimycotic 솔루션 (안정화 솔루션 x 100) 10 mL 플러스 신선한 멸 균 용기에. DMEM 매체 혼합물을 조정에 추가 최대 1000 mL. 컨테이너를 봉인 하 고 4 ° c.에 그것을 유지합니다
    2. 이전 따뜻하게 물 탕 (37 ° C)에서 서 리 없애다 MDA-MB-231-GFP (인간 유 방 암 세포 선 GFP 표시, 핵 지역화)의 1 유리병 및 IMR-90-mCherry (암 관련 된 섬유 셀 라인 mCherry-분류, 세포질 지 방화의 1 유리병 )는 물에 부드럽게 이동 하 여 액체 질소 저장에서 셀. 셀 라인, 그리고 GFP와 mCherry 라벨, 플라스 미드를 상업적으로 사용할 수 있습니다.
    3. 6 잘 플레이트에 셀 솔루션 (3 x 106 셀/mL)의 160 µ L/잘 전송 하 고 따뜻하게 (37 ° C) 기저 DMEM 매체의 5 mL를 추가 합니다. 셀 80% 합류를 도달할 때까지 24-48 h에 대 한 37 °C/5% CO2 접시를 품 어.
    4. 셀 도착 합류, 매체를 삭제 하 고 DPBS; 두 번 셀 린스 500 µ L의 트립 신-EDTA 솔루션/셀을 품 어 (0.25%, 1 x 이전 예 열 37 ° C에서) 6 분 동안 37 ° C에서. 다음, FBS의 500 µ L을 추가 하 여는 트립 신을 비활성화 하 고 셀 솔루션 복구 T-75 플라스 크를 전송. 품 어 그들 다시 37 °C/5% CO2 셀 80% 합류를 도달할 때까지.
      참고: 트립 신-EDTA 솔루션의 볼륨 세포 성장 선박에 따라 달라질 수 있습니다.
    5. 그 때 세포가 더 많은 신진 대사 활동 및 안정성에 3-4 세포와 함께 작동 하도록 이전 단계를 반복 합니다.
    6. 히드로와 혼합 되는 셀의 초기 농도 결정 하는 trypan 블루 분석 결과 (0.4%)를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.

2입니다. Hydrogels의 유 변 학적 특성의 측정

  1. 1.2 단계에서 설명한 대로 alginate/젤라틴 히드로 전조를 준비 합니다.
    참고: 살 균 조건 기계 테스트 및 분석을 위한 생성 된 샘플에 대 한 필요 하지 않습니다. 모든 유 변 학적 테스트 3 중에 수행 됩니다.
  2. 히드로 전조의 주사기를가지고 고 1 시간에 대 한 37 ° C 물 목욕에서 따뜻하게.
  3. 고분자를 켜고 다음 단계에 따라 시스템을 초기화.
    1. 제가 30 분, 고분자에 대 한 온도 제어 상자에 스위치 자체, 고분자에 전환 하 고 컴퓨터에 스위치를 실행 하는 공기 압축기는 고분자에 연결 하자에 연결 하는 공기 압축기를 켭니다.
    2. 제가 소프트웨어, 컨트롤 패널에서 초기화 를 클릭 열고 초기화 프로세스를 완료 합니다. 컨트롤 패널에서 37 ° C를 플랫폼 온도 설정 합니다.
    3. 측정 설정 탭을 클릭 하 고 서비스 기능을 시작으로 이동, 조정 드라이버 관성 드롭-다운 메뉴에서 선택한 팝업 창에서 조정 시작 을 클릭 합니다.
    4. 측정 도구는 고분자에 병렬을 탑재 합니다. 여기에 수행 하는 모든 실험 접시 사이 1mm 간격으로 25 m m 직경 접시를 사용 합니다.
    5. 컨트롤 패널에 0-간격 설정 를 클릭 하 고 완료 하는 절차에 대 한 대기. 이 과정에서 정상적인 힘에 주목.
      참고:이 절차 후 정상적인 힘은 0 이어야 합니다.
    6. 측정 설정 탭을 클릭 하 고 서비스 기능을 시작으로 이동, 조정 위 측정 시스템 관성을 선택한 팝업 창에서 조정 시작 을 클릭 합니다. 완료 되 면, 위로 이동 하려면 측정 도구를 허용 하려면 제어판에 있는 삼각형 버튼을 클릭 합니다.
  4. 진폭 청소를 실시 합니다.
    1. 시작을 클릭 한 다음 선택 기다릴 드롭-다운 메뉴에서 상단 메뉴에서 삽입 을 클릭 합니다. 설정 윈도우를 당겨 하 고 대기 시간 2 시간을 설정.
      참고:이 테스트 하기 전에 대기 단계를 추가 합니다.
    2. 시작, 다시, 삽입 단추를 클릭 하 고 드롭-다운 메뉴에서 장치를 선택. 설치 창 위로 당깁니다, 그리고 온도를 선택한 25 ° c.로 값에 도달할 때까지 기다립니다의 상자를 선택 취소 합니다.
    3. 클릭 측정단계, 다음 변수 진동 스트레인, 설정 윈도우를 올려, 램프 로그수를 프로필 을 설정 하 고 클릭 초기 변형 및 최종 변형으로 0.001% 및 100% 값을 변경 각각. 0.01 Hz에서 주파수를 설정 합니다.
    4. 온도 변수를 추가 하려면 추가 단추를 클릭 합니다. 가변 온도 클릭 하 고 25 ° c.로 풀업 창에서 계산기를 확장 하, 10 포인트/decade로 포인트 밀도 설정 합니다.
    5. 물 목욕에서 주사기를가지고 고 약 0.5 mL 고분자 플랫폼에 전조의 돌출.
    6. 클릭은 아래쪽 삼각형 컨트롤 패널에서 단추. 조정 위치를 아래로 이동 하려면 측정 도구를 기다립니다.
    7. 주걱을 사용 하 여 측정 도구의 가장자리에서 탈출 모든 초과 전 트림 하 고 불필요 한 자료를 삭제.
    8. 미네랄 오일 측정 도구의 가장자리에 플라스틱 하 고 기름을 완전히 물개 경계 될 때까지 기다립니다.
    9. 컨트롤 패널에서 계속 을 클릭 합니다. 그런 다음 아래 화면에서 계속 단추를 클릭 하 여 다음 시작 버튼 (녹색 삼각형)를 클릭 합니다.
    10. 테스트가 완료 되 면, 측정 도구를 놓고 클릭은 위쪽 삼각형 컨트롤 패널에서 단추. 측정 도구를 제거 하 고 70% 에탄올으로 청소. 70% 에탄올과 플랫폼을 청소.
    11. 현재 프로젝트에서 측정 단계를 클릭 하 고 설정 윈도우를 올려. 자, 설정 주파수 100 Hz.에 다른 모든 매개 변수를 변경 하지 않고 유지.
    12. 2.4.10 2.4.5-단계를 반복 합니다.
    13. 다이어그램을 클릭 합니다. G의 곡선을 관찰 ', G " 발진 스트레인. G의 편향 포인트를 찾아 ' 두 주파수 (0.01 Hz, 100 Hz). 모두 편향 포인트에 대 한 해당 발진 종자를 찾아.
    14. 작은 진동 스트레인을 선택 하 고 나중에 실시 하는 모든 진동 테스트에 대 한이 긴장의 1/10을 사용 하 여.
      참고: G의 발병 ' 편향 궁극적인 선형 탄성 변형 (ULES) 하지 후속 테스트에서 초과 해야 하는 것으로 간주 됩니다. 비율 1/10으로 안전 상의 이유로 공학에 사용 됩니다. 이 계산 스트레인 gC로 표시 됩니다.
    15. 테스트가 완료 되 면, 테이블을 클릭 하 고 모든 데이터를 복사 한 텍스트 파일에 붙여 넣습니다.
  5. 온도 청소를 실시 합니다.
    1. 내 애플 리 케이 션 을 클릭 하 고 템플릿을 선택 온도 램프, 진동 전단: 겔 화.
    2. 프로젝트 이름입니다.
    3. 워크플로의 단계 측정 을 클릭 합니다. 변수 온도, 올려 설치 창 고 초기와 최종 온도 37 ° C와 25 ° C, 각각 수를 설정.
    4. 풀업 창에서 0.1%, 1 Hz를 발진 주파수에 진동 긴장을 설정 합니다. 61 되도록 데이터 포인트의 수를 설정 합니다. 1 포인트/분 클릭 계산기 를 데이터 컬렉션 빈도 설정 하 고 설정 가리킨 밀도 0.2 ° C/포인트.
      참고:이 0.2 ° C/min의 속도로 변경 하려면 온도 허용할 것 이다.
    5. 제가 플랫폼에 샘플을 로드 하 고 다음 단계 2.4.5-2.4.10 여 테스트를 수행.
    6. G 관찰 다이어그램을 클릭 ', G " 온도. G의 크로스 오버 포인트를 찾아 '와 G ". 크로스 오버 포인트에서 온도 찾아.
      참고: 이것은 히드로 전조의 솔/젤 전이 온도 이다.
    7. 2.4.15 단계를 반복 합니다.
  6. 등온선 시간 청소를 실시 합니다.
    1. 내 애플 리 케이 션 및 찾을 고 등온 시간-온도 테스트하는 서식 파일을 클릭 합니다. 고 진동 변형변수를 클릭, 0.1%, 발진 스트레인을 설정 하 고 1 Hz로 진동 주파수를 설정 설치 창 올려 워크플로에서 단계 측정 을 클릭 합니다. 풀업 창에서 120 데이터 포인트의 수를 설정 합니다. 1 포인트/분 데이터 컬렉션 빈도 설정 합니다.
      참고:이 긴장의 값은 진폭 청소 결과에 기반.
    2. 온도 변수를 추가 하려면 추가 단추를 클릭 합니다. 가변 온도 중간 창에서를 클릭 하 고 25 ° c.에 설정
      1. 워크플로의 포인트 측정 장치 이동 단계를 클릭 마우스 오른쪽, 삭제를 클릭 합니다. 장치 값을 설정하는 단계, 값에 도달할 때까지 기다립니다, 확인란의 선택을 취소 하 고 25 ° c 값을 설정 계속취소, 사진, 잡담, 하단 화면에 버튼 을 클릭 합니다. 다음 단계 시작, 프로젝트 이름을 클릭 하 고 저장.
    3. 제가 플랫폼에 샘플을 로드 하 고 다음 단계로 2.4.5-2.4.10 테스트를 시작 합니다.
    4. G을 관찰 ', G " 시간. G의 크로스 오버 포인트를 찾아 '와 G ". 크로스 오버 포인트에서 시간을 찾아. 테스트가 완료 되 면, 테이블을 클릭 하 고 모든 데이터를 복사 한 텍스트 파일에 붙여 넣습니다.
      참고: 이것은 25 ° c.에 히드로 전조의 솔/젤 전환 시간
  7. 다양 한 고 시간에 항복 강도 측정 합니다.
    1. 내 애플 리 케이 션 을 클릭 하 고 찾기 서식 파일을 클릭 수율 및 흐름 스트레스, 젤 같은. 프로젝트 이름입니다. 워크플로의 시작 단계를 클릭 합니다. 상단 메뉴에서 삽입 을 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 대기하는 것을 선택. 설정 윈도우를 당겨 하 고 대기 시간 20 분을 설정 합니다.
      참고:이 테스트 하기 전에 대기 단계를 추가 합니다.
    2. 클릭 시작, 다음 삽입 다시 클릭 하 고, 드롭 다운 메뉴에서 장치를 선택 합니다. 설치 창 올려 온도 선택 하 고 25 ° c.에 설정 값에 도달할 때까지 기다려야하는 상자를 선택 취소 합니다.
    3. 워크플로의 단계 측정 , 변수 전단 응력을 선택 하 고 설정 윈도우를 올려 한 준비가 초기 및 최종 전단 응력 0 및 10000 Pa, 각각.  계산기를 클릭 합니다, 그리고 설정 포인트 밀도 0.2 포인트/실바 왼쪽에 있는 데이터 요소 탭에서 1 포인트/초 설정 합니다.
      참고: 5 Pa/s의 스트레스 램프 속도에 따라서 됩니다.
    4. 풀업 창의 맨 아래에 있는 이벤트 제어 탭을 클릭 하 고 중지 기준 설정: 전단 > 100의-1을 평가 하는 경우는 측정을 중지.
      자료 열매를 산출 하는 경우 참고:이 자동으로 측정을 중지 합니다.
    5. 제가 플랫폼에 샘플을 로드 하 고 다음 단계로 2.4.5-2.4.10 테스트를 시작 합니다.
    6. 다이어그램을 클릭 합니다. 긴장 스트레스 곡선을 관찰 합니다. 긴장과 해당 스트레스의 편향 포인트를 찾아. 반복 단계 2.7.2-2.7.6, 하지만 30, 40, 및 각 복제;에 대 일 분 대기 시간을 변경 이 항복 강도 고 다른 시간에 발생 합니다.
      참고:이 스트레스는 명백한 항복 강도로 간주 됩니다.
      참고: 소프트웨어 클릭 제가 모델 및 소프트웨어 버전에서 달라질 수 있습니다. 우리가 제공 하는 테스트 매개 변수 참조를 독자 것이 좋습니다 동안 실제 사용에서 특정 고분자/소프트웨어의 설명서를 참조 하십시오.
       

3. 발판 디자인, 셀-라덴 하이드로 겔 및 3D 인쇄 모델

  1. 비 계 디자인
    1. 종이에 프로 펠 러 같은 모델을 그립니다.
      참고: 프로 펠 러 같은 모델은 다음과 같은 고려 사항에 따라 설계: (a) 암 세포 CAFs;에 의해 포위 된다 vivo에서 시나리오 시뮬레이션 (b) 그것은 스트레스를 통해 원형 형상;의 사용의 농도 최소화 (c) 그것은 더 많은 분야는 기존 형상;를 변경 하지 않고 나중에 모델에 추가 될 수 있도록 유연한 그리고 (d)에 평평 하 게 영양 보급을 촉진 하기 위하여 그것의 수직 규모.
    2. 기원 고 기호 R0R1, R2 를 사용 하 여 내부 원, 중간 분야, 및 외부 분야의 최대 반지름을 각각 대표 하는 프로 펠 러의 센터를 보자. 기호 mn 사용 하 여 내부 호 및 분야 지역 안에 쐐기의 수를 각각 나타냅니다.
    3. 프로 펠 러 같은 모델에 각 노드의 좌표를 계산 하 고 R0, R1, R2, m, n의 상징적인 표현에 그들을 쓰기.
    4. 프로그램 스크립트 시작 변수, R0, R1, R2, mn 을 설정 하 고 각 키 노드의 상징적인 표현 입력.
      참고: 어떤 소프트웨어 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    5. 노드를 연결 하는 경로 준비 하 고 측근, 중간 분야 및 외부 분야에 대 한 카트리지를 할당 합니다. 레이어 두께 150 µ m와 레이어 4를의 수를 설정 합니다.
    6. G-코드 형식에 bioprinter에서 인식할 수 있는 텍스트 파일을 출력 하는 프로그램을 보자.
    7. R0 를 설정 = 3.85, R1 6.85, R2 = 8.65, m = 2, n = = 5. 스크립트를 실행 하 고 생성 된 G 코드 파일을 검색 합니다. 복사 하 고 bioprinter의 전용된 G-코드 폴더에 파일을 붙여 넣습니다.
    8. bioprinter 및 제어 소프트웨어를 켭니다. 프린터를 초기화 합니다. 그냥 만들고 0으로 설정 하는 모든 압력 G-코드 스크립트를 엽니다. 제어 소프트웨어 돌아갑니다 Scaffolder 생성기, 탭 누르고 오른쪽 하단 코너에 있는 실행 단추를 클릭 합니다. 프린터의 이동 경로 관찰 합니다.
      참고:이 테스트는 생성 된 G-코드의 정밀도. bioprinter와 관련 된 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    9. 이 단계는 선택 사항입니다. 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 통해 위의 매개 변수를 기반으로 실증 3D 모델을 빌드하십시오.
      참고: 공급 업체 소프트웨어 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
  2. 게 셀-라덴 A3G7 히드로 전조
    참고:이 섹션의 단계는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다. BSC 내부 bioprinter를 유지.
    1. bioprinter 70% 에탄올을 철저 하 게 살포 하 여 소독 하 고 하룻밤 자외선에 노출.
    2. (4 ° C)에서 히드로 전조의 주사기를 꺼내와 1 시간 동안 37 ° C에서 물 욕조에 따뜻한.
    3. CO에서 (단계 1.3 참조) 하는 세포로 T-플라스 크2 인큐베이터 고 BSC 안으로 배치. 문화 매체를 삭제 하 고 DPBS 셀을 두 번 씻어. 따뜻하게 트립 신-EDTA 솔루션 (3.0 mL)을 추가 하 고 6 분 비활성화 FBS의 동일한 양으로 트립 신에 대 한 37 ° C에서 세포를 품 어. Trypan 블루 분석 결과 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
    4. 물 탕에서 히드로 전조의 주사기를가지고, 그것은, 깨끗 하 고 70% 에탄올으로 소독. BSC에 주사기를 넣어.
    5. 인쇄 카트리지를 10 mL에 히드로 전조의 약 3 mL를 압출 성형. 천천히 pipetting, 거품의 생산을 피하 여 1 x 106 셀/mL에서 MDA-MB-231-GFP 세포 선구자 믹스. 살 균 끝 및 최고 모자 카트리지 커버와 파라핀 영화와 함께 인감. 생산 하는 모든 가스 거품을 제거 하기 위해 1 분 834 x g에서 원심.
    6. 단계 3.2.3-3.2.5 IMR-90-mCherry 셀-라덴 전조 하 고 셀 무료 전조에 대 한 반복 합니다.
    7. 모든 3 카트리지 70% 에탄올으로 소독 하 고는 bioprinter의 약 실에 그들을 로드. 프린터의 제어 소프트웨어에서 카트리지 온도 25 ° c.를 설정 인쇄 조건에 도달 하는 전조를 있도록 35 분을 기다립니다.
      참고:이 이번은 히드로에 포함 된 셀의 영향을 주지 않습니다.
  3. 3D 인쇄 모델
    1. 프린터의 제어 소프트웨어, 프린터의 제어 소프트웨어 도구 머리 탭을 확장 하 한 1 카트리지, 왼쪽에 그래픽 인터페이스에서 클릭 다음 노즐 팁의 위치를 측정 하기 위해 짧은 측정 버튼을 클릭 합니다. 다른 2 카트리지를 위해 이것을 반복 합니다.
    2. 분명 폴리스 티 렌 미 판 배치 G 코드 파일을 열고 모든 카트리지 200 kPa에 압력을 변경. 제어 소프트웨어 돌아갑니다 Scaffolder 발전기탭을 클릭 합니다, 그리고 인쇄, 시작을 선택한 다음 오른쪽 하단 코너에 있는 실행 단추를 클릭 합니다. 3 더 많은 복제를 얻으려면이 단계를 반복 합니다.
    3. 프로 펠 러 모델의 모든 복제 인쇄 후 추가 1 분에 대 한 모델을 상호 링크 하 여 그것을 씻어 CaCl2 솔루션 100 m m ++ Ca 이온의 과잉을 제거 하는 DPBS 2 x.
    4. 조심 스럽게 주걱을 사용 하 여 하는 agarose 코팅 6 잘 플레이트에 모델 전송. 각 잘을 DMEM 미디어의 5 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2인큐베이터에 접시를 품 어.
      참고: 모델은 우물에 떠 있는 다는 것을 확인 하십시오.
    5. 3 일 마다 신선한 매체와 세포 배양 매체를 대체, 총에서 30 일 동안 그것을 문화.

4. 생존 그리고 히드로 디스크에 회전 타원 체 형성 실험.

  1. 하이드로 겔 디스크 준비
    1. 3.2.6 3.2.1-단계를 반복 합니다.
      참고: 작은 살 균 컨테이너와 카트리지를 대체 가능 하다.
    2. 살 균 졸업된 1 mL 주사기를 사용 하 고 노즐 (구멍은 주사기 튜브의 나머지로 동일한 직경) 주사기에 큰 구멍을 만들고에 잘라. 70% 에탄올으로 깨끗 하 고 건조까지 그것을 두고.
      참고: 살 균 BSC에 이렇게 합니다.
    3. 잘 접시 뚜껑을 사용 하 여, 표면 덮여 있다; 때까지 100mm CaCl2 추가 그런 다음 주사기; 채울 셀 라덴 히드로 걸릴 교수형을 사용 하 여 100 µ L를 돌출 방법을 드롭. 1 분 동안 하이드로 겔을 두고 과도 한 DPBS로 그것을 씻어. Agarose-코팅 6 잘 플레이트에 히드로 디스크 전송 기저 DMEM의 5 mL을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 에서 최대 30 일 동안 그들을 품 어. 3 일 마다 매체를 새로 고칩니다.
  2. 셀 및 회전 타원 체 생존
    1. MTS 분석 결과 사용 하 여 세포 생존 능력을 결정 하. 각 디스크 DPBS 세척 하 고 잘 메 마른 잎을 가진 4 개 부품으로 그것을 잘라. 전체 디스크의 부분을 수집 하 고 96 잘 접시에 그들을 전송. 그리고, 각 잘 DMEM의 100 μ 플러스 20 μ MTS 시 약의 추가 2 h 37 ° C에서 혼합물을 품 어.
    2. MTS 반응 후에 상쾌한 복구 하 고 깨끗 한 96 잘 접시에 그것을 전송. 490에서 샘플의 흡 광도 측정 nm.
  3. 회전 타원 체 형성
    1. 0, 7, 15, 21, 그리고 30 일 문화의 인큐베이터에서 incubated 프로 펠 러 또는 디스크 모델을 꺼내와 깨끗 한 6 잘 플레이트에 그들을 전송.
    2. Confocal 회전 디스크 거꾸로 현미경을 사용 하 여 시각화 하는 spheroids 고 여러 위치 및 z-스택을 사용 하 여 이미지. 각 프로 펠 러, 또는 그것의 수평 직경 500 µ m 간격으로 마우스 오른쪽 z-스택 아래에서 각 수평 위치에 최고의 초점 평면에 취득을 왼쪽에서 따라 디스크 모델 이미지.
      참고: 공급 업체 정보에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.
    3. 회전 타원 체 분석에 사용 되는 2D 이미지를 만드는 프로그램 ImageJ, 제공 최대 스택 산술 도구를 사용 하 여 이미지를 재구성 합니다.

5. 스캐닝 전자 현미경 (SEM)

  1. 1.2 단계에서 설명한 대로 alginate/젤라틴 하이드로 겔을 준비 합니다.
    참고: 살 균 조건 필요 하지 않습니다.
    주의: 액체 질소 paraformaldehyde 위험 하 고 신중 하 게 처리 되어야 합니다.
  2. 박격포로 하이드로 겔의 1 mL를 넣어 액체 질소를 추가 하 고는 방 앗 공이 사용 하 여 그것을 갈기. 계속 녹 이기에서 하이드로 겔을 피하기 위해 액체 질소를 추가 합니다. 분말 1.5 mL 원심 분리기 관으로 전송 하 고, 인감 2 h. Freeze-dry 24 h에 대 한 샘플에 대 한-80 ° C에서 그것을 저장 합니다.
  3. 회전 타원 체 이미징, 세척 DPBS 2와 부드럽게 히드로 x, 37 ° C에서 30 분 동안 4 %paraformaldehyde 침수에 의해 셀 수정 DPBS로 그들을 씻어 하 고 액체 질소 그들을 동결. 마지막으로, freeze-dry 24 h에 대 한 샘플.
  4. 하이드로 겔/회전 타원 체 구조와 25.0에서 스캐닝 전자 현미경 (SEM)과 형태 분석 kV, 아래 70 최대 5 X 40의 확대와 함께 Pa (압력 챔버) 000 X.

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Representative Results

온도 스윕 25 ° C와 37 ° C에서 A3G7 전조의 뚜렷한 차이 보여줍니다. 전조는 37 ° C에 액체 있으며 1938.1 ± 84.0 mPa의 복잡 한 점도 큰 G에 의해 유효성이 검사 되는 s, x "G 이상 '. 으로 온도 감소, 전조 트라이-나선 형성29,30에 젤라틴 분자의 자발적인 물리적 녹 채 인해 실제 겔 화를 겪 습. 모두 G'는 g "증가 하 고 솔-젤 전환을 나타내는 30.6 ° C에 수렴. 계수 468.5 ± 34.2 도달 감소 온도 증가를 계속 Pa의 G'와 140.7 ± 9.3 G의 Pa "25 ° C (그림 1a)에서. 우리는 인쇄 온도 25 ° C를 선택 온도 청소의 결과에 따라. 겔 화 속도 론 실험 시뮬레이션 샘플 준비 및 처리 하는 동안 발생 하는 온도 변화 (, 37 ° C에서 샘플을 제거 물 목욕과 25 ° C bioprinter 챔버에 배치). G', G ", 및 | η * | 낮아진된 온도에서 시간과 함께 증가 하 고 솔-젤 전환 발생 ~ 25 ° C에서 17 분 때 G' ≈ G "≈ 64.3 Pa와 손실 계수와 1 (그림 1b 1 c). 전조는 계속 완고 하 고 겔의 50-90 분 후 인쇄 창에 도달. 이 인쇄 창에서 전조 수 있습니다 원활 하 게 돌출 될 200 kPa의 압력으로 G25 원통형 노즐을 사용 하 여. 항복 응력의 존재 물자의 고체 처럼 행동을 의미 하 고 그것의 자신의 무게31견딜 압출 후 구조적 무결성을 발생 시킵니다. 스트레스 램프는 겔의 서로 다른 시간에 항복 응력을 인식합니다. 결과 항복 응력 증가 겔 화 시간이 증가 보여 줍니다. 겔의 50 분, 항복 응력에 도달 하면 325.9 펜 실바 니 아, 그 모델을 확보는 돌출 후 안정.

인쇄 된 프로 펠 러 모델 그림 2a에 표시 됩니다. Confocal 현미경 검사 법 MDA-MB-231-GFP의 IMR-90-mCherry 셀 (그림 2b) 초기 압출 위치를 확인합니다. MDA-MB-231-GFP 세포 개발 spheroids 문화 기간으로 15 일 날 30 (그림 2 c - 2 층)까지 증가 크기와 spheroids의 숫자에 의해 뒤에 시작 합니다. IMR-90-mCherry 세포의 일부는 또한 제조 (그림 2 g - 2j)를 형성 한다. 눈에 띄게, 30 일 후 문화, IMR-90-mCherry 셀 암시 하는 모델에서 가능한 마이그레이션 이벤트 처음 MDA-MB-231-GFP 셀 (그림 2f)에 의해 점령 지역에서 관찰 된다. 마찬가지로, 마이그레이션된 MDA-MB-231-GFP 세포도 관찰할 수 있습니다 IMR-90-mCherry 지배 지역에서 하루 30 (그림 2j)에.

디스크 모델 그림 3a에 표시 됩니다. Confocal 현미경 검사 법 (그림 3b) 디스크에서 균질 셀 배포를 확인합니다. MDA-MB-231-GFP 셀 프로 펠 러 모델 인쇄 때 디스크 모델에서 유사 하 게 동작 합니다. 대표 이미지는 그림 3 c - 3 층에 표시 됩니다. Sem의 영상 문화 (그림 4a)의 21 일 후는 MDA-MB-231-GFP 회전 타원 체-라덴 하이드로 겔을 보여준다. 생성 및 존재는 회전 타원 체의 셀 무료 hydrogels (그림 4b)와 SEM 이미지를 비교 하 여 유효성이 검사 됩니다.

두 종류의 세포 세포 생존 능력은 그림 4 c에 설명 했다. MDA-MB-231-GFP 셀 IMR-90-mCherry 세포에 비해 더 높은 세포 생존 능력을 표현 한다. 흥미롭게도, MDA-MB-231-GFP 셀의 가능한 셀 0에 비해 수 배로 15, 하루 전에 생존의 증가 추세를 전시 한다. 이것은 전날 21, 30 일에 다시 복구에 감소 옵니다. 반면, IMR-90-mCherry 셀 문화 기간 전체 동안 최소한의 변동 가능성에 있다. 하루 21에서 MDA-MB-231-GFP 세포의 생존 능력에 감소 값 괴 코어를 개발 했다 큰 MTCSs 형성에 해당 합니다.

Figure 1
그림 1: 히드로 전조의 유 변 학적 특성. () A 온도 스윕 30.6 ° c.에 sol 젤 전환 표시 (b-c) A3G7 선구자의 겔 화 속도 론에서는 G의 증가 ', G ", 및 | η*| 겔 화, 시간과 솔-젤에서 전환 25 ° c.에서 약 17 분 발생 (d)이이 패널 전조의 항복 응력의 겔 화 시간 표시합니다. 항복 응력의 증가 더 이상 고 시간 관찰 됩니다. 결과 평균 ± SD, n≥ 3에에서 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
IMR-90-mCherry myofibroblast 및 MDA-MB-231-GFP 유방암 세포의 구성 된 3D bioprinted에 체 외 모델 내에서 그림 2: MCTS 형성. ()이이 사진 표시 샘플 생체 외에서 bioprinted (왼쪽)와 CAD 모델 (오른쪽). (b)이 대표적인 confocal 시간 경과 이미지 표시는 MDA-MB-231-GFP (녹색) 그리고 IMR-90-mCherry (레드) 세포 모델 내에서 bioprinted. (c - f) 이러한 확대/축소 기능 MDA-MB-231-GFP 셀 영역 (흰색 점선된 상자)를 표시 합니다. (g - j)이 줌 기능 표시 IMR-90-mCherry 셀 영역 (노란색 점선된 상자). 눈금 막대는 패널 2a, 패널 2b, 1mm 및 패널 2 c - 2j 선택된 영역, 500 µ m에서 2 m m 이며 배율 10 배. 이미지에서 주요한 "D" "문화의 일"을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 3D MDA-MB-231-GFP-라덴 히드로 디스크에서 MCTS 형성. ()이 사진은 히드로 디스크입니다. (b)이 대표적인 confocal 이미지 MDA-MB-231-GFP 세포 합성에 포함 된 보여줍니다. (c f) 이러한 확대/축소 기능 표시 (c) (d) 7, (e) 15, 0에서 MDA-MB-231-GFP 셀 영역 (패널 3b에서 흰색 점선된 상자)와 (f) 문화의 21 일. 눈금 막대는 패널 3a, 패널 3b, 1 mm 및 패널 3 c -선택 된 영역에 대 한 3 층 500 µ m에서 2 m m 이며 배율 10 배. 이미지에서 주요한 "D" "문화의 일"을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: MTCSs의 형태 및 세포 생존. ()이 SEM 이미지 문화를 보여주는 작은 MCTS (화살표 지적)의 21 일 후 젤 내 MDA-MB-231-GFP MCTS를 보여 줍니다. (b)이 SEM 이미지 셀 없이 alginate/젤라틴 하이드로 겔을 보여 줍니다. 배율을 350 X입니다. (c)이이 패널은 히드로 내 문화의 30 일 동안 MDA-MB-231-GFP IMR-90-mCherry의 세포 생존 능력을 보여줍니다. 결과 평균 ± SD로 분석 되었다 하 고 통계적으로 양방향 ANOVA를 사용 하 여 테스트 후 Bonferroni의 분석. p (*) < 0.05, n ≥ 3 데이터는 0에서 샘플을 만드는 데 사용 하는 셀 밀도로 정규화 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

셀-라덴 구조 오염 (생물학 또는 화학) 과정에서 어느 시점에 발생 하는 경우 손상 될 수 있습니다. 일반적으로, 생물 학적 오염 2 후 본 또는 색 문화의 3 일 문화 미디어 또는 bioprinted 구조 변경. 따라서, 살 균 (물리적, 화학적 소독) 모든 셀 관련 프로세스에 대 한 중요 한 단계 이다. 주목할 만한, 압력가 마로 소독 젤라틴 우리가 실시 하는 시험에서 느리게 젤 만든 고 속성을 변경 합니다. 따라서, 우리는 노출을 통해 UV alginate와 젤라틴 전원 살 균. UV 빛의 아주 한정 된 침투 능력으로 인해 매우 얇은 층 (< 0.5 m m)를 사용 해야 합니다. 32기계 및 생물 학적 속성 조정 하 alginate과 젤라틴의 농도 임의로 바뀔 수 있다. 현재 작업에서 우리 A3G7, 및 30 일 실험을 통해 높은 안정성을 제공 하는 가교 된 하이드로 겔의 인쇄 창 동안 바람직한 전이성 제공 하므로 선택. 젤라틴의 liquefication를 강화 하는 데 도움이 DPBS에 분말을 용 해 하는 동안 60 ° C에 난방, 하는 교 질 때. 낮은 온도 사용할 수 있습니다; 그러나, 더 이상 교 반 시간 후 하셔야 합니다.

유 변 학적 온도 스윕 30.6 ° c, 다른 간행물33와 호환이 되는 솔-젤 포인트를 제공 합니다. 이론적으로, 어떤 온도 보다 30.6 ° C 전조를 녹 일 수 있습니다. 우리는 선택 하는 37 ° C 세포 배양 매체는 37 ° C 물 욕조에 미리 데워 진에 작업을 단순화 하기 위해. 셀 혼합; 약 17 분입니다 (전에 전조 젤) 겔 화 속도 론을 바탕으로, 이 시간 후, 셀과 하이드로 겔 전 구체 혼합은 증가 점도 및 계수, 비 균질 셀-라덴 bioink를 일으키는 어렵습니다. 따라서, 고의 첫 번째 10 분 내에 셀 혼합 작업을 처리 하는 것이 좋습니다. 항복 응력 최근34;까지 전이성에 영향을 미치는 소재 특성으로 간주 되지 어쨌든, 그것은 광범위 하 게 인정 폴리머 과학자 가루 반죽/세분화 된 유체31,35,,3637의 감 적으로. 항복 응력의 존재 자체의 무게를 견딜 수 있도록 구조적 무결성을 구축 하는 데 도움이 됩니다. 높은 항복 응력 또한 압출; 증가 시작 압력을 요구할 수 있습니다. 따라서,이 때문에 과도 한 전단 응력32셀 손상에서 될 수 있습니다. 모델 충실도 압출 과정 최적의 인쇄 창 밖에 서 발생 하는 경우 손상 될 수 있습니다. 이 문제의 일반적인 지표는 최종 bioprinted 구조에 표시 됩니다: 그것은 너무 거칠거나 너무 가장자리에 액체 일 것 이다. A3G7 선구자 구조적 안정성과 세포 생존에 만족 하 고 다른 유형의 종양을 만들려고 중간 모델14로 사용할 수 있습니다 고의 50-90 분 동안 최적의 인쇄 창 전시.

프로 펠 러 모델의 총 높이 600 µ m 4에서 생성 되는 계층 150 µ m 필 라 멘 트입니다. 이 설계 수 있습니다 영양소 및 가스 셀은 대부분 미디어는 인큐베이션 기간 동안 접촉 하는 표면에서 300 µ m으로 교환. 높은 모델 제조에서 달성 하지만 하이드로 겔38, 핵심 지역에서 낮은 세포 생존에 발생할 수 있는 영양소의 제한 확산 거리의 병목 현상이 발생.

다른 전략 양식 MCTS에 생체 외에서교수형 드롭 등 미세 칩, 조립, 및 bioprinting39개발 되었습니다. 그러나,이 방법론의 일부 세포 생리학, 생화학, 일반 종양 조직에서 발생 하는 다른 셀 동작을 생성을 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 교수형 드롭 세력 단일 물리적 감 금40통해 셀 집계로 남아 세포 방법. 또한, 펩 티 드의 추가 의해 양식 MCTS 화학 유도 spheroids41의 생화학을 변경할 수 있습니다. 여기에 설명 된 하이드로 겔 합성 외부 스트레스 없이 biomimetic 환경 만들어 MCTS 형성을 수 있습니다. 문화, 작은 MCTS로 다시 구성 세포의 7 일 후에 잘 분산 된 단일 셀으로 밖으로 시작 (회전 타원 체 당 이상의 6 셀), 증가 하 고 그들의 크기와 수량 문화의 30 일 동안.

이 연구의 결과에서 우리는 발견 MDA-MB-231-GFP spheroids 하루 21, 세포 생존 능력을 감소 큰 spheroids의 형성으로이 현상을 연관. 단단한 종양 외부 계층 중간 계층 및 회전 타원 체18의 내부 괴 사 성 또는 노화 코어에 비해 높은 확산 속도 선물 하는 그것에 의하여 3 개의 다른 층 구성 되어 있습니다. 이 결과에 생존 능력 감소를 설명할 수 있었다.

이 프로토콜의이 한계는 bioink (1) 역학 (2) 셀 형식 호환성. Bioink 역학 있는 인쇄 된 구조는 결함이 있는 최적의 인쇄 창에 따른 겔 화 과정 다양 한 물성을 나타냅니다. 셀 형식 호환성 동작 네이티브 vivo에서 특정 종류의 세포 (세포 선 또는 주 문화) 무 능력을 말합니다.

A3G7 히드로 높은 안정성 및 세포 생존을 달성 한다. 3D bioprinting 전통적인 세포 배양 및 작은 동물 종양 모델에 보다 현실적인 대 안으로 높은 처리량, 저렴 한 비용, 및 높은 재현성 3D 이질적인 질병 모델을 구축 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

타오 장 그들의 장학금 지원에 대 한 중국 장학금 위원회 (201403170354)와 맥 길 엔지니어링 박사 수상 (90025) 감사합니다. 호세 G. Munguia-로페즈 CONACYT (250279와 290936 291168) 및 FRQNT (258421) 그들의 장학금 지원에 대 한 감사. 살바도르 플로레스-토레스 CONACYT을 자금 (751540) 그들의 장학금 감사 합니다. 조셉 M. Kinsella 주셔서 국가 과학 및 공학 연구 위원회, 캐나다 재단 혁신, 타운센드 Lamarre 가족 재단, 그리고 맥 길 대학에 대 한 자신의 자금. 우리는 Allen Ehrlicher 그의 고분자, 우리 우리에 게 붙일 레이블된 셀 라인에 대 한 액세스를 부여에 대 한 그의 confocal 현미경, Morag 공원 사용 하 수 있도록 댄 Nicolau 사용 하 수 있도록 하는 것을 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium alginate FMC BioPolymer CAS-No: 9005-38-3 Protanal LF 10/60 FT
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Type B gelatin from bovine skin
Dubelcco's phosphate buffered saline (DPBS 1X) Gibco LS14190136 1×, w/o calcium, w/o magnesium
Magnetic hotplate Corning  N/A Stirrer/hot plate model PC-420
50 mL centrifuge tubes Corning 352098 Falcon® 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, Sterile
Centrifuge GMI N/A Sorvall RT6000D, GMI, USA
Calcium chloride anhydrous Sigma-Aldrich C1016
MilliQ water Millipore N/A
Millipore 0.22 µm filters Millipore SLGS033SB Millex-GS Syringe Filter Unit, 0.22 µm, mixed cellulose esters, 33 mm, ethylene oxide sterilized
Oscillation rheometer MCR 302 Anton Paar N/A
Rheometer measuring tool CP25 Anton Paar 79038 Conical plate geometry for rheometer
RheoCompass Anton Paar N/A Software controlling rheometer MCR 302
Scanning electron microscope Hitachi N/A SEM, Hitachi SU-3500 Variable Pressure
Paraformaldehyde, 96%, extra pure Acros Organics 416785000
Dulbecco modified eagle medium (DMEM) Gibco 11965092
Antibiotic/Antimycotic solution (100X) stabilized Sigma A5955
Fetal bovine serum Wisent Bioproducts 080-150
Cell culture T-75 flasks Sigma-Aldrich CLS430641 75 cm2 TC-Treated surface treatment
3D bioprinter BioScaffolder 3.1 GeSiM N/A
GeSim software GeSiM N/A Software controlling BioScaffolder 3.1
10cc cartridge UV resist EFD Nordson 7012126
End cap EFD Nordson 7014472
Tip cap EFD Nordson 7014469
Piston  EFD Nordson 7012182
Stainless nozzle G25 EFD Nordson 7018345
Water bath VWR N/A
Agarose Sigma-Aldrich A9539 Bioreagent, for molecular biology
Costar 6-well plates  Corning 3516 TC-Treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile 
Confocal spinning disk inverted microscope Olympus Life Science N/A Olympus IX83
MTS assay kit Promega G3582 CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay 
Live/Dead viability cytotoxicity kit Molecular Probes,ThermoFisher Scientific L3224
Trypsin 0.25/EDTA 1X Gibco 25200-072
Corning 96-well plate Corning 3595 Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplate, Individually Wrapped, with Low Evaporation Lid, Sterile
Autoclave Tuttnauer Heidolph Brinkmann N/A Heidolph Tuttnauer 2540E Autoclave Sterilizer Electronic Model with 4 Stainless Steel Trays, 23L Capacity
Trypan blue Invitrogen  T10282 0.4% solution
Ethanol Commercial Alcohols P016EA95 Greenfield Speciality Alcohols
CO2 Incubator Panasonic N/A MCO 19AIC-PA
Lyophilizer  SP Scientific N/A Virtis Sentry 2.0
SolidWorks Dassault Systems N/A A CAD software used to build demostrative propeller-like model
MATLAB The MathWorks N/A A programming software used to generate G-code for BioScaffolder 3.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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