Author Produced

Spectrofotometrische bepaling van Phycobiliprotein in Cyanobacterium Synechocystis

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier presenteren we een protocol om te phycobiliprotein inhoud in de cyanobacterium Synechocystis een spectrofotometrische methode kwantitatief te bepalen. De extractiemethode werd ook met succes toegepast op andere cyanobacteriën en algen stammen; wegens verschillen in pigment absorptiespectra is het echter noodzakelijk is om de spectrofotometrische vergelijkingen voor elke soort afzonderlijk onderzoek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zavřel, T., Chmelík, D., Sinetova, M. A., Červený, J. Spectrophotometric Determination of Phycobiliprotein Content in Cyanobacterium Synechocystis. J. Vis. Exp. (139), e58076, doi:10.3791/58076 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dit is een simpel protocol voor de kwantitatieve bepaling van phycobiliprotein in het model cyanobacterium Synechocystis. Phycobiliproteïnen zijn de belangrijkste onderdelen van de phycobilisomes, het grote licht-oogst antennes in cyanobacteriën en verschillende taxa van de algen. De phycobilisomes van de Synechocystis bevatten twee phycobiliproteïnen: phycocyanin en allophycocyanin. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, efficiënte en betrouwbare methode voor de kwantitatieve bepaling van zowel phycocyanin en allophycocyanin in dit model cyanobacterium. We vergeleken de verschillende methoden van phycobiliprotein extractie en spectrofotometrische kwantificering. De extractie procedure zoals beschreven in dit protocol was ook met succes toegepast voor andere cyanobacteriën stammen zoals Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira sp., en Nostoc sp., alsmede over de rode algen Porphyridium cruentum. Echter de coëfficiënten uitsterven van specifieke phycobiliproteïnen van verschillende taxa kunnen verschillen en het is daarom aangeraden voor het valideren van de methode spectrofotometrische kwantificering voor elke één stam individueel. Het protocol vereist weinig tijd en kan worden uitgevoerd in een laboratorium van de wetenschap van het leven van de standaard aangezien het vereist alleen standaard uitrusting.

Introduction

fPhycobiliproteins zijn wateroplosbaar pigment-eiwitcomplexen die belangrijke componenten van de antennes licht-oogst in prokaryotische cyanobacteriën (Cyanophyceen) en diverse eukaryotic taxa (Glaucophyta, Rhodophyta vertegenwoordigen , en Cryptophyta)1. Ze ontstaan voornamelijk supramoleculaire complexen genaamd phycobilisomes en ze zijn meestal gekoppeld aan het oppervlak van de fotosynthetische membranen op de stromale kant, met uitzondering van Cryptophyta, waar de phycobiliproteïnen zijn gelokaliseerd in de thylakoïde lumen2. Vier soorten phycobiliproteïnen up-to-date zijn geïdentificeerd: de kern-allophycocyanin, en de perifere phycocyanin, phycoerythrin en phycoerythrocyanin1. Als de belangrijkste licht-oogst complexen vormen phycobilisomes een van de cruciale factoren van algen en cyanobacteriën massa culturen productiviteit. Het is aangetoond dat phycobilisomes afkappen biomassa accumulatie onder sterke licht3kunt verbeteren. Aan de andere kant onder bescheiden of lage bestralingssterkte resulteerde de antenne truncatie in groeicijfers en biomassa accumulatie vermindering3,4. Phycobiliproteïnen worden commercieel gebruikt als voedsel kleurstoffen, geneesmiddelen en additieven in de cosmetische industrie, en als fluorescentie sondes met toepassingen in stroom cytometry, fluorescerende immunoassay en fluorescentie microscopie5.

Dit protocol is gericht op de kwantitatieve bepaling van phycobiliproteïnen in het model cyanobacterium Synechocystis. Blauwalgen zijn de vroegste Oxygene fotosynthetische autotrophs; ze hebben de vorming van de aardse biosfeer voor meer dan 2,4 miljard jaar6. Ze spelen een cruciale rol in wereldwijde biogeochemische cycli van koolstof, stikstof, zuurstof en andere elementen. Onder cyanobacteriën, een eencellige stam Synechocystis een unieke positie verworven omdat het was de eerste cyanobacterium met het hele genoom sequenced7,8, het is natuurlijk gassamenstelling door exogene DNA9, en voert het stabiele en relatief snelle groei10,11. In Synechocystis, het kernonderdeel van antenne, allophycocyanin, is gekoppeld aan de integraal membraaneiwitten en de bijgevoegde phycocyanin bevindt zich in de periferie van de membraan thylakoïde.

Verschillende methoden voor de winning van de phycobiliprotein en kwantificering worden vergeleken in dit protocol. De definitieve extractiemethode werd succesvol toegepast voor Synechocystis, alsmede voor andere cyanobacteriën stammen, met inbegrip van Cyanothece sp., Synechococcuselongatus, Spirulina sp., Arthrospira SP., en Nostoc sp., en het was ook succesvol toegepast op rode algen Porphyridium cruentum. Daarom is de methode ontwikkeld in dit protocol kan worden beschouwd als een universele methode voor de extractie van de phycobiliprotein. Hoewel sommige van de geteste extractiemethoden in hogere totale proteïne opbrengsten resulteerde, de hier beschreven extractiemethode mits de hoogste phycobiliprotein levert samen met de laagste hoeveelheid chlorofyl een residu in de phycobiliprotein extract. Vermindering van de hoeveelheid chlorofyl een was essentieel voor de juiste phycocyanin en allophycocyanin spectrofotometrische kwantificering.

De phycobiliprotein absorptiespectra kan aanzienlijk verschillen tussen verschillende algen en cyanobacteriën soorten12,13,14,15,16,17 en zelfs onder de verschillende stammen van een enkele cyanobacteriën geslacht18. Dus, de specifieke golflengten en absorptie coëfficiënten zoals gebruikt voor de bepaling van phycocyanin en allophycocyanin in Synechocystis gelden niet in het algemeen aan andere stammen. Bovendien bevat geen Synechocystis phycoerythrin en phycoerythrocyanin die worden in sommige andere algen en cyanobacteriën gevonden kan. Met het oog op de bepaling van phycobiliproteïnen in stammen dan Synechocystis, is het aanbevolen om de spectrofotometrische vergelijkingen voor elke soort afzonderlijk evalueren.

Hoewel het protocol bevat twee langere stappen ('s nachts vriesdrogen van de cellulaire pellets en 1 uur eiwit extractie), is de tijd van de totale arbeid voor de kwantificering van phycobiliproteïnen niet dan 2 uur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cyanobacteriën teelt

  1. Cultiveren van Synechocystis cellen in conische kolven of in photobioreactors10,19 in gebufferde BG11 middellange20 te handhaven een pH van < 10 (bijvoorbeeldmet behulp van 17 mM HEPES10).
    Opmerking: Standaard teelt omstandigheden vereisen een gecontroleerde temperatuur (meestal 30 ° C, de optimale temperatuur is 35 ° C)21, verlichting (meestal een witte licht met een intensiteit tot 800 µmol [fotonen] / [m2·s])21, en een CO levering van de 2 (in de flat-panel photobioreactor van 400 mL, is de groei verzadigen van CO2 -concentratie 1.700 ppm)21.
  2. Om te bepalen van de dichtheid van de cultuur, het meten van de extinctie van de cultuur spectrophotometrically op 730 nm (OD730) met behulp van een cuvet met een lichtpad van 1 cm. u kunt ook de cellen onder een microscoop met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel tellen teller.

2. monsters voorbereiding

  1. Werken onder lage bestralingssterkte om te voorkomen dat de aantasting van de phycobiliprotein.
  2. Oogst 3 x 1 mL cultuur schorsing safe-lock buizen. Gebruik triplicates voor de schatting van technische fouten in de meting. Voor het uitvoeren van de bemonstering van de cultuur onder steriele omstandigheden, oogsten van de cellen in een laminaire kap en volgen van de goede praktijken van de arbeids- en veiligheid.
  3. Centrifugeer de cellen bij 15.000 x g bij laboratorium temperatuur gedurende 5 minuten aandacht besteden aan de evenwichtige centrifugerotor. Na het centrifugeren, gooi het supernatant. Zorg dat u niet te verstoren de pellet.
  4. Zet de monsters in een vriezer. Voor langdurige opslag, houden de monsters bij-80 ° C. Dit is noodzakelijk om te voorkomen dat de aantasting van de phycobiliprotein. -20 ° C is op korte termijn opslag, voldoende.
  5. Freeze-Dry de monsters 's nachts. Voor een juiste freeze-drying proces, houden de temperatuur van de condensor freeze-dryer onder-60 ° C en de druk in de freeze-droger kamer ongeveer 1 hPa.
  6. Na het beëindigen van de freeze-drying cyclus, sluit u de buis zo spoedig mogelijk om te voorkomen dat de reabsorptie van water uit de lucht.

3. cel homogenisering en pigmenten extractie

  1. Vier stuks glaskralen (met een diameter van 2 mm) toevoegen aan elke Monster buis en sluit de buizen.
    Opmerking: Wanneer het deksel van de buis van de safe-lock gebruikt voor homogenisering te dun is, het kan breken tijdens de homogenisering; Daarom worden alleen safe-lock buizen met sterke deksels aanbevolen voor dit protocol.
  2. Meng de monsters met de glasparels voor 15 s op een homogenizer bij laboratorium temperatuur.
    Opmerking: Een goed gehomogeniseerde monster is verspreid over de gehele binnenzijde van de safe-lock buizen.
  3. Voeg 1 mL PBS buffer (pH 7.4), precooled tot 4 ° C, om de monsters te uittreksel van phycobiliproteïnen.
    Opmerking: Vanaf deze stap op, houd de monsters op het ijs om te voorkomen dat de afbraak van de uitgepakte eiwitten. Dit is van cruciaal belang.
  4. Meng de monsters met PBS gedurende 5 s op de homogenizer bij laboratorium temperatuur.
    Opmerking: Na het mengen, de monsters zijn groenachtig.
  5. Na het mengen, houd de monsters op ijs voor 60 min. Cover het ijsbad met een deksel om te voorkomen dat de aantasting van de pigmenten.
  6. Centrifugeer na 60 min van phycobiliprotein extractie, de monsters bij 15.000 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten aandacht besteden aan goed het evenwicht van de centrifugerotor.
    Opmerking: Na het centrifugeren, het supernatant heeft een cyaan-blauwe kleur.

4. Phycobiliprotein kwantificering

  1. Kalibreren voor de spectrofotometrische meting, de spectrofotometer aan de basislijn met behulp van de PBS-buffer als een leeg.
  2. Zodra de spectrofotometer is gekalibreerd, negeren de PBS van een spectrofotometer cuvette en Pipetteer het supernatant met uitgepakte phycobiliproteïnen in plaats van met de afgedankte buffer.
  3. Kwantificeren van de concentratie van phycobiliprotein spectrophotometrically, met een breedte van de gleuf van 0,5 nm.
    1. Meet de extinctie van de phycocyanobilins in phycocyanin en allophycocyanin tegen de PBS buffer leeg op 615 nm (een615) en 652 nm (een652), respectievelijk, en meet de extinctie van de cellulaire puin op 720 nm (een720).
    2. Bereken de concentratie Bennett en Bogorad12van phycocyanin en allophycocyanin volgens de vergelijkingen (1) en (2):
      Equation 1
      Equation 2
      Opmerking: Een615, een652en een720 moeten aanpassen aan het bereik van de lineaire absorptie van de spectrofotometer valt. Eventueel verdunnen het monster met PBS buffer.
  4. Berekenen van de concentratie van pigment in de originele exemplaren. De concentratie pigment in de steekproef komt overeen met de resultaten van vergelijkingen (1) en (2) wanneer cultuur 1 mL en 1 mL van de extractie-buffer worden gebruikt voor de analyse. In het geval van het gebruik van verschillende volumes van cyanobacteriën monsters en/of PBS buffer, moet de definitieve pigment-concentratie worden berekend volgens vergelijking (3):
    Equation 3(3)
    Opmerking: In geval van een normalisatie phycobiliprotein inhoud per cel drooggewicht, de definitieve pigment-concentratie moet worden berekend volgens vergelijking (4)Equation 4 (4)

5. de bepaling van de cel droge gewicht (optioneel)

  1. Weeg drie lege safe-lock buizen op analytische saldi.
    Let op: Het is essentieel dat de safe-lock buizen droog zijn. In het geval van het opslaan van drogen de buizen in een vochtige omgeving, de buizen voor enkele uren in een bevriezing van de droger alvorens met een gewicht van hen. Manipuleren van de buizen voorzichtig en alleen met poedervrije gehandschoende handen om te voorkomen dat ieder contact tussen het materiaal en het researcher's vingers. Houd alle houders en centrifugeer schoon om te voorkomen dat de overdracht van enig materiaal aan de buizen.
  2. Monster 1 x 15 mL van de cultuur schorsing aan 15 mL conische buis.
  3. Centrifugeren van de suspensie van de cultuur in de 15 mL conische buisjes bij 4000 x g bij laboratorium temperatuur voor 10 min. saldo de centrifugerotor met drie extra 15 mL conische buizen, elk met 15 mL water. Werp 12 mL van het supernatans dat na het centrifugeren.
  4. Resuspendeer de pellet in het resterende supernatant en breng 3 x 1 mL van het mengsel drie 1.5-mL safe-lock buizen met een pipet. In het geval dat wat restjes van de pellet blijven in de conische buis 15 mL, voeg 1,5 mL gedeïoniseerd water aan de conische buis, vortex of schud de buis te resuspendeer de resterende pellet en 3 x 0,5 mL van het mengsel aan de drie 1.5-mL safe-lock buizen (al containi ng 3 x 1 mL van de pellet) met een pipet.
    Nota: De pellet te verdelen over drie 1.5-mL safe-lock buizen zal toestaan de schatting van een technische fout van het droge gewicht meten.
  5. Centrifugeer de cellen in 1.5-mL safe-lock buizen bij 15.000 x g bij laboratorium temperatuur voor 5 min. saldo de centrifugerotor met een extra 1.5-mL safe-lock buis waarin 1 mL water. Na het centrifugeren, gooi het supernatant.
  6. Zet de monsters in de vriezer. Voor langdurige opslag, houden de monsters bij-80 ° C; voor de korte termijn opslag is-20 ° C voldoende.
  7. Freeze-Dry de monsters 's nachts. Voor een juiste freeze-drying proces, houden de temperatuur van de condensor bevriezen droger lager dan-90 ° C en de druk in de freeze-droger kamer ongeveer 1 hPa.
  8. Na het vriesdrogen, sluit de buizen en wegen van de monsters op analytische saldi.
    Opmerking: De waarde van het droge gewicht kan worden gebruikt voor de normalisatie van de inhoud van de phycobiliprotein per cel drooggewicht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voor de eerste methode tests, was Synechocystis als batch culturen in conische kolven op een shaker gekweekt in BG11 teelt middellange20 (aangevuld met 17 mM HEPES) bij 25 ° C, onder een warm wit licht met een intensiteit van 50 µmol (fotonen) / (m 2·s) en met 1% CO2 in de kweken atmosfeer. Tijdens de teelt, de culturen werden bemonsterd safe-lock buizen en gecentrifugeerd (15.000 x g bij laboratorium temperatuur gedurende 5 minuten), het supernatant werd verworpen en de monsters waren ofwel opgeslagen bij-80 ° C en vervolgens wordt het gevriesdroogd als voorbereiding voor de afzonderlijke stappen van dit protocol of opgeslagen bij-20 ° C of -80 ° C voor vergelijkende analyse van de extractie en kwantificeringen.

De geteste extractie procedures opgenomen verstoring van de cel met het ultrasoonapparaat, homogenisering met Zirkonia kralen binnen de PBS buffer en bevriezen-ontdooien. De resultaten van verschillende extractiemethoden worden samengevat in Figuur 1. De methode zoals beschreven in dit protocol geboden dat het hoogste phycobiliproteïnen levert samen met de laagste chlorofyl een besmetting in de winning-buffer. Chlorofyl een werd ontdekt in de winning-buffer toen ultrasoonapparaat werd gebruikt voor de verstoring van de cel. Herhalende cycli van bevriezen en ontdooien van de monsters in een ultrasoonbad op ijs resulteerde in hogere opbrengsten van de eiwitten in de winning-buffer. Echter, op hetzelfde moment, de concentratie van chlorofyl een in de buffer van de extractie verhoogd (Figuur 1 inzet), die een juiste phycobiliprotein inhoud kwantificering uitgesloten.

De optimale homogenisering keer was 15 s. homogenisering voor zowel kortere (5 s) en langere (20 s) periodes die iets lagere rendementen van de phycobiliprotein, zoals afgebeeld in Figuur 2. De cellen met glazen bolletjes met een diameter van 2 mm homogenisatie resulteerde in de hoogste opbrengsten in vergelijking met glazen bolletjes met een diameter van 0,5 mm, 1 mm of 4 mm, met Zirkonia kralen met een diameter van 0,5 mm of met zee zand korrels. De PBS extractie buffer werd getest als de optimale buffer voor phycobiliproteïnen extractie (Figuur 3). De toevoeging van 100 mM NaCl of 150 mM KCl naar de PBS-buffer of water niet phycobiliprotein extractie-efficiëntie te verhogen, en hetzelfde ging voor het gebruik van 20 mM natrium acetaat buffer voor extractie (Figuur 3). De optimale phycobiliprotein extractie tijd was 60 minuten omdat, na meer tijd (tot 240 minuten), de concentratie van de phycobiliprotein in de winning-buffer veranderde niet significant (Figuur 4).

We ook getest de spectrofotometer lineariteit bereik voor de meting van de phycobiliprotein (Figuur 5) en verschillende vergelijkingen van phycobiliprotein de kwantificering, vergeleken met behulp van zowel de allophycocyanin als de phycocyanin normen (Figuur 6). De spectrofotometer gebruikt in dit protocol toonde een lineaire extinctie bereik tussen 0,1 - 3.0 (Figuur 5). Aangezien de spectra van het eiwit monsterextract had haar maximale absorptie ongeveer 620 nm (een620), en op 652 nm, de absorptie (een652) was slechts 33% van een620 (Figuur 7), de spectrofotometer lineariteit voor een652 (maximaal allophycocyanin-extinctie) werd getest slechts tot een652 van 1.16. De vergelijkingen (1) en (2) Bennett en Bogorad12 op voorwaarde dat de beste wederopbouw van zowel allophycocyanin als phycocyanin normen onder alle geteste vergelijkingen (Figuur 6). Streptomycine sulfaat, gebruikt in verschillende voorgaande studies voor de afschaffing van de membraan bevat chlorofyl een fragmenten, bleek niet nodig is voor de extractie (Figuur 7).

Voor de representatieve experiment, Synechocystis is gecultiveerd in een photobioreactor25 in een regime van turbidostat, waar de cellen werden onderhouden in exponentiële groeifase binnen een gedefinieerd bereik van de optische dichtheid (gemeten op 680 nm, OD 680) door een gecontroleerde verdunning door een verse teelt middellange (BG11 medium gebufferd met 17 mM HEPES)11,26. De culturen werden verbouwd bij 32 ° C en de input lucht bevatte 0,5% CO2. De culturen werden verlicht met een rood licht (λmax: 633 nm, λ1/2: 20 nm) van een intensiteit van 25-1100 µmol (fotonen) / (m2·s), samen met een blauw licht (λmax: 445 nm, λ1/2: 20 nm) van een intensiteit van 25 µmol ( fotonen) / (·s m2). De extinctie van de cultuur-ophanging werd gemeten door de photobioreactor base, en het bereik van OD680 was ingesteld op 0.52 - 0,58 (2 x 10,7 tot 4 x 107 cellen/mL). De culturen werden onder elke specifieke lichtintensiteit gedurende ten minste 24 uur op genoeg tijd voor acclimatisatie geteeld. Na het bereiken van stabiliteit van de groei, werden de culturen bemonsterd voor droge gewicht (volgens stappen 2.1-2.8 van dit protocol), aantal cellen en phycocyanin en allophycocyanin inhoud. De resultaten van de evaluatie van de phycobiliprotein onder toenemende licht intensiteit worden weergegeven in Figuur 8. Synechocystis daalden de phycobiliprotein inhoud van 12% van cellulaire droge gewicht (505 fg/cel) onder de laagste bestralingssterkte tot 3% van cellulaire drooggewicht (280 fg/cel) onder de hoogste bestralingssterkte.

Figure 1
Figuur 1 : Vergelijking van de extractie-efficiëntie van de methode beschreven in dit protocol met diverse referentiemethoden. De concentratie van phycocyanin (zwarte balken) en allophycocyanin (witte balken) in het extract van de ruw eiwit werd gemeten na extractie in de buffer van de PBS voor 60 min. methode A wordt beschreven in dit protocol. Methode B is bewerkt als volgt: na de oogst, de cellen werden gecentrifugeerd (15.000 x g bij laboratorium temperatuur gedurende 5 minuten) en opgeslagen bij-20 ° C's nachts. De bevroren monsters werden sonicated voor 120 s bij 4 ° C, en de phycobiliproteïnen werden gehaald in PBS buffer voor 60 min. methode C werd vanaf methode B gewijzigd doordat de pellets van geoogste cellen bij-80 ° C gedurende 30 minuten, de cellulaire pellets vriesdrogen , en de droge korrels toevoegen PBS buffer. Methode D werd vanaf Chung et al.gewijzigd. 16: na het vriesdrogen (zelfde zoals in methode C), 0,25 mL nb-acetaat met 1% streptomycine sulfaat buffer (pH 5.5) is toegevoegd aan de droge cellulaire pellet, samen met 0,25 mL van zirkonium parels (met een diameter van 0,5 mm), en de monsters werden tweemaal gehomogeniseerd voor 60 s op de homogenizer. Na homogenisatie, een andere 0,5 mL nb-acetaat met 1% streptomycine sulfaat buffer (pH 5.5) is toegevoegd aan het monster, de buizen waren vortexed en de eiwitten op het ijs werden gehaald voor 30 min. methode E bestond uit een enkele bevriezen-ontdooien cyclus in PBS buffer en eiwit extractie gedurende 24 uur bij 4 ° C. Methode F (inzet figuur) bestond uit één tot zes cycli van bevriezing van de cellen (in eerste instantie, gevriesdroogd en geresuspendeerde in PBS buffer) in vloeibare stikstof, gevolgd door ultrasoonapparaat op ijs. Als gevolg van aanzienlijke chlorofyl een aanwezigheid in het extract van de ruw eiwit, waren de phycobiliproteïnen niet gekwantificeerd binnen methode F. De afgebeelde waarden vertegenwoordigen gemiddelden uit drie technische replicaten, met de foutbalken die vertegenwoordigen standaarddeviaties. Pigment concentraties werden berekend volgens vergelijkingen (1) en (2) van dit protocol. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Effect van de homogenisering tijd op de extractie-efficiëntie phycobiliprotein. De gelyofiliseerd pellets van Synechocystis cellen (volgens maatregelen 3.1-3.5 van dit protocol) werden verstoord met glasparels op homogenizer voor 5 s, 15 s, en 20 s. De afgebeelde waarden vertegenwoordigen gemiddelden uit drie technische replicaten, met de foutbalken die vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Phycobiliprotein extractie-efficiëntie in de diverse extractie buffers. De phycobiliproteïnen werden gehaald in de PBS-buffer in de buffer van de PBS met een toevoeging van 100 mM NaCl of 150 mM KCl, met gedeïoniseerd water met 100 mM NaCl of 150 mM KCl, volgens Hemlata en Fareha22, en in 20 mM Natriumacetaat volgens Chung et al. < / C4 >. 16. de winning werd uitgevoerd bij 4 ° C volgens stappen 4.1-4.3 van dit protocol. De afgebeelde waarden vertegenwoordigen gemiddelden uit drie technische replicaten, met de foutbalken die vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Stabiliteit van de Phycobiliprotein in de buffer van de extractie tijdig. Na de extractie procedure, uitgevoerd zoals beschreven in stappen 4.1-4.3 van dit protocol, werd het extract van de phycobiliprotein in PBS buffer (pH 7.4) opgeslagen bij 4 ° C voor maximaal 4 uur, met geen significante phycocyanin (cirkels) en aantasting van de allophycocyanin (pleinen). De onderbroken lijn geeft de lineaire pasvorm van de punten van de tijd berekend met de kleinste kwadraten methode. De afgebeelde waarden vertegenwoordigen gemiddelden uit drie technische replicaten, met de foutbalken die vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Representatieve metingen van concentraties van phycocyanin en allophycocyanin in Synechocystis. De schorsing van een dichte cultuur (phycocyanin: 456 µg/mL, allophycocyanin: 106 µg/mL) werd geleidelijk verdund tot een concentratie van 19 µg/mL voor zowel phycocyanin en allophycocyanin. De afgebeelde waarden vertegenwoordigen gemiddelden uit drie technische replicaten, met de foutbalken die vertegenwoordigen standaarddeviaties. De stippellijn geeft de lineaire pasvorm van de punten van de concentratie berekend met de kleinste kwadraten methode. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Schatting van phycocyanin en allophycocyanin concentraties in pigmenten normen. De inhoud van phycocyanin en allophycocyanin pigment normen spectrophotometrically werd gemeten volgens de vergelijkingen van Bennett en Bogorad12, Lüder et al. 13, Sampath-Wiley en Neefus15, Evans14en Chung et al. 16. eiwitgehalte in de normen (desgewenst voor phycobiliproteïnen bepaling) werd gekwantificeerd aan de hand van een oplossing van bicinchoninic zuur, natriumcarbonaat, natriumkaliumtartraat en natriumbicarbonaat in 0,1 N NaOH (met een definitieve pH van 11,25), in reactie met 4% (m/v) copper(II) sulfaat pentahydraat27, met behulp van bovien serumalbumine als een eiwit standaard. De vergelijkingen van Bennett en Bogorad verstrekt de hoogste wederopbouw van beide pigmenten: 96% van phycocyanin standaard en 99% van de allophycocyanin standaard. De afgebeelde waarden vertegenwoordigen gemiddelden uit drie technische replicaten, met de foutbalken die vertegenwoordigen standaarddeviaties. De gestreepte lijn wijst op de 100%-punt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Het effect van streptomycine sulfaat op het absorptiespectrum van de ruw eiwit uitpakken in de buffer PBS. (A) de extractie procedure zoals beschreven in stappen 4.1-4.3 van dit protocol of (B) met behulp van ultrasoonapparaat zoals beschreven in de legenda van afbeelding 1 voor methode F werd uitgevoerd in PBS buffer (cirkels) en PBS buffer aangevuld met 1% streptomycine sulfaat (pleinen). De kwantificering van phycobiliprotein werd uitgevoerd volgens stappen 5.1-5.4 van dit protocol. De afgebeelde waarden vertegenwoordigen gemiddelden uit drie technische replicaten, met de foutbalken die vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 : Concentratie van phycocyanin (cirkels) en allophycocyanin (vierkantjes) in Synechocystis onder rood-oranje licht met een intensiteit van 25-1100 µmol(photons)/(m2·s) geteeldSynechocystis culturen werden gekweekt in een photobioreactor bij 32 ° C, met 0,5% CO2 in de invoer lucht, in BG11 teelt medium aangevuld met 17 mM HEPES in een regime van turbidostat volgens Zavrel et al. 11. de phycobiliprotein-concentraties werden gemeten volgens dit protocol en de inhoud van de uiteindelijke phycobiliprotein was genormaliseerd per cellulaire drooggewicht, zoals beschreven in paragraaf 2 van dit protocol. De onderbroken lijnen geven de pasvorm van de macht van de gemeten punten, berekend met de kleinste kwadraten methode. De afgebeelde waarden vertegenwoordigen gemiddelden uit drie technische replicaten, met de foutbalken die vertegenwoordigen standaarddeviaties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een eenvoudige, snelle en reproduceerbare methode voor de kwantificering van phycobiliprotein inhoud in de model cyanobacterium Synechocystis. Verschillende methoden van cel homogenisering, eiwit extractie en phycocyanin en allophycocyanin kwantificering worden vergeleken, en het laatste protocol is een combinatie van de optimale stappen van elke één procedure. Als representatieve gegevens, was de inhoud van phycobiliproteïnen gekwantificeerd in Synechocystis cellen onder toenemende lichtintensiteit. Hoewel de analyse dezelfde tijd en laboratoriumapparatuur als sommige van de eerder gepubliceerde methoden12,13,14,15,16 vereist, is het voordeel van dit protocol dat geen chlorofyl een wordt vrijgegeven in de buffer van de extractie en daarmee de phycobiliprotein meting kan worden geschat met hoge precisie.

Het bedrag van de celsuspensie vereist voor phycobiliprotein analyse kan variëren met de dichtheid van de cultuur. Het monstervolume van 1 mL is geoptimaliseerd voor culturen met een OD730 van 1,5, een celdichtheid van ongeveer 2 x 107 cellen/mL, of voor culturen met een gehalte aan phycobiliprotein van ongeveer 20 mg/L. In het geval van verdunde culturen, oogst een groter volume van de cultuur. Aan de andere kant, in het geval van dichte culturen, oogst een lagere cultuur volume-in de high-density culturen, is er een risico dat phycobiliproteïnen gedeeltelijk in de cellen na de extractie blijven. Ook kan de hoeveelheid celsuspensie nodig voor de bepaling van het droog gewicht variëren met de dichtheid van de cultuur. Het volume van de bemonstering van 15 mL is geoptimaliseerd voor de culturen met een OD730 van 1,5 of met een celdichtheid van ongeveer 2 x 107 cellen/mL. Met lagere dichtheid culturen of met lagere volumes, kunt de meetfout verhogen. Integendeel, bieden grotere cultuur volumes of dichtere culturen betere methode resoluties.

De cel homogenisering en phycobiliprotein extractie, waarmee zowel de hoge opbrengst en de hoge specificiteit moet zijn kritische stappen van het protocol. De hoogste opbrengst en de zuiverheid van de extracten met behoud van de gelijktijdige maximale eiwit werd bereikt door de trekkers van de monsters, homogenisatie van de droge cellulaire pellets door glasparels en uitvoeren van de phycobiliprotein-extractie in PBS buffer ( Figuur 1). Aangezien zelfs een kleine verontreiniging van het extract van de ruw eiwit door chlorofyl een tot een inhoud overschatting van phycobiliprotein leiden kan, is het noodzakelijk om te voorkomen dat eventuele chlorofyl een extractie door toevoeging van de PBS-buffer. Chlorofyl een werd ontdekt in het ruwe extract toen ultrasoonapparaat werd gebruikt voor de verstoring van de cel. Zoals aangetoond in de inzet van Figuur 1, met herhalende ultrasoonapparaat cycli, de hoeveelheid chlorofyl een in het extract verhoogd. Aan de andere kant, de hoeveelheid eiwitten gehaald (zoals gedetecteerd door de absorptie bij 280 nm) eveneens verhoogd na het herhalende ultrasoonapparaat cycli. Dus, het gebruik van ultrasoonapparaat (in combinatie met cycli bevriezen-ontdooien in vloeibare stikstof) wordt weergegeven als een geschikte methode voor de extractie van de totale proteïne (zowel gratis en membraan-gebonden eiwitten worden vrijgelaten uit de cellen); het wordt echter niet aanbevolen ten behoeve van phycobiliprotein spectrofotometrische kwantificering. Chung et al. het gebruik van 1% streptomycine sulfaat aanbevolen om te elimineren membraan fragmenten met chlorofyl een16. Hier, bleek het gebruik van streptomycine sulfaat niet nodig omdat het leidde niet tot een vermindering van chlorofyl een in het eiwit extract (Figuur 7). Hoewel een enkele ultrasoonapparaat cyclus voor 120 s deed niet breek de cellen efficiënt (methoden B en C, Figuur 1), andere methoden (bijvoorbeeld, methode F als aangegeven in Figuur 1 of de methoden gepresenteerd in figuur 7B) bevestigd eerdere bevindingen van ultrasoonapparaat wordt een efficiënte cel verstoring methode22,28. Aan de andere kant, verstrekt eenvoudige bevriezen-ontdooien cycli, ook eerder gerapporteerd als een efficiënte methode voor phycobiliproteïnen extractie22,28, de laagste opbrengst in de hier beschreven proeven (methode E, Figuur 1 ). Cel homogenisering (binnen de extractie-buffer, 2 x 60 s) door zirkonium kralen werd getest als minder efficiënt dan de 15-s homogenisering van de gevriesdroogde cellulaire pellet (methode D, Figuur 1). De homogenisering procedure binnen de extractie buffer werd eerder beschreven met een langere homogenisering tijd (10 min)29. Wij heb niet testen de homogenisering langer dan 2 min sinds de monsters tijdens elke cyclus van homogenisering aanzienlijk is opgewarmd. In de literatuur werden ook andere cel verstoring methoden beschreven, met inbegrip van het gebruik van een Franse pers16 of griding13,15,30; dergelijke methoden werden echter niet getest in deze studie.

De eiwit extractie werd uitgevoerd voor 15 s (Figuur 2) in PBS buffer. De pH van de buffer was 7.4, die voorheen werd gerapporteerd als optimaal voor phycobiliprotein extractie22. De toevoeging van NaCl of KCl verbetering phycobiliprotein extractie-efficiëntie (Figuur 3), die is in tegenspraak met eerdere opmerkingen22geen. Echter, zoals aangegeven in Figuur 3, de fosfaat gebufferde zoutoplossing zoals gebruikt in dit protocol vervatte 154 mM NaCl (naast 5,6 mM nb2HPO4 en 1 mM KH2PO4), die niet in staat te stellen de NaCl-vrije PBS extractie buffer als een besturingselement. We vergeleken ook PBS buffer en natrium acetaat buffer16 extractie efficiëntie. De combinatie van natriumfosfaat en kalium fosfaat binnen de PBS-buffer verstrekt hogere phycobiliproteïnen oplevert (Figuur 3). Deze bevinding correspondeerde met de eerdere bevindingen van Hemlata et al. 22.

De phycobiliprotein extractie tijd is geoptimaliseerd voor 1 h. langer extractie leidde niet tot significante phycobiliprotein afbraak of extractie verbetering (Figuur 4), die met het eerdere werk van Lawrenz et al correspondeerde. 28. een extractie tijd korter dan 1 h werd niet getest. Extractie voor meer dan 4 uur was ook niet getest aangezien bleek eerder dat de uitgepakte phycobiliproteïnen in de fosfaatbuffer stabiel voor minstens 48 h28zijn.

Wij ten opzichte van verschillende vergelijkingen van spectrofotometrische phycocyanin en allophycocyanin kwantificering, zoals eerder is beschreven in de literatuur, door de inhoud van beide phycobiliproteïnen in de commerciële normen met bekende eiwit opnieuw te berekenen concentraties (Figuur 6). De beste wederopbouw van beide pigmenten werd bereikt met de vergelijkingen van Bennett en Bogorad12. Dit resultaat was niet specifiek voor de fosfaat eerder gebruikte extractie buffer een dergelijke buffer is sinds12,13,15. Het geen was specifiek voor de pigment-normen sinds het verschil tussen een615, een618en een620 (golflengtes gebruikt voor phycocyanin schatting in eerdere werken) in de standaard phycocyanin was 1% en het verschil tussen een 650 en een652 (golflengten eerder gebruikt voor de schatting van allophycocyanin12,13,14,16) in de standaard allophycocyanin was 3%. Ook was het verschil tussen een615 en een620 in het eiwit extract van Synechocystis slechts 2%. Dergelijke kleine verschillen in de absorptiespectra kunnen leiden tot een definitieve pigment variatie van maximaal 36% (Figuur 6). Daarom waren de verschillen tussen de individuele vergelijkingen eerder verbonden met variaties in phycobiliprotein uitsterven coëfficiënten van de specifieke organismen12,13,14, 15 , 16 , 17. interessant is dat de vergelijkingen van Chung et al. verstrekt de laagste phycocyanin wederopbouw (Figuur 6) Hoewel de auteurs ook Synechocystis voor hun experimenten16 gebruikt.

In plaats van de vaststelling van één golflengten, wordt u geadviseerd te meten van een continu spectrum van het extract van de phycobiliprotein tussen 280-720 nm te schatten van de aanwezigheid van chlorofyl een in het extract, die met zowel interfereren kan de allophycocyanin en de absorptie van phycocyanin. Bovendien, door het meten van de absorptie bij 280 nm (een280), een zuiverheid van zowel phycocyanin (een615/A280 of een620/A280)21,22 en allophycocyanin (een652/A280) 24 in het extract kan worden geschat (0,7: food rang, 3.9: reactieve rang, > 4.0: p.a.)21.

Als representatieve gegevens, werd de concentratie van zowel phycocyanin en allophycocyanin in de Synechocystis bepaald onder toenemende lichtintensiteit. Handhaven van de dichtheid van de cultuur op een constant niveau binnen een turbidostat teelt regime11was,21 essentieel voor de directe vergelijkende experiment. De concentraties van het phycocyanin en allophycocyanin van 2,4% - 10.2% en 0,6% - 1,7% van het cellulaire drooggewicht, respectievelijk waren vergelijkbaar als de eerder gerapporteerde waarden11,31,32. Ook was de phycobiliprotein inhoud per cel basis vergelijkbaar zoals gemeld eerder11,33. Met de toenemende licht daalde de phycobiliproteïnen inhoud. Interessant, zelfs onder de hoogste lichtsterkte van 1100 µmol (fotonen) / (m2·s), de phycobiliproteïnen waren niet volledig gebleekt.

Aangezien het protocol vereist dat alleen standaard apparatuur en relatief snel is, kan het gemakkelijk worden vastgesteld in een laboratorium waarin phycobiliproteïnen routinematig worden geanalyseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Het protocol goedgekeurd van een eerdere publicatie11. T. Z., D. Ch. en J. Č. werden ondersteund door het ministerie van onderwijs, jeugd en sport van de Tsjechische Republiek binnen het nationale programma voor duurzaamheid ik (Binengrenzen ik), nummer LO1415 te verlenen. J. Č. werd ook ondersteund door GA CR, Grant nummer 18-24397S. Toegang tot instrumenten en andere faciliteiten werd gesteund door de Tsjechische onderzoeksinfrastructuur voor systeembiologie C4SYS (project geen LM2015055). M. A. S. werd gesteund door een subsidie van de Russische Science Foundation [nr. 14-14-00904].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Synechocystis sp. PCC 6803 Institut Pasteur, Paris, France 6803 Cyanobacterium strain
Roti-CELL PBS Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany 9143.1 Phosphate-Buffered Saline (PBS) solution, pH 7.4
Eppendorf safe-lock tubes  Eppendorf, Hamburk, Germany 30120086 Safe-lock tubes 1.5 ml
VWR 80-Place Storage System VWR International, Radnor, Pennsylvania, USA 30128-282 Holder for safe-lock tubes 
RAININ 100 µl -1000 µl  Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 17014382 Pipette
GP-LTS-A-1000µL-/F-768/8 Mettler-Toledo, Columbus, Ohio, USA 30389272 Pipette tips
Rotina 420R Hettich, Kirchlengern, Germany 4701 Refrigerated centrifuge for 1.5 ml safe-lock tubes and 15 ml conical centrifuge tubes
LCexv 4010 Liebherr, Bulle, Switzerland 9005382197172 Refrigerator and freezer -20 °C
Revco ExF -86°C Upright Ultra-Low Temperature Freezer Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA EXF24086V  Freezer -80 °C
CoolSafe LaboGene, Lillerød, Denmark 7.001.000.615 Freeze dryer 
UV-2600 Shimadzu, Kyoto, Japan UV-2600 Spectrophotometer 
Hellma absorption cuvettes, semi Micro Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z600288  VIS/UV-VIS semi-micro cuvettes 0.75-1.5 ml, spectral range 200-2500 nm 
Silamat S6 Ivoclar Vivadent, Schaan, Liechtenstein 602286WU Homogenizer 
Solid-glass beads Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA Z273627 Glass bead of the diameter 2 mm
CPA225D-0CE Sartorius AG, Göttingen, Germany SECURA225D-1OBR Analytical balances
C-Phycocyanin from Spirulina sp.  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA P2172 Phycocyanin standard
Allophycocyanin Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA A7472 Allophycocyanin standard
Bicinchoninic Acid Kit  Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA BCA1, B9643 Complete kit for total proteins determination
AlgaeTron  Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic AG 130-ECO  Cultivation chamber for E. flasks, with controllable light and atmosphere
Photobioreactor Photon System Instruments Ltd., Drásov, Czech Republic FMT-150 Cultivation equipment for cyanobacteria and algae with completely controllable environment
Cellometer  Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts, USA Auto M10 Cell counter
Corning 15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA CLS430791  15 ml Centrifuge tube for dry weigth sampling
Herasafe KS Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA 51024579 Laminar flow hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mimuro, M., Kikuchi, H. Antenna Systems and Energy Transfer in Cyanophyta and Rhodophyta. Light-Harvesting Antennas in Photosynthesis. Green, B. R., Parson, W. W. Springer. Dordrecht, The Netherlands. 281-306 (2003).
  2. Spear-bernstein, L., Miller, K. R. Unique location of the phycobiliprotein light-harvesting pigment in the Cryptophyceae. Journal of Phycology. 25, (3), 412-419 (1989).
  3. Kirst, H., Formighieri, C., Melis, A. Maximizing photosynthetic efficiency and culture productivity in cyanobacteria upon minimizing the phycobilisome light-harvesting antenna size. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1837, (10), 1653-1664 (2014).
  4. Page, L. E., Liberton, M., Pakrasi, H. B. Reduction of photoautotrophic productivity in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by phycobilisome antenna truncation. Applied and Environmental Microbiology. 78, (17), 6349-6351 (2012).
  5. Sonani, R. R. Recent advances in production, purification and applications of phycobiliproteins. World Journal of Biological Chemistry. 7, (1), 100 (2016).
  6. Bryant, D. A. The Molecular Biology of Cyanobacteria. Springer Netherlands. Dordrecht, The Netherlands. (1994).
  7. Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. I. Sequence features in the 1 Mb region from map positions 64% to 92% of the genome. DNA Research. 2, 191-198 (1995).
  8. Kaneko, T., et al. Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803. II. Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions. DNA Research. 3, 109-136 (1996).
  9. Grigorieva, G., Shestakov, S. Transformation in the cyanobacterium Synechocystis sp 6803. FEMS Microbiology Letters. 13, (4), 367-370 (1982).
  10. Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp: PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15, (1), (2015).
  11. Zavřel, T., Očenášová, P., Červený, J. Phenotypic characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 substrains reveals differences in sensitivity to abiotic stress. PLoS One. 12, (12), e0189130 (2017).
  12. Bennett, A., Bogorad, L. Complementary chromatic adaption in a filamentous blue-green alga. The Journal of Cell Biology. 58, 419-435 (1973).
  13. Lüder, U. H., Knoetzel, J., Wiencke, C. Acclimation of photosynthesis and pigments to seasonally changing light conditions in the endemic antarctic red macroalga Palmaria decipiens. Polar Biology. 24, (8), 598-603 (2001).
  14. Evans, L. V. The effects of spectral composition and irradiance level on pigment levels in seaweeds. Experimental Phycology: A Laboratory Manual. Lobban, C. S., Chapman, D. J., Kremer, B. P. Cambridge University Press. Cambridge, New York, New Rochelle, Melbourne, Sydney. 123-133 (1988).
  15. Sampath-Wiley, P., Neefus, C. D. An improved method for estimating R-phycoerythrin and R-phycocyanin contents from crude aqueous extracts of Porphyra (Bangiales, Rhodophyta). Journal of Applied Phycology. 19, (2), 123-129 (2007).
  16. Chung, Y. H., Park, Y. M., Moon, Y. J., Lee, E. M., Choi, J. S. Photokinesis of Cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Photoscience. 11, (3), 89-94 (2004).
  17. Sun, L., et al. Phycobilisomes from Cyanobacteria. Handbook on Cyanobacteria: Biochemistry, Biotechnology and Applications. Gault, P. M., Marler, H. J. Nova Science Publishers, Inc. New York, NY. 105-160 (2009).
  18. Six, C., et al. Diversity and evolution of phycobilisomes in marine Synechococcus spp.: A comparative genomics study. Genome Biology. 8, (12), (2007).
  19. Sinetova, M. A., Červený, J., Zavřel, T., Nedbal, L. On the dynamics and constraints of batch culture growth of the cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Journal of Biotechnology. 162, (1), (2012).
  20. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35, (2), 171-205 (1971).
  21. Zavřel, T., Sinetova, M. A., Búzová, D., Literáková, P., Červený, J. Characterization of a model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 autotrophic growth in a flat-panel photobioreactor. Engineering in Life Sciences. 15, (1), 122-132 (2015).
  22. Hemlata, G., Fareha, B. Studies on Anabaena sp. nccu-9 with special reference to phycocyanin. Journal of Algal Biomass Utilization. 2, (1), 30-51 (2011).
  23. Rito-Palomares, M., Nuez, L., Amador, D. Practical application of aqueous two-phase systems for the development of a prototype process for c-phycocyanin recovery from Spirulina maxima. Journal of Chemical Technology & Biotechnology. 76, (12), 1273-1280 (2001).
  24. Zhang, H., et al. Selenium-Containing Allophycocyanin Purified from Selenium-Enriched Spirulina platensis Attenuates AAPH-Induced Oxidative Stress in Human Erythrocytes through Inhibition of ROS Generation. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59, (16), 8683-8690 (2011).
  25. Nedbal, L., Trtílek, M., Cervený, J., Komárek, O., Pakrasi, H. B. A photobioreactor system for precision cultivation of photoautotrophic microorganisms and for high-content analysis of suspension dynamics. Biotechnology and Bioengineering. 100, (5), 902-910 (2008).
  26. Zavřel, T., Knoop, H., Steuer, R., Jones, P. R., Červený, J., Trtílek, M. A quantitative evaluation of ethylene production in the recombinant cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 harboring the ethylene-forming enzyme by membrane inlet mass spectrometry. Bioresource Technology. 202, 142-151 (2016).
  27. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  28. Lawrenz, E., Fedewa, E. J., Richardson, T. L. Extraction protocols for the quantification of phycobilins in aqueous phytoplankton extracts. Journal of Applied Phycology. 23, (5), 865-871 (2011).
  29. Lea-Smith, D. J., et al. Phycobilisome-Deficient Strains of Synechocystis sp. PCC 6803 Have Reduced Size and Require Carbon-Limiting Conditions to Exhibit Enhanced Productivity. Plant Physiology. 165, (2), 705-714 (2014).
  30. Seo, Y. C., et al. Stable isolation of phycocyanin from Spirulina platensis associated with high-pressure extraction process. International Journal of Molecular Sciences. 14, (1), 1778-1787 (2013).
  31. Touloupakis, E., Cicchi, B., Torzillo, G. A bioenergetic assessment of photosynthetic growth of Synechocystis sp. PCC 6803 in continuous cultures. Biotechnology for Biofuels. 8, (1), 133 (2015).
  32. Touloupakis, E., Cicchi, B., Benavides, A. M. S., Torzillo, G. Effect of high pH on growth of Synechocystis sp. PCC 6803 cultures and their contamination by golden algae (Poterioochromonas sp.). Applied Microbiology and Biotechnology. 100, (3), 1333-1341 (2016).
  33. Ishii, A., Hihara, Y. An AbrB-Like Transcriptional Regulator, Sll0822, Is Essential for the Activation of Nitrogen-Regulated Genes in Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Physiology. 148, (1), 660-670 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics