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Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis

Biochemistry

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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para determinar cuantitativamente el contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystis mediante un método espectrofotométrico. El procedimiento de extracción fue aplicado con éxito a otras cepas de cianobacterias y algas; sin embargo, debido a variaciones en los espectros de absorción del pigmento, es necesario probar las ecuaciones espectrofotométricas para cada cepa individual.

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Zavřel, T., Chmelík, D., Sinetova, M. A., Červený, J. Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis. J. Vis. Exp. (139), e58076, doi:10.3791/58076 (2018).

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Abstract

Esto es un protocolo simple para la determinación cuantitativa del contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Ficobiliproteínas son los componentes más importantes de phycobilisomes, las antenas principales de recolección de luz en cianobacterias y varios taxones de algas. Phycobilisomes de Synechocystis contienen dos ficobiliproteínas: ficocianina y allophycocyanin. Este protocolo describe un simple, eficiente y confiable método para la determinación cuantitativa de ficocianina y allophycocyanin en esta cianobacteria modelo. Se compararon varios métodos de extracción de ficobiliproteína y cuantificación espectrofotométrica. El procedimiento de extracción como se describe en este protocolo se aplicó con éxito a otras cepas de cianobacterias como Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., y Nostoc SP., así como las algas rojas Porphyridium cruentum. Sin embargo, los coeficientes de extinción de ficobiliproteínas específicos de distintos taxones pueden variar y por lo tanto, se recomienda validar el método de cuantificación espectrofotométrica para cada cepa individual. El protocolo requiere poco tiempo y puede realizarse en cualquier laboratorio de Ciencias de la vida estándar ya que requiere equipos estándar.

Introduction

fPhycobiliproteins son complejos de proteína pigmento soluble en agua que representan los componentes principales de las antenas de luz-cosechar en procariotas cianobacterias (Cyanophyta) y varios taxones eucariotas (Glaucophyta, Rhodophyta y Cryptophyta)1. Se producen principalmente como complejos supramoleculares llamados phycobilisomes y por lo general se unen a la superficie de las membranas fotosintéticas en el lado del estroma, a excepción de Cryptophyta, donde se localizan las ficobiliproteínas en la tilacoides lumen2. Hasta la fecha se han identificado cuatro tipos de ficobiliproteínas: el núcleo allophycocyanin y la ficocianina, ficoeritrina y phycoerythrocyanin periférica1. Como los complejos principales de recolección de luz, phycobilisomes representan uno de los factores cruciales de la productividad de culturas masivas de algas y cianobacterias. Se ha demostrado que phycobilisomes truncamiento puede aumentar la acumulación de biomasa bajo luz fuerte3. Por otra parte, con irradiación moderada o baja, el truncamiento de la antena daba como resultado tasas de crecimiento y acumulación de biomasa reducción3,4. Ficobiliproteínas comercialmente se utilizan como colorantes de alimentos, productos farmacéuticos y aditivos alimentarios, en la industria cosmética y fluorescencia sondas con aplicaciones en citometría de flujo, inmunoensayos fluorescentes y microscopía de fluorescencia5.

Este protocolo se centra en la determinación cuantitativa de ficobiliproteínas en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Cianobacterias están el primeros autótrofos fotosíntesis oxygenic; ha formando la Biosfera de la tierra por más de 2,4 billones de años6. Desempeñan un papel crucial en los ciclos biogeoquímicos globales de nitrógeno, carbono, oxígeno y otros elementos. Entre cianobacterias, una cepa unicelular Synechocystis ganó una posición única ya que fue el primer cianobacteria con la totalidad del genoma secuenciado7,8, es naturalmente transformable por ADN exógeno9, y realiza un crecimiento estable y relativamente rápido de10,11. En Synechocystis, el componente base de antena, allophycocyanin, se asocia con las proteínas integrales de membrana y la ficocianina adjunto se encuentra en la periferia de la membrana del thylakoid.

Varios métodos para la extracción de ficobiliproteína y cuantificación se comparan dentro de este protocolo. El procedimiento de extracción final fue aplicado con éxito para Synechocystis, así como a otras cepas de cianobacterias, incluyendo Cyanothece SP., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP.y Nostoc SP. y se aplicó con éxito a algas rojas Porphyridium cruentum. Por lo tanto, el método desarrollado en este protocolo puede considerarse como un método universal para la extracción de ficobiliproteína. A pesar de que algunos de los métodos de extracción probadas resultaron en mayores rendimientos de proteína total, aquí describe procedimiento de extracción siempre ficobiliproteína más rendimientos con el menor contenido de clorofila un residuo en el Extracto de ficobiliproteína. Reducir el contenido de clorofila a fue esencial para la correcta ficocianina y cuantificación espectrofotométrica allophycocyanin.

Los espectros de absorción de ficobiliproteína pueden variar significativamente entre diferentes algas y cianobacterias especies12,13,14,15,16,17 e incluso entre varias cepas de un género de cianobacterias solo18. Por lo tanto, las longitudes de onda específicas y coeficientes de absorción según lo utilizado para la determinación de ficocianina y allophycocyanin en Synechocystis no son generalmente aplicables a otras cepas. Además, Synechocystis no contienen ficoeritrina y phycoerythrocyanin que se puede encontrar en algunas algas y cianobacterias. A los efectos de la determinación de ficobiliproteínas en cepas que no sean de Synechocystis, se recomienda evaluar las ecuaciones espectrofotométricas para cada cepa individual.

Aunque el protocolo contiene dos pasos más (durante la noche la liofilización de los pellets celulares y extracción de proteínas de 1 hora), el tiempo de trabajo total para la cuantificación de ficobiliproteínas es no más de 2 horas.

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Protocol

1. cianobacterias cultivo

  1. Cultivar células de Synechocystis en matraces Erlenmeyer o en fotobiorreactores10,19 en tampón BG11 medio20 a mantener un pH < 10 (p. ej., con 17 mM HEPES10).
    Nota: Las condiciones de cultivo estándar requieren una temperatura controlada (normalmente, 30 ° C, la temperatura óptima es de 35 ° C)21, iluminación (por lo general, una luz blanca de intensidad hasta 800 μmol [fotones] / [m2·s])21y un CO fuente 2 (en el fotobiorreactor de planas de 400 mL, el crecimiento de saturar la concentración de CO2 es 1.700 ppm)21.
  2. Para determinar la densidad de cultivo, medir la densidad óptica de la cultura mediante espectrofotometría a 730 nm (OD730) utilizando una cubeta con una trayectoria de la luz de 1 cm. por otra parte, contar las células bajo el microscopio utilizando un hemocitómetro o una célula automatizada contador.

2. preparación de muestras

  1. Trabajo con baja radiación para evitar la degradación de ficobiliproteína.
  2. 3 x 1 mL de suspensión de cultivo en tubos safe-lock de la cosecha. Uso se triplica para la estimación de errores técnicos en la medición. Para realizar el muestreo del cultivo bajo condiciones estériles, cosechar las células en una campana laminar y siga las prácticas de trabajo y seguridad adecuadas.
  3. Centrifugar las células a 15.000 x g a temperatura de laboratorio durante 5 min ponga atención en el rotor de la centrífuga correctamente equilibrada. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante. Asegúrese de no perturbar el sedimento.
  4. Poner las muestras en un congelador. Para almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras a-80 ° C. Esto es necesario para evitar la degradación de ficobiliproteína. Para el almacenamiento a corto plazo,-20 ° C es suficiente.
  5. Las muestras por congelación durante la noche. Para un adecuado proceso de liofilización, mantener la temperatura del condensador secador de congelación por debajo de-60 ° C y la presión en la cámara de congelar-secador alrededor de 1 hPa.
  6. Después de terminar el ciclo de liofilización, cierre el tubo tan pronto como sea posible para evitar la reabsorción de agua desde el aire.

3. célula de homogeneización y extracción de pigmentos

  1. Añadir cuatro pedazos de granos de cristal (con un diámetro de 2 mm) a cada tubo de muestra y cerrar los tubos.
    Nota: Cuando la tapa del tubo de safe-lock usado para la homogeneización es demasiado fina, puede romper durante la homogeneización; por lo tanto, sólo el safe-lock tubos con tapas fuertes se recomiendan para este protocolo.
  2. Homogeneizar las muestras con los granos de cristal de 15 s en un homogeneizador a temperatura de laboratorio.
    Nota: Una muestra bien homogeneizada se extiende sobre la superficie interna entera de los tubos safe-lock.
  3. Añadir 1 mL de tampón PBS (pH 7.4), preenfriado a 4 ° C, para las muestras con el fin de extraer ficobiliproteínas.
    Nota: De este paso, mantener las muestras en hielo para evitar la degradación de las proteínas extraídas. Esto es fundamental.
  4. Mezclar las muestras con PBS durante 5 s en el homogenizador a temperatura de laboratorio.
    Nota: Después de mezclar, las muestras son de color verdosas.
  5. Después de mezclar, mantener las muestras en hielo durante 60 minutos tapa el baño de hielo con una tapa para evitar la degradación de pigmentos.
  6. Después de 60 min de ficobiliproteína extracción, centrifugar las muestras a 15.000 x g a 4 ° C por 5 min atención para equilibrar adecuadamente el rotor de la centrífuga.
    Nota: Después de la centrifugación, el sobrenadante tiene un color azul cian.

4. ficobiliproteína cuantificación

  1. Antes de la medición espectrofotométrica, calibrar el espectrofotómetro a la línea de base utilizando el tampón de PBS como un blanco.
  2. Una vez calibrado el espectrofotómetro es descartar el PBS de una cubeta de espectrofotómetro y pipetear el sobrenadante con ficobiliproteínas extraído en vez de con el tampón de desecho.
  3. Cuantificar la concentración de ficobiliproteína mediante espectrofotometría, utilizando un ancho de corte de 0.5 nm.
    1. Medir la absorbencia de la phycocyanobilins en ficocianina y allophycocyanin contra el tampón de PBS en blanco a 615 nm (un615) y 652 nm (A652), respectivamente, y medir la absorbencia de la ruina celular a 720 nm (un720).
    2. Calcular la concentración de ficocianina y allophycocyanin según las ecuaciones (1) y (2) de Bennett y Bogorad12:
      Equation 1
      Equation 2
      Nota: A615, A652y un720 deben ajustarse a la gama de absorbancia lineal del espectrofotómetro. Si es necesario, diluir la muestra con tampón PBS.
  4. Calcular la concentración de pigmento en las muestras originales. La concentración de pigmento en la muestra se corresponde directamente con los resultados de las ecuaciones (1) y (2) cuando 1 mL de cultivo y 1 mL de la solución de extracción se utilizan para el análisis. En caso de utilizar diferentes volúmenes de las muestras de cianobacterias o tampón PBS, la concentración de pigmento final debe calcularse según la ecuación (3):
    Equation 3(3)
    Nota: En caso de un contenido de ficobiliproteína normalización por peso seco de la célula, la concentración de pigmento final se calculará según la ecuación (4)Equation 4 (4)

5. determinación del peso seco celular (opcional)

  1. Pesan tres tubos safe-lock vacíos en balanzas analíticas.
    PRECAUCIÓN: Es fundamental que los tubos safe-lock están secos. En el caso de almacenar los tubos en un ambiente húmedo, secar los tubos durante varias horas en congelar secador antes de pesarles. Manipular los tubos suavemente y sólo con las manos enguantadas para evitar cualquier contacto entre el material y los dedos del investigador libre de polvo. Mantenga todos los titulares y limpia para evitar a la transferencia de cualquier material de los tubos de centrífuga.
  2. 1 x 15 mL de suspensión de cultivo en tubo cónico de 15 mL de la muestra.
  3. Centrifugue la suspensión de la cultura en los tubos cónicos de 15 mL a 4.000 x g a temperatura de laboratorio durante 10 min equilibrio del rotor de la centrífuga con tres adicionales 15 mL tubos cónicos, cada uno conteniendo 15 mL de agua. Después de la centrifugación, descartar 12 mL del sobrenadante.
  4. Resuspender el precipitado en el sobrenadante restante y la transferencia de 3 x 1 mL de la mezcla de tres tubos safe-lock de 1,5 mL con una pipeta. En el caso de algunas sobras de la pelotilla permanecen en el tubo cónico de 15 mL, agregar 1,5 mL de agua desionizada al tubo cónico, vortex o agitar el tubo para suspender de nuevo los restantes de la pelotilla y transferencia de 3 x 0,5 mL de la mezcla de los tres tubos de safe-lock de 1,5 mL (ya containi 3 x 1 mL de la pelotilla del ng) con una pipeta.
    Nota: Dividir la pastilla en tres tubos safe-lock de 1,5 mL permitirá la estimación de cualquier error técnico de medición de peso seco.
  5. Centrifugar las células en tubos safe-lock de 1,5 mL a 15.000 x g a temperatura de laboratorio durante 5 min equilibrio del rotor de la centrífuga con un tubo adicional de safe-lock de 1,5 mL que contiene 1 mL de agua. Después de la centrifugación, descartar el sobrenadante.
  6. Poner las muestras en el congelador. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener las muestras a-80 ° C; para el almacenamiento a corto plazo,-20 ° C es suficiente.
  7. Las muestras por congelación durante la noche. Para un adecuado proceso de liofilización, mantener la temperatura del condensador secador de congelación por debajo de-90 ° C y la presión en la cámara de congelar-secador alrededor de 1 hPa.
  8. Después de la liofilización, cierre los tubos y pese las muestras en balanzas analíticas.
    Nota: El valor del peso seco puede utilizarse para la normalización de los contenidos de ficobiliproteína por peso seco de la célula.

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Representative Results

Para las pruebas del método inicial, Synechocystis fue cultivado como culturas lote en matraces Erlenmeyer en una coctelera en BG11 cultivo medio20 (complementado con 17 mM HEPES) a 25 ° C, bajo una luz blanca cálida de una intensidad de 50 μmol (fotones) / (m 2·s) y con 1% de CO2 en la atmósfera de cultivo. Durante el cultivo, los cultivos fueron muestreados a los tubos safe-lock y centrifugaron (15.000 x g a temperatura de laboratorio durante 5 min), el sobrenadante fue desechado y las muestras fueron ya sea almacenadas a-80 ° C y liofilizadas como preparación para la cada paso de este protocolo o almacenado a-20 ° C o -80 ° C para el análisis comparativo de la extracción y cuantificaciones.

Los procedimientos de prueba de extracción incluyen la interrupción de la célula por sonicación, homogeneización con los granos de zirconio en el tampón PBS y hielo-deshielo. Los resultados de diferentes métodos de extracción se resumen en la figura 1. El método como se describe en este protocolo proporciona que las ficobiliproteínas mayor rendimientos junto con la menor clorofila una contaminación en el tampón de extracción. Clorofila a fue detectada en el tampón de extracción cuando sonicación fue utilizada para la interrupción de la célula. Repetición de ciclos de congelación y descongelación de las muestras en un baño de ultrasonido en el hielo resultó en mayores rendimientos de proteína en el tampón de extracción. Sin embargo, al mismo tiempo, aumentó la concentración de clorofila a en el buffer de extracción ( recuadrode lafigura 1 ), que excluyó una cuantificación del contenido de ficobiliproteína adecuada.

El tiempo de homogeneización óptima era 15 s. homogeneización tanto más corto (5 s) y largo (20 s) períodos proporcionan rendimientos de ficobiliproteína ligeramente inferiores, como se muestra en la figura 2. Homogeneizar las células con perlas de vidrio de 2 mm de diámetro produjo los rendimientos más altos en comparación con perlas de vidrio de un diámetro de 0,5 mm, 1 mm o 4 mm, con granos de zirconia de un diámetro de 0.5 mm o con granos de arena de mar. El tampón de extracción de PBS fue probado como el buffer óptimo para la extracción de ficobiliproteínas (figura 3). La adición de NaCl 100 mM o 150 mM KCl el tampón PBS o agua no aumentó la eficiencia de la extracción de ficobiliproteína, y lo mismo fue para el uso del tampón de acetato sódico 20 mM para la extracción (figura 3). El tiempo de extracción óptima ficobiliproteína fue 60 minutos porque, después de más tiempo (hasta 240 minutos), la concentración de ficobiliproteína en el tampón de extracción no cambiaron significativamente (figura 4).

También probamos la gama de linealidad de espectrofotómetro para la medida de ficobiliproteína (figura 5) y compararon varias ecuaciones de cuantificación de ficobiliproteína, ficocianina y allophycocyanin estándares (figura 6). El espectrofotómetro utilizado en el presente Protocolo mostraron un rango lineal de absorbancia entre 0.1 - 3.0 (figura 5). Puesto que los espectros de la proteína del extracto tuvo su máxima absorción alrededor de 620 nm (un620) a 652 nm, la absorción (un652) era solamente el 33% de un620 (figura 7), la linealidad del espectrofotómetro para un652 (máximo Allophycocyanin absorbancia) fue probada solamente hasta un652 de 1.16. Las ecuaciones (1) y (2) de Bennett y Bogorad12 proporcionó la mejor reconstrucción de ficocianina y allophycocyanin normas entre todas las ecuaciones probadas (figura 6). Sulfato de estreptomicina, usado en varios estudios previos para la eliminación de la membrana de los fragmentos que contienen clorofila a, se demostró que no es necesario para la extracción (figura 7).

Para el experimento representativo, Synechocystis fue cultivado en un fotobiorreactor25 en un régimen de turbidostat, donde las células se mantuvieron en la fase de crecimiento exponencial dentro de un rango definido de la densidad óptica (medido a 680 nm, OD 680) por una dilución controlada por un cultivo fresco mediano (medio BG11 tamponado con HEPES de 17 mM)11,26. Las culturas fueron cultivadas a 32 ° C y el aire de entrada contiene 0,5% de CO2. Las culturas fueron iluminadas con una luz roja (λmáx.: 633 nm, λ1/2: 20 nm) de una intensidad de 25-1100 μmol (fotones) / (m2·s), junto con una luz azul (λmáx.: 445 nm, λ1/2: 20 nm) de una intensidad de 25 μmol ( fotones) / (m2·s). Se midió la densidad óptica de la suspensión de la cultura por la base del fotobiorreactor, y la gama de OD680 fue fijado a 0,52 - 0.58 (2 x 107 a 4 x 107 células/mL). Las culturas se cultivaron en cada intensidad de luz específico durante al menos 24 horas proporcionar suficiente tiempo de aclimatación. Después de alcanzar estabilidad de crecimiento, las culturas fueron muestreadas para el peso seco (según los pasos 2.1-2.8 del presente Protocolo), recuento de células y contenido de ficocianina y allophycocyanin. Los resultados de la evaluación de ficobiliproteína bajo intensidades de luz de aumento se muestran en la figura 8. Synechocystis disminuyó el contenido de ficobiliproteína del 12% del peso seco celular (505 fg/célula) bajo la irradiación menor al 3% del peso seco celular (280 fg/celular) debajo de la irradiancia máxima.

Figure 1
Figura 1 : Comparación de la eficiencia de la extracción del método descrito en el presente Protocolo con varios métodos de referencia. La concentración de ficocianina (barras negras) y allophycocyanin (barras blancas) en el extracto de proteína cruda se midió después de extracción en el tampón de PBS durante 60 minutos método se describe en este protocolo. Método B fue modificado como sigue: después de la cosecha, las células fueron centrifugadas (15.000 x g a temperatura de laboratorio durante 5 min) y almacenado a-20 ° C durante la noche. Las muestras congeladas fueron sonicadas para 120 s a 4 ° C y las ficobiliproteínas se extrajeron en tampón PBS para 60 minutos método C fue modificado del método B mediante el almacenamiento de los pellets de células cosechadas a-80 ° C durante 30 minutos, los pellets celulares la liofilización y añadir tampón PBS a las pelotillas secas. D método fue modificado de Chung et al. 16: después de la liofilización (igual que en método C), 0,25 mL de acetato de Na con 1% estreptomicina sulfato de tampón (pH 5.5) fue agregado al seco pellet celular, junto con 0.25 mL de granos de zirconio (con un diámetro de 0,5 mm), y las muestras se homogeneizaron dos veces por 60 s en el homogenizador. Después de la homogeneización, otro 0,5 mL de acetato de Na con 1% estreptomicina sulfato de tampón (pH 5.5) se añaden a la muestra, los tubos fueron agitadas y las proteínas se extrajeron en hielo por 30 minutos método E consistió en un solo ciclo de hielo-deshielo en tampón PBS y extracción de proteínas durante 24 h a 4 ° C. Método F (figura del recuadro) consistió en una y seis ciclos de congelamiento de las células (inicialmente, liofilizado y resuspendió en buffer PBS) en nitrógeno líquido, seguido de sonicación en hielo. Debido a la clorofila significativa presencia en el extracto de proteína cruda, no cuantificaron las ficobiliproteínas dentro método f el. Los valores representados representan promedios de tres repeticiones de la técnicas, con las barras de error que representa desviaciones estándar. Concentraciones de pigmento se calculan según las ecuaciones (1) y (2) del presente Protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Efecto del tiempo de homogeneización en la eficiencia de extracción de ficobiliproteína. Los pellets liofilizados de Synechocystis células (según los pasos 3.1 a 3.5 del presente Protocolo) fueron interrumpidos con perlas de vidrio en homogeneizador de 5 s, 15 s y 20 s. Los valores representados representan promedios de tres repeticiones de la técnicas, con las barras de error que representa desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Eficiencia de la extracción de ficobiliproteína en tampones de extracción diferentes. Las ficobiliproteínas se extrajeron en el tampón de PBS, en el tampón de PBS con la adición de NaCl 100 mM o 150 mM KCl, en agua desionizada con NaCl 100 mM o 150 mM KCl, según Hemlata y Fareha22y en acetato de sodio 20 mM según Chung et al < / C4 >. 16. la extracción se realizó a 4 ° C según los pasos 4.1-4.3 del presente Protocolo. Los valores representados representan promedios de tres repeticiones de la técnicas, con las barras de error que representa desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Estabilidad de ficobiliproteína en el tampón de extracción en el tiempo. Después del procedimiento de extracción, realizado como se describe en los pasos 4.1-4.3 del presente Protocolo, el extracto de ficobiliproteína en tampón PBS (pH 7.4) se almacenó a 4 ° C durante 4 horas, sin significativa ficocianina (círculos) y degradación allophycocyanin (cuadrados). La línea discontinua representa el ajuste lineal de los puntos de tiempo calculado por el método de mínimos cuadrados. Los valores representados representan promedios de tres repeticiones de la técnicas, con las barras de error que representa desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Mediciones representativas de ficocianina y allophycocyanin concentraciones en Synechocystis. Una suspensión densa de la cultura (ficocianina: 456 μg/mL, allophycocyanin: 106 μg/mL) se diluyó poco a poco hasta una concentración de 19 μg/mL para la ficocianina y allophycocyanin. Los valores representados representan promedios de tres repeticiones de la técnicas, con las barras de error que representa desviaciones estándar. La línea punteada representa el ajuste lineal de los puntos de concentración calculado por el método de mínimos cuadrados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Estimación de la concentración de ficocianina y allophycocyanin en normas pigmentos. El contenido de ficocianina y allophycocyanin en estándares de pigmento se midió espectrofotométricamente según las ecuaciones de Bennett de Bogorad12, Lüder et al. 13, Sampath-Wiley y Neefus15, Evans14y Chung et al. 16. contenido de proteína en las normas (según sea necesario para la determinación de ficobiliproteínas) se cuantificó usando una solución de ácido bicinchoninic, carbonato de sodio, tartrato de sodio y bicarbonato de sodio en 0,1 N NaOH (con un pH final de 11,25), en reacción con 4% (w/v) de cobre (II) sulfato pentahidrato27, utilizando albúmina sérica bovina como estándar de proteínas. Las ecuaciones de Bennett y Bogorad proporcionan la reconstrucción más alto de ambos pigmentos: 96% de ficocianina estándar y el 99% de allophycocyanin estándar. Los valores representados representan promedios de tres repeticiones de la técnicas, con las barras de error que representa desviaciones estándar. La línea discontinua destaca el punto de 100%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Extraer el efecto del sulfato de la estreptomicina sobre el espectro de absorción de la proteína cruda en el buffer PBS. Procedimiento (A) la extracción como se describe en los pasos 4.1-4.3 de este protocolo o (B) mediante sonicación como se describe en la leyenda de la figura 1 para el método F se realizó en tampón PBS (círculos) y el tampón de PBS suplementado con 1% sulfato de estreptomicina (cuadrados). Se realizó la cuantificación de ficobiliproteína según pasos 5.1-5.4 del presente Protocolo. Los valores representados representan promedios de tres repeticiones de la técnicas, con las barras de error que representa desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8 : Concentración de ficocianina (círculos) y allophycocyanin (cuadrados) en Synechocystis cultivadas bajo luz de color naranja rojizo de una intensidad de 25-1100 µmol(photons)/(m2·s). Culturas de Synechocystis se cultivaron en un fotobiorreactor a 32 ° C, con 0,5% de CO2 en el aire de entrada, en medio de cultivo BG11 con 17 mM HEPES en un régimen de turbidostat según Zavrel et al. 11. se midieron las concentraciones de ficobiliproteína según este protocolo y el contenido de ficobiliproteína final fue normalizado por peso seco celular, como se describe en la sección 2 del presente Protocolo. Las líneas discontinuas representan el ajuste de la potencia de los puntos medidos, calculados por el método de mínimos cuadrados. Los valores representados representan promedios de tres repeticiones de la técnicas, con las barras de error que representa desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un método sencillo, rápido y reproducible para la cuantificación del contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystisdel modelo. Se comparan varios métodos de homogeneización de la célula, extracción de proteínas y cuantificación de ficocianina y allophycocyanin y el protocolo final representa una combinación de lo óptimo de cada procedimiento individual. Como datos representativos, se cuantificó el contenido de ficobiliproteínas en Synechocystis células cada vez más intensidad de la luz. A pesar de que el análisis requiere de tiempo similar y equipo de laboratorio como algunos de los métodos previamente publicados12,13,14,15,16, la ventaja de este protocolo es que no hay clorofila a se libera en el tampón de extracción y, por tanto, la medición de ficobiliproteína puede estimarse con la alta precisión.

La cantidad de la suspensión celular necesaria para el análisis de ficobiliproteína puede variar con la densidad de la cultura. El volumen de muestra de 1 mL está optimizado para las culturas con un OD730 de 1.5, una densidad celular de aproximadamente 2 x 107 células/mL, o de culturas con un contenido de ficobiliproteína de aproximadamente 20 mg/L. En el caso de culturas diluidas, cosecha un volumen más grande de la cultura. Por otra parte, en el caso de cultivos densos, cosecha una baja cultura volumen-de alta densidad las culturas, hay un riesgo de ficobiliproteínas permanecen parcialmente en las células después de la extracción. Del mismo modo, la cantidad de la suspensión celular necesaria para la determinación de peso seco puede variar con la densidad de la cultura. El volumen de muestreo de 15 mL está optimizado para las culturas con un OD730 de 1,5 o con una densidad celular de aproximadamente 2 x 107 células/mL. Con cultivos de densidad inferiores o con volúmenes más bajos, puede aumentar el error de medición. Por el contrario, volúmenes más grandes de la cultura o las culturas densas ofrecen mejores resoluciones de método.

Pasos críticos del protocolo son la extracción de homogeneización y ficobiliproteína de células que debe ofrecer altos rendimientos y alta especificidad. Los más altos rendimientos y pureza de los extractos con la preservación de la proteína máxima simultánea se logró mediante la liofilización de las muestras, homogeneizando los pellets celulares seco por cuentas de vidrio y realizar la extracción de ficobiliproteína en tampón PBS ( Figura 1). Puesto que incluso una pequeña contaminación del extracto de proteína cruda por clorofila a puede conducir a una sobreestimación del contenido de ficobiliproteína, es necesario evitar cualquier una extracción clorofila al añadir el tampón de PBS. Clorofila a fue detectada en el extracto crudo cuando sonicación fue utilizado para la interrupción de la célula. Como se muestra en el recuadro de la figura 1, con la repetición de ciclos de sonicación, la cantidad de clorofila a en el extracto aumentó. Por otro lado, la cantidad de extrae proteínas (según lo detectado por la absorbancia a 280 nm) también aumentó después de repetidos ciclos de sonicación. Por lo tanto, el uso de sonicación (en combinación con los ciclos de hielo-deshielo en nitrógeno líquido) aparece como un método adecuado para la extracción de proteínas totales (libres y unida a la membrana las proteínas se liberan de las células); sin embargo, no se recomienda para la cuantificación espectrofotométrica ficobiliproteína. Chung et al. recomienda el uso de sulfato de estreptomicina de 1% para eliminar fragmentos de membrana con clorofila16. Aquí, el uso de sulfato de estreptomicina no parece ser necesario ya que no condujo a una reducción de la clorofila a en el extracto de proteína (figura 7). Aunque una sonicación único ciclo para 120 s no perturben las células eficientemente (los métodos B y C, figura 1), otros métodos (p. ej., método F que se presenta en la figura 1 o los métodos presentados en la figura 7B) confirmaron resultados anteriores de sonicación siendo una celda eficiente método interrupción22,28. Por otra parte, simples ciclos de hielo-deshielo, divulgados también previamente como un método eficiente para la extracción de ficobiliproteínas de22,28, siempre los más bajos rendimientos en las pruebas descritas aquí (método E, figura 1 ). Homogeneización de la célula (en el tampón de extracción, 2 x 60 s) de circonio granos fue probado como menos eficiente que la homogeneización del 15-s de la pelotilla celular liofilizada (método D, figura 1). El procedimiento de homogeneización en el tampón de extracción fue descrito previamente con una homogeneización más largo tiempo (10 min)29. No probamos la homogeneización durante más de 2 minutos desde las muestras calentado significativamente durante cada ciclo de homogeneización. En la literatura, otros métodos de interrupción de la célula también fueron descritos, incluyendo la utilización de una prensa francesa16 o griding13,15,30; sin embargo, tales métodos no fueron probados en este estudio.

La extracción de proteínas se realizó por 15 s (figura 2) en tampón PBS. Tampón pH es 7.4, que fue divulgado previamente como óptimos para la extracción de ficobiliproteína22. La adición de NaCl o KCl no mejoró la eficiencia de extracción de ficobiliproteína (figura 3), que es la contradicción anterior observaciones22. Sin embargo, como se indica en la figura 3, la solución salina con tampón fosfato según lo utilizado en este protocolo contiene 154 mM NaCl (además de 5,6 mM de Na2HPO4 y 1 mM KH2PO4), que no permiten establecer la Libre de NaCl extracción Tampón PBS como un control. También comparamos tampón PBS y eficiencias de extracción de sodio acetato buffer16 . La combinación de fosfato de sodio y fosfato de potasio en el tampón de PBS ofrece ficobiliproteínas más altos rendimientos (figura 3). Este hallazgo correspondió con los resultados anteriores de Hemlata et al. 22.

El tiempo de extracción de ficobiliproteína fue optimizado para 1 h. más extracción no produjo ficobiliproteína significativa degradación o extracción mejora (figura 4), que correspondió con el trabajo anterior de Lawrenz et al. 28. un tiempo de extracción más corto que 1 h no fue probado. Del mismo modo, extracción durante más de 4 horas no fue probada ya que se comprobó previamente que las ficobiliproteínas extraídos en el tampón de fosfato son estables durante al menos 48 h28.

Se compararon varias ecuaciones de cuantificación espectrofotométrica de ficocianina y allophycocyanin como se describe anteriormente en la literatura, por actualizar el contenido de ambos ficobiliproteínas en las normas comerciales con proteínas conocidas concentraciones (figura 6). La mejor reconstrucción de ambos pigmentos fue alcanzada con las ecuaciones de Bennett y Bogorad12. Este resultado no fue específico para el fosfato tampón de extracción desde dicho buffer ha sido utilizado previamente12,13,15. No era específico a las normas de pigmento desde la diferencia entre un615A618y un620 (longitudes de onda utilizados para la estimación de la ficocianina en trabajos anteriores) en la ficocianina estándar fue 1% y la diferencia entre un 650 y un652 (longitudes de onda usados previamente para allophycocyanin estimación12,13,14,16) en el allophycocyanin estándar fue del 3%. De manera similar, la diferencia entre un615 y A620 en el extracto de proteína de Synechocystis fue sólo el 2%. Esas pequeñas diferencias en los espectros de absorción pueden resultar en una variación del pigmento final de hasta un 36% (figura 6). Por lo tanto, las diferencias entre las ecuaciones individuales fueron conectadas más bien a las variaciones de ficobiliproteína coeficientes de extinción de los organismos específicos12,13,14, 15 , 16 , 17. Curiosamente, las ecuaciones de Chung et al. proporciona la reconstrucción más bajo de la ficocianina (figura 6) aunque los autores también utilizaron Synechocystis para sus experimentos16.

En vez de la determinación de longitudes de onda individuales, se recomienda para medir un espectro continuo del extracto ficobiliproteína entre 280-720 nm, para estimar la presencia de clorofila a en el extracto, que podría interferir tanto con la Allophycocyanin y la absorción de ficocianina. Además, midiendo la absorbancia a 280 nm (un280), una pureza de ficocianina (un615/A280 o un /A de620280)21,22 y allophycocyanin (un652/A280) 24 en el extracto se puede estimar (0.7: alimenticia, 3.9: grado reactivo, > 4.0: grado analítico)21.

Como datos representativos, se determinó la concentración de ficocianina y allophycocyanin en Synechocystis bajo aumento de intensidad de la luz. Mantener la densidad de la cultura a un nivel constante dentro de un turbidostat cultivo régimen11,21 era esencial para el experimento comparativo directo. Las ficocianina y allophycocyanin concentraciones de 2.4% a 10.2% y 0.6% - 1,7% del peso seco celular, respectivamente, fueron similar los valores previamente divulgados11,31,32. También, la base de celular por contenido ficobiliproteína era similar según lo divulgado previamente11,33. Con la luz cada vez más, el contenido de ficobiliproteínas disminuyó. Curiosamente, incluso bajo la más alta luminosidad de 1100 μmol (fotones) / (m2·s), las ficobiliproteínas no eran totalmente blanqueada.

Puesto que el protocolo requiere de equipo estándar y es relativamente rápido, puede ser adoptada fácilmente en cualquier laboratorio en que se analizan rutinariamente las ficobiliproteínas.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El protocolo fue adoptado de una anterior publicación11. T. Z., CH. D. y J. Č. fueron apoyados por el Ministerio de educación, juventud y deportes de la República Checa en el programa nacional de sustentabilidad (NPU I), concesión número LO1415. J. Č. también fue apoyada por el GA CR, número 18-24397S. Acceso a los instrumentos y otras instalaciones fue apoyado por la infraestructura de investigación Checa para Biología de sistemas C4SYS (no proyecto LM2015055). M. A. S. fue apoyado por una beca de la Fundación de la ciencia rusa [no. 14-14-00904].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synechocystis sp. PCC 6803 Institut Pasteur, Paris, France 6803 Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 9143.1 Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes  Eppendorf, Hamburk, Germany 30120086 Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA 30128-282 Holder for safe-lock tubes 
RAININ 100 µl -1000 µl  Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 17014382 Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 30389272 Pipette tips
Rotina 420R Hettich, Kirchlengern, Germany 4701 Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010 Liebherr, Bulle, Switzerland 9005382197172 Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA EXF24086V  Freezer -80 °C
CoolSafe LaboGene, Lillerød, Denmark 7.001.000.615 Freeze dryer 
UV-2600 Shimadzu, Kyoto, Japan UV-2600 Spectrophotometer 
Hellma absorption cuvettes, semi Micro Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z600288  VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm 
Silamat S6 Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein 602286WU Homogenizer 
Solid-glass beads Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z273627 Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE Sartorius AG, Göttingen, Germany SECURA225D-1OBR Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P2172 Phycocyanin standard
Allophycocyanin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA A7472 Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA BCA1, B9643 Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron  Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic AG 130-ECO  Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic FMT-150 Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer  Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA Auto M10 Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS430791  15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 51024579 Laminar flow hood

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