अंशांकन-मुक्त इन विट्रो ठहराव में प्रोटीन होमो-oligomerization का उपयोग कर वाणिज्यिक इंस्ट्रूमेंटेशन और नि: शुल्क, खुला स्रोत चमक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

Biochemistry

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Summary

यह प्रोटोकॉल वाणिज्यिक प्रकाश स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव के आधार पर इन विट्रो में प्रोटीन होमो-oligomerization को बढ़ाता है के लिए एक अंशांकन-मुक्त दृष्टिकोण का वर्णन करता है । सही प्राप्ति सेटिंग्स और विश्लेषण विधियाँ दिखाई जाती हैं ।

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Nolan, R., Alvarez, L. A., Griffiths, S. C., Elegheert, J., Siebold, C., Padilla-Parra, S. Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software. J. Vis. Exp. (137), e58157, doi:10.3791/58157 (2018).

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Abstract

संख्या और चमक प्रोटीन होमो-oligomerization का पता लगाने के लिए एक अंशांकन मुक्त प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव स्पेक्ट्रोस्कोपी (FFS) तकनीक है । यह एक पारंपरिक फोकल डिजिटल डिटेक्टरों से सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर नियोजित किया जा सकता है । इन विट्रो में तकनीक के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल एक का उपयोग करें मामले के माध्यम से दिखाया गया है, जहां संख्या और चमक को सही mVenus-बला FKBP12F36V के oligomeric राज्य से पहले और बाद में dimerizing दवा AP20187 के अलावा मात्रा देख सकते हैं । सही माइक्रोस्कोप अधिग्रहण मापदंडों और सही डेटा प्रक्रिया और विश्लेषण विधियों का उपयोग करने के महत्व पर चर्चा कर रहे हैं । खास तौर पर photobleaching करेक्शन के विकल्प के महत्व पर जोर दिया जाता है । इस सस्ती पद्धति से कई जैविक संदर्भों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन कर रोजगार दिया जा सकता है.

Introduction

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन्स I n इन विट्रो

परंपरागत रूप से, क्रि और परमाणु चुंबकीय अनुनाद प्रयोगों क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (cryoEM) के साथ संयुक्त करने के लिए सही तीन प्रोटीन के आयामी वास्तुकला का वर्णन करने के लिए चुना प्रौद्योगिकियों रहे है और द्वारा उनके समारोह का अनुमान scrutinizing उनके उच्च संकल्प संरचनात्मक विवरण । प्रोटीन, तथापि, स्थैतिक संरचनाओं नहीं कर रहे है और समय और अंतरिक्ष में संरचना परिवर्तन और कंपन की एक किस्म से गुजरना कर सकते हैं । यही कारण है कि crystallographic या CryoEM डेटा से संरचनात्मक जानकारी के लिए अंय तकनीकों (जैसे, आणविक गतिशीलता सिमुलेशन और एकल अणु तकनीक) के साथ पूरित किया जाना चाहिए: एक प्रोटीन के समारोह में अपने गठन से संबंधित है परिवर्तन और बातचीत, और यह जानकारी एक स्थिर संरचना में मौजूद नहीं है । आदेश में अंतर आणविक गतिशीलता के लिए जांच करने के लिए, एकल अणु Forster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) के आधार पर तकनीक बहुत प्रभावी रहे हैं1. ये दृष्टिकोण जटिल मीडिया में अणुओं के विभिन्न उपआबादी का आकलन करने में सक्षम हैं । यह बहुत महत्वपूर्ण है, के रूप में इन परिवर्तनों को तेजी से कर रहे है और डेटा के अधिग्रहण के दौरान हो (यानी, nanosecond दूसरी श्रेणी के लिए) ।

समाधान और सतह स्थिरीकरण में प्रोटीन: दो मुख्य दृष्टिकोण सामान्यतः का पता लगाने और इन परिवर्तनों को बढ़ाता है के लिए कार्यरत हैं. अंतर आणविक बातचीत का पता लगाने के लिए और विशेष रूप से, लाइगैंडों द्वारा प्रेरित dimerization की प्रक्रिया, smFRET हमेशा सबसे अच्छा उपकरण नहीं है । दरअसल, झल्लाहट दूरी पर ही नहीं (≈ 10 एनएम) पर भी दो dipoles के उंमुखीकरण पर निर्भर करता है (दाता और स्वीकारकर्ता, χ2) और स्वीकारकर्ता अवशोषण स्पेक्ट्रा2के साथ दाता उत्सर्जन के ओवरलैप, लेकिन शायद यह पिछले हालत कम है महत्वपूर्ण है कि प्रायोगिक तौर पर सही झल्लाहट जोड़ा चुना जा सकता है प्रदान की है । होमो-dimerization की जांच के लिए smFRET का एक विशेष नुकसान ब्याज के प्रोटीन के लेबल से आता है: hetero smFRET के लिए, dimerization केवल ५०% तक का पता लगाया जा सकता है (यानी, hetero-झल्लाहट केवल दाता का पता लगाने में सक्षम हो जाएगा-स्वीकारकर्ता और स्वीकारकर्ता-दाता होमो-dimers नहीं बल्कि दाता-दाता या स्वीकारकर्ता-स्वीकारकर्ता, जो कि dimers का अन्य ५०% है). प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (FCS) और डेरिवेटिव (FCCS, आदि3) का उपयोग करने के लिए प्रोटीन प्रसार स्थिरांकों और इन विट्रो में बाध्यकारी स्थिरांक का पता लगाने के लिए एक और विकल्प है । इन तरीकों को पूरी तरह से होमो-dimerization नहीं कर पा रहे है या तो, FCS एक उपाय के रूप में एकाग्रता और प्रसार, और त्रिज्या और फैलाना एक कण के गुणांक प्रसार बहुत खराब आणविक वजन पर निर्भर हैं; आणविक वजन में एक 10 गुना वृद्धि उदाहरण के लिए केवल प्रसार गुणांक4में एक २.१५ गुना परिवर्तन का मतलब होगा । दो रंग FCS या FCCS के मामले में, केवल ५०% होमो-dimers के लिए ऊपर के रूप में एक ही कारण के लिए देखा जाएगा । सबसे व्यावहारिक और मात्रात्मक दृष्टिकोण होमो में dimerization का पता लगाने के लिए इन विट्रो और vivo में होमो-झल्लाहट5 और संख्या और चमक (एन एंड बी)6हैं. इस तथ्य को देखते हुए कि होमो-झल्लाहट anisotropy मूल्य के विशिष्ट इंस्ट्रूमेंटेशन वसूली की आवश्यकता है (यानी, ऑप्टिकल तत्वों/विश्लेषक समानांतर और सीधा ध्रुवीकरण ठीक करने के लिए), एन एंड बी यहां एक अनुकूल तकनीक के रूप में प्रस्तुत किया जाता है प्रोटीन होमो-dimerization और एकत्रीकरण का पता लगाने । यह दोनों विट्रो में और एक वाणिज्यिक सेट अप के साथ vivo में नियोजित किया जा सकता है ।

संख्या और चमक

एन एंड बी हाल ही में7की समीक्षा की गई है । कि समीक्षा जी कोशिकाओं में तकनीक के आवेदन पर ध्यान केंद्रित किया । यह गणितीय औपचारिकता यहां पुनरुत्पादन के रूप में इन समीकरणों मेंएकत्र आंकड़ों को लागू किया जाएगा सार्थक है । सबसे पहले, यह कुछ शब्दों और गणितीय मात्रा को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है:

  • एक इकाई अणु जो एक साथ बंधे है का एक सेट है ।
  • एक एंटिटी की चमक ε फोटॉनों यह प्रति इकाई समय (प्रति फ़्रेम) का उत्सर्जन करता है की संख्या है ।
  • n मौजूद निकायों की संख्या है ।
  • किसी छवि श्रृंखला के पाठ्यक्रम पर दिए गए पिक्सेल के लिए, < I > इसका माध्य तीव्रता है और σ2 इसकी तीव्रता में विचरण कर रहा है ।

फिर, फोटॉन-डिटेक्टरों गिनती और मोबाइल संस्थाओं और कोई पृष्ठभूमि संभालने के साथ,

Equation 1
Equation 2

जहां N स्पष्ट संख्या है और बी स्पष्ट चमकहै । में यह परिणाम

Equation 3
Equation 4

दलाल एट अल. 8 दिखाया है कि एनालॉग उपकरणों के साथ, एक तीन सुधार शर्तों की जरूरत है: एस फैक्टर, पृष्ठभूमि ऑफसेट, और readout शोर σ02. फिर, फिर से मोबाइल संस्थाओं संभालने,

Equation 5
Equation 6

देने

Equation 7
Equation 8

ध्यान दें कि के लिए ऊपर समीकरण अलग है कि दलाल एट अल में दिया जाता है । 8 और बाद में समीक्षा । 7 में दलाल एट अल. एक typo में एस के कारण लोप हो गया था और इस त्रुटि की समीक्षा में reproduced था । ऊपर समीकरण सही एक है । एसको मापने के लिए निर्देश, ऑफसेट और σ02 -एक साथ उनके अर्थ की व्याख्या के साथ-दलाल एट अल द्वारा दिए गए हैं । 8

चमक ε फैलाना संस्थाओं के oligomeric राज्य के लिए आनुपातिक है: ε दो बार के रूप में dimers के लिए बड़ा हो जाएगा के रूप में यह मोनोमर के लिए है, ट्रिमर्स के लिए बड़ा के रूप में यह मोनोमर के लिए है के रूप में दो बार hexamers के लिए बड़ा के रूप में यह ट्रिमर और इतने पर के लिए है । इस तरह, चमक ε को मापने, एक multimerization के किसी भी प्रकार हो सकता है ।

यदि वहां oligomeric राज्यों के एक मिश्रण मौजूद हैं, संख्या और चमक व्यक्तिगत oligomeric राज्यों मौजूद उबरने के लिए सक्षम नहीं है । इस तकनीक की एक सीमा है ।

प्रवृत्ति एल्गोरिथ्म और nandb सॉफ्टवेयर

photobleaching के लिए सुधार के महत्व को पहले9पर बल दिया गया है । Photobleaching अनिवार्य रूप से समय चूक मोड में प्रकाश माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के दौरान होता है; दोनों लाइव कोशिकाओं में और इन विट्रो में। साहित्य में ब्लीचिंग7के लिए सही करने के लिए कई दृष्टिकोण बताए गए हैं । रुझान वाले पैरामीटर टी के स्वत: पसंद के साथ घातीय छानने तकनीक वर्तमान सबसे अच्छा है । यह मुक्त, खुला स्रोत सॉफ्टवेयर nandb9में एकीकृत है । दरअसल, सॉफ्टवेयर है कि उपयोगकर्ता को मैंयुअल रूप से अपने रुझान का चयन करने की आवश्यकता पैरामीटर गलत परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते है क्योंकि इस पैरामीटर विकल्प की संभावना मनमाने ढंग से और गलत होगा । स्वचालित एल्गोरिथ्म डेटा का निरीक्षण करता है और इसके लिए उपयुक्त पैरामीटर, उपयोगकर्ता हस्तक्षेप9के लिए आवश्यकता के बिना निर्धारित करती है । यहां तक कि पैरामीटर चिकनी का सबसे अच्छा विकल्प के साथ, अपनी सीमाएं है और अच्छी तरह से केवल photobleaching प्रतिशत से कम 25% के साथ काम करता है, के रूप में सिमुलेशन9के साथ दिखाया गया है । मजे की बात है, जब स्वचालित प्रवृत्ति दिनचर्या का उपयोग कर, अपनी सटीकता ऐसी है कि एक कम चमक मूल्यों के साथ काम कर सकते है (यहां तक कि < 1.01), और इसलिए कम तीव्रता, और अभी भी काफी सटीक करने के लिए होमो-dimerization ।

Photobleaching भी एक और समस्या का कारण बनता है: एक multimer परिसर में photobleached fluorophores की उपस्थिति । यह उदाहरण है, एक ट्रिमर एक डिमर की तरह दिखाई देते है जब ट्रिमर में तीन इकाइयों में से एक गैर फ्लोरोसेंट है । हूर और ंयूएलर10 पता चला कि इस के लिए सही करने के लिए और इस सुधार भी बाद में एक समीक्षा7में जोर दिया गया था । nandb सॉफ़्टवेयर इस सुधार9शामिल हैं ।

FKBP12 F36V सिस् टम

FKBP12F36V एक प्रोटीन है जो स्वाभाविक रूप से oligomerize नहीं है, लेकिन AP20187 दवा (बोलचाल की बीबी dimerizing ligand के रूप में जाना जाता है)11,12के अलावा पर dimerize के लिए जाना जाता है । यह संख्या और चमक के लिए एक आदर्श परीक्षण के मामले बनाता है: बला FKBP12F36V के साथ, बीबी के अलावा पर oligomeric राज्य के एक दोहरीकरण मनाया जाना चाहिए ।

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Protocol

1. FKBP12 F36V-mVenus शुद्धिकरण

  1. रूपांतर (DE3) pLysS कोशिकाओं pET22b वेक्टर युक्त monomerized मानव FKBP12F36V12 और एन टर्मिनल His6 और mVenus टैग (अनुरोध पर उपलब्ध वेक्टर) के साथ । पौंड पर प्लेट कोशिकाओं ५० µ g/एमएल एम्पीसिलीन और ३४ µ g/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल के साथ पूरक आगर ।
  2. हस्तांतरण १०० मिलीलीटर पौंड स्टार्टर संस्कृति में तब्दील कालोनियों और झटकों के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16-20 घंटे के लिए हो जाना ।
  3. घने स्टार्टर संस्कृति पतला (OD600 > 1) पौंड मध्यम (2 x ५०० एमएल बैचों) में 1:100 और OD600 के लिए 2-3 घंटे के लिए विकसित = ०.६-०.८ (३७ ° c, २०० rpm) ।
  4. बर्फ पर शांत संस्कृतियों । २५० µ एम IPTG के साथ प्रेरित और 21 डिग्री सेल्सियस, २०० rpm पर 16-20 घंटे के लिए हो जाना ।
  5. 20 मिनट के लिए २,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा फसल कोशिकाओं ।
  6. IMAC बफर की ४० मिलीलीटर में गोली resuspend (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच ७.५, ५०० mm NaCl, 3 मिमी imidazole, 1 मिमी β-mercaptoethanol) EDTA-मुक्त छेड़ने अवरोधकों के साथ पूरक (1 गोली प्रति सेल गोली).
  7. Sonicate कोशिकाओं (५०० वाट, 20 kHz, ४०% आयाम, पर 9 एस, 11 पर 15 मिनट के लिए बंद) बर्फ और फसल में घुलनशील सामग्री पर केंद्रापसारक द्वारा २०,००० x जी
  8. स्थानांतरण घुलनशील lysate एक शंकु कुप्पी और राल के 2 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें). १०५ rpm रोटेशन के साथ 1 घंटे के लिए मशीन
    नोट: निकेल sepharose भी इस IMAC कदम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  9. हार्वेस्ट राल और imac बफर की २५० मिलीलीटर के साथ धो एक imac बफर बी की ५०० मिलीलीटर (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच ७.५, ५०० मिमी NaCl, 7 मिमी imidazole, 1 मिमी β-mercaptoethanol) के बाद ।
    नोट: ५० mM imidazole में वृद्धि अगर निकेल sepharose राल का उपयोग कर ।
  10. Elute His6-टैग की गईं प्रोटीन IMAC बफर सी (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट पीएच ७.५, ५०० mm NaCl, ३०० mm imidazole, 1 मिमी β-mercaptoethanol) का उपयोग कर ।
  11. एक आकार अपवर्जन कॉलम पर सुई ( सामग्री की तालिकादेखें) 10 मिमी HEPES पीएच ७.५, १५० मिमी NaCl, 1 मिमी डीटीटी में equilibrated । FKBP12F36V ने अपने पीक रेफरेंस पर ८७.७१ एमएल का कॉलम हमने इस्तेमाल किया है ।
  12. एसडीएस के माध्यम से शुद्धता का आकलन-पृष्ठ और पूल और ध्यान के रूप में की आवश्यकता है ।

2. Multiwell प्लेट सरणी की तैयारी

  1. गल शुद्ध FKBP12F36V (या ब्याज की लेबल प्रोटीन) से-८० ° c ।
  2. १०० एनएम शुद्ध FKBP12F36V (मध्यम, 10 मिमी HEPES पीएच ७.५, १५० mm NaCl, 1 मिमी डीटीटी) का समाधान तैयार करें । Sonicate और केंद्रापसारक (१३,००० rpm के त्वरित स्पिन) समुच्चय के गठन को रोकने के लिए ।
  3. पिपेट १००-२०० µ एक गिलास नीचे के साथ एक 8 अच्छी तरह से प्रेक्षण कक्ष में एल ।
  4. BB dimerizer को 10, 20, ४०, ८०, १००, १५०, ३००, और ५०० एनएम12,13के अंतिम सांद्रता में जोड़ें ।
  5. एक संदर्भ के रूप में, अकेले mVenus के १०० एनएम का समाधान संभावित एकत्रीकरण और वर्षा प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए तैयार है और एक ही अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ मोनोमर के लिए एक चमक मूल्य पुनर्प्राप्त ।

3. अंशांकन-मुक्त फोकल अधिग्रहण

  1. फोकल सिस्टम (चित्रा 1) शुरू करो । किसी भी प्रकाश स्कैनिंग सूक्ष्मदर्शी फोकल प्रणाली डिजिटल डिटेक्टरों या अच्छी तरह से सुसज्जित अनुरूप डिटेक्टरों8से लैस है, और हर के लिए एक निरंतर आवास समय रखने में सक्षम हासिल पिक्सेल काम करेंगे ।
  2. उत्तेजना बीम पथ सेट करें:
    1. ५१४ एनएम लेजर पर बारी और उद्देश्य (FKBP12F36V-mVenus के लिए) के बाहर निकलने पर 20-100
    2. चुनें 63x 1.4 na उद्देश्य या एक कॉलर सुधार जल विसर्जन उद्देश्य FCS के लिए बनाया गया है ।
    3. एक HyD, APD या नपे पीएमटी डिटेक्टर पर बारी । डिटेक्टरों फोटॉन में सक्षम-गिनती बेहतर कर रहे हैं, के रूप में इस मामले में, एसकी गणना, ऑफसेट और σ02 अनावश्यक हैं ।
    4. उत्सर्जन खिड़की से चुनें ५२०-५६० एनएम
    5. इसी उत्सर्जन के लिए 1 हवादार इकाई पर pinhole सेट ~ ५४५ एनएम ।
    6. प्राप्ति मोड को 16 x 16 पिक्सेल पर सेट करें
    7. सेट पिक्सेल निवास समय टीइस तरह का ध्यानकेंद्रित है कि यह टीफ़्रेम संतुष्ट > > टीडी > > टीनिवास, जहां डी फैलाना प्रोटीन और टी के निवास समय है फ़्रेम फ़्रेम दर है । इस के लिए निवास का समय स्थापित करने के लिए संगत ~ 13 µs ।
      नोट: कुछ वाणिज्यिक निर्माताओं स्कैनर है कि ध्यान केंद्रित नहीं रख रहे थे प्रति पिक्सेल लगातार समय था । इस भक्ति विधि काम करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    8. पिक्सेल आकार पर सेट करें ~ १२० एनएम ।
    9. xyt प्राप्ति मोड का चयन करें और प्राप्ति प्रति और अच्छी तरह से प्राप्त करने के लिए फ़्रेम की संख्या का चयन करें (उदाहरण के लिए ५,०००).
    10. यदि प्रणाली उच्च प्रवाह मोड के साथ सुसज्जित है, प्रत्येक अच्छी तरह से और अधिग्रहण की संख्या प्रति अच्छी तरह से प्रक्रिया को स्वचालित करने के निर्देशांक परिचय ।
      नोट: यदि एक विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर के लिए एक पानी की मशीन की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए सावधान रहना ।
    11. यदि प्रणाली एक छिड़काव प्रणाली के साथ सुसज्जित है, BB समाधान लोड और छिड़काव कार्यक्रम के लिए सही शुरू ५०००वें फ्रेम के बाद dimerization के कैनेटीक्स का मूल्यांकन करते हुए उदाहरण के लिए, १०,००० छवियों को प्राप्त करने ।
  3. तेल की एक बूंद में तेल विसर्जन उद्देश्य/पानी का उपयोग अगर एक कॉलर सुधार पानी विसर्जन FCS के लिए डिजाइन उद्देश्य ।
  4. मंच में 8 अच्छी तरह से अवलोकन चैंबर माउंट ।
  5. सही अच्छी तरह से चुनें और समाधान पर ध्यान केंद्रित ।
    नोट: महत्वपूर्ण: प्रतिबिंब और बिखरने से बचने के लिए नीचे कांच के पास ध्यान केंद्रित से बचें । जब समाधान में गहरा ध्यान केंद्रित करते हैं, तो स्वचालित फ़ोकस विकल्प को डिस्कनेक्ट कर दें ।
  6. प्राप्ति प्रारंभ करें और TIFF स्वरूप में छवियों के परिणामी स्टैक सहेजें ।

4. प्रवृत्ति और चमक आर पैकेज nandb का उपयोग कर विश्लेषण

  1. एक प्रक्रिया की गुणवत्ता की जांच के रूप में, ImageJ14 का उपयोग करने के लिए छवियों पर एक नज़र रखना और तीव्रता प्रोफ़ाइल ठीक है, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है । यह निर्धारित करने के लिए उपयोगी है या नहीं बहुत अधिक photobleaching हुई है । अगर बहुत ज्यादा ब्लीचिंग है, तो डेटा आगे के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है ।
    नोट: ImageJ भी व्यावसायिक स्वरूपों से झगड़ा करने के लिए छवियों को बदलने के लिए उपयोगी हो सकता है । nandb सॉफ्टवेयर नीचे वर्णित केवल TIFF फ़ाइलों के साथ काम कर सकते हैं ।
  2. डाउनलोड और स्थापित आर और RStudio15,16। यह डाउनलोड और आर पहले स्थापित करने के लिए सबसे अच्छा है, तो RStudio ।
    नोट: इस प्रकार nandb R पैकेज का उपयोग कैसे करें का वर्णन है । आर भाषा का ज्ञान nandb का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं है, लेकिन यह जीवन को आसान बना देगा ।
  3. nandb पैकेज स्थापित करें ।
    1. खोलें RStudio और कंसोल में, प्रकार install. पैकेज ("nandb") और स्थापना के लिए प्रतीक्षा करें ।
  4. nandb पता करने के लिए जाओ
    1. मैनुअल17की समीक्षा करें ।
    2. विभिंन कार्यों के लिए अंतर्निहित RStudio मदद की समीक्षा करें । सबसे अधिक संभावना समारोह का उपयोग किया जाएगा चमक () हो जाएगा । इस फ़ंक्शन के लिए मदद फ़ाइल लिखकर देखें? चमक () पर सांत्वना ।
  5. चमक परिकलित करें
    1. कहते है कि एक डेस्कटॉप पर एक छवि फ़ाइल img001. tif बुलाया है (ध्यान दें कि ' nandb ' केवल झगड़ा फ़ाइलों के साथ काम करता है) । एक कि छवि की चमक की गणना कर सकते हैं:
      b <-चमक ("~/Desktop/img001.tif", ताऊ = "auto")
      1. यह R में चर b करने के लिए छवि की चमक असाइन करता है । ताऊ = "ऑटो" यह सुनिश्चित करता है कि छवि चमक गणना करने से पहले सही ढंग से विट्रेंड है । सबसे आम बात करने के लिए यहां से मतलब है या छवि के माध्य चमक की गणना है । एक टाइपिंग मतलब (ख) या माध्य (बी) द्वारा यह कर सकते हैं । एक भी उपयोग कर डेस्कटॉप के लिए चमक छवि लिख सकते है
        ijtiff:: write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
    2. एक डेस्कटॉप पर images_folder छवियों से भरा फ़ोल्डर है और एक की जरूरत है इन छवियों की चमक की गणना और झगड़ा फ़ाइलों के रूप में चमक छवियों को लिखने के लिए कहते हैं । फिर देख? brightness_folder () । यह फ़ंक्शन पूरे फ़ोल्डर को एक साथ संसाधित करता है:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", तौ = "वत")
      यह जो एक सॉफ्टवेयर वे आर पसंद है के लिए विशेष रूप से अच्छा है, क्योंकि फ़ाइलों के सभी एक एकल कमान में संसाधित कर रहे हैं, और फिर एक उत्पादन चमक उनके चुने हुए सॉफ्टवेयर में झगड़ा छवियों के साथ काम पर जा सकते हैं, यह14 ImageJ , अजगर या कुछ और ।

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Representative Results

रुझान और monomeric चमक

एक बार डेटा प्राप्त कर लिया गया है, एक चमक गणना शुरू करने के लिए समाधान में ब्याज की प्रोटीन की oligomeric राज्य निर्धारित कर सकते हैं । भले ही समाधान में ब्लीचिंग का प्रभाव उतना कठोर नहीं हो सकता है क्योंकि यह vivo मेंहो सकता है, तीव्रता का पता लगाना अभी भी स्थिर मतलब नहीं होगा, संभवतः fluorophore से संबंधित photophysical इफेक्ट के कारण,18 लेकिन इस के पीछे के कारण पूरी तरह नहीं समझ रहे हैं । यह एक प्रभाव है जब चमक की गणना; जब मोनोमर-डिमर संक्रमण का निर्धारण करने की कोशिश कर रहा है, यह पहलू महत्वपूर्ण है । चित्रा 2में दिखाया गया डेटा के लिए स्वत: प्रवृत्ति एल्गोरिथ्म लागू करके, तीव्रता ट्रेस ठीक है, समाधान में FKBP12F36V-mVenus की चमक के लिए एक अधिक सटीक मूल्य प्रदान करने के लिए सही है । बीबी के अलावा पहले, बिना विरूपण, बी = १.०२६, जबकि विरूपण के बाद, बी = १.००५ (चित्रा 2बी) ।

FKBP12 का निर्धारण F36V -mVenus मोनोमर-डिमर संक्रमण इन विट्रो में

२०,००० की छवियों के अनुक्रम शुद्ध FKBP12F36V-mVenus में १०० एनएम समाधान प्रोटोकॉल अनुभाग में निर्दिष्ट के रूप में प्राप्त किए गए । १०,००० फ्रेम्स हासिल करने के बाद homodimerizer ड्रग बीबी को अधिग्रहण करते समय समाधान के लिए जोड़ दिया गया । ५,००० फ्रेम के प्रत्येक लगातार श्रृंखला (चित्रा 3) का विश्लेषण किया गया था । मतलब चमक 5 मिनट के बाद बीबी इसके अलावा बी = १.०१०, जो एक 2 गुना वृद्धि हुई है, एक FKBP12F36V डिमर का संकेत था । प्रक्रिया की कैनेटीक्स चित्रा 3में दिखाया गया है; पूर्ण FKBP12F36V dimerization के लिए बी पी इसके अलावा के बीच देरी लगभग 2 मिनट था ।

प्रोटीन समुच्चय की पहचान

प्रोटीन समुच्चय के एक नंबर दोनों फ्रेम की एक सीमित संख्या में और भी तीव्रता ट्रेस (चित्रा 4) में पता लगाया गया । ये समुच्चय स्वाभाविक रूप से समाधान में जब प्रोटीन के साथ काम कर रहे है और sonicating और/या प्रोटीन कमजोर पड़ने से बढ़ती द्वारा समाप्त किया जा सकता है । फिर भी, कुछ जैविक समस्याओं में, एक मोनोमर और बड़े समुच्चय के बीच संक्रमण का पता लगाने की जरूरत है । चित्रा 4 एक उदाहरण से पता चलता है जहां एक FKBP12F36V प्रोटीन समग्र अवलोकन मात्रा के माध्यम से फैलाना (छवियां 16 x 16); हमारे पिछले गणना के लिए इन आंकड़ों को खारिज कर दिया गया, तथापि, एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है दिखाने के लिए कि इन समुच्चय का पता लगाया जा सकता है और एक ही सेटिंग्स और दृष्टिकोण का उपयोग कर विशेषता । पहली नजर में, जब ५००० छवियों का मूल्यांकन, एक FKBP12F36V-बीबी (बी = १.०१०) के साथ इलाज mVenus के लिए औसत चमक ठीक कर सकते हैं । कच्चे चमक छवि को देखने, एक स्पष्ट रूप से देख सकते हैं, हालांकि, बी ≈ १.०८० के एक उच्च मूल्य के साथ लगभग 8 पिक्सल के हित के एक क्षेत्र । ब्याज की इस क्षेत्र टी = ३४-३७ एस जहां एक FKBP12F36V समग्र प्रेक्षण क्षेत्र के आसपास फैलाना पर कुछ फ्रेम के साथ मेल खाता है । कुल काफी लंबे समय के लिए सही अपने आकार निर्धारित करने के लिए अवलोकन मात्रा में नहीं रह गया था ।

Figure 1
चित्रा 1 . N के आवेदन और समाधान में प्रोटीन मोनोमर-डिमर संक्रमण का पता लगाने के लिए बी । (ए) एक लेज़र स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (LSM) एक लेजर स्रोत (mVenus लेबल प्रोटीन के मामले में ५१४ एनएम पर सेट) के साथ सुसज्जित की एक सरल ऑप्टिकल पथ (हमारे मामले में एक विसर्जन उद्देश्य की ओर नीले तीर) का निर्देशन (एक 63x 1.4 na तेल) के एक के १०० एनएम समाधान रोशन FKBP12F36V-mVenus समाधान । उत्सर्जन प्रतिदीप्ति (हरे तीर) एक dichroic दर्पण के माध्यम से गुजरता है और एक bandpass फिल्टर है कि उत्सर्जन प्रकाश साफ की ओर निर्देशित है, और एक pinhole 1 हवादार इकाई पर सेट एक बिंदु डिजिटल फोटॉन गिनती में सक्षम डिटेक्टर से पहले सही स्थित है । (ख) रोशनी की एक फोकल खंड 16 x 16 के माध्यम से स्कैन किया गया है एक FKBP12F36V-mVenus अणुओं है कि दर्ज करें और गाऊसी आकार फोकल मात्रा प्रतिदीप्ति तीव्रता उतार चढ़ाव की एक सरणी के उत्पादन से बाहर निकलें । (ग) छवि श्रृंखला समय के साथ प्राप्त की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 . स्वचालित प्रवृत्ति को सही समाधान में मोनोमर की आबादी को मापने की जरूरत है । (a) ५००० १६ x 16 पिक्सेल छवियों का स्टैक प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में प्राप्त किया गया था । पहली फ्रेम की तीव्रता औसत समय हल तीव्रता प्रोफ़ाइल, जो ब्लीचिंग और अन्य विलायक और/या photophysic प्रभाव से संबंधित हो सकता है कि दीर्घकालिक उतार चढ़ाव से पता चलता है के साथ एक साथ दिखाया गया है । इन दीर्घकालिक उतार चढ़ाव के लिए जो भी कारण, वे चमक गणना प्रभाव और इसलिए प्रवृत्ति की आवश्यकता होती है । स्वत: प्रवृत्ति के बिना, एक बी = १.०२६ हो जाता है, जबकि स्वत: प्रवृत्ति, बी = १.००५ के बाद । इसके अलावा, बिना चमक (बाएं पैनलों, दूसरी पंक्ति) और (सही पैनलों, दूसरी पंक्ति) चिकनी फ़िल्टरिंग के साथ दिखाया गया है । (ख) में प्रस्तुत किया गया एक ही डेटा (a) में दिखाया गया है और तीव्रता और चमक के संदर्भ में परिणाम है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . इन-विट्रो N & B वास्तविक समय में FKBP12F36V मोनोमर और dimers के बीच संक्रमण को हल करने में सक्षम है । dimerizer दवा बी सी के अलावा सही 2 मिनट (०.००५ से सच आणविक चमक में ०.०१० के बाद) सच चमक में एक दो गुना वृद्धि हुई । (क) पहले फ्रेम की तीव्रता को एक साथ दिखाया गया है मतलब की तीव्रता प्रोफ़ाइल के साथ ट्रेंडेड छवि । (बाएँ पैनलों, दूसरी पंक्ति) और (सही पैनलों, दूसरी पंक्ति) चिकनी फ़िल्टरिंग के साथ के बिना चमक दिखाया गया है । (ख) मतलब चमक की साजिश रची है (हर ५००० फ्रेम) सच आणविक चमक ε का उपयोग कर । dimerization टी = 4 मिनट में बी एम इसके अलावा (टी = 1min) के बाद 2 मिनट होता है । फिट वक्र एक sigmoidal समारोह के लिए dimerizer दवा (BB) के अलावा dimerization की ओर प्रवृत्ति तनाव है । त्रुटि पट्टियां प्रत्येक समय बिंदु पर चमक बंटन की मानक त्रुटि दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . इन विट्रो N & B समाधान में प्रोटीन समुच्चय के आकार को हल करने के लिए । (एक) FKBP12F36V-mVenus के अधिग्रहण के लिए समय-हल तीव्रता ट्रेंड्ड ट्रेस चमक छवियों (दूसरी पंक्ति) के साथ एक साथ दिखाए जाते हैं । (b) समय-हल किया गया रुझान गहनता ट्रेस एक लाल डॉटेड वृत्त (ऊपर बाएं पैनल) के साथ हाइलाइट किया गया है तीव्रता में एक अधिकतम दिखाता है । इस विशेष समय (t = ३४ सेकंड) से मेल खाती है जो पहले तीव्रता फ़्रेम दिखाया गया है और एक लाल तीर एक FKBP12F36V-mVenus समग्र रोशन क्षेत्र में प्रवेश से पता चलता है । चिकनी चमक छवि में एक करीब देखो ब्याज की एक क्षेत्र है कि उच्च oligomeric राज्यों और छवि के बाकी शामिल से पता चलता है मोनोमर और dimers के बीच एक मिश्रण है बी = १.००८ के औसत के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

एन एंड बी एक तकनीक का पता लगाने के लिए वाणिज्यिक प्रकाश डिजिटल डिटेक्टरों से सुसज्जित फोकल सूक्ष्मदर्शी स्कैनिंग का उपयोग कर multimerization है । यह दृष्टिकोण एक बिंदु FCS, FCCS, और smFRET की तुलना में काफी आकर्षक है क्योंकि यह अंशांकन मुक्त है और चमक गणना सीधी और एकाग्रता स्वतंत्र6है । यह प्रमुख महत्व का है, हालांकि, चमक गणना9प्रदर्शन करने से पहले ब्लीचिंग और दीर्घकालिक तीव्रता उतार चढ़ाव के लिए सही करने के लिए; ब्लीचिंग और अन्य कलाकृतियों के कारण चमक की एक मामूली वृद्धि oligomeric राज्य में एक परिवर्तन के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है (के रूप में चित्र 2में देखा) अगर प्रवृत्ति उपेक्षा या गलत तरीके से किया जाता है । स्वत: प्रवृत्ति एल्गोरिथ्म का उपयोग सटीक चमक गणना के लिए अनुमति देता है ।

यह महत्वपूर्ण है, जब छवियों को प्राप्त करने के नियमों का एक नंबर का पालन करें । सबसे पहले, फोकल मात्रा में अणुओं के निवास समय है, और इसलिए उनके प्रसार लगातार क्रम में फोकल प्रणाली के सही मापदंडों को निर्धारित करने के लिए जाना जाना चाहिए; लेबल अणुओं के निवास समय के लिए पिक्सेल आवास समय और फ्रेम समय7के बीच रहने की जरूरत है । सही fluorophore चुनना महत्वपूर्ण है । एक उज्ज्वल और स्थिर fluorophore शोर और ंयूनतम photobleaching के लिए अच्छा संकेत के लिए आवश्यक है । ब्लीचिंग से बचने के लिए लेजर पावर को अपेक्षाकृत कम रखा जाना चाहिए । प्रति पिक्सेल 1 या 2 की फोटॉन गिनती पर्याप्त हैं । गिनती कम रखने भी डिटेक्टर ढेर से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. तकनीक का सामना कम फोटॉन बजट से बेहतर होने से इसका सामना ब्लीचिंग से होता है. इस प्रोटोकॉल mVenus में नियोजित किया गया है; जो एक अपेक्षाकृत उज्ज्वल fluorophore है, eGFP19के बराबर है । एक विकल्प है कि चुनिंदा एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन लक्ष्य nanoboosters का उपयोग है; ये पारंपरिक fluorophores20से ज्यादा उज्जवल हो सकते हैं ।

हार्डवेयर के संदर्भ में, डिजिटल फोटॉन-गिनती डिटेक्टरों ठहराव आसान बनाने के लिए, लेकिन N & B एनालॉग डिटेक्टरों के साथ संभव है, बशर्ते कि एक कुछ अधिग्रहण मापदंडों बरामद किया है । 8

हालांकि anisotropy जैसे अंय तरीकों का पता लगाने के लिए नए सॉफ्टवेयर के आगमन के साथ होमो-dimerization, विश्लेषण, एन एंड बी के लिए एक सुलभ दृष्टिकोण के रूप में अकेला खड़ा पता लगाने और प्रोटीन बातचीत और oligomerization, इन विट्रो में दोनों कर सकते है और जीवित कोशिकाओं में ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम का समर्थन किया गया है वेलकम ट्रस्ट ग्रांट 105278/Z/R.N. को 14/ वेलकम ट्रस्ट सेंटर फॉर ह्यूमन जेनेटिक्स द्वारा वित्त पोषित वेलकम ट्रस्ट कोर अवार्ड 203852/जेड/ सीएस समूह में कार्य कैंसर रिसर्च यूके (C20724/A14414), और यूरोपीय संघ के क्षितिज के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित है २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम अनुदान ६४७२७८ ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosettaTM (DE3) pLysS cells Novagen 70956-3
Ampicillin Sigma Aldrich PubChem Substance ID 329824407
Chloramphenicol Sigma Aldrich PubChem Substance ID: 24892250
LB starter culture QIAGEN
LB medium QIAGEN https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG Sigma Aldrich PubChem Substance ID 329815691
IMAC buffer Medicago 09-1010-10
EDTA-free protease inhibitors  Sigma Aldrich 11873580001
TALON resin Clonetech
Nickel sepharose GE Healthcare
S200 16/60 column GE Healthcare
Glass bottom 8 well observation dish Ibidi 80827

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References

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