Biochemistry
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मल्टीप्लेक्स्ड सह-प्रतिरक्षा का उपयोग कर प्रोटीन इंटरेक्शन नेटवर्क गतिशीलता का परिमाणीकरण
Chapters
Summary August 21st, 2019
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मात्रात्मक बहुसंकेत इम्यूनोवेरीफ्ट (क्यूएमआई) दो नमूनों के बीच लक्षित प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की बहुतायत में मतभेदों के संवेदनशील पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। QMI biomaterial की एक छोटी राशि का उपयोग किया जा सकता है, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर टैग की आवश्यकता नहीं है, और किसी भी पहले से परिभाषित प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Transcript
मात्रात्मक मल्टीप्लेक्स सह-इम्यूनोप्रिपिपिटेशन, या क्यूएमआई, उपयोगकर्ताओं को एक पूर्वनिर्धारित प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क में सैकड़ों बाइनरी इंटरैक्शन को एक साथ मापने में सक्षम बनाता है। एक ही तरह से एक साथ कई सह-आईपीएस का प्रदर्शन करके बायोइन्फॉर्मेटिक्स तकनीक इस बात की जांच कर सकती है कि सह-संघों के समूह समन्वित तरीके से कैसे बदलते हैं । परख विकसित करने के लिए समय लेने वाली है, लेकिन एक बार QMI पैनल हाथ नेटवर्क पैमाने पर डेटा में है एक अपेक्षाकृत बस रात भर परख में संकेत ट्रांसडक्शन सिस्टम के बारे में एकत्र किया जा सकता है ।
क्यूएमआई को विभिन्न नमूनों और अभिकर्मकों को 96 अच्छी प्लेटों में सटीक पिपिंग की आवश्यकता होती है। त्रुटियों को रोकने के लिए प्रत्येक परख स्थापित करते समय और चलाते समय सावधानीपूर्वक नोट्स लिए जाने चाहिए। नमूना तैयार करने और इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए, बर्फ पर 15 मिनट की इनक्यूबेशन के लिए प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों के साथ एक उपयुक्त डिटर्जेंट में नमूने को lysing द्वारा शुरू करें।
इनक्यूबेशन के अंत में, झिल्ली और मलबे को हटाने के लिए नमूना नीचे स्पिन और मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए सुपरनैंट पर बीसीए परख प्रदर्शन करते हैं। प्रोटीन सांद्रता को सामान्य करने के बाद, एक चुंबकीय मनका मास्टर मिश्रण तैयार करें जिसमें प्रत्येक वर्ग के लगभग 250 चुंबकीय मोती शामिल हैं। प्रति नमूना फ्लाई पी बफर के 20 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करने से पहले फ्लाई पी बफर में दो बार चुंबकीय मनका मिश्रण को धोने के लिए चुंबकीय पृथक्करण का उपयोग करें।
पूरी तरह से पाइपिंग के बाद, प्रति सैंपल एक बर्फ ठंडे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में मोतियों के 20 माइक्रोलीटर को लें और इम्यूनोप्रिपिटेशन के लिए प्रत्येक ट्यूब में सामान्यीकृत प्रोटीन सांद्रता के साथ समान मात्रा में lysate जोड़ें। फिर प्रत्येक प्लेट को चलाने के लिए प्रत्येक lysate नमूने को एक ट्यूब में विभाजित करें और प्रकाश से संरक्षित चार डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर नमूनों को इम्यूनोप्रिपिटेट करें। अगली सुबह ट्यूबों के पहले सेट से lysate को हटाने के लिए एक चुंबकीय मनका रैक का उपयोग करें और प्रति धोने बर्फ ठंड मक्खी पी बफर के ५०० माइक्रोलीटर में दो बार मोती धोने ।
पुनःपन्नता की मात्रा की गणना करने के बाद, आइस कोल्ड फ्लाई पी बफर की गणना की मात्रा में इम्यूनोप्रिपिट्स को फिर से बढ़ाएं। कोमल पाइपिंग द्वारा चुंबकीय मोतियों को अच्छी तरह से पुनर्व्यवित करें और बर्फ पर एक फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से प्लेट में प्रति अच्छी तरह से मोतियों के 25 माइक्रोलीटर वितरित करें। एक अलग 96 अच्छी तरह से प्लेट में, एक दो बार काम एकाग्रता के लिए attinilated जांच एंटीबॉडी द्वारा पतला।
प्रत्येक जांच एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 25 माइक्रोलीटर को चुंबकीय मनका के उपयुक्त कुओं में वितरित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें जिसमें परख प्लेट होती है और चुंबकीय मोतियों को मिलाने और पुनर्उत्पादित करने के लिए क्षैतिज प्लेट शेखर पर उच्च गति से हिलाएं। मिश्रण करने के बाद, प्रकाश से सुरक्षित चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे इनक्यूबेशन के लिए गति को कम करें। इनक्यूबेशन के अंत में, चार डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय प्लेट वॉशर पर प्रति धोने ताजा फ्लाई पी बफर के साथ तीन बार प्लेट धोएं।
अंतिम धोने के बाद, फ्लाई पी बफर में स्ट्रेप्टाविडिन पीई के 50 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से खर्च करें। मिश्रण हिलाएं और प्रकाश से सुरक्षित 30 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेटिंग से पहले मोतियों को फिर से खर्च करें । इनक्यूबेशन के अंत में, प्लेट को चार डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय प्लेट वॉशर पर फ्लाई पी बफर के साथ तीन बार धोएं और फ्लाई पी बफर के 125 माइक्रोलीटर में मोतियों को फिर से रखें।
मोतियों को अच्छी तरह से पुनर्व्यवसस्त करने और प्लेट को रिफ्रिजेटेड फ्लो साइटोमीटर में लोड करने के लिए 900 घूर्णन पर एक मिनट के लिए प्लेट को हिलाएं। फ्लो साइटोमीटर सॉफ्टवेयर में, उच्च RP1 लक्ष्य सेटिंग, प्रति क्षेत्र 1, 000 मोतियों की एक स्टॉप स्थिति और 80 माइक्रोलीटर की एक नमूना मात्रा का चयन करें। रन को आधे रास्ते में रोकें और बसने से रोकने के लिए मोतियों को फिर से खर्च करें।
रन के अंत में, एक्सएमएल प्रारूप में डेटा फ़ाइलों का निर्यात करें। एएनसी विश्लेषण करने के लिए, प्रायोगिक डिजाइन के विवरण को प्रतिबिंबित करने और कार्यक्रम चलाने के लिए एएनसी इनपुट फ़ाइल भरें, जो सक्रिय निर्देशिका में सीएसवी फ़ाइल लिखेगा। हिट में समाप्त होने वाली फ़ाइल।
सीएसवी प्रोटीन सह-संघों की रिपोर्ट करेगा जो चार प्रयोगात्मक प्रतिकृति में से कम से तीन में नियंत्रण और प्रायोगिक स्थितियों के बीच ०.०५ के झूठे सकारात्मक स्तर पर काफी अलग हैं । भारित सहसंबंध नेटवर्क विश्लेषण के लिए, एमएफआई में समाप्त होने वाले मैटलैब द्वारा डेटा फ़ाइल आउटपुट के कॉलम शीर्षकों को चिपका दें। सीएसवी एक नई स्प्रेडशीट के पहले कॉलम में और प्रयोगात्मक उपचार और किसी भी अन्य चर का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग संख्या और उपचार के लिए कॉलम प्रयोग जोड़ें।
इस फ़ाइल को लक्षण के रूप में सहेजें। सीएसवी और ओपन आर स्टूडियो। एमएफआई युक्त फ़ोल्डर के लिए कार्य निर्देशिका सेट करें।
सीएसवी और लक्षण। सीएसवी फ़ाइलें, कोड के वर्गों को हाइलाइट करें, और टिप्पणी की गई कमांड फ़ाइल में दर्शाए गए आर कमांड को चलाने के लिए कमांड एंटर को हिट करें। भारित सहसंबंध नेटवर्क विश्लेषण मॉड्यूल प्रत्येक प्रयोगात्मक विशेषता के साथ काफी सहसंबद्ध एक ग्राफिक फ़ाइल के रूप में आउटपुट होगा और प्रत्येक मॉड्यूल के साथ प्रत्येक बातचीत का सहसंबंध सीएसवी फ़ाइल के रूप में आउटपुट होगा।
एएनसी आउटपुट फ़ाइल में प्रत्येक इंटरैक्शन के लिए, पहचानें कि क्या वह इंटरैक्शन सीएनए द्वारा भी महत्वपूर्ण है और एक नया कॉलम बनाएं जो इंगित करता है कि क्या प्रत्येक एएनसी हिट भी सीएनए हिट है। मानों को दो गुना परिवर्तन लॉग इन करने और सभी एएनसी यूनियन सीएनए हिट के लिए औसत मूल्य की गणना करने के लिए परिवर्तित करें। अंत में, प्रत्येक एएनसी यूनियन CNA के साथ एक नई स्प्रेडशीट बनाएं जो एक कॉलम में अपने इम्यूनोप्रिपिcipitेशन लक्ष्य द्वारा सूचीबद्ध है, दूसरे कॉलम में इसका जांच लक्ष्य है, और तीसरे कॉलम में इसका गुना परिवर्तन मूल्य है।
नोड एज आरेख बनाने के लिए इस फ़ाइल को एक नेटवर्क के रूप में साइटोस्केप में आयात करें। दो स्वतंत्र सांख्यिकीय दृष्टिकोणों द्वारा पहचाने गए उच्च आत्मविश्वास प्रोटीन इंटरैक्शन को ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर, साइटोस्केप, या पूरक सामग्री में शामिल आर कोड और विश्लेषण निर्देशों का उपयोग करके हीटमैप के रूप में नोड एज आरेख के रूप में कल्पना की जाती है। प्रोटोकॉल के दौरान, उपयोगकर्ताओं को सही ढंग से पिपेट करने के लिए, सावधानीपूर्वक रिकॉर्ड रखने के लिए, और हर समय नमूनों को ठंडा रखने के लिए ध्यान रखने की जरूरत है ।
हमने यह समझने के लिए क्यूएमआई का उपयोग किया है कि सिग्नल ट्रांसडक्शन रास्ते विभिन्न इनपुट प्रकारों के बीच अंतर कैसे करते हैं और कई रिसेप्टर्स से जानकारी को एकीकृत करते हैं।
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