Ispanak Thylakoid Protein kompleksleri yerli yeşil Jel Elektroforez ve grup Time-Correlated tek foton sayma kullanarak karakterizasyonu tarafından ayrılması

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada çözündürüldükten thylakoid kompleksleri tarafından yerel Yeşil Jel Elektroforez ayırmak için bir iletişim kuralı mevcut. Yeşil Jel bantları daha sonra zaman korelasyon tek foton sayma (TCSPC tarafından) karakterizedir ve veri analizi için temel adımlar sağlanır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Schwarz, E., Blanchard, G. Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting. J. Vis. Exp. (144), e58470, doi:10.3791/58470 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fotosentez ışık reaksiyonları thylakoid membranlarda pigmentli protein kompleksleri bir dizi tarafından yapılmaktadır. Stoichiometry ve bu komplekslerin organizasyon son derece dinamik hem uzun hem de kısa süre ölçekler fotosentez için değişen çevre koşullarına uyum süreçleri nedeniyle (Yani, fotokimyasal sigara Şoklama, durum geçişlerini ve uzun vadeli yanıt). Tarihsel olarak, bu işlemler spectroscopically değişiklikler açısından Klorofil Floresans tarif edilmistir ve Spektroskopi fotosentetik parametreleri izlemek için hayati bir yöntem kalır. Sınırlı birkaç temel protein karmaşık dinamiklerini görüntülenmeyecektir yolu vardır. Burada yüksek çözünürlüklü ayrılık ve thylakoid kompleksleri, yerel Yeşil Jel Elektroforez görselleştirme için hızlı ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem tek foton ilişkili süre bantları üzerinde yeşil jel ayrılmış Klorofil Floresans özelliklerini detaylı karakterizasyonu için sayma ile birleştirilmiştir.

Introduction

Fotosentetik canlılar sürekli değişen çevre koşullarına verimliliği maksimize etmek ve başarıyla komşular1ile rekabet için onların Fizyoloji ayarlamanız gerekir. Bu makine ortam ışığı koşulları tarafından üç büyüklük gölgeler ve tam güneş ışığı altında arasında dalgalanma olarak fotosentez, ışık reaksiyonları için sorumlu özellikle doğrudur. Ayrıca, kuraklık, soğuk veya sıcak stres gibi çevresel faktörler karbon dioksit doğal elektron lavabom ışık reaksiyonları ürünler için karbon fiksasyonu için kullanılabilirliğini azaltabilir. Bitki gerekir, bu nedenle, hasat ve güneş radyasyonu gerektiği gibi aşırı ışık enerjisini dağıtmak yeteneği koruyarak mümkün olduğunca verimli bir şekilde kullanmak. Photooxidative hasar hala düzenli olarak tüm ışık koşullarında2altında,3, başarısızlık yönetmek için absorbe uyarma enerji başarıyla felaket hücre hasarı ve ölüme yol açabilir sırasında oluşur. Birkaç adaptif mekanizmaların hakim çevre koşulları değişiklikler ve geçici dalgalanmalar (Yani, kısa ve uzun timescales üzerinden)4şekilde ayarlanmış fotosentetik aparatı izin yok. Bu uzun vadeli yanıt (soldan sağa) ve olmayan fotokimyasal Şoklama (NPQ) içerir. NPQ kendisi durum geçişlerini (qT), hızla indüklenebilir enerji su verme (qE) ve photoinhibition (qI)5de dahil olmak üzere en az üç bileşen olayları kapsayacak şekilde kabul olduğunu.

Bu işlemler aslında gözlenen ve büyük ölçüde spektroskopik olayları açısından tanımlanan [Örneğin, NPQ anlamına gelir bir damla oranı artış nedeniyle değil (Klorofil Floresans Şoklama) gözlenen Klorofil Floresans içinde photochemistry]6. "Durum geçişlerini" benzer şekilde gözlenen için bir terimdir floresans PSI ve PSII7göreli miktarını değiştirin. Süre bu olayların numaralandırma mümkün kılmıştır spektroskopik teknikleri [özellikle, darbe genlik modülasyonlu (PAM) floresans spektroskopisi] ve gözlemleyerek ve fotosentetik süreçleri içinde dissekan için hayati bir araç olmaya devam Vivo, büyük bir biyokimya spektroskopik bu gözlemler temel mekanizmaları aydınlatmak için gereklidir. Devlet geçişler, örneğin, LHCII protein fosforilasyon/dephosphorylation döngüsünü STN7 kinaz ve TAP38/PPH1 fosfataz, sırasıyla8,9,10içerir. Bu döngü LHCII anten hareket ettirerek LHCII trimers bir bölümünü PSII böylece emme değiştirerek PSI için iki photosystems arasında fiziksel dağıtım ayarlar kesit photosystems11,12. NPQ qE bileşeni hızla ısı violaxanthin/zeaksantin epoxidation/de-epoxidation döngüsü ve PsbS protein eylemlerle aşırı uyarma enerji dönüştürür. Tam PsbS bu süreçte hareketsiz değil tam olarak13anlaşılmış roldür. NPQ, photoinhibition, qI bileşeni genellikle PSII D1 protein zarar atfedilir. Restorasyon tam fotosentetik yeterlilik bozuk PSII photocenters düzeltmek için bir ayrıntılı onarım işlemi gerektirir. PSII onarım döngüsü PSII kompleksleri granal yığınları, kompleksleri sökülmesi, değişimi hasarlı D1 proteinlerin, yeniden birleştirilmesinden PSII kompleksleri ve PSII kompleksleri hareketi granal yığınları14içine geri dışarı geçiş içerir. Photoinhibition ve PSII duyarlilik kesin yapısını bir konu yoğun İnceleme15kalır.

Olayları devlet gibi eğitim zorluk geçişler veya PSII onarım kısmen karmaşık biyokimyasal sistemlerin mekaniği görselleştirmek için bir basit yolu olduğu gerçeğini doğar. Bir süreci anlamak için klasik biyokimyasal yaklaşım onlar yalıtım modunda karakterize edilebilir böylece önce bileşenlerinin ayırmaktır. Yerel jel elektroforez başarılı çalışmalar ayrı ve thylakoid membran ile daha fazla partiye hazırlık Yöntemleri (yani sükroz degrade Santrifüjü ve Kromatografi)16üzerinden photosystem kompleksleri karakterize 1980'lerde ortaya çıktı. Yavaşça solubilize thylakoid membran üzerinden yerel kompleksleri için geliştirilen deterjan sistemleri yakında en önemlisi Allen ve Staehelin17 tarafından elektroforetik ayrımı yöntemleri için uyarlandı ve ve sebebiyet veren Peter ve Thornber18, yerli yeşil Jel Elektroforez için. Çeşitli teknikler deneysel cephanelik, yerel sayfa dışında temsil eden tek kişi fotosentez araştırmalarda yaygın olarak çalışan bir yöntem yapmış çekici özellikleri bir dizi varken. Yerel sayfa nispeten hızlı ve basit, aynı anda çok sayıda thylakoid kompleksleri ayrılması yüksek çözünürlüklü sağlarken küçük özel ekipman gerektiren. Bu uygun bir araç için thylakoid dynamics eğitimi ve, ikinci boyutu yanı sıra bulmak ve yeni thylakoid kompleksleri karakterize için çok yönlü bir sistem deterjan ve tampon sistemleri, çeşitli standart sayfa ile birlikte ne zaman yerel sayfa yapar.

Gibi belirsiz, smeary jeller kaç şeritli oluşan kötü sonuçlar üretmek kolay olduğu söyleniyor, güvenilmez bir tekniği, özellikle de deneyimsiz ellerde olduğun için bir itibar yerli yeşil jelleri oldu. Bu sorunu, kısmen, mavi-yerli sayfa19giriş ile çözüldü. BN tampon sistemi coommassie boya kullanımı protein ayrımı daha sağlam yapar. Bu nedenle, BN-sayfa kez kurmak göreli bir acemi için daha kolay ve daha güvenilir bir teknik ve yüksek çözünürlüklü ayrımları thylakoid kompleksleri, sağlayabilir. Bu nedenlerden dolayı BN SAYFALIK bu alanın çoğu iş için seçim yöntemi haline gelmiştir. BN-sayfa çalıştırmak Yeşil Jel Elektroforez, onun büyük dezavantajı olduğunu genellikle daha yavaş olmakla birlikte coommassie boya boyama aşağı akım yaparken aynı zamanda zayıf bantları, klorofil içeren tanımlaması engelleyen spektroskopik karakterizasyonu sorunlu.

Biyokimyasal bilgilerini yerel jelleri tarafından sağlanan ve 2D SDS-sayfa büyük ölçüde spektroskopik teknikleri verilerle birleştirildiğinde güçlendirilmiş. İstihdam ne olursa olsun, konut projeleri belirlemek için yerel jeller kullanarak merkezi bir sorun kimliği her zaman meydan okunabilir sistemidir (proteinler bir grupta bulunduYani, her zaman temsil comigrating kompleksleri veya bileşenleri, daha doğrusu tek fizyolojik otantik karmaşık bir). Spektroskopik karakterizasyonu yeşil jel bantlarında pigmentler biyofiziksel Kılavuzu ve konut projeleri ne tür onlar bulunma olasılığı olduğunu belirlemek için kullanılır. Klorofil Floresans bu konuda sık sık önemli ölçüde farklı spectra ve farklı fotosentetik pigment-protein kompleksleri karakteristik floresans ömürleri nedeniyle özellikle yararlıdır. Ise basit kararlı durum 77 K floresans spectra tarihsel olarak yerli jel kompleksleri kimliklerini doğrulayan yararlı olabilirdi, (TCSPC) sayma modern ilişkili süre tek foton çok daha fazla bilgi sağlayabilir. TCSPC sadece floresan ömürleri üzerinde dayalı kompleksleri karakterizasyonu verir, ancak aynı zamanda enerji transferi bir kompleksi içinde spektral bileşenler arasındaki ayrıntılı açıklaması mümkün kılar. Bu tür bir karakterizasyonu olarak çeşitli yerel jel sistemleri yayılır kullanımı giderek gerekli hale geliyor ve daha iyi doğrulanması için protein kompleksleri tanımlamasını sağlayan ve yeni sağlayan yeni sözde kompleksleri keşfedilir Bu komplekslerin nasıl çalıştığı hakkında biyofiziksel bilgi.

Bu yazıda biz bu ışık reaksiyonları mekaniği araştırılması amacıyla yerel thylakoid kompleksleri, yüksek nitelik kararlılık elde etmek için yerel jel elektroforez ile az veya hiç deneyimi olan sağlayan bir yöntem sağlar fotosentez. Bu temel teknik sonra sonuçları geliştirmek veya diğer türler için uygulanabilirlik genişletmek için deneyci'nın takdirine artar olabilir. O zaman TCSPC, temel analiz ve teknik tarafından sağlanan verilerin sunumunu için bazı adımlar olarak yerli yeşil jel bantları tutulmasi için işlemi açıklar. Yerel jel elektroforez TCSPC analizi ile bağlantı yardımcı programı bu jel sistemlerinin protein kompleksleri bantları içindeki malzemelerin kimlik doğrulaması ve biyofiziksel sağlayarak genişletir. Burada açıklanan yeşil jel sistemi Allen ve Staehelin17 bazı değişikliklerle tarafından geliştirilen ve Schwarz ve arkiçinde kullanılan ile aynı temel alır. 20. bu sistem birçok biridir ancak için bu yöntem yararlıdır belirli özelliklere sahiptir. Thylakoid yalıtım, Jel Elektroforez ve TCSPC Analizi uygun bir günde, olası sorunları örnek depolama ve yıkımı obviating yapılabilir böylece yeterince hızlı. Biz de bu yöntem sonuçları arasında iyi üstün, en iyi duruma getirme derecesine bağlı olarak değişen sağlarken deneyimsiz kullanıcılar, elinde sağlam olduğunu bulmak.

Kullanılan deterjan ve arabellek sistemlerinin yanı sıra soruşturma altında organizma biyolojisi üzerinde yerel bir jel görselleştirildiği kompleksleri bağlı akılda tutulması önemlidir. Farklı deterjan ve tampon sistemleri tercihen kompleksler farklı türde ayırın ve belirli bir fotosentetik organizma farklı kompleksleri gelen tüm bunların altında verilen herhangi bir durum mevcut olacaktır diğer organizmalar olacaktır. Burada açıklanan sistem Schwarz ve arkiçinde açıklandığı gibi özellikle PSI megacomplexes, çalışma için uygundur. 20, ama düşüyor spektrumunun daha destabilizing ucunda PSII megacomplexes eğitim görenler için. Çeşitli deterjan ve tampon sistemleri yerli jel elektroforez thylakoid proteinlerin içinde kullanılan kapsamlı bir çalışma için bu göl ve arkincelemek için tavsiye edilir. 21 ve Rantala vd. 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. stok çözümleri hazırlık yerli yeşil jelleri dökme için

  1. 4 konsantre arabellek çözüm x % 40 gliserol, 200 mM glisin ve 100 mM Tris pH 8.3 arabelleğe oluşan jelleri çözmek için hazır olun.
  2. 4 konsantre arabellek çözüm x % 40 gliserol, 200 mM glisin ve 100 mM Tris pH 6.3 arabelleğe oluşan yığın jelleri hazırlamak.
  3. Bu arabellekleri 4 ° C'de küf gelişimini önlemek için saklayın.
    Not: 100-200 mL her arabellek hazırlanması için kullanmaya devam etmeniz önerilir böylece arabellekleri 4 ° c, ay boyunca stabildir.
  4. 10 250 mM Tris HCl pH 8.3, içeren tampon çalıştıran x 1 L hazırlamak 1.92 M glisin ve % 1 SDS. Arabellek benchtop üzerinde çalışan x 10 saklayın.

2. hisse senedi çözüm hazırlık yalıtım ve Thylakoids Solubilization için

  1. TMK homojenizasyon arabelleği 50 mM Tris arabellek (pH 7), 10 mM MgCl2ve 10 mM KCl içeren 100 mL hazırlamak ve 4 ° C'de depolayın
    Not: Bu homojenizasyon ve thylakoid örnekleri düzenleme için ana arabellek olduğunu. Alternatif olarak, konsantre hisse senedi çözümleri hazırlanan ve gerektiğinde (Tris arabellek, MgCl2ve 1 M yoğunlaşmaktadır gibi kolayca benchtop üzerinde depolanması KCl can tüm) seyreltilmiş.
  2. Thylakoid hisse senedi çözümler her deterjan TMK arabelleği % 20 w / donma v. 1 mL aliquots-20 ° C'de çözülerek solubilization deterjanlar, B-disil maltoside (DM) ve n-Oktil B-d-glucoside (OG), hazır olun.
  3. Thylakoid solubilization arabellek (SB), aynı zamanda örnek yükleme arabellek hazırlayın.
    1. İlk olarak, TMK arabelleği 7 mLs ve gliserol 3 mLs birleştirerek olun TMK-gliserol arabellek.
    2. İçin 800 μL TMK-gliserol arabelleği 100 μL DM hisse senedi çözüm ve 100 μL OG hisse senedi çözüm ekleyin. 1 mL aliquots-20 ° C arasında dondurulup % 2 DM ve %2 OG içeren bu SB çalışma çözüm saklayın.
      Not: Her aliquot çözdürülen ve gerektiği gibi refrozen.

3. daha sonra kullanmak üzere yeşil Mini jelleri dökme

  1. Ayrı istifleme ve jeli 15 mL tek kullanımlık test tüpleri çözümlerinde çözme hazırlayın.
    Not: sağlanan birimleri 1.5 mm plaka çubukları kullanarak tek bir mini jel için yeterlidir.
    1. Yığın jel çözüm yapmak için 4 x yığın jel arabellek, 0.5 mL % 40 akrilamid stok çözeltisi (39:1 C) ve 3.25 mL su 1 yığın arabellek x 5 mL % 4 akrilamid de vermek için 1,25 mL birleştirir. Çözüm çözme jel yapmak için 4 arabellek, 0,94 mL % 40 akrilamid stok çözeltisi (39:1 C) ve 4.7 mL su 1 arabellek çözme x 7,5 mL % 5 akrilamid vermek için çözümleme x 1,875 mL birleştirir.
  2. Çözme jel dökmek.
    1. Çözme jel ekleyin 50 μL % 10 amonyum Persülfat (APS), sonra TEMED 10 μL eklemek, tüp kap ve karıştırmak için birkaç kez yavaşça tersine çevirin. Hemen çözme jel ve alt kısmındaki yığma jel tarak dişleri arasında yaklaşık 1 cm bırakarak jel plakaları arasında jel solüsyonu dökün.
    2. Hafifçe üst düzeye jel çözme jel üzerine % 100 etanol pipet.
      Not: jel 15 dk içinde ayarlı değil, taze APS çözüm yapılmalıdır ve/veya yeni TEMED kullanılmalıdır.
    3. Sonra jel polimerli (jel ve etanol arasında arayüz kolayca görülebilir ve jel sızdırdığında hareket etmez), etanol ve leke bir emici kağıt ile kapalı dökün.
  3. Yığın jel dökmek.
    1. 25 eklemek μL % 10 APS yığın jel çözüme eklemek TEMED, 5 μL sonra kap ve çözme jel aynı şekilde karıştırmak için ters çevir. Plakaları arasındaki boşluğu tamamen doldurulana kadar çözme jel üstünde jel solüsyonu dökün ve bir 10-iyi tarak ekleyin.
      Not: kullanılmak üzere hazır olduğunuzda jel tarak kaldırın ve kuyu kuyu düz ve jel tarafından kapatılmamış olduğundan emin yapma suyla durulayın. Jel yerde 4 ° C'de tarak ile en az birkaç gün saklanabilir.

4. ıspanak gelen ham Thylakoid membran izolasyon bırakır

Not: Tüm adımları önceden soğutulmuş ekipman ve arabellekleri kullanarak buza yürütülmesi gereken. Loş ışık da önerilir. Deneyci'nın takdirine bağlı olarak ve biyolojik süreçlerin altında eğitim bağlı olarak, proteaz ve/veya fosfataz inhibitörleri TMK arabellekleri homojenizasyon önce taze eklenmelidir.

  1. Tamamen ıspanak yaprakları TMK arabellekte bir cam Dounce homogenizer ile homojenize.
    Not: Normalde bir küçük bebek ıspanak yaprağı için yaklaşık 1-2 mL arabelleği yeterlidir. Bir tek bebek ıspanak yaprağı genellikle 1.5 mm mini jel birkaç wells yüklemek için yeterli malzeme sağlar.
  2. Çözünmez enkaz kaldırmak için ham yaprak homogenate filtre.
    1. Basit bir yapmak için filtreleme aygıtı, hassas bir görev kesilmiş yarısında silin ve dört eşit parçaya katlayın. Hassas görev silme 5 mL tek kullanımlık şırınga dibine paketi ve TMK arabelleği ile silin önceden ıslak.
    2. Şırınga pistonu aşırı arabellek yetersiz hassas görev silme tuşuna basın ve pistonu kaldırıldıktan sonra Temizleme işlemi filtre şırınga altına sıkıca basılı olduğundan emin olmak için kullanın.
    3. Yaprak homogenate Temizleme işlemi filtre ortasına üzerine pipette ve pistonu homogenate filtreden geçmek için kullanın. Filtre uygulanmış homogenate 1,5 mL santrifüj tüpü içinde toplamak.
  3. Homogenate 5000 x g 4 ° C'de çözünmez malzeme thylakoid membranlar dahil olmak üzere, cips için 10 dk de santrifüj kapasitesi. Süpernatant atın ve Pelet TMK arabellek 1 mL resuspend.
  4. Her örnek içinde Klorofil miktarı böylece klorofil, aynı toplam miktarı her örnek içerir her resuspended thylakoid örnek aşağıda açıklandığı gibi sesini tarafından normalleştirmek.
    Not: Bu aynı birimin deterjan çözündürüldükten her örnek sağlayacak ve değişkenlik solubilization Pelet birim farklılıkları nedeniyle en aza indirir.
    1. Klorofil resuspended thylakoid membranlar her örnekten ayıklamak için 50 μL 1.5 mL microcentrifuge tüpte aliquot almak ve metanol 950 μL da ekleyin. Tüp kap ve birkaç kez ters çevirme karıştırın.
    2. Metanol/klorofil özü 10.000 x g zarlarını proteinler cips için 10 dakika için de santrifüj kapasitesi.
    3. Porra ve arkgöre süpernatant içeren pigment klorofil konsantrasyonu belirlemek. 23. 652 ve 665 nm bir spektrofotometre ve 1 cm küvet kullanarak absorbans okumalar alıp. Aşağıdaki denklemi kullanarak toplam klorofil konsantrasyonu belirlemek:
      Chls bir + b (μg/mL) = 22,12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm)
    4. Klorofil konsantrasyon ölçümleri bir kılavuz olarak kullanarak, kaldırmak ve böylece her tüpün klorofil aynı toplam miktarı içerir gerektiğinde, her örnek bazı birimden atın.
  5. Yeniden thylakoid membranlar tarafından Santrifüjü 5000 x g 10 dk. çıkarmak için de cips ve süpernatant atın. Tüm süpernatant Pelet hiçbirini aspirating olmadan kaldırmak için dikkatli olun.

5. solubilization yerli jelleri üzerine yükleme için Thylakoid membranlar

  1. TMK % 30 gliserol deterjan solüsyonu (SB) bir aliquot çözülme ve karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin. Buz üstünde tutun.
  2. Thylakoid Pelet SB klorofil konsantrasyonu 1 mg/ml vermek için uygun hacmi ekleyerek geçiyoruz.
    Not: Bu konsantrasyon ampirik olarak belirlenmelidir koşullarına en uygun solubilization bulmak için bir başlangıç noktasıdır. Klorofil konsantrasyon geçerli karşılaştırmaların yapılmasına olanak örnekleri arasında aynı tutulmalıdır.
  3. Yukarı ve aşağı üst üste örnek renginde solma önlemek dikkatli olurken pipet. Thylakoid örnekleri solubilize izin vermek için buz üzerinde tutun.
    Not: en az 10 dakika Solubilize. Solubilization zaman solubilization zaman örnekleri arasındaki farkı en aza indirgemek yeterince uzun olmalıdır.
    Örnek: 3 dakika tüm örneklerini solubilize gerekiyorsa, sonra yaklaşık 30 dakika solubilization için izin verilmelidir.
  4. Çözündürüldükten thylakoids 4 ° C'de çözünmez malzeme cips için 10.000 x g, santrifüj kapasitesi.
    Not: Çözündürüldükten thylakoid örnekleri buz üzerinde saatlerce sabit, ama donma-çözülme döngüsü megacomplex bantları kaybına neden olabileceğinden depolama-70 ° C'de kaçınılmalıdır.

6. çözündürüldükten Thylakoid proteinler tarafından yerel jel elektroforez ayrılması

  1. Solubilized thylakoid süpernatant daha önceden hazırlanmış adımda 5,4 doğrudan yerel jel üzerine hazırlanan yükleyin. 1.5 mm jel için çözündürüldükten thylakoid iyi başına 15 μL yükleyin.
  2. Yerli yeşil jöle 1 tampon çalıştıran x kullanarak SDS-sayfa jelleri temelde aynı şekilde çalışır. Jel 100 V çalıştırın ve tüm jel tankı jel rezistif Isıtma azaltmak için çalışma süresi için ıslak buza koyun.
    Not: Jel yaklaşık 2 saat ücretsiz pigment jel (Şekil 1) alt ulaşmak için geçiş ön için istemeniz gerekir.

7. eksizyon Thylakoid karmaşık gruplarından gelen yerli yeşil jelleri

Not: jel dan ilgi belirli Grup bilincin band ışın yolu yerleştirilmesine ve yakındaki kompleksleri gelen sokak floresans toplanan gelen önlemek için izin vermek gereklidir.

  1. Jel Elektroforez hücre ve arabellek jel plakaları kapalı distile su ile çalışan durulama kaldırın. Üst plaka jel kaldırmak ve jel distile su ile durulayın.
  2. Jel alt cam plaka üzerinde tutun ve jel ve plaka buza koyun. Kullanılmadığı zaman jel karanlıkta bırakın ve kurumasını önlemek için plastik bir şal ile kaplayın.
  3. Cam tabakta kalan jel ile ilgi TCSPC analiz için hazır olduğunda her grubun tüketim. Gruplar bir keskin bistüri veya jilet ile temiz bir şekilde tüketim ve eksize grup bulaşıcı hiçbir grup malzeme içeren ilgilen.

8. oda sıcaklığında kararlı durum floresans Spectra koleksiyonu

  1. TCSPC tarafından analiz edilecek her karmaşık, oda sıcaklığında floresans spektrum Floresans Spektrometre kullanılarak 600 ve 800 nm arasında alınır.
    Not: Bu yelpazenin toplamak için kullanılan uyarma dalga dalga boyu TCSPC için kullanılan aynı olmalıdır.

9. TCSPC yeşil jel bantları

Not: TCSPC kurulum bir tasviri için Şekil 2 ' ye bakın.

  1. İki cam mikroskobu slayda jel dilim sandviç. Maskeleme bandı, mikroskobu slaytlardan birini her ucunda yerleştirilir ve slaytları birlikte sıkıca jel dilim sıkıştırmadan tutulabilen çubukları oluşturmak için üzerinde birkaç kez katlanıp kullanın.
    Not: Bu lazer ışını mikroskobu slaytlar arasında ve jel dilim üzerinden geçmek için bir yol oluşturur.
  2. Su küçük bir miktar sinyal saçılma azaltacaktır pürüzsüz bir arabirim oluşturmak için cam slaytlar kenarında jel dilim ekleyin.
  3. Jel/slayt sandviç ışın yolundaki kiriş içinde jel sandviç olduğunu, cam slaytlar yan tarafından ışın yolu dikey olmak floresan emisyon izin plakaları, Açık kenar üzerinden jel dilim vurur böylece kelepçe.
    Not: kullanılan uyarma dalga boyu deney üzerinde bağlıdır. Bir dalga boyu 435 nm heyecanlandırmak klorofil a ve 465 süre klorofil b nm tercihen klorofil b heyecanlandırmak. Bu durumda, 435 nm uyarma dalga boyu kullanıldı.
  4. Her karmaşık floresans emisyon yelpazesinde düzenli aralıklarla 10.000 toplam veri puan toplamak. Örneğin, veri toplamak her 10 nm, başlangıç 680 nm ve son 750 nm.
    Not: birden fazla jel bantları photobleaching yeterli sinyal koleksiyonu engeller durumunda, o taze örnek kullanılabilir olacak şekilde belirlenmesi her kompleks için hazırlayın.

10. TCSPC (veri analizi)

  1. Belirli bir karmaşık, ilk toplanan tüm dalga boyları için her bozunma eğrisi pik yüksekliği normalleştirmek.
    Not: Bu adım DAS yapımı için gerekli değildir ancak overlaid ve görsel olarak bir başka ilk incelenmesi veri göre çürüme eğrileri sağlar.
  2. Kuyruk-her bozunma eğrisi aşağıda açıklandığı gibi karmaşık kararlı duruma floresans yelpazede maç.
    1. Sonra çürüme sinyal, genellikle birkaç nanosaniye sonra dümdüz bir timepoint seçin.
    2. Seçili timepoint sinyal yoğunlukta kararlı duruma floresans spektrum bu dalgaboyu, değerine eşit olması için her dalga boyu, bozunma eğrisi normalize (Yani, tüm dalgaboyu seçili timepoint birlikte değerleri kararlı duruma floresans spektrum yeniden oluşturur).
  3. Kuyruk eşlemeli çürüme eğriler üzerinden çürümesi-ortak spectra (DAS) aşağıda açıklandığı gibi oluşturun.
    1. Verileri kullanarak kuyruk eşlemeli çürüme eğri noktaları araziler floresan yoğunluğu vs. dalga boyu düzenli zaman aralıklarında grafik bir dizi oluşturun (Örneğin, her 10 ps). Örneğin, 50 ps DAS dalga boyu vs 50 ps, her çürüme eğri oluşturacak değerini komplo tarafından inşa edilmiştir.
    2. Tüm zaman içinde floresans spektrum çürüme gösterir bir şelale stili çizim oluşturma çürüme ilişkili spectra yerleşimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Yeşil Jel Elektroforez için temsilcisi sonuçları Şekil 1' de sunulmuştur. 1 yolu için ıspanak thylakoids, net, keskin yeşil grup en büyük bir dizi görünür olan Yeşil Jel Elektroforez için ideal sonuçları gösteren bir örnek sağlar. Hepsi 1 şeride gördünüz gruplar belirli bir örneğinde normalde mevcut değildir çünkü bu sonuçlar kısmen biraz atipik vardır. Ek örnek Temizleme, thylakoid solubilization ve degrade jel elektroforez (4-%7 akrilamid) da normalde en iyi sonuçları elde etmek için gerekli önce kloroplast yalıtım şeklinde. Lanes 2 ve 3 mevcut daha tipik sonuç burada % 5 Sigara-gradient jel ile birlikte ayrıntılı iletişim kuralını kullanarak elde. Şerit 4, 5 ve 6 solubilization thylakoid örnek altında derecelerde artan nedeniyle kötü sonuç için bir örnek sağlar. Lane 7 Arabidopsis thylakoids ıspanak yerine tipik sonuçlar gösteren bir örnek sağlar. Arabidopsis için megacomplex bantları jel üstündeki kötü çözülmesi ıspanak, olanlar için karşılaştırıldığında eğiliminde olduğunu unutmayın.

Yerli yeşil jel Grup veri toplamak için kullanılan TCSPC Kur grafik gösterimi Şekil 2' de gösterilmiştir. Şekil 3 TCSPC veri 10. adımda açıklandığı gibi toplanan sonra analiz başlangıç için tipik bir iş akışı gösterilmektedir. TCSPC veri toplanır zaman, belirli bir dalga boyu her viraja isteğe bağlı sayıda veri noktaları veya "sayar" temsil eder. Bu eğrileri Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi birbirleri ile overlaid zaman eğrileri birbirleriyle doğrudan aynı ölçekte temsil değil ve tümü aynı başlangıç saat noktasına kayıtlı olmayabilir çünkü karşılaştırılamaz. Veri Analizi ilk adımda bu nedenle onun karşılık gelen araç yanıt işlevini (IRF) için her eğrinin karşılaştırmaktır. IRF belirli bir eğri için zirve için zaman t ayarlanır = 0, ve öncü karşılık gelen floresans bozunma eğrisi Şekil 3B' gösterildiği gibi öncü IRF örtüşmesi için ayarlanır. Tüm eğrileri bu daha sonraki analizler için aynı zaman kayıt için ayarlar.

DAS yapımı için gerekli değildir, ancak aynı pik yüksekliği tüm eğrileri bu noktada normalize bir ilk veri analizi yapılacak eğriler arasında yararlı bir karşılaştırma sağlar. Şekil 3 ciçinde aynı çürüme eğrileri Şekil 3A içinde sunulan LHCII için olduğu gibi Şekil 3Bve pik yüksekliği normalleştirme zaman kayıt sonra gösterilir. Şekil 3D' da görüldüğü gibi farklı kompleksleri gelen en yüksek normalize çürüme eğrileri sonra bir başka davranış farklılıkları görüntülenmeyecektir için konut projeleri arasında izin verilen bir dalga boyu, overlaid. Örneğin, LHCII PSI floresan kesinlikle çok hızlı bir şekilde çürüyen söndürülür, ancak yavaş yavaş, bozunmaları karakteristik uzun ömürlü bir floresan var. Çünkü bu açıkça bifazik grup 5 floresans bozunma eğrisi kısmen çok düşündüren veri, ilginç bir örnek sağlar. Karmaşık grup 5 için ilk floresan bozunma eğrisi PSI olarak aynı oranda yaklaşık 500 ps için takip henüz bile daha hızlı bundan sonra bozunmaları. Bu tür sonuçları ilginç daha da ayrıntılı olarak inşa çürüme ilişkili spectra tarafından (DAS) analiz edilebilir.

Şekil 4' te, LHCII ve grup 5 için temsilcisi DAS şelale araziler karmaşık gösterilir. DAS inşaatı ilk çürüme eğri verilen bir kompleks için kuyruk-oda sıcaklığında floresans spektrum kompleks için için uyumlu olduğunu 11,2 adımda anlatıldığı gibi gerektirir. LHCII için çürüme eğrileri kuyruk eşleşen sonuçları Şekil 4Agösterilir. DAS sonra 11,3 adımda anlatıldığı gibi bu eğrileri inşa edilir. DAS LHCII için Şekil 4A gösterilen çürüme eğrileri inşa ve sonuçları Şekil 4B' sunulmaktadır. DAS 0 ile 100 ps arasında netlik için ihmal ve sadece karakteristik yavaş çürüme nedeniyle bundan sonra her 100 ps için izole LHCII sundu. DAS LHCII için dinamik özellikler olmaması için dikkate değerdir ve LHCII floresan spektrum şeklinde sinyal bozuluyor aynı zaman içinde kalır. Floresans spektrum çürüme de ertelendi maksimum floresans ulaşmak için 100 ps gerektiren. Protein kompleksleri hasat izole ışık için beklenenden farklı olması gibi bu göstermektedir, bu enerji olarak floresans yaşlılık kompleksi içinde enerjik ayrı pigmentler arasında transfer edilmez. Bunun istisnası ilk 100 ps, muhtemelen nedeniyle karmaşık boyunca uyarma enerji ilk yeniden dağıtılması sırasında meydana gelen spektrumda değişikliğidir.

DAS grup 5 karmaşık için Şekil 4 cLHCII için gösterilen benzer bir şekilde inşa, gösterilir. Grubu 5 çeşitli yollarla LHCII için öğretici bir kontrast sağlar. LHCII için karşılaştırıldığında, floresan bant 5 çok daha hızlı, sadece 30 PS maksimum yoğunluk ulaşan ve ilk yoğunluğu az % 20 sonra 500 ps çürüyen bozunmaları. Karmaşık grup 5 floresans spektrumu da emisyon bozunmaları bir dizi ilginç dynamics sergiler. 0 ve 60 ps, spectra karşılaştırıldığında açıkça bir artış içinde 720, floresans gösterir nm 680 ve 710 nm, floresans pahasına. Bundan sonra 680 nm vardiya 690 doğru zirvesinde nm ve 720 nm vardiya geri doğru 710 zirve sırasında genişletiyor nm (e.g., 500 PS 60 ps karşılaştırmak). Bu tür veri enerji transferi için kanıt LHCII PSI anten ve sonunda PSI çekirdek sağlarken bağlantısız LHCII anten proteinlerin varlığı kural yardımcı olur.

Bu dinamikler da çözümlenmemiş doruklarına yaklaşık 680 olma olasılığı olduğunu düşündürmektedir nm, 690 nm, 710 nm ve 720 nm. Bu veriler, bu nedenle nerede spektral özellikleri daha iyi çözülmesi daha yakın aralıklarla TCSPC veri toplayarak bir örnek sağlar (Örneğin her 5 nm tercihan--dan her 10 nm). Daha yüksek spektral çözünürlük, yokluğunda bile, ancak, DAS grup 5 karmaşık için kanıt bir kompleksi içinde birden çok Floresanda türler arasındaki enerji transferi için bir örnektir. Ayrıca hızla çürüyen bir tepe 740 yukarıda görünüyor nm, veri aynı zamanda daha fazla spektral özellikleri içerecek şekilde daha geniş bir spektrum üzerinde toplanmalıdır düşündüren.

Figure 1
Şekil 1: temsilcisi yeşil jel sonuçları. TCSPC analize tabi yeşil jel bantları PSI-LHCII etiketli (photosystem ben LHCII megacomplexes), PSI (photosystem ben LHCI), Grup 5 (PSI-LHCII kompleksi), PSII-LHCII (photosystem II ve ışık-karmaşık II hasat ilişkili), PSII (photosystem II çekirdek karmaşık) ve (ışık-karmaşık II hasat) LHCII. 1 yolu için ideal bir bantlama deseni kloroplast yalıtım solubilization ve yeşil jel elektroforez % 4-7 akrilamid degrade jel üzerinde önce kaynaklanan gösterir. Lanes 2 ve 3 basit thylakoid yalıtım ve Elektroforez ortalama sonuç üzerinde gradyan olmayan %5 akrilamid jel göster. Şerit 4-6 solubilization altında artan önem gösterin. Lane 7 basit protokolü kullanarak Arabidopsis için temsilcisi sonuçları gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: şematik tek fotonun ilişkili süre araç sayım. Kavite terkedilen dye lazer pompalar bir Pasif mod kilitli NdYVO4 lazer ışık kaynağıdır. 5-ps bakliyat değişken tekrarlama oranları ve dalga boylarında bir autocorrelator kullanarak karakterizedir. Bakliyat başvuru fotodiyot gidip kalanı örnek heyecan verici bir kısmı ile ayrılır. Örnek emisyon mikroskop objektif kullanarak toplanır ve polarize bileşenleri iki algılama kanallarını kullanarak tespit edilir. Örnek emisyon zamanı gösterilir, algılama elektronik nerede kullanılarak çözümlendi CFD sürekli kesir ayrıştırıcı, TAC = = zaman genlik dönüştürücü ve MCA çok kanallı analyzer =. Zaman çözünürlüğü enstrüman yanıt işlevinden (ca. 40 ps) belirlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: temsilcisi ham TCSPC veriler ve normalleştirilmiş floresans çürüme eğrileri. (A) yerleşim ham TCSPC veri LHCII için. TCSPC veri toplanan her 10 nm arasında 670 nm ve 740 nm (B) A temsilcisi eğrisi gösteren zaman kayıt aracı yanıt işlevine (IRF) Floresan veri. (C) tüm eğrileri onların anılan sıraya göre IRFs kaydedildi sonra (A) LHCII verilerden 1 maksimum pik yüksekliği için normalleştirilmiş. (D) yerleşimi floresans girdabında eğrileri 680 nm PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII ve grubu 5. Tüm çürüme eğrileri 1 maksimum pik yüksekliği için normalleştirilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: şelale tarzı DAS inşaatı. (A) kuyruğu çürüme eğrileri DAS inşaatı için hazırlık LHCII için eşleşen çizer. (B) DAS araziler için LHCII için zaman t = 0, her 30 ps t grubu 5 için her 100 ps 100 500 PS ve 1000 PS (C) DAS, araziler için 0-210 ps ve 500 ps bundan sonra her 100 ps =. Her iki (b) ve (C), zaman = 0 40 PS olduğunu IRF tarafından tanımlanan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Başarılı thylakoid solubilization ve yerel jel çalıştırmak birden çok farklı görünür yeşil bantlar üzerinde önemli bozulma olmadan jel çözümlenmesi veya grupları bulaşması neden olur. Jel aşırı yüksek bir deterjan konsantrasyon, bir yanlış örnek pH çok hızlı veya çok yüksek bir ısıda, jel çalıştıran malzeme, undissolved ve uygun olmayan şekilde döktü bir jel kötü çözülmüş thylakoid kompleksleri için katkıda bulunabilir tüm faktörler vardır. Jel kendisi şartları en iyi duruma getirme sırasında (Örneğin., akrilamid degrade konsantrasyonları), çözünürlük ilgi gruplarından en üst düzeye çıkarmak için yardımcı olabilir. Solubilization koşulları ve biyoloji örnek malzemenin kalite ve doğal yeşil jeller üzerinde çözüldü thylakoid kompleksleri miktarı katkıda bulunmak en önemli faktörler olduğunu bizim deneyimdir. Tüm konut projeleri tüm biyolojik koşullar altında bulunması hatırlamak önemlidir.

Yerli yeşil jelleri normal SDS-sayfa mini jeller aslında aynı şekilde dökülür. Jelleri sabah döktü ve daha sonra aynı gün kullanıma hazır veya 4 ° C'de jel tarak ile birkaç gün ve herhangi bir önemli değişiklik performans için depolanma. Standart, kolay ulaşılabilir 39:1 C akrilamid çözümler yığınlama ve çözme jelleri dökmek için kullanılabilir. Sözde "büyük gözenek" jelleri daha yüksek acrylamide:bis kullanılarak yapılabilir-akrilamid oranları (Örn., 100: 1 C) jelleri, ama biz üstündeki megacomplexes ayrılması artırmak için bu aynı zamanda daha az keskin neden eğilimi bul bantları çözüldü. Deneyim, en yüksek grup çözünürlükte (ayrılmış bant en büyük sayısı) daha düşük C oranında ve doğrusal akrilamid konsantrasyon gradyan % 5-7 ile elde edilir. Eski bir degrade kullanılabilir değilse, ancak, çok tatmin edici grup ayrımı ve çözünürlük % 5 civarında bir çözme jel konsantrasyon ile elde edilebilir akrilamid. O Elektroforez nispeten alçak gerilim yüksek çözünürlük ile birbirinden ayırmak yerel kompleksleri izin veren ve Isıtma kompleksleri denatüre, jel, azaltmak için de gerçekleştirilebilmesi önemlidir.

Burada verilen thylakoid yalıtım için yöntem hızlı ama nispeten "kirli" (yani, diğer organelleri veya diğer hücre zarlarında gelen thylakoid membranlar kloroplast ayrı girişiminde bulunmaz). Bu sadece klorofil içeren proteinler görselleştirildiği beri thylakoid kompleksleri ve sonraki ölçümler, floresans tabanlı görüntülenmesi amacıyla yeterli olur. Bu unutulmamalıdır bu aşağı akım diğer uygulamalar için (e.g., ikinci SDS-sayfa ve protein algılama boyut), thylakoid protein mevcut olacak. Ayrıca kloroplast solubilization, muhtemelen solubilization önce çözünmez materyallerin kaldırılması nedeniyle önce izole zaman iyi çözünürlük elde edilir unutulmamalıdır. Ne zaman belgili tanımlık yöntem tanımlamak burada aşağıda, diğer homojenizasyon yöntemleri gibi bir blender kullanılan, ama bir cam Dounce homogenizer hızlı ve etkili ve kantitatif korunabilmesi tüm homojenize yaprak malzeme sağlar. Arabellek yaprak malzeme oranı bilgimizi önemli görünüyor. Yaklaşık 2 mL arabelleği için bir bebek ıspanak yaprağı yarısı uygun bir başlangıç noktası olduğunu ama deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.

Klorofil solubilization arabelleğe uygun oranını yeşil jel performans optimizasyonu için çok önemlidir ve deneyci bir verilen bitki türleri veya deneysel Kur tarafından tespit edilmelidir. Uygun solubilization bir açık, derin zümrüt yeşili süpernatant beyaz nişasta Pelet yukarıda neden olur. Beyaz Pelet üzerine yeşil malzeme tabakası altında çözündürüldükten thylakoids olup olmadığını gösterir. O zavallı göç grupları bulaşması da dahil olmak üzere jel, neden olur ve doğru bir bantlama deseni vermeyecektir solubilization altında kaçınılmalıdır. Bu yöntemle üretilen thylakoid granül resuspend ve solubilize kolay olmalı. Hızlı ve homojen resuspended kompakt granül durumunda alternatif bir yöntem tavsiye edilir. Örnekleri ilk TMK-gliserol arabellek, sonra TMK-gliserol arabelleği deterjanlar 2 X konsantrasyon içeren ek bir yarı-cilt ekleneceği yarım ses resuspended.

Bazı megacomplex grup yoğunluğu kaybına neden olabileceğinden aşırı solubilization de kaçınılmalıdır. Ayrıca, bu örnek jel üzerine daha büyük bir hacim yükleyerek için aşırı solubilization telafi etmek mümkün değil - biz 15'ten fazla μL örnek başına 1.5 mm jel iyi yükleme ayırma kalitesini azaltır bulduk; Bunu yaparken kompleksleri ile düşük bereket görselleştirmek için arzu olabilir, ancak. Bunun tersi olarak, 15 μL artırabilir daha az yükleme çözünürlük bant ve bulaşması azaltır, ancak bazı düşük yoğunluklu grup görünürlüğünü azaltmak. Genel olarak, yüksek protein konsantrasyonu ve artan deterjan konsantrasyon grup bozulma için katkıda bulunmak ve bulaşması jel.

Yeşil Jel kompleksleri (TCSPC) analizi sayma ilişkili süre tek foton için uyarma ve emisyon dalga boylarında deneyci onların takdirine göre seçilmelidir. Bizim amacımız için seçilen uyarma dalga boyu 435 yapıldı nm, klorofil a ve klorofil b. farklı dalga boylarında olabilir, ancak heyecanlandırmak, belirli chlorophylls veya diğer pigmentler daha seçici heyecanlandırmak için kullanılan (Örneğin, bir uyarma dalga boyu yaklaşık 465 nm tercihen klorofil b heyecanlandırmak). Benzer şekilde, bir floresan emisyon 680 bölgesinden 740 için kapsayan spektrum nm LHCII, PSI ve PSII için bildirilen emisyon spectra göre seçildi. Bu nedenle, bu bölge bizim için ilgi tüm ilgili spektral özellikleri kapsar. Hangi veri toplanır dalga boyu aralıklarla deneyci kararına kadar da vardır. Her 5 gibi daha kısa aralıklarla nm yerine her 10 nm, daha ayrıntılı bir çürüme ilişkili spektrum oluşturmak olası yapacak, ama bu daha fazla zaman gerektirir ve gerekli olmayabilir. Diğer taraftan, daha uzun aralıklarla ilgili spektral detayları çözmek başarısız olabilir.

Sadece overlaying normalleştirilmiş floresans çürüme eğrileri farklı kompleksleri gelen bu konut projeleri hakkında ifşa bilgi sağlayabilir. Floresan LHCII, üzerinden örneğin, karakteristik uzun ömürlü, floresans üzerinden PSI bozunmaları ise çok daha hızlı olur. Bu noktada karşı enstrüman yanıt işlevi (IRF) gözlenen çürüme kinetik geçici araç tepki süresi çözümlenen olduğundan emin olmak için verileri incelemek için özen gösterilmelidir.

Çürüme ilişkili spectra (DAS) TCSPC veri oluşturmak yoluyla enerji transferi kromofor izole çürüme eğrileri sadece bakarak mümkün olduğundan daha bir kompleksi içinde arasında çok daha detaylı bir resmini oluşturur. TCSPC tarafından toplanan sinyal yoğunluğu rasgele olduğundan DAS oluşturmak yoluyla, kuyruk TCSPC çürüme eğri kararlı duruma floresans spektrum için gerekli eşlemesidir. Uzun süre noktalarda 5.000 ps gibi ancak, belirli bir dalga boyu ("kuyruk" çürüme) Floresan yoğunlukta kararlı duruma floresan yoğunluğu bu dalga boyu için aynıdır. Kararlı durum floresans spektrum bu nedenle onların kuyrukları için kararlı duruma spektrum eşdeğer olması tüm TCSPC bozuluyor normalleştirmek için kullanılabilir. Bu gerçek göreli yoğunluğunu floresans sinyalinin her bozunma eğrisi için verir. Ne zaman birlikte şelale Arsa tarzda overlaid DAS, tüm serisi grafik gösterimi floresans spektrum çürüme zamanla sağlar. Eğer araziler için yeterince uzun zaman puan (için çürüme eğrileri kuyruk) yürütülen şelale Arsa sonuna kadar kararlı durum floresans spektrum çürüme. En erken zaman noktası, öte yandan, TCSPC enstrüman yanıt işlevi tarafından belirlenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Acknowledgments

Finansman ve destek Michigan Eyalet Üniversitesi'nde kimya bölümü tarafından verilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycine Sigma G8898
Tris base Sigma #648310
SDS Sigma L3771
Decyl Maltoside Sigma D7658 n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside Sigma O8001
Acrylamide BioRad 161-0148 37.5/1 C 40% solution
TEMED BioRad 161-0800
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Magnesium Chloride Sigma M2670
Potassium Chloride Sigma P9333

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yamori, W. Photosynthetic response to fluctuating environments and photoprotective strategies under abiotic stress. Journal of Plant Research. 129, (3), 379-395 (2016).
  2. Kim, J. H., Nemson, J. A., Melis, A. Photosystem II reaction center damage and repair in Dunaliella salina (Green Alga) (analysis under physiological and irradiance-stress conditions). Plant Physiology. 103, (1), 181-189 (1993).
  3. Sundby, C., McCaffery, S., Anderson, J. M. Turnover of the photosystem II D1 protein in higher plants under photoinhibitory and nonphotoinhibitory irradiance. Journal of Biological Chemistry. 268, (34), 25476-25482 (1993).
  4. Dietze, lL., Bräutigam, K., Pfannschmidt, T. Photosynthetic acclimation: state transitions and adjustment of photosystem stoichiometry-functional relationships between short-term and longterm light quality acclimation in plants. FEBS Journal. 275, (6), 1080-1088 (2008).
  5. Horton, P., Ruban, A. V., Walters, R. G. Regulation of light harvesting in green plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 655-684 (1996).
  6. Baker, N. R. Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annual Review of Plant Biology. 59, 89-113 (2008).
  7. Williams, W. P. Spatial organization and interaction of the two photosystems in photosynthesis. Nature. 225, (5239), 1214-1217 (1970).
  8. Bellafiore, S., Barneche, F., Peltier, G., Rochaix, J. D. State transitions and light adaptation require chloroplast thylakoid protein kinase STN7. Nature. 433, (7028), 892-895 (2005).
  9. Shapiguzov, A., et al. The PPH1 phosphatase is specifically involved in LHCII dephosphorylation and state transitions in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107, (10), 4782-4787 (2010).
  10. Pribil, M., Pesaresi, P., Hertle, A., Barbato, R., Leister, D. Role of plastid protein phosphatase TAP38 in LHCII dephosphorylation and thylakoid electron flow. Public Library of Science Biology. 8, (1), (2010).
  11. Larsson, U. K., Jergil, B., Andersson, B. Changes in the lateral distribution of the light-harvesting chlorophyll-a/b-protein complex induced by its phosphorylation. European Journal of Biochemistry. 136, (1), 25-29 (1983).
  12. Minagawa, J. State transitions--the molecular remodeling of photosynthetic supercomplexes that controls energy flow in the chloroplast. Biochimica et Biophysica Acta. 1807, (8), 897-905 (2011).
  13. Ruban, A. V. Nonphotochemical Chlorophyll Fluorescence Quenching: Mechanism and Effectiveness in Protecting Plants from Photodamage. Plant Physiology. 170, (4), 1903-1916 (2016).
  14. Rokka, A., Suorsa, M., Saleem, A., Battchikova, N., Aro, E. M. Synthesis and assembly of thylakoid protein complexes: multiple assembly steps of photosystem II. Biochemical Journal. 388, (Pt 1), 159-168 (2005).
  15. Li, L., Aro, E. M., Millar, A. H. Mechanisms of Photodamage and Protein Turnover in Photoinhibition. Trends in Plant Science. (2018).
  16. Dunahay, T. G., Staehelin, L. A. Isolation of photosystem I complexes from octyl glucoside/sodium dodecyl sulfate solubilized spinach thylakoids: characterization and reconstitution into liposomes. Plant Physiology. 78, (3), 606-613 (1985).
  17. Allen, K. D., Staehelin, L. A. Resolution of 16 to 20 chlorophyllprotein complexes using a low ionic strength native green gel system. Analytical Biochemistry. 194, (1), 214-222 (1991).
  18. Peter, G. F., Thornber, J. P. Biochemical composition and organization of higher plant photosystem II light-harvesting pigment-proteins. Journal of Biological Chemistry. 266, (25), 16745-16754 (1991).
  19. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Analytical Biochemistry. 199, 223-231 (1991).
  20. Schwarz, E. M., Tietz, S., Froehlich, J. E. Photosystem I-LHCII megacomplexes respond to high light and aging in plants. Photosynthesis Research. 136, (1), 107-124 (2018).
  21. Suorsa, M., Paakkarinen, V., Aro, E. M. Optimized native gel systems for separation of thylakoid protein complexes: novel super- and mega-complexes. Biochemical Journal. 439, (2), 207-214 (2011).
  22. Rantala, M., Tikkanen, M., Aro, E. M. Proteomic characterization of hierarchical megacomplex formation in Arabidopsis thylakoid membrane. Plant Journal. 92, (5), 951-962 (2017).
  23. Porra, R. J., Thompson, W. E., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 975, (3), 384-394 (1989).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics