改良多向分化效力的常规人多能干细胞的化学逆转与幼稚样态

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Developmental Biology

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Summary

我们提出一项协议, 以有效, 散装, 快速化学逆转传统的谱系诱导人类多潜能干细胞 (hPSC) 成一个 epigenomically 稳定幼稚的植入啮鼠动物样多潜能状态。该方法在常规 hPSC 线的多向分化上降低了谱系引种基因的表达和显著改善。

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Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical Reversion of Conventional Human Pluripotent Stem Cells to a Naïve-like State with Improved Multilineage Differentiation Potency. J. Vis. Exp. (136), e57921, doi:10.3791/57921 (2018).

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Abstract

天真的人类多潜能干细胞 (n-hPSC) 具有改进的功能, 可能对再生医学产生广泛的影响。该协议的目标是有效地恢复沿袭的, 传统的人类多潜能干细胞 (hPSC) 保持在无馈线或馈线依赖的条件, 以一个天真的干细胞, 改善功能。这种化学幼稚的逆转方法采用了经典的白血病抑制因子 (LIF), GSK3β和甲酮/ERK 抑制鸡尾酒 (LIF-2i), 补充只有 tankyrase 抑制剂 XAV939 (LIF-3i)。LIF-3i 将传统的 hPSC 还原为一种稳定的多能态, 采用人类预植入啮鼠动物的生物化学、转录和表观遗传特征。这种 LIF-3i 方法需要最小的细胞培养操作, 并在广泛的人类胚胎干细胞 (人类胚胎干细胞) 和无转基因人类诱导的多潜能干细胞 (hiPSC) 线高度重现。LIF-3i 方法在分化之前不需要重新启动步骤;hPSC 可直接与极高的效率相区别, 维持核型和 epigenomic 的稳定性 (包括印迹位点)。为提高该方法的普遍性, 传统的 hPSC 首先培养在 LIF-3i 鸡尾酒补充两个额外的小分子, 事实蛋白激酶 A (佛司可林) 和声波刺猬 (嘘) (purmorphamine) 信号 (LIF-5i)。这一简短的 LIF-5i 适应步骤显著增强了传统 hPSC 的初始克隆扩展, 允许它们随后以 LIF-3i 的数量单独恢复, 从而不需要采摘/亚克隆稀有的 N hPSC殖民地以后。LIF-5i-stabilized hPSCs 随后在 LIF-3i 单独维持, 不需要抗凋亡分子。最重要的是, LIF-3i 逆转明显改善了常规 hPSC 的功能干细胞, 通过减少其谱系引种基因表达和清除联运变异的定向分化通常观察到独立的 hPSC 线。给出了 LIF-3i-reverted n-hPSC 的代表性特征, 并给出了等基因系 hPSC 在谱系引物的功能比较的实验策略。概述了类似幼稚的国家。

Introduction

2i (甲酮/ERK 和 GSK3β抑制剂) 培养系统最初开发, 以改善异种血清基小鼠胚胎干细胞 (卓制) 的文化, 以统一的地面状态, 干细胞类似于老鼠植入前啮鼠动物1。然而, 2i 不支持人类多潜能干细胞 (hPSC)2线的稳定维护。最近据报道, 各种复杂的小分子、生长因子补充和转基因方法捕获认定类似人类天真的多能分子状态2。然而, 许多用这些方法创建的 "天真的" 状态也表现出核型不稳定, epigenomic 缺陷 (例如,全球父母基因印迹的丧失), 或分化潜能受损。

相比之下, 对 GSK3β、ERK 和 tankyrase 信号和白血病抑制因子 (LIF-3i) 的三重化学抑制的鸡尾酒, 足以满足常规 hPSC 线3的一种稳定幼稚的逆转。LIF-3i-reverted 天真的 hPSC (hPSC) 维持正常的核型, 并增加其表达的幼稚特定的人类植入前啮鼠动物基因 (如北美, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, 斯特拉 (DPPA3), KLF17, TFCP2L1)。LIF-3i 逆转也授予 hPSC 与卓制相似的天真干细胞独特的分子和生物化学特征, 包括增加磷酸化 STAT3 信号, 减少 ERK 磷酸化, 全球 5-甲基胞嘧啶 CpG低甲基化, 全基因组的 CpG 去甲基化在胚胎干细胞 (ESC) 特定的基因启动器, 和显性远端 OCT4 增强剂的使用。此外, 与其他幼稚的逆转方法, 导致 aberrantly hypomethylated 印迹基因组的基因座, LIF-3i-reverted n-hPSC 没有系统性丧失印迹的 CpG 模式或丧失 DNA 甲基表达 (例如,DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3

一种直接的 LIF-3i 培养, 广泛的常规人类胚胎干细胞 (人类胚胎干细胞) 和人类诱导的多能干细胞 (hiPSC) 生长在喂食器或 E8 无饲养条件获得迅速和大量逆转到一个天真的啮鼠动物样的状态。然而, 直接 LIF-3i 幼稚逆转可能是低效的一些不稳定的常规 hPSC 线由于固有的基因组和沿袭引多变性产生的基因多样性的捐助者的背景。

因此, 为了拓宽 LIF-3i 方法的效用, 本文提出了一种渐进优化, 它允许在喂食器上培养的几乎任何常规人类胚胎干细胞或无转基因 hiPSC 线的普遍幼稚逆转。这种普及天真的逆转方法在常规 hPSC 中采用了一个瞬态初始培养步骤, 补充了 LIF-3i 鸡尾酒与另外两个小分子 (LIF-5i), 事实蛋白激酶 a (佛司可林) 和声波刺猬 (嘘) (purmorphamine) 信号。在 LIF-5i 中, 常规 hPSC 的一个初始通道将它们适应随后的稳定 LIF-3i 批量回归。最初的 LIF-5i 适应显著增加了在 E8 或喂食器上生长的常规 hPSC 的初始单细胞克隆增殖 (在其随后稳定的、连续的 LIF-3i 单独的通道之前)。传统的 hPSC 线适应了第一个通道在 LIF-5i 容忍随后批量克隆传代的天真恢复细胞在 LIF-3i 条件, 这省却需要采摘和亚克隆的稀有稳定的殖民地, 或常规使用抗凋亡分子或相关蛋白激酶 (岩石) 抑制剂。

LIF-3i 方法已成功地用于稳定地扩展和维护 > 30 独立, 基因多样性的常规 hPSC 线 > 10–30通道使用非酶或酶解离方法, 并没有诱导染色体或 epigenomic 异常的证据, 包括印迹基因位点的异常。此外, 序列 LIF-5i/LIF-3i 文化是唯一的天真的逆转方法, 迄今已报告, 改善功能干细胞的常规 hPSC 线, 通过减少其谱系引种基因表达和大大提高了他们的多向分化效力。LIF-3i 天真回归方法消除了谱系引种、常规 hPSC 线分化的内在联运变异性, 将在再生医学和细胞治疗中有很大的应用前景。

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Protocol

所有动物程序都是按照约翰霍普金斯医学院动物保育和使用委员会 (IACUC) 批准的动物护理准则和议定书进行的。

1. 为依赖于饲养者的常规 (人类胚胎干细胞中/mef) 或天真恢复的 (LIF-3i 中/mef) hPSC 培养小鼠胚胎成纤维细胞 (mef) 的制备

  1. 购买或准备从 CF1 或 CF1 x DR4 混合 E13.5 小鼠胚胎的 MEF 馈线的内部低通道供应在发布的协议4之后。
    1. Cryopreserve 低通道 (p1-p2) MEF 区域性预 (长期存储) 或后 (长达6月) 辐照和储存在液态氮如前所述4
    2. 辐照 (5000 rad) 大体积扩展 MEF 下 p5 使用γ或 X 射线照射器和准备整除数在 1.5 X 106细胞每瓶为短期贮存 (少于6月) 在-80 °c 在一个超低温冷藏柜。
    3. 板在 1.2 x 106 (新鲜地被辐照的不保存) 和 1.5 x 106 (被辐照的保存) 之下 MEF 每一个6井糊板材为准备饲养者文化, 如下所述。
  2. 在生物安全柜中加入1.5 毫升的无菌0.1% 明胶溶液, 制备明胶涂层的6井无菌组织培养处理板。
  3. 在实验室 CO2孵化器中, 在37摄氏度的至少1小时或一夜间孵化明胶涂层板材。
  4. 在第二天, 解冻低通道 (例如, P2 到 P4) 亚砜-保存和辐照 (5000 rad) MEF 根据下面所示的步骤。
    注意: 非辐照的 MEF 也应在使用前立即解冻、扩展和辐照。
  5. 在37摄氏度的水浴中放置一个冷冻的 MEF 整除。解冻后, 用乙醇消毒管, 并立即稀释至少10倍的亚砜 cryoprotectant 与 MEF 介质 (表 1) 内的一个生物安全柜 (例如, 转移1毫升亚砜-mef 整除到9毫升 mef 培养基中的无菌15毫升圆锥)。
  6. 离心稀释的 MEF 细胞在 200 x g 5 分钟在无菌15毫升圆锥管。
  7. 在生物安全柜中, 吸入并丢弃无细胞的上清液, 并在并用重悬新鲜的 MEF 培养基中进行细胞颗粒的释放。
  8. 如上文所示, 轻轻丢弃明胶溶液, 并在 mef 介质中加入2毫升的 mef, 再悬浮在糊6井板的每一个井中。将 mef 单元格和板块 1.2 x 106 (新鲜辐照的非冷冻保存) 或 1.5 x 106 (辐照保存) 的每一个6井糊板的 mef 计数。
    注: 所有从 CO2孵化器转移到生物安全柜的细胞培养板可以用乙醇喷纸轻轻擦拭, 但不应直接喷洒70% 乙醇溶液, 以避免在油井中乙醇的传播。
  9. 在实验室 co2孵化器 (5% co2, 湿润大气) 中孵化37摄氏度的 MEF 板, 以允许附着, 使用前。

2. 传统 hPSC 文化在随后的幼稚逆转中的大体积稳定, 并简要 LIF-5i 适应步骤

  1. 在开始 LIF-5i/LIF-3i 逆转之前, 验证所有常规的 hPSC 线是否拥有正常的核型。
    注: 应避免高通道常规 hPSC 线的 LIF-3i 逆转 (例如, P > 40–50), 因为这些文化可能已经产生了基因畸变, 可能对稳定、高效和体积 LIF-3i 逆转有负面影响,convetional hPSC 线。
  2. 在基于 MEF 的文化系统 (如第1节中所述) 中, 维护和扩展传统的 hPSC 文化, 并验证正常的核型, 或无馈线养殖系统 (根据调查者的喜好)。
    注意: 与馈线相关的 hPSC/MEF cocultures (例如,人类胚胎干细胞介质 (表 1) 辅以 4–10 ng/mL bFGF) 或无馈线 (e., E8 5或 mTSER 6介质 (根据制造商的说明及其与受精涂层板) 方法是兼容的批量天真的逆转使用 LIF-5i/LIF-3i/MEF 系统 (图 1)。非酶方法是首选的传代常规 hPSC 之前, 准备他们的逆转。LIF-5i 和 LIF-3i 的培养基配方不含抗生素或抗真菌剂。为了避免任何细菌或真菌污染, 应严格遵守生物安全柜的标准操作规程, 不育和维护。
  3. 对于基于 MEF 的区域性系统, 请在 LIF-5i-adapted 常规 hPSC 文化传代之前至少一天内, 在糊6井板块中对 mef 馈线进行准备。
  4. 在传统的 hPSC 文化已经达到了50% 融合 (在最初电镀后的3–5天), 取代标准人类胚胎干细胞培养基与 LIF-5i 培养基 (2 毫升每井;表 1)。
    注: 在安全柜中执行这些步骤。
  5. 文化和维护常规 hPSC/MEF 在 LIF-5i2孵化器 (5% co2, 潮湿的大气) 2 天。改变 LIF-5i 媒介每日适应他们以后的段落和稳定的回归在 LIF-3i。
  6. 另外, 对于无馈线传统文化 (例如, 在 E8), 文化 hPSC 在 LIF-5i 只有一夜之间传代第二天早晨。
    注: LIF-5i 和 LIF-3i 的文化可以保持与大气 (21% o2) 或生理 (5% o2) 氧气水平在 co2孵化器 (5% CO2, 潮湿的大气)。
  7. 在传代之前, 将培养皿放在生物安全柜中, 用 PBS 清洗 LIF-5i-adapted 常规 hPSC, 并在每个井中添加1毫升细胞离解试剂。孵化5分钟在37°c 在一个 CO2孵化器, 并轻轻地 triturate 与吸管进入单个细胞悬浮在生物安全柜。
    注: 非酶解离解缓冲器可交替用于为传代制备单细胞。
  8. 收集细胞悬浮在人类胚胎干细胞培养基 (至少2倍稀释) 在一个无菌15毫升圆锥管, 并轻轻地 triturate 细胞吹打获得一个单一的细胞悬浮。
  9. 离心机在 300 x g 5 分钟, 吸/丢弃上清, 并并用重悬细胞颗粒在 LIF-5i 培养基在生物安全柜。使用 hemocytometer 或自动单元格计数器计数单元格。
  10. 用 pbs 清洗预镀的 mef 板两次 (每井2毫升, 6 井板), 并将其 x 106单元 (在2毫升 LIF-5i 介质中) 分布到 pbs 清洗的 mef 板的1井中。
  11. 调整和优化每个单独的 hPSC 线的初始电镀密度是幼稚的恢复, 因为 replating 效率可以是高度可变的。在 co2孵化器 (5% co2, 潮湿的大气) 安置板材。
    注意: 不建议使用这种方法对大多数 hPSC 行采用抗凋亡试剂。LIF-5i 系统已经显著提高了常规 hPSC 线的初始批量克隆再电镀效率。然而, 一次性使用岩石抑制剂 (5–10微米 Y-27632) 可以进一步提高传统 hPSC 文化的初始 LIF-5i 克隆再镀效率的第一段, 一些不稳定的血统引 hPSC 线的倾向自发分化。
  12. 如果从无馈线的文化开始 (例如, E8), 直接转移一井分离的常规 hPSC 适应 LIF-5i 入一个被辐照的 MEF 被镀的井 (, 1:1 段落)。
  13. 第二天, 轻轻地旋转盘子, 以解除所有非附着细胞, 吸入培养基 (PBS 洗涤是可选的), 并取代2毫升的 LIF-5i 培养基。每天在生物安全柜中执行此步骤3–5天, 或直到细胞60–70% 汇合 (图 1)。在 co2孵化器 (5% co2, 潮湿的大气) 安置板材。

3. LIF-3i 介质中 n-hPSC 的长期维护和扩展

  1. 在最初的 LIF-5i 适应之后, 在生物安全柜中的每3–4天, 或者当文化成为60–70% 汇合时, 通过随后稳定的 LIF-3i 文化 (图 1)。
    注: LIF-3i 文化需要严格的维护和允许 n-hPSC 培养达到高的融合/细胞密度从长时间的培养 (例如, > 4 天) 减少后续克隆再电镀效率, 并促进自发分化。
  2. 在生物安全柜中, 通过轻轻添加2毫升的 PBS, 摒弃培养基, 洗净 LIF-5i/LIF-3i 文化的每一个井。丢弃 PBS 并添加1毫升的细胞脱离溶液。孵化5分钟在37°c 在 co2孵化器 (5% CO2, 潮湿的大气)。
  3. 收集细胞悬浮液, 添加人类胚胎干细胞培养基 (不带抑制剂或生长因子 (表 1); 至少2倍稀释) 恢复所有 hPSC, 并通过吹打轻轻 triturate 细胞以获得单个细胞悬浮。将悬浮液转移至无菌15毫升圆锥管。
  4. 离心机在300克5分钟, 吸/丢弃上清。在 LIF-3i 培养基中重新悬浮细胞颗粒。使用 hemocytometer 或自动单元格计数器计数单元格。
  5. 板 ~ 2 x 105细胞每井在被辐照的 MEF 在糊6井板材为常规传代 LIF-3i 文化。为最初的 LIF-5i-adapted 文化, 板材最初更高的密度 (4 x 105细胞/井) 在第一个段落之前入 LIF-3i/MEF。
  6. 将 LIF-5i-adapted hPSC 重新板和分发到新的 PBS 冲洗辐照的 MEF 进纸板上 (在上一天前准备) 在 LIF-3i 介质中。每日更换 LIF-3i 介质。
  7. 使用 n-hPSC 在功能研究或超低温保存前, 在 LIF-3i 培养基中至少第4-7 连续散通道的 hPSC。记录常规或 LIF-3i 介质中 n-hPSC 的通道数。
    注: 不推荐使用高通道的 LIF-3i 逆转 (例如> p40) 沿袭引道, 常规 hPSC 线。应努力使传统的 hPSC 线在尽可能低的通道中恢复可用。此外, 不建议使用 LIF-3i-reverted hPSC 超过 10 LIF-3i 通道的功能研究, 因为这种 n-hPSC 的文化可能会港口 karyotypically 异常克隆由于延长克隆细胞培养选择。如果不提供 LIF-3i < 10 通道的 N hPSC 库存, 则应进行功能性研究, 逆转低通道常规 hPSC 线的新鲜 LIF-5i/LIF-3i。

4. LIF-3i-reverted hPSC 的超低温保存和解冻

  1. 在 LIF-3i 中, 如上文所示, 在使用功能研究或长期冷冻保存之前, 将 hPSC 至少5-7 个通道展开还原。记录在常规条件和 LIF-3i 条件下, 每一个冷冻瓶的通道数量。
    注: 在功能化验中不使用过量 LIF-3i-reverted n-hPSC 可在每段中保存, 但低逆转后通道(例如 g.、< p3) 的冻结可能会导致不良或高度可变的解冻后恢复效率。
  2. 在生物安全柜中, 吸入培养基, 在 PBS 中洗涤细胞 (每井2毫升), 用细胞脱离溶液 (每井1毫升) 将 pbs 和离解 hPSC 菌落分离成单个细胞。在 co2孵化器 (5% co2, 潮湿的大气) 安置板材为5分钟在37°c。稀释细胞脱离溶液与 LIF-3i 培养基 (2 倍), 收集 hPSC 在一个无菌15毫升圆锥, 离心细胞在 200 x g 5 分钟, 并用重悬细胞颗粒在 LIF-3i 培养基 (每良好当量)。使用 hemocytometer 或自动单元格计数器计算单元格数。
  3. 离心 hPSC 在 LIF-3i 介质中 (200 x g为5分钟) 和并用重悬细胞在一个安全柜中的冷冻解决方案 (表 2), 密度至少 1 x 106细胞/毫升。
  4. 将细胞转移到长期贮存的低温管中, 放入缓冻容器中。允许样品在-80 摄氏度冷藏库过夜。
  5. 第二天, 将 cryovials 转移到液氮冷藏库中, 用于长期贮存。
  6. 解冻时, 将冷冻小瓶放入37摄氏度水浴中2分钟. 消毒瓶 (乙醇喷雾), 转移 hPSC 在一个无菌15毫升圆锥和慢慢稀释细胞10倍在人类胚胎干细胞培养基 (表 1) 补充与5微米的蛋白激酶 (岩石) 抑制剂 Y-27632 在无菌生物安全罩柜内。
  7. 离心机在 200 x g 5 分钟。在生物安全柜中, 丢弃无细胞上清液和并用重悬 LIF-3i 培养基中的细胞颗粒 (), 辅以5微米岩石抑制剂 Y-27632。
    注意: 排除 Y-27632 将导致解冻后恢复效率较差 (图 2)。
  8. 将解冻后的细胞悬浮 LIF-3i/ROCK 抑制剂转移到 PBS 洗涤的 MEF 电镀井中。Cryopreserve LIF-3i 的文化密度为每瓶 1 x 106细胞。在糊6井板的一个井中, 将这些小瓶解冻到馈线中。
  9. 第二天, 开始定期 LIF-3i 中等扩张, 没有蛋白激酶抑制剂。

5. hPSC 样品收集用移料器

  1. 要准备来自 LIF-3i/MEF (或人类胚胎干细胞/MEF 常规) 的样本 (例如, 基因表达 (例如, 定量 rt-pcr, 微阵列) 或蛋白质 (例如,西方印迹) 分析, 消耗来自 MEF 馈线的 LIF-3i 文化, 使用磁性活化细胞分选 (mac) 与 anti-TRA-1-81 抗体涂层微珠根据制造商的协议。
  2. 或者, 使用以下简单的预镀方法来耗尽馈线的文化, 如下所述。
  3. 在无菌生物安全罩柜中, 丢弃无细胞上清液, 用2毫升无菌 PBS 清洗颗粒。用细胞脱离溶液分离粘附 LIF-3i/MEF 培养物 (1 毫升/井)。孵化5分钟在 co2孵化器 (5% CO2, 潮湿的大气)。收集 hPSC 在一个无菌15毫升圆锥。在人类胚胎干细胞培养基中洗涤2倍, 将细胞转化为无菌15毫升锥形, 离心机在 200 x g处进行5分钟。
  4. 在生物安全柜中, 将 LIF-3i/MEF 离解细胞的每一个井重新悬浮成2毫升的 LIF-3i 介质, 并直接转移到一个新的井中的6井板已新鲜涂有0.1% 明胶。
  5. 孵化 LIF-3i/MEF hPSC 细胞为1小时在37°c 在 co2孵化器 (5% CO2, 潮湿的大气)。在新的锥形管中用吸管收集非黏附细胞。轻轻地加入2毫升的人类胚胎干细胞培养基到每个井和漩涡收集剩余的非黏附的细胞。
    注: 大部分被辐照的 MEF 将附着在1小时内的糊板上, 使得大部分 hPSC 悬浮。
  6. 结合和离心细胞在 300 x g 5 分钟洗在 PBS。在离心后对液氮中的细胞颗粒进行快速冻结, 或者在与下游蛋白或核酸分析相兼容的株溶藻缓冲中重新悬浮颗粒 (图 2B)。
  7. 用匹配的传统引物等基因系 hPSC 控制对 LIF-3i hPSC 线进行刻画。
    注意: 由于引种文化之间和内部的内在差异, 相关的控制是在文化的匹配 timepoint 或在幼稚逆转之前准备的。详细的协议和材料为下游免疫荧光 bioimaging, 流式细胞术, 西方印迹, 基因表达 (rt-pcr 检测和微阵列), 甲基化研究 (斑点印迹, CpG 甲基化芯片), OCT4 近端和远端增强剂占主导地位的记者化验和信令抑制剂化验在别处提供3

6. 后幼稚逆转: 在功能测定之前使用 LIF-3i-reverted n-hPSC 的基因组完整性和保留父母印记的验证

  1. 在开始 LIF-5i/LIF-3i 逆转之前, 屏幕上的起始引物, 传统的 hPSC 文化为拥有正常核型 (例如, 以姬姆萨带染色分析使用发布的方法7)。
    注: 这是为了消除常规的 hPSC 种群, 可能导致异常基因组改变, 这可能会驱动 artefactual 选择生存优势在克隆 LIF-3i 条件。
  2. 为了获得最佳结果, 在使用功能研究或定向分化几个星期, 新鲜地将传统的 hPSC 文化恢复到一种天真的状态 LIF-3i。
    注意: 不建议在 LIF-3i 条件下的常规长时间 "维护" 文化, 10 段以上的短文。常规的扩展和维护人类胚胎干细胞和 hiPSC 线应使用传统的文化系统 (例如,在 E8, 或 MEF/人类胚胎干细胞培养基与 bFGF)。
  3. 评估后恢复的 n-hPSC 线保留正常核型5–7通道后 LIF-3i 逆转 (e., 与姬姆萨波段染色分析7, 或任何其他选择方法)。
  4. 评估所有恢复的 n-hPSC 线, 以保留正常的父母基因组印记通过 DNA 甲基化分析的选择 (例如, 中央 DNA 芯片的协议 LIF-3i-reverted n-hPSC 的父母印记的分析在别处提供3) 后5–10通道 LIF-3i 逆转。

7. 后幼稚逆转: 用 LIF-3i-reverted n-hPSC 定量定向分化试验设计指南

  1. 直接利用 LIF-3i n-hPSC 建立定向分化协议, 无需额外的细胞培养操作。
    注: 重新启动 (即,将 n-hPSC 回到传统的引物条件之前, 他们使用的定向分化化验) 是不必要的 LIF-3i 方法, 不建议。
  2. 为了控制单个 hPSC 线功能测试中的检测和联运变异性的影响, 通过使用至少三 hPSC 的独立分化协议, 交叉验证谱系特异分化效用来自独立遗传背景的线 (多捐助者衍生的 hiPSC 和人类胚胎干细胞)。
  3. 对于功能比较, 建立同级文化, 在相同的段落编号, 并从相同 (等基因系) hPSC 线平行于传统的血统引种和 LIF-3i-reverted hPSC 文化。在各自的媒体中保持等基因系 hPSC 文化的引导/天真的兄弟姐妹 (e., E8 vs。LIF-3i), 并同时区分使用相同的区分协议和材料, 以消除任何实验性偏差 (图 4)。
  4. 为等基因系引物对幼稚 hPSC 比较, 调整和优化初始电镀密度的每一个单独的鉴别试验。
    注: LIF-3i-reverted hPSC 的神经祖、确定性内胚层和换血术内皮定向分化的详细协议在别处提供3。LIF-3i-reverted n-hPSC 在定向分化检测中比常规 hPSC 具有更强的增殖和分化能力。hPSC 通常需要较低的初始电镀浓度比传统的 hPSC, 而不像他们传统的引 hPSC 同行, 不需要使用抗凋亡试剂, 以提高其克隆生存后, 酶分化测定中的消化。

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Representative Results

该协议优化了在馈线依赖和馈线无关的传统 hPSC 文化 (图 1) 中 LIF-3i 的高效天真的回归。本文描述的详细协议概述了从馈线依赖或无馈线常规 hPSC 条件 (E8 介质) 开始的 LIF-3i 的顺序适应。

图 1–3了几种常规人类胚胎干细胞和无转基因 hiPSC 线 LIF-3i 逆转的代表性结果。这些典型的结果可以验证与商业上可用的人类胚胎干细胞线 H9, 或与商业上可用的无转基因, 脐血衍生的 episomal hiPSC 线 (6.2) 衍生于 Zambidis 实验室8,9。引入一个初始的 LIF-5i 适应步骤, 允许高效的后续, 大量克隆繁殖的常规 hPSC 文化在 LIF-3i, 不需要抗凋亡剂或岩石抑制剂10 (图 1A, B).在 LIF-3i 5–7通道后, 可以快速收集多片幼稚样的 hPSC 样品, 用于下游分析或多向定向分化。或者, LIF-3i 文化可以保存在将来的应用中。解冻后的细胞恢复可以改善 (图 2) 通过包含岩石抑制剂在超低温保存和解冻后的介质11

对分子和功能干细胞的决定因素, 无论是在体外和在胚胎中, 最近回顾了2。这些因素包括遗传背景、与培养相关的关键发育基因突变的获取、人类胚胎干细胞和 hiPSC 派生和培养方法上的差异。以下是对 LIF-3i-reverted hPSC 的表型、分子和功能 pluripotencies 的鉴定和验证所采用的标准化验的摘要。

菌落形态
在引物、常规和 LIF-3i-reverted 培养系统之间的过渡伴随着 hPSC 菌落形态的明显物理变化 (图 1B)。常规 hPSC 细胞增殖为扁平的、宽的单层菌落, 迅速从小细胞团簇 (在 MEF 或无饲养条件下) 扩展, 但作为单个细胞却很差。暴露的常规 hPSC 线, 以 LIF-3i 促进生长和扩展和小, 紧密包装, 圆顶形的殖民地, 出现无性从单细胞。这些形态学的变化是完全可逆的, LIF-3i-reverted 圆顶状的菌落可以自发地过渡到常规的单层形态学, 如果 LIF-3i 被撤回, 细胞重新培养的标准常规人类胚胎干细胞培养基辅以 bFGF。此外, LIF-3i-reverted 细胞在高汇合密度下的扩张 (或长时间不频繁传代的培养) 导致扁平化、常规形态的自发重新取得, 克隆效率降低;强调需要勤奋维护和照顾 LIF-3i-reverted hPSC (g., < 40–60% 汇流)。

表面干细胞标记物的实时免疫荧光染色及流细胞分析
在连续 LIF-3i 培养过程中, 干细胞标记在从常规到幼稚状态的过渡中的评价可以通过活体抗体染色监测无创性, 而不检测对 LIF-3i/MEF 扩张的任何负面影响 (e., 活染色 fluorochrome-共轭抗体对 TRA-1-81, TRA-1-60 和 SSEA4)。

干细胞在 LIF-3i 逆转过程中的保留也可以通过流动细胞分析干细胞相关的表面标记表达 TRA-1 和 SSEA 抗原在单细胞传代 (图 1C) 或完整的, 固定的菌落原位免疫荧光 (图 3)。虽然这些标记不区分常规和 LIF-3i 状态, 但它们的水平与 hPSC 从常规 hPSC 过渡到 LIF-3i 条件时可能发生的自发分化频率成反比。额外的表面抗原, 可能更具体地标记人类天真的状态在体外2,12,13 也可以用来检测有效的 LIF-3i hPSC 逆转。

n-hPSC 分子干细胞的验证
由于 hPSC 线的遗传背景被认为是联运变异性的有力贡献者, 因此在比较 hPSC 文化系统时, 必须严格评估等基因系文化在匹配的文化 timepoints (图 4)。由于这些系统中的一些已经被证明可以产生异常基因组和表观遗传构型的 hPSC 种群2, 任何幼稚的逆转方法都应该用一些独立遗传背景的 n-hPSC 来测定, 以一种方式这足以证实生物重现性, 并排除非发育相关的 "伪多潜能" 状态 (即,具有明显的分子干细胞特征, 但缺乏功能分化能力)。Zimmerlin。进一步扩大了对 LIF-3i 培养系统的验证, 包括测定从各种重新编程方法衍生出的还原 n-hiPSC 的分子和功能 pluripotencies, 这是另一个已知的功能变异性贡献者。在多能状态之间2

因此, 大多数对人类天真的文化系统的研究集中在对 n-hPSC 的分子干细胞的测定 1) 的表观遗传学水平 (例如,组蛋白标记的芯片排序或芯片 PCR, 全球 DNA 甲基化的 immunoblots 或整体基因亚硫酸氢酶测序, 等位基因特异的 CpG 甲基化芯片, OCT4 增强器主要使用的记者系统, 全球活动在监管元素通过 DNAse I 超敏性和重复元素分析的 RNA 排序), 2) transcriptomic水平 (RNA 排序, 表达微阵列和定量 rt-pcr), 蛋白质表达分析 (e., 资产管制, 免疫荧光显微镜, 和西方印迹) 和 3) 通过代谢研究 (例如,糖酵解, 氧化磷酸化和烟酰胺代谢)。介绍了免疫荧光染色的典型例子和西方印迹检测分子干细胞关键标志物的表达 (图 3B, C)。例如, 图3B 中所示的是活化磷酸化 (磷) 和 STAT3 和 ERK1/2 的总亚型, 这些都是小鼠 ESC 像幼稚干细胞的关键分子标志。这些是使用 anti-STAT3 和 anti-ERK1/2 的主要抗体检测到的。此外, 干细胞在畸胎瘤分化检测中的功能性表现在常规。LIF-3i-reverted hPSC 畸胎瘤组织解剖10周后注射和固定在4% 甲醛和石蜡嵌入 (图 3D)。

制备 LIF-3i/MEF 或人类胚胎干细胞/MEF/bFGF/碱性成纤维细胞, 用于下游分子分析, 应包括 MEF 损耗。在我们的实验室中成功地使用了两种方法来描述 MEF 损耗。MEF 预镀是一种简单、可靠、经济高效的方法, 用于从 n-hPSC 样品中去除分子研究中的馈线, 并且是一种更可取的替代法, 或 mac 分离 (anti-TRA-1-81 或 anti-TRA-1-60 抗体为基础的分离).另外, LIF-5i/LIF-3i 培养物中自发分化的 TRA-1-negative 黏附细胞可以通过预镀 LIF-3i 消化, 迅速从 LIF-5i/LIF-3i N hPSC 的文化中消除, 然后再通过预先电镀酶单细胞为 1 h 在板材前涂0.1% 明胶 (图 2)。

n-hPSC 功能干细胞的评价
对 PSC 功能干细胞的最严格的检测是胚泡注射嵌合体试验, 由于伦理上的原因, 在 n-hPSC 线的检测中受到限制。或者, 有几个小组报告了 hPSC 与其他各种方法的生成, 试图产生种间合体。然而, 与标准鼠标 ESC2的嵌合体能力相比, 这些尝试已经对小鼠或猪胚产生了极低或不成功的 hPSC 血统的贡献。

另外的功能性研究通过各种方法对 hPSC 的体外分化进行了研究, 但发现有偏、有缺陷或减少多向分化能力, 伴随窝藏后生异常2,13。类似的 epigenomic 畸变, 特别是在印迹位点, 已被发现在鼠标 ESC 后, 长期暴露在 LIF-2i 鸡尾酒14。有趣的是, 一些回归文化系统报告了 PSC 功能干细胞的特定属性的全球改进, 例如在体内滋养外胚层贡献的增强能力2,15.

利用独立衍生的 LIF-3i-reverted hPSC 的广泛集合, Zimmerlin使用多向鉴别试验表明, LIF-3i 系统显著改善常规干细胞线的功能 hPSC3. 这允许对等基因系对中的常规 vs LIF-3i hPSC 线进行系统分析, 以消除联运相关的变化 (图 4)。LIF-3i-reverted hPSC 线不需要在 EB 分化之前再启动一步。然而, LIF-3i hPSC 增殖的克隆率明显高于 E8 等基因系细胞, 因此, 初始较低的电镀密度需要调整, 以允许每种文化在类似的 timepoint 达到汇合。

调查人员应该经常使用多种化验来证明 LIF-3i-reverted hPSC 的改进功能, 不仅包括体内畸胎瘤的检测, 而且还有从体外定向分化到神经的测定,确定的内胚层和 hematovascular血统 3使用多种化验(例如, 2D APEL3,16 和3D 胚体17,18 系统)。为了控制与检测相关的重现性, 应至少两种不同的分化方法在复制为每等基因系对 primed/LIF-3i hPSC 文化 (图 4, APEL, 胚体区分协议)。实验设计应该包括一个健壮的数字 (例如, > 3–5) primed/LIF-3i 等基因系对 hPSC 线从多个独立的捐助者遗传背景 (图 4)。

Figure 1
图 1:传统的、沿袭的 hPSC 文化的逐步过渡, 以 LIF-3i 的方式与幼稚的条件结合起来。(A)逐步 LIF-3i 逆转的议定书模式。(顶部示意图)hPSC 向 LIF-3i 文化过渡的常规方法。(底部示意图)两个总结的策略, LIF-3i 天真的逆转传统 (底漆) hPSC 养殖的任何一个馈线 (即,引物/MEF 到 LIF-3i/MEF), 或无馈线条件 (i. e, Primed/E8 到 LIF-3i/MEF)。(B)人类 PSC 的形态。显示是 hPSC 在 LIF-3i 逆转期间使用商业上可用的人 episomal iPSC 线 (6.2) 的代表性显微照片。显示的是最初的常规扁平单层菌落之间的转变, 以及随后在中间 LIF-5i 和稳定 LIF-3i 培养条件下出现的圆顶状克隆菌落。刻度条 = 200 µm (C)干细胞表面标记的代表性流细胞分析。显示的是 TRA-1-81 和 SSEA-4 表面表达在常规 hPSC 线 6.2 (p40) 在 E8 扩展, 最初的段落在 LIF-5i/MEF, 并且跟随1到9个段落 (P1-P9) 在 LIF-3i 条件。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: hPSC 的低温保存及 MEF 预镀样品的制备。(a) LIF-3i/MEF 文化冻结/解冻周期的例子。采用常规脐血衍生、非集成、无转基因的人 iPSC 线 E5C3, 在人类胚胎干细胞培养基中的 MEF 馈线上进行了扩增, 并辅以 4 ng/毫升 bFGF 为18通道。传统的, 沿袭引 E5C3 在 LIF-5i (左) 适应, 并转换成 LIF-3i 培养基3通道 (中心)。中心面板中显示的 E5C3 LIF-3i 细胞以亚砜为基础的 cryoprotectant 培养基 (表 2; 每瓶 1 x 106细胞) 和储存在液氮中。一个月后解冻一瓶, E5C3 细胞转移到一个6井板 (右) 的送纸井。通过补充 LIF-3i 培养基与5µM Y-27632, 只有一天解冻后, 细胞恢复可以增强。刻度条 = 200 µm (B)采用预镀方法消除了 LIF-3i/MEF hPSC 文化中的 MEF (以及粘附的差异化细胞)。显示的是在预镀前和之后的流动细胞分析的 PE 共轭 anti-TRA-1-81 和 TRA-1-60 抗体, APC 共轭 SSEA-4 抗体和 SSEA-1/CD15 抗体表明, TRA-1 抗原阴性和 MEF 细胞耗尽使用一小时预镀方法。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: LIF-3i/MEF n-hPSC 培养中干细胞的特征。(A)表面和核干细胞标记。干细胞因子北美在同一 (等基因系) TRA-1-81+SSEA4+常规, 引脐血源 hiPSC 线 E5C3 (p39) 在引物 (E8) 扩张, 或天真 LIF-3i (p8 LIF-3i/MEF) 条件。在腔片上有代表性的 hPSC 培养物的免疫荧光染色显示了北美在 SSEA-4+TRA-1-81+ hPSC 中培养的干细胞、常规 (E8 培养基) 或 LIF-3i/MEF 中的细胞核的统一表达。条件。刻度条 = 100 µm. (B)西方污点分析。STAT3 (左), ERK (中心) 和控制β肌动蛋白表达的代表性 hPSC 线 (人类胚胎干细胞线 H9) 在常规 (E8 培养基) 或 LIF-3i/MEF 条件 (3i)。(C)表达幼稚的干细胞相关转录因子。显示的是 STELLA/DPPA3, NR5A2 和 TFCP2L1 的免疫荧光在一个代表性 LIF-3i/MEF 文化 (脐血衍生 hiPSC 线 E5C3 在 p33 (人类胚胎干细胞/MEF) + p8 (LIF-3i/MEF)。刻度条 = 100 µm. (D)常规和 LIF-3i-reverted hPSC 畸胎瘤的测定。在 E8 (p9) 或 LIF-3i/MEF (+ p12) 中培养的等基因系代表 hiPSC 线 (脐血源 E32C6) 中的功能性干细胞的验证。10 x 106细胞等基因系平行培养的常规, 引物 vs LIF-3i-reverted hPSC 被注射到 immunodeficient 的小鼠四肢。畸胎瘤 microsections 的苏木精和伊红染色显示, 外胚层 (神经花环: NR, 视网膜色素 epitheliam: RPE), 胚层 (chondroblasts: Ch) 和内胚层 (腺组织: GI) 血统。刻度条 = 100 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.

Figure 4
图 4:等基因系与天真状态的功能干细胞比较。(A)在独立分化协议中, 等基因系常规与 LIF-3i 培养 hPSC 中不同多能态的功能干细胞的评估策略示意图。显示两个换血术-血管祖分化系统 (APEL 单层和3D 胚体 (EB) 系统), 以前被用来评估差异效力的常规LIF-3i-reverted 在同一 (等基因系) hPSC 线培养在平行后 LIF-3i 回归以同样段落数字。LIF-3i-reverted hPSC 线在 EB 分化之前不需要再启动一步, 直接服从微分协议。(B) EB 血管祖 (VP) 分化系统。本研究采用的 EB 3D 微分系统, 先前描述为17,18。显示的是在10天的 EB 分化 (左面板) 的代表结果为同一脐血 (CB) 衍生 E5C3 hPSC 线9的等基因系文化, 在传统的人类胚胎干细胞/mef (引物/mef) 条件下培养或 LIF-3i/MEF 天真条件。流式细胞术对这些 EB 细胞的分析显示, 在分化前 E5C3 线 LIF-3i 逆转后, CD31+CD146+ VP 的数量显著增加。直方图显示了 CD31+CD146+ VP 细胞百分比在10天恢复的平均±SD, 使用等基因系对独立 hPSC 线 (两个 CB hiPSC 和一个成人成纤维细胞衍生hiPSC, 虚线连接等基因系对)。结果表明, 在多 hPSC 线遗传背景下 EB 系统的 VP 分化效率显著提高。(C) APEL 单层血管祖分化系统。常规 (引 E8) 和 LIF-3i-reverted hPSC 可以直接区分使用相同的文化条件, 生长因子, 细胞因子和小分子的逐步 APEL 内皮分化协议 3,16. 显示的是使用 E5C3 脐血 hiPSC 线的独立 APEL 分化实验, 以及 CD146 分化7天 CD31+APEL+血管祖群的百分比。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

LIF-3i 系统将经典小鼠2i 天真逆转鸡尾酒1的改良版应用于人类多潜能干细胞。hPSC 的自我更新 (不能单独扩展 2i) 在 LIF-2i 通过补充这鸡尾酒与 tankyrase 抑制剂 XAV939 稳定。LIF-3i 文化允许大量和有效地逆转传统 hPSC 到一个多能状态类似于人类植入前啮鼠动物3。虽然 XAV939 在 hPSC 中的作用机制很可能是复杂的, 并且与2i 协同, 但它们可能至少包括一个重要的稳定和增强 hPSC 自我更新通过 WNT 信号通路3

传统的 hPSC 文化通常采用多能态, 具有高度可变的谱系引种基因表达和植入后啮鼠动物表观, 可能导致不一致或减少功能干细胞2.这种固有的血统启动传统的 hPSC 文化也可能干扰的成功 LIF-3i 逆转一些 hPSC 线2。然而, 在 LIF-3i 方法中列入最初的 LIF-5i 适应步骤 (表 1) 普遍扩大了 LIF-3i 在众多 hPSC 线之间逆转的效率, 并促进了传统 hPSC 线的大量天真回归。这就绕过了罕见的幼稚恢复的殖民地的繁琐采摘和亚克隆, 或者需要使用常规的抗凋亡分子来稳定它们的生存能力。

LIF-5i/LIF-3i 天真回归方法在各种人类胚胎干细胞和 hiPSC 线中重现。它需要最少的训练与基本细胞培养技能。Zimmerlin人成功地使用了这一顺序策略, 以恢复 > 30 独立人类胚胎干细胞和无转基因 hiPSC 线从广泛的捐助者3。LIF-5i (图 1) 中的单个通道足以让大多数 hPSC 线在大量 hPSC 文化中进行有效的天真逆转, 并进一步推进它们在 LIF-3i 中的后续稳定维护和扩展。

此外, LIF-3i/MEF 系统支持强健的批量克隆扩展效率, 在所有的步骤之间的沿袭引传统 hPSC 文化所有的方式完成幼稚般的 hPSC 逆转 (i., 适应,7–10通道的过渡和扩展仅在 LIF-3i/MEF)。尽管目前这种养殖系统的配方需要馈线的支持, 但提出了一种简单、价格低廉的方法, 用预镀技术对 LIF-3i 进行了分析, 并对其进行了研究 (图 2)。

另外还报告了多种其他文化系统, 以促进传统的 hPSC 类似天真的多潜能状态2。虽然这些 hPSC 文化系统也依赖于经典的老鼠天真的2i 条件的利用, 在大多数情况下, 这些单细胞传代方法也需要额外的化学调制, 以稳定固有的不稳定/亚稳态人类天真的状态。重要的是, 这些其他方法中的大多数显示了分化和/或获得异常 epigenomic 印记或核型2后功能干细胞受损。虽然传统的引 hPSC 培养中异常核型的出现已经有了很好的文献记载,19、长时间的酶单细胞传代方法通常采用在大多数天真的逆转方法中。这也显示了事实异常染色体构型的生成20,21;更敏感的技术 (例如,拷贝数变异, 单核苷酸多态性) 可能会显示额外的改变22,23

与此相反, LIF-3i-reverted hPSC 线的广泛的曲目被证实拥有正常的核型在低中通道 (例如, p5-p15), 并且在高段落数字 (e., > p30) 以后 LIF-3i 文化3。此外, LIF-3i-reverted hPSC 的 epigenomic 印迹重现性正常且完好, 5–10通道后 LIF-3i 反转2。通过使用敏感的等位基因特定的商业甲基化阵列平台, 先前证明了在 LIF-3i-reverted hPSC 线 (第4-7 通道 LIF-3i) 的印迹位点上的 CpG 甲基化标记被发现严重正常结构1。由于异常的基因印迹和核型可能最终损害 hPSC 的功能能力, 本议定书概述了先决条件指南, 鼓励研究人员在幼稚逆转之前和之后验证 hPSC 文化, 使用此方法以及其他。

LIF-3i 方法改善了人类胚胎干细胞和非转基因 hiPSC 线的干细胞跨胚层的功能性 (图 3)。与其他幼稚的回归协议不同, LIF-3i 方法需要重新启动的步骤, 以 hPSC 随后的分化 (即,转换 n-hPSC 回到传统的引物条件之前, 他们使用的定向鉴别化验)。LIF-3i-reverted n-hPSC 显着更有效的分化能力比他们的等基因系常规 hPSC 同行在畸胎瘤的检测 (图 3D) 和定向分化协议的所有血统三毒菌层数2。由于常规 hPSC 功能测试中的检测依赖性和联运变异, 应使用独立的定向分化协议和来自多种遗传背景的 hPSC 来评估谱系特异分化。通过仔细的实验设计, 可以预期在 LIF-3i 条件下, hPSC 线的广泛阵列可显著提高其多向分化效率, 与等基因系常规对应的4–10通道相比。

总之, 这种方法迅速无性扩大了人类 PSC 的数量, 提高了它们的下游分化效率, 增加了分化后沿袭的祖细胞数, 并降低了联运的变异性。在传统的, 血统引 hPSC 线。这些具有改进功能的 n-hPSC 可能会对它们为发育中的胚胎贡献功能性组织的潜能产生更大的影响。例如, 稳定的 n-人类胚胎干细胞可以用于开发可移植的人体器官和成体干细胞开发动物合体, 或产生人性化的基因靶向动物模型的疾病。该 tankyrase 抑制剂的进一步优化-利用 LIF-3i 方法在定义的无馈线 GMP 符合的文化条件将有助于有效的临床有用的生成广泛的功能和 engraftable 细胞类型治疗用。

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Disclosures

根据生命技术与约翰霍普金斯大学 (JHU) 之间的许可协议, Zambidis 博士有权获得大学颁发的关于干细胞许可的版税的份额。这一安排的条款由 JHU 按照其利益冲突政策进行管理。这并不会改变作者对共享数据和材料的期刊政策的遵守。

Acknowledgments

这项工作得到了 nih/内 (R01EY023962)、nih/发育研究院 (R01HD082098)、RPB 斯坦创新奖、马里兰干细胞研究基金 (2018-MSCRFV-4048、2014-MSCRFE-0742)、新德科学论坛奖和莫斯利基金会赠款的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated BD Biosciences 561716 use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibody Sigma Aldrich HPA029708 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibody Abcam ab6276 use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated  BD Biosciences 550315 use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience 17-0319-42 use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kit Miltenyi Biotec 130-091-935
anti-NANOG antibody Abcam ab109250 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibody Sigma Aldrich HPA005455 use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody Cell Signaling 4695 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody Cell Signaling 4370 use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody Cell Signaling 9145 use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated Agilent E0432 use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated  R&D System FAB1435A use 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated R&D System NLLC1435G use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibody Cell Signaling 9139 use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibody Millipore MAB4388 use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated  R&D System NLLC4770R use at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0068 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated Stemgent 09-0069 use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560193 use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated BD Biosciences 560161 use 10µL per assay (FACS)
APEL2-Li StemCell Technologies 5271
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3311
CellAdhere dilution buffer StemCell Technologies 7183 dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouse Charles river 023
CHIR99021 R&D System L5283 reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope system Zeiss LSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC line Thermo Fisher Scientific A18945 also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates Corning 3506
Countess  cell counting chamber slide Thermo Fisher Scientific C10228
Countess automated cell counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)  Thermo Fisher Scientific 11995-065
DMEM-F12 Thermo Fisher Scientific 11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide) Sigma Aldrich D2650
DR4 mouse The Jackson Laboratory 3208
Essential 8 (E8) medium StemCell Technologies 5940
Fetal bovin serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30071.03
Forskolin Stemgent 04-0025 reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine) Sigma Aldrich G1890-100G resuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828-028
L-Glutamine (100X) Thermo Fisher Scientific 25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
mTeSR1 medium StemCell Technologies 85850
Nalgene cryogenic vials Thermo Fisher Scientific 5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System Fisher Scientific 154534
Paraformaldehyde (PFA) solution , 4% in PBS USB Corporation  19943
PD0325901 Sigma Aldrich PZ0162 reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Biological Industries 02-023-1A
Purmorphamine Stemgent 04-0009 reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin A Peprotech AF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 Peprotech 120-05ET resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF) Peprotech 100-18B resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human LIF Peprotech 300-05 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
SB431542  Stemgent 04-0010-05 reconstitute at 100mM in DMSO
Stemolecule Y27632 in Solution Stemgent 04-0012-02 ROCK inhibitor in solution (10mM)
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent Thermo Fisher Scientific A11105-01
Streptavidin-Cy3 conjugate Sigma Aldrich S6402 use at 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
Thermo Scientific Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific 5100-0001
Vascular endothelial growth factor (VEGF)-165 Peprotech 100-21 resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
Vitronectin XF matrix StemCell Technologies 7180 dilute at 40µL/mL in CellAdhere™ dilution buffer
XAV939 Sigma Aldrich X3004 reconstitute at 100mM in DMSO
β-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985-023 light sensitive

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