Usando o conjunto de ferramentas de animação de FishSim para investigar o comportamento dos peixes: um estudo de caso na escolha do companheiro copiando em Mollies Sailfin

Behavior

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Summary

Usando o romance FishSim animação Toolchain, apresentamos um protocolo para manipulação visual não-invasivo de informação pública no contexto da escolha do companheiro copiando no sailfin mollies. FishSim Animação Toolchain fornece uma estrutura de fácil de usar para o design, animação e apresentação de estímulos de animação peixe para experimentos comportamentais com peixe de teste ao vivo.

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Gierszewski, S., Baker, D., Müller, K., Hütwohl, J. M., Kuhnert, K. D., Witte, K. Using the FishSim Animation Toolchain to Investigate Fish Behavior: A Case Study on Mate-Choice Copying In Sailfin Mollies. J. Vis. Exp. (141), e58435, doi:10.3791/58435 (2018).

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Abstract

Na última década, empregar animações de computador para a investigação do comportamento animal tem aumentado devido à sua capacidade de forma não-invasiva, manipular a aparência e comportamento de estímulos visuais, em relação ao manipular animais vivos. Aqui, apresentamos o Toolchain de animação de FishSim , uma estrutura de software desenvolvida para fornecer a pesquisadores com um método fácil de usar para a implementação de animações 3D computador em experimentos comportamentais com peixe. O toolchain oferece modelos para criar estímulos 3D virtuais de cinco espécies de peixes diferentes. Estímulos são personalizáveis na aparência e tamanho, com base em fotografias tiradas de peixes vivos. Vários estímulos podem ser animados por gravação caminhos a nadar em um ambiente virtual usando um controlador de vídeo game. Para aumentar a padronização do comportamento simulado, o caminho de natação pré-gravado pode ser repetido com estímulos diferentes. Várias animações mais tarde podem ser organizadas em listas de reprodução e apresentadas em monitores durante experimentos com peixes vivos.

Em um estudo de caso com sailfin mollies (Poecilia latipinna), nós fornecemos um protocolo sobre como conduzir um experimento de copi-escolha do companheiro com FishSim. Nós utilizado este método para criar e animar virtuais machos e fêmeas de modelo virtual e em seguida apresentado estas para viver fêmeas focais em um experimento de escolha binária. Nossos resultados demonstram que animação de computador pode ser usada para simular peixes virtuais em um experimento de copi-escolha do companheiro para investigar o papel dos pontos de gravid femininos como uma indicação de qualidade para uma fêmea modelo da cópia da escolha do companheiro.

Aplicar esse método não está limitado a escolha do companheiro cópia experimentos, mas pode ser usado em vários projetos experimentais. Ainda assim, sua usabilidade depende os recursos visuais da espécie estudo e primeiro precisa de validação. Em geral, animações de computador oferecem um alto grau de controle e padronização em experimentos e suportar o potencial para 'reduzir' e 'substituir' animais de estímulo ao vivo, bem como para 'refinar' procedimentos experimentais.

Introduction

Recentemente, utilizar técnicas modernas para a criação de estímulos artificiais, tais como realidade virtual e animações de computador garnered popularidade em pesquisa1. Esses métodos fornecem várias vantagens em comparação com abordagens experimentais clássicas com estímulo ao vivo animais1,2. Animação por computador permite que a manipulação não-invasiva da aparência (tamanho, cor) e o comportamento de animais de estímulo virtual utilizados em experiências. Por exemplo, a remoção cirúrgica da espada no masculinas verdes espadas (Xiphophorus helleri) para testar as preferências do companheiro em fêmeas3 foi processada desnecessária usando animação por computador em um estudo posterior sobre esta espécie4. Além disso, animações de computador podem criar fenótipos são raramente encontrados na natureza5. Características morfológicas de animais virtuais podem ser alteradas mesmo além do alcance natural de que espécie de4. Particularmente, a possível manipulação sistemática do comportamento é uma das principais vantagens de animação por computador, já que é quase impossível com animais vivos6,7.

Várias técnicas existem para a data para a criação de animações de computador. Simples animações de bidimensional (2D) geralmente derivam de uma foto de um estímulo, movendo-se em apenas duas dimensões e podem ser criadas com software comum como MS PowerPoint8 ou o Adobe After Effects9. Animações tridimensionais (3D) que exigem gráficos 3D mais sofisticados software de modelagem, habilitar o estímulo ser movido em três dimensões, aumentando as possibilidades de movimentos físicos realistas e complexo6,7 , 10 , 11 , 12. até mesmo a realidade virtual projetos que simula um ambiente 3D onde navegar animais vivos foram utilizados13,14. Em uma recente revisão Chouinard-Thuly et al 2 discutir estas técnicas um por um e destacar as vantagens e desvantagens em sua aplicação na investigação, que notavelmente depende do escopo do estudo e as capacidades visuais do animal test (ver "Discussão"). Além disso, Powell e Rosenthal15 dar conselhos sobre design experimental apropriado e que perguntas podem ser endereçados empregando estímulos artificiais na investigação do comportamento animal.

Desde a criação de animação por computador pode ser difícil e demorado, surgiu a necessidade de programas para facilitar e padronizar o processo de design de animação. Neste estudo, apresentamos o livre e open-source FishSim animação Toolchain16 (curto: FishSim; https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/), uma abordagem multidisciplinar que combina biologia e ciência da computação para resolver essas necessidades. Semelhante a anteriormente publicados ferramenta anyFish17,18, seguido do desenvolvimento do toolchain o objetivo de proporcionar a investigadores com um método fácil de usar para a implementação de estímulos 3D animados em experimentos com peixes. Nosso software é composto por um conjunto de ferramentas que pode ser usado para: (1) criar peixes virtuais 3D (FishCreator), (2) animar os caminhos de natação dos peixes virtuais com um controlador de vídeo game (FishSteering) e (3) organizam e apresentam pré-gravado animações em monitores para viver peixes focais (FishPlayer). Nosso conjunto de ferramentas fornece vários recursos que são especialmente úteis para testes em uma situação de escolha binária, mas também aplicável a outros projetos experimentais. Além disso, a animação possível de dois ou mais peixe virtual permite a simulação de empolamento ou namoro. Animações não são vinculadas a um estímulo específico, mas podem ser repetidas com outros estímulos, tornando possível alterar a aparência de um estímulo, mas mantendo seu comportamento constante. A natureza aberto o toolchain, bem como o fato de que é baseado no sistema de operação de robô ROS (www.ros.org), fornecem alta modularidade do sistema e oferecer possibilidades quase infinitas para incluir dispositivos de realimentação externo (como o controlador ou um sistema de rastreamento) e adaptar o toolchain às próprias necessidades em pesquisa. Além do sailfin molly, quatro outras espécies estão atualmente utilizáveis: o Atlântico molly Poecilia mexicana, o guppy Poecilia reticulata, a esgana – Gasterosteus aculeatus e um ciclídeo Haplochromis spp. Novas espécies podem ser criados em uma gráfica 3D, modelagem de ferramenta (por exemplo, liquidificador, www.blender.org). Para exemplificar o fluxo de trabalho com FishSim e para fornecer um protocolo sobre como conduzir um experimento de copi-escolha do companheiro com animação de computador, realizamos um estudo de caso com sailfin mollies.

Escolha do companheiro é uma das decisões mais importantes que os animais fazem na sua história de vida. Os animais desenvolveram diferentes estratégias para encontrar os melhores parceiros de acasalamento. Eles podem depender de informações pessoais quando avaliação potencial parceiros de acasalamento independente, possivelmente de acordo com preferências genéticas predeterminadas para uma certa característica fenotípica de19,20. No entanto, eles podem também observar a escolha do companheiro de coespecíficos e desse modo utilizar informação pública21. Se o observador, então, decide escolher o mesmo companheiro (ou o mesmo fenótipo) como o observado conspecific — o "modelo" — escolhido anteriormente, isto é chamado de companheiro-escolha copiar (doravante abreviado como MCC)22,23. Companheiro-escolha copiar é uma forma de aprendizagem social e, portanto, uma estratégia de escolha do companheiro não-independente,24, que tem sido observado em ambos os vertebrados25,26,,27,28, 29 e invertebrados de31,30,32. Até agora, MCC estudou-se predominantemente em peixe e é encontrado tanto em laboratório condições33,34,35,36,37,38 , como no selvagens39,40,41,42. Companheiro-escolha copiar é especialmente valioso para um indivíduo se dois ou mais potenciais parceiros de acasalamento são aparentemente similares em qualidade e uma escolha de companheiro "bom" — em termos de maximizar a adequação — é difícil fazer43. A qualidade de um modelo feminino se pode afetar se fêmeas focais copiar sua escolha ou não44,,45,46,47. Respectivamente, modelo "boa" ou "má" qualidade feminina tem sido atribuída a dela ser mais ou menos experientes na escolha do companheiro, por exemplo no que diz respeito a tamanho e idade44,,45,46, ou por ela ser um conspecific ou um heterospecific47. Em mollies sailfin que copiar a escolha do companheiro de coespecíficos39,,48,,49,50,51, verificou-se que as fêmeas focais mesmo copiar a rejeição de um macho52 . Desde que a MCC é considerado para desempenhar um papel importante na evolução de características fenotípicas, bem como a especiação e hibridização21,23,53,54, as consequências de copiar um " escolha falsa"pode ser tremenda em reduzir a aptidão do copiadora55. Se um indivíduo decide copiar a escolha de um outro indivíduo, é importante avaliar se o modelo observado é uma fonte confiável de informação, ou seja, que o modelo em si está fazendo uma "boa" escolha devido a ele ou ela ser bem experiente em companheiro escolha. Aqui surge a pergunta: que recursos visuais podem caracterizar um modelo fiável a copiem em fêmeas de sailfin molly?

Uma característica visual distinta no feminino sailfin mollies e outras Poecilia é o local gravid (também conhecido como 'anal spot', 'ninhada patch' ou 'ponto de gravidez'). Esta área Escuramente pigmentada na sua região anal deriva de melanização do tecido que reveste o ovário sac56. O tamanho e a presença da mancha gravid são variáveis em fêmeas coespecíficas e individualmente mais podem mudar durante a progressão de ciclos ovarianos56,57. Gravid manchas podem servir para atrair machos e facilitar a orientação de gonopodial para inseminação interno58 ou como um meio de publicidade fertilidade59,60. Considerando a ligação entre o local de gravid e status reprodutivo de uma fêmea, previmos que gravid local serve como um sinal de qualidade feminino modelo, fornecendo informações sobre seu estado atual de reprodução para observar as fêmeas focais. Nós investigamos duas hipóteses alternativas. Primeiro, se o local gravid é um sinal geral de maturidade, como previsto por Farr e Travis59, denota um modelo presumivelmente confiável e experiente em comparação com um modelo imaturo (sem o ponto). Aqui, as fêmeas focais são mais propensos a copiar a escolha de um modelo com uma mancha, mas não a de um modelo sem uma mancha. Segundo, se o local gravid marca não-receptividade devido já a desenvolver ninhadas, conforme predito por Sumner et al 60, o modelo é presumivelmente menos confiável, desde que as fêmeas não-receptivo seria consideradas menos exigentes. Neste caso, as fêmeas focais não copiará sua escolha senão a de modelos sem mancha. Até agora, o papel do gravid spot para MCC em fêmeas de sailfin molly tem nunca foi testado, nem manipulado experimentalmente.

Usamos o FishSim para executar um experimento MCC, apresentando estímulo virtual machos e fêmeas de modelo virtual em monitores de computador em vez de usar o estímulo ao vivo e modelo peixe como usado no procedimento experimental clássico49,50 ,,51,61. A usabilidade geral do nosso software anteriormente foi validada para testar hipóteses sobre a escolha do companheiro em sailfin mollies12. Aqui, nós testamos se a ausência ou a presença de uma mancha gravid em fêmeas de modelo virtual afeta a escolha do companheiro de observar as fêmeas focais ao vivo. Primeiro deixamos focais fêmeas se aclimatar ao tanque de teste (Figura 1.1) e deixe-os escolher entre dois machos diferentes estímulo virtual em um teste de escolha de imediato (Figura 1.2). Depois, durante o período de observação, o macho virtual prévio não-preferenciais foi apresentado junto com uma fêmea de modelo virtual (Figura 1.3). Em um teste de escolha de companheiro segundo subsequente, fêmeas focais escolheu novamente entre os machos mesmos (Figura 1.4). Analisamos se fêmeas focais tinham copiado a escolha do companheiro da fêmea modelo observado, comparando sua decisão de escolha do companheiro no primeiro e segundo teste escolha do companheiro. Realizamos dois diferentes tratamentos experimentais, no qual estamos manipulados visualmente a qualidade do sexo feminino modelo virtual. Durante o período de observação, também apresentamos o prévio não-preferenciais virtual macho (1) juntamente com uma fêmea de modelo virtual com uma mancha gravid (tratamento do "ponto"); ou (2) junto com uma fêmea de modelo virtual, sem uma mancha gravid (tratamento de "nenhum ponto"). Além disso, em um controle sem qualquer fêmea modelo, nós testamos se fêmeas focais escolheu consistentemente quando não públicas foram fornecidas informações.

Figure 1
Figura 1. Visão geral das etapas experimentais mais importantes para uma experiência MCC com estímulos de peixes virtuais. (1) período de aclimatação. (2) teste de imediato-escolha: ao vivo focal fêmea escolhe entre machos estímulo virtual. Período de observação (3) : fêmea focal observa o macho não-preferenciais prévio junto com uma fêmea de modelo virtual com mancha gravid. (4) escolha do companheiro-segunda teste: a fêmea focal novamente escolhe entre machos estímulo virtual. Neste exemplo, ela copia a escolha do modelo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Protocol

Os experimentos realizados e manipulação do peixe estavam em conformidade com a legislação de bem-estar Animal de alemão (Deutsches Tierschutzgesetz) e aprovaram pelo oficial de bem-estar animal interno Dr. Urs Gießelmann, Universidade de Siegen e o (autoridades regionais Kreisveterinäramt Siegen-Wittgenstein; De licença: 53,6 55-05).

1. peixes virtual Design

Nota: Encontre uma lista do necessário hardware e software na lista de materiais suplementares. Uma descrição detalhada da funcionalidade geral do FishSim e truques e dicas adicionais pode ser encontrada no Manual do usuário (https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain/).

  1. Preparação de texturas de corpo feminino com e sem mancha gravid
    1. Iniciar o GIMP e clique em arquivo >> abrir para abrir a imagem de textura do corpo feminino "PLF_body_6. png"da pasta modelos no diretório"fishsim_animation_toolchain". Use esta imagem como referência para todas as novas texturas de corpo feminino criado com mancha gravid. Selecione a área de mancha escura gravid do quadro de referência com a ferramenta Seleção livre e cortá-lo (clique em Editar >> cortar).
      Nota: GIMP (disponível em www.gimp.org) é uma foto gratuita ferramenta, semelhante ao Adobe Photoshop, que pode ser usado para manipular gráficos e imagens digitais de edição.
    2. Abra um segundo arquivo de textura do corpo feminino no GIMP (por exemplo, "PLF_body_7.png") e transferir a área local para a segunda textura corpo inserindo (Editar >> colar em) prévia corte área local como uma nova camada flutuante. Ajustar a posição do ponto gravid na segunda imagem e mesclar camadas clicando camada >> âncora camada.
      Nota: Certifique-se de que a área da mancha gravid tem o mesmo tamanho e posição idêntica em cada fêmea modelo virtual (Figura 2).
    3. Exportação (Editar >> exportar como) a nova textura "ponto" sob um novo nome (por exemplo, PLF_body_7_S. png) na pasta modelos . Fechar tudo abrir janelas de imagens no GIMP.
      Nota: Não faça quaisquer outras alterações (por exemplo, dimensionamento) para a textura de arquivos desde que eles são especificamente editados para ser posteriormente mapeados para os peixes 3D.
    4. Crie uma segunda textura corpo sem uma mancha gravid, usando o mesmo arquivo de textura original corpo feminino uma segunda vez (por exemplo, "PLF_body_7.png"). Agora, cobrir manchas gravid já existentes no arquivo original com a ajuda do GIMP.
    5. Abra a textura do corpo feminino no GIMP e selecione a ferramenta clone. Selecione o padrão da zona circundante abdominal (sem pigmentação escura) pressionando Ctrl + botão esquerdo do mouse e use esta seleção para cobrir a pigmentação escura existente por pintura por cima com a ferramenta clone (Figura 2).
    6. Exportar o recém-criado "nenhum pedaço" textura sob um novo nome (por exemplo, PLF_body_7_NS.png) na pasta modelos . Feche o GIMP.

Figure 2
Figura 2: fotos de Exemplar de corpo feminino texturas antes (original) e após a manipulação para o "ponto" e "nenhum ponto" tratamento usando a edição de imagens ferramenta GIMP. O círculo pontilhado marca a área que foi manipulada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Ajustando o ponto de vista e criar o "cenário" para animação
    1. Iniciar FishSim selecionando o ícone de FishSim no lançador no lado esquerdo da área de trabalho. Configurar a resolução para os monitores de apresentação e clique em Iniciar.
      Nota: Recomenda-se fazer os seguintes ajustes (passos 1.2.2\u20121.2.4) na tela de um dos monitores da apresentação (se monitor dimensões e resoluções diferem).
    2. Pressione F1 no teclado para alterar a visualização de modo para modo de edição (alternar entre a visualização e edição de modo pressionando repetidamente F1).
      Nota: Alternar para modo de edição permite a edição da barra de ferramentas na parte superior da janela. A cena, como visto no modo de visualização retrata o que será apresentado na tela durante os experimentos.
    3. Ajuste o ponto de vista para coincidir com as dimensões dos monitores da apresentação, ajustando o ângulo da câmera. Girar a câmera, segurando o botão esquerdo do mouse e mova o cursor. Pan-a câmera segurando o botão direito do mouse e movendo o cursor. Zoom in e out, mantendo do meio do mouse (ou os dois botões do mouse) e movendo o cursor.
    4. Clique em configurações de câmera na barra de ferramentas de edição (ícone da câmera) e clique em copiar para cam estático para definir o ponto de vista. Clique em arquivo >> salvar a cena para salvar a cena ajustada como a nova cena de padrão. Para isso, substituir o arquivo "default_scene.scene" na pasta do diretório FishSim de cenas .
      Nota: A cena padrão aparecerá em cada início de FishSim e como a cena inicial em FishPlayer. Em FishPlayer a cena padrão também serve como uma pausa durante experimentos (Figura 3A). Ajustando a cena tem de ser feito apenas uma vez.

Figure 3
Figura 3: imagens de uma cena em FishSim. (A) a cena padrão vazio sem peixe, (B) uma cena mostrando um macho sozinho, (C) uma cena mostrando aquele mesmo macho junto com uma fêmea de modelo com uma mancha e (D) uma cena mostrando o macho idêntico e o modelo idêntico feminino sem uma mancha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Projeto de um virtual estímulos masculino para apresentação durante os testes de escolha do companheiro
    Nota: Prepare-se estímulos masculinos virtuais que serão mais tarde animados e apresentados para viver focais fêmeas durante testes de escolha do companheiro.
    1. Se não já, abra e comece a FishSim. Pressione F1 para entrar no modo de edição.
    2. Clique em arquivo >> modelo de peixe de carga do menu drop-down e carregar o padrão masculino sailfin molly modelo "default_PLM.x", selecionando-o na pasta modelos.
    3. Esquerda clique duas vezes o peixe carregado para selecioná-lo. Ele será destacado em uma malha. Clique no ícone de engrenagem na barra de ferramentas para abrir o conjunto de ferramentas do peixe. Uma caixa irá aparecer com as opções de edição usadas para personalizar o macho virtual. Desmarque Mostrar malha para uma melhor visão do peixe.
    4. Altere o nome para masculino.
      Nota: O nome do macho é importante e representa o "papel" jogará mais tarde durante a animação. Esse nome deve ser idêntico para cada macho virtual recém-criado que será usado mais tarde durante os experimentos.
    5. Alterar a escala (dimensões) do sexo masculino, alterando os valores de x, y e z, se necessário e clique em aplicar.
    6. Edite a textura do macho clicando em Caixa de ferramentas editar texturas . Clique em uma característica dos peixes (corpo, dorsal, caudal) para alterá-lo.
      Nota: Escolha uma textura para caixa pop-up com todos os arquivos. png que podem ser usados como texturas. Texturas aparecerá com nomes como determinado na pasta modelos .
    7. Clique em uma textura exibida na lista (à direita), e diretamente irá aparecer e substituir a textura prévia sobre o peixe.
    8. Quando o macho desejado é criado, clique em aplicar sob configuração na Caixa de ferramentas editare clique em salvar peixes para o disco. Salve o novo macho como "Male_A.fish" na pasta modelos .
    9. Além disso, salvar toda a cena (arquivo >> salvar a cena) incluindo que um macho na pasta de cenas . Aqui, é recomendável usar o nome "Male_A_alone.scene" (Figura 3B).
    10. Clique em arquivo >> cena de carga para carregar a cena padrão vazio e repita etapas 1.3.2 para 1.3.9 como muitos machos virtuais diferentes, conforme a necessidade de criar e salvar cada um recém-criado masculinas sob um nome exclusivo na pasta modelos e como um novo cenário-arquivo em a pasta de cena .
  2. Design de modelo virtual feminino peixes para apresentação durante o período de observação
    1. Clique em arquivo >> cena de carga para carregar a cena padrão. Siga o passo 1.3.1 e clique arquivo >> carga modelo de peixe para carregar o modelo feminino de padrão "default_PLF.x" da pasta modelos .
    2. Esquerda clique duas vezes a fêmea carregada para selecioná-lo e abrir o conjunto de ferramentas do peixe. Altere o nome para "fêmea". Escala a fêmea se necessário conforme descrito na etapa 1.3.5.
      Nota: Nome e dimensionamento devem ser idênticos para todas as fêmeas para efeitos desta experiência.
    3. Substitua o "spot" criado anteriormente a textura do corpo feminino padrão-corpo textura (listada na caixa à direita), conforme descrito nas etapas 1.3.6 para 1.3.7.
    4. Clique em Apply em Config na Editar caixa de ferramentase, em seguida, salvar o peixe disco clicando em salvar e criar um arquivo "Female_1S.fish" (S = local).
    5. Clique em arquivo >> cena de carga para carregar a cena padrão. Repita as etapas 1.4.1 para 1.4.4 para criar pelo menos um (ou tantos quantos necessários) idêntico modelo feminino, mas sem o gravid local e o nome "Female_1NS.fish" (NS não = nenhum ponto). Salve cada peixe na pasta de modelos .
      Nota: Para o período de observação do experimento MCC, cenas, incluindo um macho e uma fêmea tem que ser criado e salvo.
    6. Clique em arquivo >> cena de carga para carregar a cena padrão vazio. Clique em arquivo >> modelo de carga peixe para inserir um macho virtual "Male_A.fish" da pasta modelos . Clique em arquivo >> modelo de peixe de carga novamente para adicionar o virtual modelo feminino "Female_1S.fish" para a cena. Altere a posição de cada peixe, alterando seus x-, y- e z-coordenadas para que seus corpos não se sobreponham.
      Nota: Exclua um peixe da cena clicando duas vezes sobre ele e pressionando Delete no teclado.
    7. Salvar a cena, incluindo o modelo feminino e masculino clicando arquivo >> cena salvar como "Male_A_with_Female_1S.scene" (Figura 3).
    8. Repita as etapas 1.4.6 a 1.4.7 para criar três cenas adicionais para: (1) Male_A com Female_1NS (ver Figura 3D), (2) Male_B com Female_1S e (3) Male_B com Female_1NS.

2. animação de estímulos de peixes virtuais

Nota: Cada tipo de animação que precisava para a experiência precisa ser preparado usando somente uma vez um exemplar masculina cena e cena uma observação exemplar (macho e fêmea juntos de animação). Durante o processo de animação, um caminho de natação para cada peixe é criado que pode depois ser repetido por qualquer peixe, desde que o nome é idêntico (consulte a etapa 1.3.4).

  1. Virtuais masculinas animações para apresentação durante os testes de escolha do companheiro
    Nota: Preparar duas animações de um macho virtual: (1) um caminho de natação com uma duração de 7,5 min e (2) um caminho de natação com a duração de 5 min.
    1. Conecte o controlador do jogo (por exemplo, Sony Play Station 3) na porta USB do computador operacional.
    2. Abra FishSim e clique em arquivo >> cena de carga para carregar a cena de um macho da pasta cenas, por exemplo, "Male_A_alone.scene". Inicie FishSteering clicando no ícone do FishSteering .
    3. Configure as definições do controlador em uma janela separada.
      Nota: FishSim e FishSteering executar simultaneamente e peixes podem ser dirigido em visualização de modo, conforme mostrado durante as experiências, ou no modo de edição, pressionando F1.
    4. Para animar o peixe (masculino), selecione-o no menu suspenso do painel do volante . Nomes de modelo aqui correspondem ao nome dado na Editar caixa de ferramentas (consulte a etapa 1.3.4).
    5. Clique em começar a colocar e usar o controlador para colocar o peixe em qualquer posição inicial no tanque virtual. Clique em parar a colocação.
    6. Começar a gravar o caminho de natação do peixe clicando Iniciar gravação. Use o controlador para mover os peixes ao redor da cena.
      Nota: A duração da gravação é dado no canto inferior direito do painel de direção.
    7. Clique em parar gravação. Clique em salvar para salvar o caminho de natação como um arquivo de .bag (um "registro") na unidade (por exemplo, na área de trabalho). Escolha o nome do arquivo para representar a duração do registro, por exemplo, "7_30_min_male_alone.bag".
      Nota: Uma vez que a gravação é interrompida, não é possível editar a duração total novamente.
    8. Edite a gravação para adicionar movimento da barbatana dorsal do macho para imitar o comportamento de corte masculino durante os testes de escolha do companheiro. Selecione o menu drop-down no recurso de Editar a barbatana dorsal (apenas um recurso pode ser editado por vez).
    9. Selecione iniciar edição e o caminho completo da natação serão reproduzidos. Pressione o botão L1 no controlador para levantar a nadadeira dorsal em pontos específicos no tempo. Clique em salvar para salvar a versão editada do caminho nadar como um novo . bolsa-arquivo.
    10. Repita as etapas 2.1.8 e 2.1.9 mas selecione as ferramentas para adicionar o seu movimento. Salve a versão final para uso posterior em FishPlayer. Fechar FishSteering.
      Nota: É aconselhável salvar arquivos-saco para cada etapa edição sob um nome exclusivo. Por isso, é sempre possível voltar para uma versão anterior da animação se algo durante o processo de edição errado.
  2. Animação virtual masculina e modelo feminina para apresentação durante o período de observação
    Nota: Prepare uma animação com um virtual macho e a fêmea modelo virtual em namoro, assim, sexualmente interagindo uns com os outros, com uma duração total de 10 min.
    1. Aberto FishSim. Pressione F1 para entrar no modo de edição e clique em arquivo >> cena de carga para carregar uma cena com masculino e feminino, por exemplo, "Male_A_with_Female_1S.scene". Comece a FishSteering.
    2. Selecione o sexo masculino e feminino alternadamente para colocá-los (clicando em Start/Stop colocação) no tanque virtual.
    3. Para a gravação, selecione o peixe fêmea primeiro do menu suspenso do painel volante e criar um caminho de natação com duração de 10 min, as seguintes etapas para 2.1.5 2.1.6.
      Nota: O caminho de natação de peixes apenas uma de cada vez pode ser gravado. Depois de animar o primeiro peixe, o caminho de natação dos peixes segundo pode ser incluído usando a função Editar enquanto o peixe previamente direccionais será reproduzido ao lado para toda a duração da animação.
    4. Clique em parar a gravação e salvar o caminho de natação na unidade, por exemplo, como "10_00_min_male_with_female.bag". Então sucessivamente edite do macho caminho de natação, movimento de barbatana dorsal e movimento de ferramentas conforme descrito nas etapas 2.1.8 a 2.1.10. Salvar a versão final para uso posterior em FishPlayer.

3. preparar listas de animação para o experimento MCC

Nota: Use FishPlayer para apresentar animações em dois monitores para viver fêmeas focais. Organize a lista de reprodução para cada monitor separadamente simular o procedimento do experimento MCC (Figura 1). A ferramenta consiste de uma janela principal, mostrando a lista de reprodução de disco para cada monitor (Figura 4) e uma janela de animação separado para cada monitor de apresentação.

  1. Funcionalidades gerais e a disposição das cenas e registros
    1. Feche todas as janelas e abra o FishPlayer clicando no ícone correspondente. Configurar a instalação para o uso com dois monitores para apresentação (esquerda e direita) e clique em Iniciar.
      Nota: A cena padrão criada na etapa 1.2.4 (salvo em scenes/default_scene.scene) sempre será carregada e exibida em ambos os monitores, como a cena inicial e durante um comando de pausa.
    2. Adicione entradas à lista de reprodução para cada monitor separadamente. Clique em Adicionar carga cena para adicionar a cena de , por exemplo, A masculino, da pasta no diretório FishSim de cenas . Clique em Adicionar jogar o registro para adicionar um registro da unidade, por exemplo, o registro de 7,5 min para um macho sozinho.
      Nota: A cena e o registro a seguir serão então vinculados pelo software e o macho virtual retratado na cena será animado conforme definido no registro correspondente.
    3. Clique em Adicionar pausa para adicionar um comando de pausa de duração específica (minutos/segundos), mostrando a cena padrão sem peixe como uma pausa para peixes manipulação entre os registros.
      Nota: Duração da pausa geralmente deve depender do tempo necessário para a manipulação de peixes. Clique em uma entrada e arraste para alterar a sua ordem na lista. Entradas selecionadas são marcadas em vermelho. Excluir uma entrada da lista de reprodução, selecionando a entrada e clicando em Excluir seleção.
    4. Clique em Reproduzir/parar para iniciar e interromper uma apresentação. Pare sempre terminará o playlist completo, por exemplo, lá não é nenhuma maneira de fazer uma pausa no meio de uma lista de reprodução uma vez em execução.
      Nota: Listas de reprodução serão sempre iniciar a partir da primeira entrada e executados de cima para baixo. Portanto, a ordem correta de todas as entradas deve ser definido antes do experimento e não pode ser alterada depois sem parar a apresentação. Um timer na parte inferior da janela mostra a duração e o tempo real da atual lista de reprodução.
  2. Arranjo de playlist para os dois tratamentos e o controle do experimento MCC
    Nota: Em termos do arranjo de entrada, a experiência da MCC é dividida em duas partes: (1) o teste de escolha de imediato e (2) o período de observação, seguido pelo teste de segunda escolha do companheiro. Portanto, para cada tratamento e o controle, listas de reprodução tem que ser organizados em duas ordens diferentes.
    1. Ao executar o experimento, em primeiro lugar, prepare uma lista de reprodução para o teste de escolha de imediato.
    2. Em segundo lugar, no processo de execução experimento, altere a organização da lista de reprodução para o período de observação posterior e o segundo teste de escolha de companheiro, segundo a qual o macho virtual foi preferido pela fêmea focal no teste imediato-escolha.
  3. Arranjo de playlist específica para o tratamento do "ponto"
    1. O teste de imediato-escolha no tratamento 1, ordenar a lista de reprodução exatamente como está representada na Figura
    2. Após o teste de escolha de imediato, fazer pausa para calcular qual macho virtual foi preferido (consulte a etapa 5.9 abaixo). Então Reorganize as listas de reprodução para o período de observação, em que informação pública é fornecida para a fêmea focal, mostrando o macho não-preferenciais prévio junto com a fêmea de modelo.
    3. Organize a lista de reprodução para a observação e o segundo teste de escolha de companheiro seguinte de acordo com a Figura 5.
    4. Para o período de observação, vincule o registro 10-min (masculino e modelo feminino junto) com uma cena mostrando o prévio preferido masculino em paz.
      Nota: Neste caso, será exibido apenas o caminho de natação do macho e, porque o está faltando na cena, a fêmea modelo virtual estarão ausente.
    5. Para a lista de reprodução com o macho não-preferenciais, link do registro 10-min à cena, incluindo o macho não-preferenciais prévio junto com a fêmea de modelo. Escolha as cenas, incluindo uma fêmea modelo com uma grávida mancha (S) para este tratamento.
      Nota: Em contraste com 3.3.2, aqui, o registro idêntico será reproduzido, mas agora a fêmea modelo é visível.

Figure 4
Figura 4: captura de tela mostrando as listas de reprodução do FishPlayer para os monitores esquerdos e direito na primeira parte (i. e., a escolha de imediato teste) do experimento MCC. Entradas de lista de reprodução são ordenadas conforme necessário para o teste de escolha de imediato em tratamento 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Screenshot mostrando as listas de reprodução do FishPlayer para os monitores de esquerda e direito na segunda parte (período de observação e segundo teste de escolha de companheiro) do experimento MCC. Entradas de lista de reprodução são ordenadas conforme necessário para o período de observação e o segundo teste de companheiro-escolha no tratamento 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Arranjo de lista de reprodução específica para o tratamento de "nenhum ponto"
    1. Para o tratamento 2, ordenar as listas de reprodução conforme descrito para o tratamento 1 (figuras 4 e 5), mas em vez disso, use a cena, incluindo a fêmea modelo virtual, sem uma mancha gravid (NS) durante a observação.
  2. Arranjo de playlist específicas para o controle de coerência de escolha
    Nota: No controle para a consistência da escolha, entradas de lista de reprodução para o teste de escolha do companheiro são idênticas aos tratamentos 1 e 2 (Figura 4). Durante o período de observação, no entanto, nenhuma informação pública é fornecida às fêmeas focais e, portanto, nenhuma fêmea modelo é visível.
    1. Ordenar as listas de reprodução, conforme mostrado na Figura 5 , mas combinar as cenas para cada macho sozinho junto com o registro de 10 min.
      Nota: Neste caso, será exibido apenas o caminho de natação dos peixes machos e, porque o está faltando na cena, a fêmea modelo estarão ausente em ambos os lados.

4. experimental Setup

  1. Lugar dois computador telas cada um em lados opostos de um tanque de testes. Ajuste as telas para cobrir a maior parte das paredes de vidro do tanque teste e ter 1,5 cm de espaço entre as telas e as paredes do tanque. Fornece a iluminação para o tanque de cima.
  2. Cubra o fundo do tanque com uma fina camada de cascalho e preenchê-lo com água adequada para peixes vivos para a altura das telas. Marca uma zona de escolha com uma linha vertical na profundidade de 20 cm de cada extremidade do lado de fora do tanque. Um cilindro de vidro acrílico e dois cronómetros ter à mão.
  3. Conecte os monitores para a alimentação e o computador operacional, colocado pelo menos 1 m longe do tanque de teste, por exemplo, em uma pequena mesa (Figura 6).

Figure 6
Figura 6: configuração Experimental para o experimento MCC com animação de computador. O funcionamento do computador se conecta a dois monitores de apresentação (Monitor 1 e 2) que animações para viver focais fêmeas dentro do tanque de teste de repetição. Para ilustração, ambos os monitores LCD são dobrados para mostrar uma cena animada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. executar o experimento MCC

Nota: Siga o procedimento abaixo para realizar uma avaliação do tratamento 1, tratamento 2 ou o controle do experimento MCC, usando uma fêmea focal ao vivo (ver Figura 1).

  1. Abra o FishPlayer no computador operacional e organizar as listas de reprodução para o teste de escolha de imediato , como por exemplo, descrito para o tratamento 1 (Figura 4). Verifique se estão executando os monitores para apresentação e que eles estão mostrando a cena padrão vazio.
  2. Coloque uma fêmea focal ao vivo no interior do depósito de teste. Deixe-a nadar livremente e se aclimatar o tanque e a apresentação dos tanques vazios em ambos os monitores, por um período de 20 min.
  3. Após aclimatação, coloque a fêmea focal em um cilindro de acrílico transparente no meio do tanque de teste para garantir uma distância igual para ambos os monitores e executar as listas de reprodução em ambos os monitores simultaneamente clicando em jogar, começando com a escolha de imediato teste.
    Nota: A fêmea focal é autorizada a assistir os dois machos de estímulo virtual de dentro do cilindro para em torno de 2,5 min.
  4. Antes do cronômetro atinge 02:30 min, vá devagar para o tanque experimental e liberar a fêmea focal do cilindro levantando suavemente-em linha reta fora da água, por exemplo, às 02:15 min.
    Nota: Aqui, o tempo exato depende da distância do computador operacional para o tanque de testes e deve ser determinada durante execuções de teste prévio. É fundamental agir lentamente e suavemente para evitar salientando o peixe. Desde que o peixe pode agir muito rápido, é aconselhável já ter um cronômetro na mão enquanto liberando a fêmea para iniciar diretamente medindo o tempo de associação (ver passo 6.1).
  5. Retornar para o funcionamento do computador. Observar a fêmea focal e ter dois cronómetros na mão para tempo de associação de medida com cada macho estímulo virtual (consulte a etapa 6.1).
    Nota: A fêmea focal é permitida nadar livremente e escolher entre dois machos por 5 min.
  6. Pare de medir o tempo de associação quando o temporizador chega a 07:30 min. A entrada de pausa então correrá por 1,5 min. Use a pausa como manipulação de tempo para, mais uma vez, coloque a fêmea focal dentro do cilindro e anote o tempo para cada macho virtual em uma folha de dados.
    Nota: Após a pausa, a segunda 07:30 entrada minutos vai começar e a fêmea focal pode assistir dois machos por 02:30 minutos. Posição masculina agora é alternada entre esquerda e direita para controlar para um viés de lado possíveis nas fêmeas focais (consulte a etapa 6.3).
  7. Antes do cronômetro atinge 11:30 min, liberar a fêmea focal do cilindro. Tempo de associação de medida para o próximos 5 min.
  8. Pare de medir o tempo de associação quando o temporizador chega a 16:30 min. A entrada de pausa terá a duração de 1 min. uso este tempo de manuseio para colocar a fêmea focal dentro do cilindro.
  9. Anote vezes Associação para a segunda medição. Para cada macho, resumir vezes Associação de ambas as metades do teste imediato-escolha (antes e depois os machos foram trocados). Calcular se a fêmea focal tinha um preconceito de lado e o macho que foi preferido pela fêmea focal (consulte etapas 6.1 a 6.3).
    Nota: Nenhum problema se a pausa é terminada antes que o cálculo é feito, desde que prosseguir para o próximo passo precisa o playlist para alcançar seu fim e parar.
  10. Reorganizar as listas de reprodução (fazer não fechar FishPlayer!) como mostrado na Figura 5 (dependendo do tratamento atual) para que o prior preferido masculino será animado em paz durante o período de observação e o macho não-preferenciais prévio será animado juntamente com o modelo virtual feminino.
    Nota: As alterações feitas para as listas de reprodução não são visíveis para a fêmea focal.
  11. Clique em jogar para continuar que a segunda parte do experimento e as entradas será repetida de cima para baixo, começando com o período de observação de 10 min.
    Nota: Durante o período de observação, a fêmea focal permanece no interior do cilindro, mas é capaz de assistir as duas apresentações.
  12. Após o período de observação, uma pausa de 0,5 min começa. Antes do cronômetro atinge 10:30 min, liberar a fêmea focal do cilindro e começar a segunda escolha do companheiro - teste com o recorde de 5 min para cada macho. Medir os tempos de associação para o próximos 5 min.
  13. Pare de medir o tempo de associação quando o temporizador chega a 15:30 min. A entrada de pausa então correr 1,5 min. lugar a fêmea focal dentro do cilindro e anote o tempo medido para cada macho virtual.
    Nota: Após a pausa, o próximo 07:30 min entrada começará e a fêmea focal podem assistir dois machos (cuja posição novamente alternou entre esquerda e direita) para 2,5 min.
  14. Antes do cronômetro chega 19:30 min, liberar a fêmea focal do cilindro e medir o tempo de associação para o último 5 min.
  15. Pare de medir o tempo de associação quando o temporizador chega a 24:30 min e encerrar o experimento. Anote as vezes de associação para os dois machos virtuais e prosseguir com a análise.

6. medição de dados

  1. Medir o tempo de associação durante a primeira e a segunda parte (antes e depois de estímulos são comutados) de cada teste escolha do companheiro, quando a fêmea focal é permitida escolher entre os dois machos.
    Nota: Começa a medir quando a fêmea cruza a linha de confinar a zona de escolha com a cabeça e o opérculo. Pare quando a cabeça e o opérculo estão fora da zona de escolha de medição.
  2. Resumir a associação tempo medido para cada macho na primeira e segunda parte de um teste de escolha de companheiro e determinar qual macho foi preferido.
    Nota: O macho preferencial é determinado como a que a fêmea focal gastou mais de 50% do tempo total que ela passou em ambas as zonas de escolha dentro de um teste de escolha do companheiro. Para análise, tempo de associação é muitas vezes traduzido em golo de preferência (escolha do companheiro valor relativo), que é definido como o tempo passou de uma fêmea focal com um macho dividido pelo tempo que passou com os dois machos nas zonas de escolha do companheiro.
  3. Calcule se fêmeas focais mostram um viés de lado durante o teste de escolha de imediato e excluem as fêmeas tendenciosas da análise final.
    Nota: As fêmeas focais são consideradas preconceituosos lado se gastaram mais de 90% do tempo total (as duas metades do teste imediato-escolha) na mesma zona de escolha, mesmo após a posição masculina foi trocada. Sua escolha para um macho é então considerada como o lado tendencioso e o julgamento é finalizado.
  4. Medir o comprimento do cada fêmea focal padrão (SL).
    Nota: Para impedir que o peixe ser salientado durante experimentos, sempre medições após a cessação de um ensaio experimental.

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Representative Results

Seguindo o protocolo, usamos FishSim para criar animações de computador de virtual sailfin molly machos e fêmeas. Ainda usamos o toolchain para apresentar animações para viver fêmeas focais em uma situação de escolha binária para executar um experimento MCC, de acordo com o procedimento experimental descrito na Figura 1 e a etapa 5 do protocolo.

A fim de determinar se as fêmeas focais copiado a escolha da fêmea modelo virtual, medimos o tempo de associação um focal da fêmea para cada macho dentro do primeiro e segundo teste de escolha de companheiro durante os experimentos. Vários parâmetros são normalmente analisados usando o tempo de associação, obtido a primeira e o segunda escolha do companheiro-teste para cada tratamento e o controle para a consistência da escolha. Como os dados estão sendo analisados não está vinculado a um teste estatístico específico, mas pode ser feito de várias maneiras (por exemplo, paramétrica/não-paramétricos testes, medidas repetidas ANOVA, modelos estatísticos) e pode depender da estrutura de dados final. Para nossa análise de dados, foi utilizado R 3.2.262. Estamos carregados os dados brutos que obtivemos em nosso experimento, bem como o R-código que usamos para nossa análise para Figshare (doi: 10.6084/m9.figshare.6792347).

No estudo atual, criamos 15 fêmeas modelo virtual diferente com uma grávida mancha para tratamento 1 e idêntico modelo 15 fêmeas, sem um lugar para tratamento 2. Todas as fêmeas modelo tinham um virtual comprimento padrão (CP) de 50 mm. A área local gravid relativa foi 4,7% da superfície total do corpo (excluindo as barbatanas; medida com ImageJ v1.51j8) para todas as fêmeas em 1 tratamento. Além disso, criamos 30 machos de diferentes estímulos virtual apresentados durante os testes de escolha do companheiro, permitindo a 15 pares de estímulos masculino exclusivo. Estímulo os machos tinham um SL virtual entre 41-45 mm. Realizamos 15 ensaios para cada tratamento e o controle para a consistência da escolha. Nós testamos um número total de descendente de 55 fêmeas focal ao vivo de mollies sailfin selvagens capturados Mustang ilha perto de Corpus Christi, Texas, EUA, em 2014. Todas as fêmeas focais eram adultos maduros e foram testadas apenas uma vez. Duas fêmeas tinham que ser excluído devido a problemas técnicos durante o teste. Uma mulher foi excluída devido ao estresse, uma vez que ela não se aclimatar à situação de teste e estava com muito medo de entrar de qualquer zona de escolha. O controle para o preconceito de lado em peixes focais (etapa de protocolo 6.3) necessário que excluímos mais sete fêmeas de análise final devido a sua tendência de lado no teste imediato-escolha. No total, foram analisados um total de n = 15 fêmeas focais para cada tratamento e o controle. Focais fêmeas tinham uma média SL de 32 ± 5 mm no tratamento 1, 33 ± 5 mm no tratamento 2 e 33 ± 3 mm no controle para a consistência da escolha. Comparamos o comprimento padrão (CP) de focais fêmeas através de tratamentos e o controle usando um teste de soma de classificação de Kruskal Wallis para revelar dados independentes que SL não diferiu entre tratamentos e o controle (teste de Kruskal Wallis classificação soma: n = 45, df = 2, χ2 = 0.329, p = 0.848).

O mais importante parâmetro medido em um experimento MCC é tempo de associação focal da fêmea para cada macho (etapa 6.1 do protocolo). Tempo de associação é uma medida indireta da preferência fêmea companheiro no peixe63,64,,65,66 e uma medida bem estabelecida para determinar a escolha do companheiro em mollies sailfin quando não há contato direto é desde12,,48,61,67,68. Para cada tratamento e o controle, usamos primeiro tempo de associação para analisar se a motivação escolha diferia entre os testes de escolha do companheiro. Escolhendo a motivação é definida como o tempo total que uma fêmea focal gasto em ambas as zonas de escolha dentro de um teste de escolha de companheiro. No entanto, uma mudança na escolha de motivação não reflete necessariamente uma mudança na preferência para qualquer macho. Se escolher a motivação é significativamente diferente entre os dois testes de escolha do companheiro é obrigatório o uso de escores de preferência em vez de tempo absoluto associação, para posterior análise assegurar a comparabilidade dentro e entre os tratamentos (ver protocolo passo 6.2 ). Em nosso estudo, escolhendo a motivação de fêmeas focais antes e após a observação de uma fêmea de modelo virtual sexualmente interagindo com um macho não diferiram no tratamento 1 (Wilcoxon assinou classificação teste: n = 15, V = 44, p = 0.379) e no controle para escolha (de consistência Wilcoxon assinou classificação teste: n = 15, V = 42, p = 0,33). No entanto, escolhendo a motivação foi significativamente maior após a observação de uma fêmea de modelo virtual sem mancha gravid sexualmente interagindo com um macho no tratamento 2 (Wilcoxon assinou classificação teste: n = 15, V = 22, p = 0,03).

O mais importante determinante de se ocorreu o MCC é um aumento significativo em contagens de tempo gasto/preferência para o macho não-preferenciais prévia do primeiro para o segundo companheiro-escolha teste22. Transferido para uma situação natural, um aumento no tempo gasto com o macho prévio e não-preferenciais, consequentemente aumenta a probabilidade de que uma fêmea poderá acasalar com o macho. Portanto, a principal análise comparada as vezes absolutas ou o golo de preferência para o macho não-preferenciais prévio entre os dois testes de escolha do companheiro. Esta análise tem de ser feito para cada tratamento e o controle separadamente. Desde que, em nosso estudo, escolha motivação diferem no tratamento 2, usamos o golo de preferência para o macho de estímulo inicialmente não-preferenciais, em vez de tempo de associação absoluto, para determinar se essas pontuações alterados entre a primeira e segunda escolha-companheiro teste quando foi fornecida informação pública, em comparação com o tratamento de controle em que a informação pública estava ausente.

Por isso, nos encaixamos um modelo linear misto efeito (LME) com a função de lme desde o pacote 'nlme'69 com pontuação de preferência para o macho não-preferenciais prévia (pref_NP) como a variável dependente. Incluímos o teste de escolha de companheiro (Mtest: M1, M2) e tratamento (tratamento: não spot, nenhuma mancha, controle) como fatores fixos, bem como o comprimento focal da fêmea padrão (SL) como uma co-variável. Para explicar a concepção de medidas repetidas, focal feminina identidade (ID) foi incluída como um fator aleatório. Nós estamos especialmente interessadas em se o efeito da escolha do companheiro teste foi diferente entre os tratamentos; Portanto, incluímos uma interação entre a escolha do companheiro teste e o tratamento em nosso modelo. Realizamos duas comparações ortogonais para "tratamento" usando a função contrastes70. Vamos definir os contrastes do modelo (1) para comparar o controle contra a média de todos os tratamentos em que qualquer modelo virtual fêmea foi apresentada durante a observação [controle >> (in loco, nenhum ponto)] e (2) para comparar o tratamento mostrando um modelo virtual feminino com ponto contra isso sem um ponto (ponto >> nenhum ponto). Uma trama dos resíduos padronizados fator contra os valores cabidos revelou auto-regressão das variâncias residuais para "Mtest". Portanto, incluímos uma função de pesos usando a classe varIdent da função lme para permitir variações diferentes para cada nível de "Mtest"71,72. Usamos o pacote R 'phia'73 para uma análise post hoc com correção de Bonferroni Holm de termos de interação significativa. Nós inspecionados suposições modelo (Q/Q-plots, resíduos, resíduos contra valores equipadas) para todos os modelos visualmente74. Comparou-se ainda mais a distribuição dos resíduos contra uma distribuição normal usando testes de normalidade de Shapiro-Wilk. Os p-valores fornecidos foram considerados significativos se p ≤ 0,05.

Os resultados desta análise são apresentados na Figura 7A e tabelas 1 e 2. Encontramos uma interação significativa entre M2 e o contraste "[controle >> (in loco, nenhum ponto)]" para os escores de preferência do macho não-preferenciais prévio (LME: df = 42, t =-2.74, p = 0,009). No entanto, contagens de preferência não foram afetadas pela focal SL feminino. Ainda mais a análise post hoc do termo interação revelou uma diferença significativa dos escores de preferência do macho não-preferenciais prévio em M2 no tratamento 1 (local: df = 1, χ2 = 30.986, p < 0,001) e tratamento 2 (nenhum ponto: df = 1, χ2 = 19,957, p < 0,001), mas não para o controle (χ2-teste: df = 1, χ2 = 2.747, p = 0.097). Aqui, nossos resultados demonstram que, como previsto para a MCC, partituras de preferência para o prévio não-preferenciais virtual macho aumentada significativamente de M1 M2, depois focais fêmeas foram apresentadas com a escolha do companheiro simulado de uma fêmea de modelo virtual. Encontramos este efeito em ambos os tratamentos, mas não no controle para a consistência da escolha. Em vez disso, no controle onde nenhuma fêmea modelo esteve presente durante o período de observação, focais fêmeas foram consistentes em sua escolha de companheiro para um macho.

Fatores Baixa Estimativa Superior SE DF t-valor p-valor
(Interceptar) 0,046 0.339 0.632 0,145 42 2.336 0,024
M2 0.207 0,296 0,384 0,044 42 6.750 < 0,001
Controle → (in loco, nenhum ponto) -0.041 -0.012 0,017 0,014 41 -0.852 0.4
Não manchar → nenhum ponto -0.093 -0.043 0,008 0.025 41 -1,715 0.094
SL -0.012 -0.003 0,006 0,004 41 -0.747 0.459
M2 x [controle → (in loco, nenhum ponto)] -0.148 -0.085 -0.023 0,031 42 -2,743 0,009
M2 x (não local → nenhum ponto) -0.067 0.042 0.15 0.054 42 0.777 0.441

Tabela 1. LME estima pelos efeitos no golo de preferência para o macho virtual prévio não-preferenciais. Pontuação de preferência para o prior não-preferenciais virtual masculino estímulo foi a variável dependente em todo. Dado são estimativas ± erro-padrão e intervalos de confiança inferior/superior, graus de liberdade, valores de t e p-valores para cada fator fixo. Estimativas de interceptação representam a grande média de todos os tratamentos. Ortogonais comparações dos tratamentos são dadas. Se os tratamentos são combinados entre parênteses, valores médios destes tratamentos são utilizados nas comparações. A categoria de referência de interceptação para o fator "M2" é "M1". P-valores significativos (p < 0,05) são impressas em negrito. M1 = teste imediato-escolha, M2 = teste de segunda escolha do companheiro, SL = comprimento padrão de fêmeas focais. 90 observações com n = 15 fêmeas focais por tratamento.

Fator aleatório Variação SD
ID ((intercepção)) 1.464x10-10 1.21x10-5
Residual 1.859x10-2 0.1364

Tabela 2. Componentes de variância LME para focal identificação feminino. Variância e desvio padrão para o efeito aleatório "focal feminino ID" e os resíduos são dadas.

Figure 7
Figura 7: resultados do MCC virtual experiência manipulação modelo feminino qualidade pelo visual ausência ou presença de uma mancha de grávida. (A) preferência Partituras para o macho (prévia) estímulo virtual não-preferenciais em M1 e M2 para tratamentos e o controle. (B) mudança de preferência de M1 M2 (copiando Pontuação) para a prévia não-preferenciais virtual macho nos tratamentos e no controle. A linha pontilhada não mostra nenhuma mudança na preferência, valores positivos mostram um aumento na preferência e valores negativos mostram uma diminuição na preferência. Cinza pontos em A e B descrevem dados brutos de cada fêmea focal. (C) número de reversões de escolha do companheiro em M2 para cada tratamento e o controle. M1 = teste imediato-escolha, M2 = segundo teste de escolha de companheiro, ns = não significativo, * = p < 0.05, * * = p < 0,01, * * * = p < 0,001. N = 15 para tratamentos e o controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para obter informações adicionais sobre se um efeito de copiar pode ser mais ou menos forte, dependendo o respectivo tratamento, foi uma comparação entre copiar partituras e o número de reversões de companheiro-escolha entre os diferentes tratamentos e o controle conduzido. Portanto, analisamos mais se copiar Partituras para o macho não-preferenciais prévia eram diferentes através de tratamentos. A pontuação de cópia para um macho descreve a mudança na preferência feminina para um macho do primeiro para o segundo teste de escolha do companheiro. A pontuação de cópia é definida pelo placar de preferência de um macho no teste de segunda escolha do companheiro-menos o resultado de que mesmo do sexo masculino no teste de imediato-escolha. Golo de copi variam entre -1 e + 1 e pode ser positivas ou negativas de valores em que valores negativos descrevem uma diminuição de valores positivos e de preferência um aumento na preferência por aquele macho. Aqui, nós nos encaixamos um LME com a cópia de Pontuação (copy_NP) como a variável dependente, o tratamento como um fator fixo, focal SL feminino como uma covariável e área de ponto focal da fêmea como um fator aleatório. Aqui, foi realizado as mesmas duas comparações ortogonais para "tratamento" como descrito acima.

Como mostramos na Figura 7B e tabelas 3 e 4, encontramos um significativamente maior copiando o placar para o macho não-preferenciais prévio em tratamentos com uma fêmea de modelo virtual em comparação com o controle (LME: df = 20, t =-2.833, p = 0,01), mas não significativa diferença entre os tratamentos (LME: df = 20, t = 0.618, p = 0.544). Golo de cópia não foram afetados pela focal SL feminino.

Fatores fixos Baixa Estimativa Superior SE DF t-valor p-valor
(Interceptar) -0.889 -0.081 0.727 0.389 21 -0.208 0.837
Controle → (in loco, nenhum ponto) -0.153 -0.088 -0.023 0,031 20 -2.833 0.01
Não manchar → nenhum ponto -0.079 0.033 0.146 0.054 20 0.618 0.544
SL -0.013 0.011 0,035 0.011 20 0.991 0.333

Tabela 3. LME estima para efeitos em copiar Partituras para o macho virtual prévia não-preferenciais. Copiar Pontuação para o prior não-preferenciais virtual masculino estímulo foi a variável dependente em todo. Dado são estimativas ± erro-padrão e intervalos de confiança inferior/superior, graus de liberdade, valores de t e p-valores para cada fator fixo. Estimativas de interceptação representam a grande média de todos os tratamentos. Ortogonais comparações dos tratamentos são dadas. Se os tratamentos são combinados entre parênteses, valores médios destes tratamentos são utilizados nas comparações. P-valores significativos (p ≤ 0,05) são impressas em negrito. SL = comprimento padrão de fêmeas focais. 45 observações com n = 15 fêmeas focais por tratamento.

Fator aleatório Variação SD
spot_area ((intercepção)) 0,028 0,166
Residual 0,075 0.275

Tabela 4. Componentes de variância LME para área de ponto focal feminino. Variância e desvio padrão para o efeito aleatório "spot_area" e os resíduos são dadas.

Além disso, nós testamos se o número de fêmeas focais que inverteu sua preferência inicial companheiro em M2 diferiu entre tratamentos. Reversão de escolha do companheiro é definida como se há uma mudança na preferência por um macho (de menos de 50% a mais de 50% do tempo em ambas as zonas de escolha) do primeiro para o segundo teste de escolha do companheiro. Reversão de escolha do companheiro é contado como um "Sim" (mudou de preferência por um macho) ou um "não" (preferência por um macho não mudar). Aqui, realizamos um post hoc pairwise G-teste usando o R 'RVAideMemoire'75 com correção para múltiplo testes do pacote. Como mostramos na Figura 7, onze de 15 fêmeas focal inverteu sua escolha do companheiro no tratamento 1 e dez fêmeas inverteu sua escolha do companheiro no tratamento 2. Por outro lado, observou-se apenas duas reversões no controle. Desse modo, o número de fêmeas focais que inverteu sua escolha inicial do companheiro em favor o macho não-preferenciais prévia em M2 foi significativamente maior em ambos os tratamentos em comparação ao controle (post hoc G-teste emparelhadas: Spot vs controle, p = 0,002; não mancha vs controle, p = 0,003) mas não significativamente diferentes entre os tratamentos 1 e 2 (G-teste Post-hoc emparelhadas: mancha vs sem mancha, p = 0,69).

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Discussion

O local gravid em fêmeas de sailfin molly foi descrito anteriormente, para servir como meio de propaganda de fertilidade para machos coespecíficas59,60. Se um ponto gravid pode também fornecer informações às fêmeas coespecíficas no contexto da escolha do companheiro não tinha sido testado até agora. O presente estudo de caso, investigamos o papel potencial de um ponto de gravid como fonte de informação pública para observar as fêmeas coespecíficas no contexto da MCC. Nosso estudo mostra que o ponto gravid parece não ser um sinal de modelo feminino qualidade para fêmeas focais ao vivo quando decidir copiar a escolha do companheiro de uma fêmea de modelo virtual para um macho virtual. As fêmeas focais copiado a escolha de uma fêmea de modelo virtual para um macho de virtual prévia não-preferenciais, independentemente de se a fêmea modelo tinha uma mancha grávida ou não. Nós não encontramos nenhuma diferença em copiar partituras nem o número de reversões de companheiro-escolha entre os dois tratamentos, indicando que o efeito cópia também foi igualmente forte, se a fêmea modelo tinha uma mancha grávida ou não. Quando não públicas foram fornecidas informações no controle (nenhuma fêmea modelo presente), focais fêmeas foram consistentes em sua escolha do companheiro. Isto suporta que a mudança observada, de preferência dentro de tratamentos pode ser explicada pela presença da fêmea modelo virtual apenas, fornecendo informações públicas suficientes para copiar a escolha do companheiro de outros.

Apesar da presença geral e a extensão da mancha gravid são considerados para ser ligada ao ciclo reprodutivo feminino, com o ponto sendo maior antes do parto e menor ou ausente após dar à luz,60, observações sistemáticas de visuais do desenvolvimento de gravid manchas nas fêmeas individuais ainda estão desaparecidos. Além disso, variação no tamanho de ponto gravid pode ser elevada entre fêmeas individuais com manchas também ser completamente ausente em fêmeas maduras, gravid60. Apesar de sailfin molly fêmeas são mais receptivo curto após parto59,76, eles são capazes de armazenar esperma por vários meses57. Portanto, fêmeas devem sempre ser exigentes para o melhor amigo de qualidade. Com relação ao nosso estudo de caso na MCC e as hipóteses testadas, podemos concluir que uma grávida mancha não pode ser um indicador válido do modelo feminino qualidade observando coespecíficas fêmeas. Informações sobre a situação reprodutiva de uma fêmea de modelo que uma fêmea observando possivelmente poderia ganhar parecem não ser importante na decisão de copiar escolha dela ou não, pelo menos entre sailfin mollies.

Notadamente, nosso estudo demonstra um procedimento altamente padronizado para manipulação visual do públicas informações fornecidas na MCC experimentos usando peixe animado. Em contraste com um estudo mais adiantado por Benson77, que injetou peixe vivo com tinta de tatuagem para manipular gravid pontos, nosso método fornece uma alternativa completamente não-invasivo para manipulação visual. Descrevemos em detalhes o procedimento sobre como criar e animar virtual sailfin mollies em FishSim. Ainda mais, mostramos como a animação de computador pode ser usada para adotar o procedimento experimental de um clássico MCC experimentar com peixes virtuais para a apresentação para peixes de teste ao vivo em uma situação de escolha binária.

Seguindo o protocolo, podemos identificar várias etapas críticas que necessitam de atenção específica para assegurar a manipulação correta de nosso conjunto de ferramentas e o sucesso do experimento. Desde animações de computador são criadas e apresentadas usando computadores e dispositivos de exibição como monitores de computador, o equipamento técnico sempre deve ser bom o suficiente para garantir um liso processamento de fluxo de trabalho geral e, mais importante ainda, a reprodução da animação (etapas 2, 3 e 5). Ao usar dois ou mais monitores para apresentação dos estímulos, suas especificações técnicas devem ser idênticas. Ao usar o nosso software, a resolução do monitor de conjunto deve ser sempre que da apresentação monitores (consulte a etapa 1.2.1.). Definindo a cena (etapa 1.2.), bem como o design (passos 1.3. e 1.4.) e animação (passo 2) de estímulos virtuais sempre deve ser feita em um monitor mais tarde utilizado para apresentação de estímulo durante as experiências para garantir as dimensões corretas.

Neste protocolo, concentremo-nos sobre os passos necessários para criar um conjunto de estímulos de peixe (passos 1.3. e 1.4.) para uso em um julgamento de um tratamento (passo 5). Aqui, gostaríamos de apontar que é importante criar vários estímulos diferentes peixes e/ou animações para compensar pseudoreplication15,78,79 que afeta a possível interpretação dos dados obtidos durante as experiências. Com nosso conjunto de ferramentas, é fácil criar vários estímulos de peixe oferecendo possibilidades para usar um conjunto exclusivo de estímulos para cada tentativa experimental. Globalmente, o número total de estímulos necessários depende do tamanho de amostra pretendida para cada tratamento (ver secção "Resultados representativos" para obter informações sobre nosso estudo de caso).

Com nosso conjunto de ferramentas, nós quisemos fornecer um processo rápido e fácil de criar animação usando um controlador de vídeo game (etapa 2). Desse modo, o comportamento de natação geral do peixe virtual é gerado automaticamente, com base nos vídeos de natação ao vivo sailfin mollies80. Comportamento de natação (incluindo movimento de barbatanas e ferramentas) é, portanto, voltado para o uso com estímulos virtuais de sailfin mollies em particulares e ao vivo-rolamento peixes em geral. Para além do peixe vivo-rolamento, um modelo adicional para um esgana – fornece funções adicionais para o movimento espécie-específicos, tais como a subida/descida de espinhos dorsais e ventrais.

Funções de animação atualmente fornecidas pelo nosso conjunto de ferramentas podem não ser suficientes para cada padrão comportamental e espécies de peixes. Isto, no entanto, o utilizador e depende da pergunta de pesquisa testado. Além disso, animação com FishSteering (etapa 2) precisa de um pouco de prática antes para me acostumar com as funções do controlador de jogos. Portanto, o processo de animação é provavelmente a etapa mais demorada do protocolo. Um controlador de uma marca diferente pode ser usado aqui, mas a funcionalidade pode não ser tão suave e as funções dos botões (como determinado no manual do usuário) podem ser diferentes ou completamente ausente. Durante o processo de animação, apenas uma característica de um estímulo virtual (por exemplo, a posição, barbatanas, ferramentas) pode ser animada de cada vez. Em primeiro lugar, o movimento de natação (posição) e depois outros recursos (por exemplo, barbatanas) podem ser adicionados independentemente. Recomendamos salvar cada etapa separadamente. Isto oferece a vantagem que o usuário tem a possibilidade de voltar para uma versão anterior da animação para alterar uma característica específica, por exemplo, mantendo o caminho de natação constante mas mudando o movimento de barbatana dorsal comparado a uma versão anterior. Especialmente quando animando mais do que um peixe (etapa 2.2.), a ordem na qual peixe estímulos são animados é muito importante e precisa ser determinado antecipadamente. Aqui, pode ser útil para se referir a biologia das espécies testadas. Em nosso estudo de caso, simulamos o comportamento de corte de sailfin mollies no qual um macho geralmente segue uma fêmea81. Daí, nós primeiro o caminho de natação da fêmea virtual criado e adicionado o caminho para o macho virtual, seguindo a fêmea.

Ao executar o procedimento experimental (etapa 5), o momento é crucial para o sucesso do experimento. Os tempos / durações nos referidos no protocolo (etapa 5) derivado de estudos anteriores com sailfin mollies. Eles devem ser considerados como sugestões e não são obrigados para o sucesso geral de experimental mas devem, todavia, ser firmemente seguiram durante o procedimento. Tempo de aclimatação pode variar entre espécies de peixes e até mesmo pessoas e geralmente deve ser, enquanto o peixe focal precisa explorar o teste todo tanque e adaptar ao seu novo ambiente. Determinamos o comprimento de duração de pausa apropriado em pistas de treinamento do procedimento experimental. A pausa deve ser pelo menos tanto quanto o tempo necessário para pegar o peixe com o cilindro, bem como andar para e do tanque de testes e computador operacional para libertar os peixes do cilindro. Aqui, vezes possivelmente variam dependendo da situação experimental específica em cada laboratório e as espécies de peixes testados. Em qualquer caso, o experimentador individualmente pode mudar de tempos / durações ou definindo um tempo diferente em FishPlayer (ver passo 3.1. 3.) ou através da criação de sequências de animação com um comprimento diferente (consulte a etapa 2.1).

O experimentador pode melhorar a medição do tempo de associação para cada teste escolha do companheiro através da implementação de um sistema de rastreamento automatizado, embora ele precisa ser capaz de rastreamento em tempo real. Aqui, nós também queremos salientar que não há nenhuma possibilidade de ter um observador cego e, consequentemente, cego análise quando seguindo o procedimento de ensaio MCC. Desde que o experimentador não pode saber que virtual estímulo masculino vai ser preferido pela fêmea focal antes do teste, ele ou ela precisa estar ciente da escolha do peixe focal para reorganizar a ordem das sequências de animação em conformidade (ver passos 3.2 e 5.10).

O protocolo que descrevemos aqui é específico para nosso projeto de estudo na MCC em sailfin mollies. No entanto, o conjunto de ferramentas também pode ser usado em combinação com outros projetos experimentais com até quatro monitores para apresentação. Em geral, ferramentas de animação de computador oferecem uma ampla variedade de soluções para estudar várias perguntas sobre o comportamento dos peixes como companheiro de escolha, empolamento decisões ou detecção de predador-presa, usando estímulos visuais artificiais. Considerações técnicas e conceituais gerais para o uso de animação por computador em pesquisa de comportamento animal devem ser cuidadosamente avaliadas antes de usá-lo em experimentos,2,15. Mais importantes para a decisão se abordagens de animação de computador podem ser implementadas na pesquisa considera que os recursos visuais de espécies de peixes testados e se ele responde naturalmente no sentido virtuais estímulos apresentados em telas de monitor. Especialmente, ao testar o efeito dos aspectos cor, convém que telas de monitor só retratam cores como valores RGB e que isso pode impedir ou limitar as possibilidades de investigação, embora a saída de cores RGB pode ser ajustado a82. Para algumas espécies de peixes, uma limitação certamente pode ser que os monitores não emitem comprimentos de onda UV ou que, por outro lado, certos tipos de monitor são altamente polarizados que pode ser uma limitação com o peixe sendo sensível à luz polarizada, por exemplo em questões de companheiro de escolha83. Portanto, é necessária uma validação da eficácia de estímulos apresentados como animações de computador antes de testar qualquer hipóteses2,12,15,84,85.

No futuro, novos desenvolvimentos em reconhecimento de rastreamento e ação animal podem tornar possível criar estímulos virtuais interativos que reagem em tempo real para peixes vivos e simular o comportamento correspondente para aumentar maciçamente realismo para observar peixes 86. graças a modularidade do ROS subjacente, dispositivos externos, como câmeras podem ser integrados a toolchain, desde que o usuário tenha conhecimentos de programação adequados. Uma primeira tentativa bem sucedida mostrou que FishSim geralmente pode ser usado para simular a estímulos de peixe virtual interativo pela extensão de um 3D em tempo real de rastreamento sistema87,88,89. Durante o evento de comunicação de ciência "Molly sabe melhor" (https://virtualfishproject.wixsite.com/em2016-fisch-orakel), fomos capazes de demonstrar que peixes virtuais podem ser programados para acompanhar peixe focal ao vivo na tela e executar o comportamento de corte de acordo com um algoritmo predefinido. Além disso, tais sistemas de rastreamento em tempo real podem ser usados para medir o tempo de associação automaticamente para melhorar o procedimento experimental. Este recurso ainda não está incluído na versão atual do FishSim , mas está sujeita a desenvolvimento futuro.

Em conclusão, o uso de animação por computador em pesquisa de comportamento animal é uma abordagem promissora quando os métodos convencionais que necessitam de tratamento invasivo de animais vivos para manipular a expressão de uma característica visual ou padrão comportamental. Manipulação de animações de computador permite um alto grau de controle e padronização em relação ao uso teste ao vivo peixe, especialmente, desde que também oferece soluções para manipular o comportamento que é muito limitados ou mesmo impossíveis em peixes vivos. Além disso, em consonância com o princípio dos 3R- e diretrizes semelhantes para a utilização de animais na pesquisa e no ensino de90,91, esta técnica tem o potencial para 'reduzir' e 'substituir' animais de teste ao vivo, bem como para 'refinar' experimental procedimentos de pesquisa.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (WI 1531/12-1 KW e SG) e KU 689/11-1, KDK, KM e JMH. Agradecemos sinceramente o programa Alemanha DAAD subir para fornecer e organizar um estágio de iniciação científica entre SG e DB (financiamento-ID: 57346313). Nós estamos gratos ao Mitacs para financiamento DB com um prêmio de estágio de pesquisa de ascensão-Globalink (FR21213). Gentilmente agradecemos Aaron Berard para convidar-na apresentar FishSim dos leitores de JoVE e Alisha DSouza, bem como três revisores anônimos por seus valiosos comentários sobre uma versão anterior do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hardware
2x 19" Belinea LCD displays Belinea GmbH, Germany Model 1970 S1-P 1280 x 1024 pixels resolution
1x 24" Fujitsu LCD display Fujitsu Technology Solutions GmbH, Germany Model B24-8 TS Pro 1920 x 1080 pixels resolution
Computer Intel Core 2 Quad CPU Q9400 @ 2.66GHz x 4, GeForce GTX 750 Ti/PCIe/SSE2, 7.8 GiB memory, 64-bit, 1TB; keyboard and mouse
SONY Playstation 3 Wireless Controller Sony Computer Entertainment Inc., Japan Model No. CECHZC2E USB-cable for connection to computer
Glass aquarium 100 cm x 40 cm x 40 cm (L x H x W)
Plexiglass cylinder custom-made 49.5 cm height, 0.5 cm thickness, 12 cm diameter; eight small holes (approx. 5 mm diameter) drillt close to the end of the cylinder lower the amount of water disturbance while releasing the fish
Gravel
2x OSRAM L58W/965 OSRAM GmbH, Germany Illumination of the experimental setup
2x Stopwatches
Name Company Catalog Number Comments
Software
ubuntu 16.04 LTS Computer operating system; Download from: https://www.ubuntu.com/
FishSim Animation Toolchain v.0.9 Software download and user manual (PDF) from: https://bitbucket.org/EZLS/fish_animation_toolchain
GIMP Gnu Image Manipulation Program (version 2.8.22) Download from: https://www.gimp.org/

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