Séparation des épinards thylakoïdes Complexes des protéines par électrophorèse de Gel vert natif et caractérisation de bande en utilisant le comptage de Photon unique Time-Correlated

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Summary

Nous présentons ici un protocole visant à séparer les thylakoïdes solubilisée complexes par électrophorèse sur Gel natif de vert. Gel vert bandes sont caractérisés par la suite par temps en corrélation unique Photon Counting (TCSPC) et les étapes de base pour l’analyse de données sont fournis.

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Schwarz, E., Blanchard, G. Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting. J. Vis. Exp. (144), e58470, doi:10.3791/58470 (2019).

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Abstract

Les réactions de la lumière de la photosynthèse sont effectuées par une série de complexes de protéine pigmentée dans les membranes des thylakoïdes. La stoechiométrie et l’organisation de ces complexes est très dynamique sur long et des échelles de temps courtes en raison de processus qui s’adaptent à la photosynthèse à l’évolution des conditions environnementales (c.-à-d. non photochimique trempe, les transitions d’État et le réponse à long terme). Historiquement, ces processus ont été décrits par spectroscopie en fonction des changements dans la fluorescence de la chlorophylle, et spectroscopie reste une méthode indispensable pour la surveillance des paramètres photosynthétiques. Il y a un nombre limité de façons dont la dynamique complexe de protéine sous-jacentes peut être visualisée. Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour la séparation à haute résolution et la visualisation des thylakoïdes complexes, électrophorèse sur gel vert natif. Cette méthode est couplée avec le temps-corrélé de photon unique comptant pour une caractérisation détaillée des propriétés de fluorescence de la chlorophylle de bandes séparées sur le gel vert.

Introduction

Les organismes photosynthétiques doivent ajuster en permanence leur physiologie à l’évolution des conditions environnementales afin de maximiser leur productivité et soutenir la concurrence avec les voisins de1. Ceci est particulièrement vrai pour le mécanisme responsable des lumière des réactions de photosynthèse, comme la lumière ambiante conditions peuvent fluctuer de trois ordres de grandeur entre les ombres et plein soleil. En outre, les facteurs environnementaux tels que la sécheresse, froid ou de chaleur peuvent réduire la disponibilité de dioxyde de carbone pour la fixation du carbone, qui est l’évier électron naturelle pour les produits des réactions lumière. Plantes doivent, par conséquent, récolter et utiliser le rayonnement solaire aussi efficacement que possible tout en conservant la capacité de dissiper le surplus d’énergie lumineuse que nécessaire. Tandis que photooxidative dommages se produisent encore régulièrement au titre de l’ensemble de conditions de lumière2,3, incapacité à gérer les énergie d’excitation absorbé avec succès peut conduire à la lésion des cellules catastrophique et la mort. Plusieurs mécanismes d’adaptation existent qui permettent à l’appareil photosynthétique à accorder aux changements de conditions d’environnement, tant à des fluctuations transitoires (p. ex., sur des échelles de temps longues et courtes)4. Il s’agit de la réponse à long terme (LTR) et non photochimique trempe (QNP). QNP est lui-même considéré comme pour englober au moins trois autres phénomènes de composant, y compris les transitions d’État (qT), trempe rapidement inductible de l’énergie (qE) et photoinhibition (qI)5.

Ces processus ont été initialement observés et définis en grande partie en termes de phénomènes spectroscopiques [p. ex. QNP se réfère à une goutte d’eau dans la fluorescence de la chlorophylle observés (extinction de fluorescence de la chlorophylle) qui n’est pas due à une augmentation du taux de photochimie]6. « Les transitions d’état » de la même façon on entend le changement observé dans la quantité relative de la fluorescence du PSI et PSII7. Alors que les techniques spectroscopiques qui ont fait l’énumération de ces phénomènes possible [en particulier, la spectroscopie de fluorescence (PAM) modulation d’amplitude d’impulsion] et continuent d’être un moyen vital d’observation et dissection photosynthétiques processus dans Vivo, beaucoup de biochimie est nécessaire afin d’élucider les mécanismes qui sous-tendent ces observations spectroscopiques. Transitions de l’États, par exemple, implique un cycle de phosphorylation/déphosphorylation des protéines LHCII par la protéine kinase STN7 et TAP38/PPH1 phosphatase, respectivement8,9,10. Ce programme permet de régler la distribution physique de l’antenne LHCII entre les deux photosystèmes en déplaçant une partie des trimères LHCII de PSII au PSI, modifiant ainsi l’absorption coupe transversale des photosystèmes11,12. Le composant qE de QNP se transforme rapidement en énergie d’excitation excessive en chaleur par l’intermédiaire de l’action de la violaxanthine/zéaxanthine époxydation/de-époxydation cycle et la protéine de l’OSP. Le rôle exact des organes subsidiaires principaux dans ce processus, c’est pas encore pleinement compris13. Le composant de qI de QNP, photoinhibition, est généralement attribué aux dommages à la protéine D1 du PSII. Restauration de compétence pleine photosynthèse nécessite un processus de réparation complexe pour résoudre endommagé photocenters PSII. Le cycle de réparation PSII implique la migration des complexes PSII hors les piles contiennent, démantèlement des complexes, remplacement des protéines endommagées de D1, remontage des complexes PSII et mouvement des complexes PSII dans les piles contiennent14. La nature exacte de la photoinhibition et PSII photovieillissement reste un objet d’un examen minutieux,15.

Les transitions de la difficulté à étudier des phénomènes comme l’état ou la réparation PSII découle en partie du fait qu’il n’y a pas un moyen simple de visualiser la mécanique des systèmes biochimiques complexes. L’approche biochimique classique pour comprendre un processus consiste à séparer ses composants afin qu’ils peuvent être caractérisés en vase clos. Électrophorèse sur gel natif découle d’efforts couronnés de succès dans les années 1980 à séparer et à caractériser les complexes de photosystème des membranes thylakoïdes avec plusieurs méthodes préparatives (centrifugation en gradient de saccharose et chromatographie)16. Les détergents systèmes développés pour solubiliser doucement les complexes natives des membranes thylakoïdes étaient bientôt adaptés aux méthodes de séparation par électrophorèse, plus particulièrement par Allen et Staehelin17 et et Peter et Thornber18, donnant lieu électrophorèse sur gel vert natif. Alors que le seul représentant de diverses techniques dans l’arsenal expérimentale, natif de PAGE a un certain nombre de caractéristiques attrayantes qui en ont fait une méthode couramment employée dans la recherche de la photosynthèse. PAGE native est relativement rapide et simple, nécessitant des équipements peu spécialisés, tout en assurant simultanément la séparation de haute résolution d’un grand nombre de complexes de thylakoïdes. Cela rend PAGE native, un outil pratique pour l’étude dynamique des thylakoïdes et, lorsqu’il est combiné avec une PAGE standard dans la deuxième dimension, mais aussi une variété de systèmes de détergent et de la mémoire tampon, un système polyvalent pour la trouver et la caractérisation de nouveaux complexes de thylakoïdes.

Cela étant dit, gels verts natifs ont eu la réputation d’être une technique peu fiable, en particulier dans des mains inexpérimentées, tel qu’il est facile de produire des résultats médiocres, consistant en des gels floues, graisseux avec peu de bandes. Ce problème a été résolu, en partie, avec l’introduction de bleu-indigène PAGE19. L’utilisation de colorant coommassie dans le système de tampon ne rend la séparation de protéines plus robustes. Par conséquent, BN-PAGE est souvent une technique plus facile et plus fiable pour un novice relative à mettre en place et peut fournir des séparations de haute résolution de thylakoïdes complexes. Pour ces raisons, BN-PAGE est devenu la méthode de choix pour la plupart des travaux de ce champ. BN-PAGE est généralement plus lente à gérer que l’électrophorèse sur gel vert, son inconvénient principal est que la coloration coommassie interfère avec l’identification de faibles bandes contenant de la chlorophylle, tout en s’en aval spectroscopiques caractérisation de problématique.

L’information biochimique fournie par gels natifs et SDS-PAGE 2D peut être considérablement renforcée lorsqu’il est combiné avec les données techniques spectroscopiques. Quel que soit le système utilisé, un problème central avec l’aide de gels natifs pour identifier des complexes est que l’identification peut toujours être contestée (c'est-à-dire, les protéines trouvées dans une bande pourrait toujours représenter complexes migrent ou composants, plutôt qu’un seul complexe physiologiquement authentique). Caractérisation spectroscopique fournit des informations biophysiques sur les pigments dans les bandes de gel vert et peut être utilisée pour déterminer quels types de complexes, elles sont susceptibles de contenir. Fluorescence de la chlorophylle est particulièrement utile à cet égard en raison de la souvent radicalement différents spectres et les durées de vie de fluorescence qui sont caractéristiques des complexes protéiques-pigment photosynthétique. Alors que les spectres de fluorescence simple équilibre 77K ont été historiquement utiles pour confirmer l’identité des complexes de gel natif, moderne temps-corrélé de photon unique comptant (TCSPC) peut fournir beaucoup plus d’informations. TCSPC permet non seulement de la caractérisation des complexes basées sur des durées de vie de fluorescence, mais rend aussi possible la description détaillée du transfert d’énergie entre les composantes spectrales au sein d’un complexe. Ce genre de caractérisation devient de plus en plus nécessaire que l’utilisation des différents systèmes "spreads" de gel natif et nouveaux complexes putatifs sont découverts, permettant l’identification des complexes de protéines doivent être mieux authentifiées et offrant de nouvelles données biophysiques sur le fonctionnement de ces complexes.

Dans cet article, nous fournissons une méthode qui permet à ceux ayant peu ou pas d’expérience avec électrophorèse native de parvenir haute qualité de thylakoïdes native complexes aux fins de l’enquête sur les mécanismes des réactions de lumière photosynthèse. Cette technique de base peut ensuite être augmentée à la discrétion de l’expérimentateur pour améliorer les résultats ou étendre l’applicabilité à d’autres espèces. Nous décrivons ensuite le processus pour soumettre les bandes de gel vert natif à TCSPC, ainsi que quelques étapes de base analyse et présentation des données fournies par la technique. Le couplage de l’électrophorèse sur gel natif avec analyse TCSPC étend l’utilité de ces systèmes de gel en fournissant l’authentification et la caractérisation biophysique des complexes protéiques dans les bandes. Le système de gel vert décrit ici repose sur développé par Allen et Staehelin17 avec quelques modifications, qui est le même que celui utilisé dans Schwarz et coll.. 20. ce système est un des nombreux mais a des spécificités qui sont utiles pour cette méthode. C’est assez rapide pour que l’isolement des thylakoïdes, électrophorèse sur gel et TCSPC analyse pratique peuvent être effectuées en une seule journée, il ne soit pas des problèmes potentiels de conservation de l’échantillon et de la dégradation. Nous constatons également que cette méthode est robuste dans les mains des utilisateurs inexpérimentés, tout en offrant des résultats qui vont du bon au supérieur, selon le degré d’optimisation.

Il est important de garder à l’esprit que les complexes visualisées sur un gel natif dépendant sur le détergent et le tampon des systèmes utilisés, ainsi que sur la biologie de l’organisme incriminé. Différents systèmes de détergent et tampon préférentiellement séparent différents types de complexes, et un organisme photosynthétique donné auront différents complexes provenant d’autres organismes, pas ce qui se présentera sous aucune circonstance donnée. Le système décrit ici est particulièrement adapté à l’étude des megacomplexes PSI, comme décrit dans Schwarz et al. 20, mais il tombe sur la fin plus déstabilisante du spectre pour ceux qui étudient la PSII megacomplexes. Pour une étude approfondie des différents systèmes de détergent et de la mémoire tampon utilisée en électrophorèse native des protéines des thylakoïdes, il est recommandé de revoir Järvi et al. 21 et Rantala et al. 22.

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Protocol

1. préparation de Solutions stock pour le coulage des Gels natifs de vert

  1. Préparer un 4 x solution de tampon concentré pour résoudre les gels composé de 40 % de glycérol, glycine de 200 mM et 100 mM Tris tamponnée à pH 8,3.
  2. Préparer un 4 x solution de tampon concentré pour empilage gels composé de 40 % de glycérol, glycine de 200 mM et 100 mM Tris tamponnée à pH 6,3.
  3. Stocker ces tampons à 4 ° C pour empêcher la croissance de moisissures.
    Remarque : Les tampons sont stables pendant des mois à 4 ° C, préparation de 100-200 mL de chaque tampon pour une utilisation continue est recommandée.
  4. Préparer 1 L de 10 x tampon contenant 250 mM Tris HCl, pH 8,3, glycine de 1,92 M et le 1 % SDS. Stocker les 10 de mémoire tampon en cours d’exécution sur la paillasse.

2. préparation de la Solution stock pour l’isolement et la solubilisation des thylakoïdes

  1. Préparer 100 mL de tampon d’homogénéisation TMK contenant un tampon Tris 50 mM (pH 7), 10 mM MgCl2et 10 mM KCl et conserver à 4 ° C.
    Note : Ceci est le tampon principal pour l’homogénéisation et la manipulation des échantillons de thylakoïdes. Alternativement, des solutions concentrées de stock peuvent être préparées et diluées selon les besoins (tampon Tris, MgCl2et KCl peut tous être facilement stocké sur la paillasse comme concentre de 1 M).
  2. Préparer les solutions des thylakoïdes des détergents de solubilisation, B-décyl maltoside (DM) et n-octyle B-d-glucoside (OG), en dissolvant chaque détergent dans un tampon TMK 20 % w / v gel à-20 ° C dans les parties aliquotes 1 mL.
  3. Préparer le tampon de solubilisation de thylakoïdes (SB), qui est également le tampon de dissociation de l’échantillon.
    1. Tout d’abord, faire TMK-glycérol tampon en combinant 7 ml de tampon TMK et 3 ml de glycérol.
    2. À 800 μL de tampon de TMK-glycérol, ajouter 100 μL de solution étalon de DM et 100 μL de solution d’OG. Conserver cette solution de travail de SB, contenant OG DM et 2 % 2 %, congelé à-20 ° C dans les parties aliquotes 1 mL.
      Remarque : Chaque aliquote peut être décongelé et recongelé selon les besoins.

3. coulée vertes Mini Gels pour une utilisation ultérieure

  1. Préparer distinct empilage et résoudre les solutions gel dans des éprouvettes jetable de 15 mL.
    Remarque : Les volumes fournis sont suffisants pour un simple gel mini à l’aide d’entretoises 1,5 mm.
    1. Pour faire la solution de gel empilement, mélanger 1,25 mL 4 x 3,25 mL d’eau pour donner 5 mL de 4 % d’acrylamide dans 1 x tampon empilement empilement tampon de gel et 0,5 mL de solution mère de 40 % d’acrylamide (39 : 1 C). Pour faire la solution de gel résolution combiner 1,875 mL 4 x résolution 4,7 mL d’eau pour obtenir 7,5 mL de 5 % d’acrylamide dans 1 x solution tampon tampon et 0,94 mL de solution mère de 40 % d’acrylamide (39 : 1 C).
  2. Verser le gel résolution.
    1. Ajouter 50 μL de persulfate d’ammonium 10 % (APS) à la solution de gel résolution, puis ajouter 10 μL de TEMED, bouchon du tube et retourner doucement plusieurs fois pour mélanger. Versez immédiatement la solution de gel entre les plaques de gel, en laissant environ 1 cm entre le haut du gel résolution et bas des dents peigne pour le gel de concentration.
    2. Pipetez doucement 100 % éthanol sur le dessus du gel résolution au niveau du gel.
      Remarque : Si le gel ne définit pas moins de 15 min, il faudrait une solution fraîche APS et/ou TEMED nouvelle doit être utilisé.
    3. Après le gel a polymérisé (l’interface entre le gel et l’éthanol sera facilement visible et ne se déplacera pas lorsque le gel est perturbé), décanter de l’éthanol et la tache avec un papier absorbant.
  3. Verser le gel de concentration.
    1. Ajouter 25 μL de 10 % APS à la solution de gel empilement, ajouter 5 μl de TEMED, ensuite cap et inverti de mélanger de la même manière que le gel résolution. Verser la solution de gel sur le dessus du gel résolution jusqu'à ce que l’espace entre les plaques est complètement rempli et insérer un peigne de 10 puits.
      Remarque : Lorsque vous êtes prêt à servir, retirer le peigne du gel et rincer les puits avec de l’eau, en s’assurant que les puits sont droites et non obstruée par le gel. Le gel peut être stocké avec le peigne en place à 4 ° C pendant au moins plusieurs jours.

4. l’isolement des Membranes des thylakoïdes brut des épinards laisse

Remarque : Toutes les étapes effectuer sur glace à l’aide de tampons et matériel préalablement réfrigérée. Éclairage tamisé est également recommandée. Selon la discrétion de l’expérimentateur et les processus biologiques à l’étude, les inhibiteurs de protéase ou phosphatase devraient être ajoutés frais aux tampons TMK avant l’homogénéisation.

  1. Complètement homogénéiser les feuilles d’épinards dans un tampon TMK avec un homogénéisateur Dounce de verre.
    Note : Environ 1 à 2 mL de tampon est normalement suffisante pour une feuille d’épinard petit bébé. Une feuille d’épinard seul bébé permettent généralement assez de matériel pour charger plusieurs puits sur un gel mini de 1,5 mm.
  2. Filtrer l’homogénat de feuille brute pour enlever les débris insolubles.
    1. Pour faire un simple dispositif de filtrage, couper une tâche délicate essuyer au semestre et pliez-la en quartiers. Emballez la tâche délicate de lingette au fond d’une seringue de 5 mL et pré mouillage l’essuyer avec un tampon TMK.
    2. Le piston de la seringue permet d’appuyer sur excès de tampon sur la lingette tâche délicate et n’oubliez pas que le filtre de la lingette est pressé fermement au fond de la seringue après que le piston est supprimé.
    3. Pipeter l’homogénat de feuille vers le centre du filtre nettoyer et utiliser le piston pour passer l’homogénat à travers le filtre. Recueillir l’homogénat filtrée dans un tube à centrifuger 1,5 mL.
  3. Centrifuger l’homogénat à 5 000 x g pendant 10 min à 4° C pour granuler matières insolubles, y compris les membranes thylakoïdes. Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL de tampon TMK.
  4. Normaliser la quantité de chlorophylle dans chaque échantillon en ajustant le volume de chaque échantillon de thylakoïdes resuspendues afin que chaque échantillon contienne la même quantité totale de chlorophylle, tel que décrit ci-dessous.
    Remarque : Ceci permettra à chaque échantillon à être solubilisées dans le même volume de détergent et minimise la variabilité de la solubilisation en raison des différences dans le volume de granulés.
    1. Pour extraire la chlorophylle de chaque échantillon des membranes des thylakoïdes remises en suspension, prendre un 50 μL aliquote dans un tube de microtubes de 1,5 mL et ajouter 950 μl de méthanol. Boucher le tube et mélanger en retournant plusieurs fois.
    2. Centrifuger l’extrait de méthanol/chlorophylle à 10 000 x g pendant 10 min granuler protéines précipitées.
    3. Déterminer la concentration de chlorophylle du pigment contenant du surnageant selon Porra et al. 23. prendre des mesures d’absorbance à 652 et 665 nm à l’aide d’un spectrophotomètre et une cuvette de 1 cm. Déterminer la concentration de chlorophylle totale à l’aide de l’équation suivante :
      Chls a + b (μg/mL) = 22.12 (Abs 652 nm) + 2.71 (Abs 665 nm)
    4. À l’aide de mesures de concentration de chlorophylle comme guide, enlevez et jetez quelques volume de chaque échantillon, si nécessaire, afin que chaque tube contient la même quantité totale de chlorophylle.
  5. Re-pellet membranes thylakoïdes par centrifugation à 5 000 x g pendant 10 min. enlever et jeter le surnageant. Veillez à supprimer tous les surnageant sans aspirer tout le culot.

5. la solubilisation des Membranes des thylakoïdes pour le chargement des Gels natifs

  1. Décongeler une partie aliquote de la solution détergente TMK 30 % glycérol (SB) et inverser plusieurs fois pour mélanger. Gardez-le sur la glace.
  2. En ajoutant le volume approprié de SB pour donner une concentration de chlorophylle de 1 mg/mL, dissoudre le culot de thylakoïdes.
    Note : Cette concentration est un point de départ pour trouver les conditions optimales de solubilisation, qui doivent être déterminées de manière empirique. La concentration de chlorophylle doit rester les mêmes entre les échantillons pour permettre des comparaisons valables à apporter.
  3. Pipetter en haut et en bas à plusieurs reprises tout en prenant soin d’éviter de faire mousser de l’échantillon. Rester sur la glace afin de permettre à solubiliser les thylakoïdes.
    Remarque : Solubiliser pendant au moins 10 minutes. Temps de solubilisation devrait être assez longtemps que la différence de temps de solubilisation entre les échantillons est réduit au minimum.
    Exemple : Si 3 minutes sont nécessaires pour solubiliser tous les échantillons, puis environ 30 minutes devraient pouvoir de solubilisation.
  4. Centrifuger les thylakoïdes solubilisées à 10 000 x g à 4 ° C pour granuler matière insoluble.
    Remarque : Solubilisée thylakoïdes échantillons sont stables sur la glace pendant des heures, mais conservation à-70 ° C doit être évitée, comme les cycles de gel-dégel peuvent provoquer une perte de mégacomplexe bandes.

6. séparation des protéines des thylakoïdes solubilisée par électrophorèse sur Gel natif

  1. Charger le surnageant de thylakoïdes solubilisée préparées à l’étape 5.4 directement sur le gel natif préparée plus tôt. Pour un gel de 1,5 mm, charge 15 μL de thylakoïdes solubilisée par puits.
  2. Exécutez le gel vert natif dans essentiellement la même manière que les gels SDS-PAGE à l’aide de 1 x tampon. Exécutez le gel à 100 V et placez le réservoir de gel tout sur glace mouillée pendant la durée de la course afin d’atténuer le chauffage résistif du gel.
    Remarque : Le gel devrait nécessiter environ 2 heures pour le pigment libre à l’avant de la migration pour atteindre le fond du gel (Figure 1).

7. l’excision des thylakoïdes complexe bandes de Gels natifs de vert

Remarque : Excision de la bande spécifique d’intérêt du gel est nécessaire pour permettre à la bande pour être placé dans le chemin du faisceau et empêcher fluorescence parasite de complexes à proximité d’être collecté.

  1. Retirer le gel de la cellule de l’électrophorèse, puis rincez exécutant tampon hors les plaques de gel avec de l’eau distillée. Enlever la plaque supérieure du gel et de rincer le gel avec de l’eau distillée.
  2. Conserver le gel sur la plaque de verre de fond et placer le gel et la plaque sur la glace. Quand pas en service, garder le gel dans l’obscurité et recouvrir d’une pellicule de plastique pour éviter qu’il ne se dessèchent pas.
  3. Avec le gel restant sur la plaque de verre, l’accise chaque bande d’intérêt lorsqu’il est prêt pour l’analyse TCSPC. D’accise bandes proprement avec un scalpel tranchant ou une lame de rasoir et veiller à ce que la bande excisée ne contient aucun matériel de bande contaminantes.

8. collecte des spectres de Fluorescence en état stationnaire de la température ambiante

  1. Pour chaque complexe qui est analysé par TCSPC, un spectre de fluorescence de la température ambiante est pris entre 600 et 800 nm à l’aide d’un spectromètre à fluorescence.
    Remarque : La longueur d’onde d’excitation utilisée pour recueillir ce spectre doit correspondre à la longueur d’onde utilisée pour TCSPC.

9. TCSPC des bandes de Gel vert

Remarque : Reportez-vous à la Figure 2 pour une description de la configuration TCSPC.

  1. "Sandwich" de la tranche de gel entre deux lames microscopie de verre. Utilisez du ruban, placés à chaque extrémité de l’une des lames microscopie et plié à plusieurs reprises, pour créer des entretoises pour que les diapositives peuvent être tenus ensemble fermement sans comprimer la tranche de gel.
    Remarque : Cela va créer un chemin pour le faisceau laser à passer entre les lames de microscope et par l’intermédiaire de la tranche de gel.
  2. Ajouter une petite quantité d’eau à la tranche de gel sur le bord des lames de verre pour créer une interface lisse qui réduire la diffusion du signal.
  3. Pince dans la marche des rayons, la gel/diapositive sandwich afin que le faisceau frappe la tranche de gel par le bord libre des plaques, permettant l’émission de fluorescence à travers le côté des lames de verre où le gel est pris en sandwich, perpendiculaire au trajet du faisceau.
    Remarque : La longueur d’onde d’excitation utilisée dépendra de l’expérience. Une longueur d’onde de 435 nm va exciter la chlorophylle a et b de chlorophylle, tandis que 465 nm va exciter préférentiellement la chlorophylle b. Dans ce cas, 435 nm a été utilisé comme la longueur d’onde d’excitation.
  4. Collecter 10 000 points de données total à intervalles réguliers à travers le spectre d’émission de fluorescence pour chaque complexe. Par exemple, recueillir des données toutes les 10 nm, commençant à 680 nm et se terminant à 750 nm.
    Note : Préparez plusieurs bandes de gel pour chaque complexe à étudier ce nouvel échantillon est donc disponible dans le cas où le Photoblanchiment empêche la collection signal adéquat.

10. TCSPC (analyse des données)

  1. Pour un immeuble donné, tout d’abord normaliser la hauteur de chaque courbe de décroissance pour toutes les longueurs d’ondes recueillies.
    Remarque : Cette étape n’est pas nécessaire pour la construction de la DAS, mais permet des courbes de décomposition d’être superposées et comparées visuellement entre eux comme une première inspection des données.
  2. Queue-match chaque courbe de décroissance pour le spectre de fluorescence de l’état stationnaire du complexe tel que décrit ci-dessous.
    1. Choisissez un validant, après quoi le signal de la désintégration a aplati, habituellement au bout de quelques nanosecondes.
    2. Pour chaque longueur d’onde, normaliser la courbe de décroissance de sorte que l’intensité du signal en le validant sélectionné est égale à la valeur du spectre fluorescence stabilisé à cette longueur d’onde (c'est-à-dire, les valeurs de toutes les longueurs d’onde ensemble à la validant sélectionné recrée le spectre de fluorescence de l’état stationnaire).
  3. Construire des spectres de décomposition-associé (DAS) partir des courbes de décroissance queue assortie, tel que décrit ci-dessous.
    1. À l’aide de données points à partir des courbes de décroissance queue assortie construire une série de parcelles en traçant la courbe intensité de fluorescence vs longueur d’onde à intervalles réguliers (par exemple, chaque 10 ps). Par exemple, le DAS à 50 ps est construit en reportant la valeur de chaque courbe de décroissance à 50 ps vs longueur d’onde.
    2. Superposition de tous les spectres associés à désintégration pour créer un terrain de style cascade qui montre la décomposition du spectre de fluorescence au fil du temps.

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Representative Results

Les résultats représentatifs pour l’électrophorèse de gel vert sont présentés dans la Figure 1. Lane 1 fournit un exemple des résultats idéaux pour l’électrophorèse de gel vert des épinards thylakoïdes, dans lequel un nombre maximal de bandes vertes claires et nettes est visible. Ces résultats sont quelque peu atypiques, en partie parce que pas toutes les bandes vus en piste 1 sont normalement présents dans un échantillon donné. Nettoyage d’échantillon supplémentaire, sous la forme d’isolement chloroplastique avant la solubilisation de thylakoïdes et l’électrophorèse sur gel en gradient (4-7 % d’acrylamide) sont également normalement nécessaire pour obtenir des résultats optimaux. 2 voies et 3 résultats plus typiques obtenus en utilisant le protocole détaillé ici en conjonction avec un gel non pente de 5 %. Voies, 4, 5 et 6 fournissent un exemple de mauvais résultats due à l’augmentation des degrés du sous-solubilisation de l’échantillon de thylakoïdes. Voie 7 fournit un exemple des résultats typiques obtenus avec Arabidopsis thylakoïdes au lieu des épinards. Notez que pour Arabidopsis les bandes mégacomplexe en haut du gel ont tendance à être mal résolue par rapport à ceux dans les épinards.

Une représentation graphique de l’installation TCSPC utilisée pour collecter les données des bandes autochtones gel vert est illustrée à la Figure 2. La figure 3 montre un flux de travail typique pour le début de l’analyse après que TCSPC données ont été collectées comme décrit à l’étape 10. Lorsque TCSPC données collectées, chaque courbe correspondant à une longueur d’onde donnée représente un nombre arbitraire de points de données, ou « compte ». Lorsque ces courbes sont recouvertes d’un autre, comme illustré à la Figure 3 a, les courbes ne peuvent pas être comparés entre eux directement parce qu’ils ne sont pas représentés à la même échelle et peuvent pas tous être enregistrés au même point de départ temps. La première étape de l’analyse des données est donc de comparer chaque courbe de sa fonction de réponse instrument correspondant (IRF). Le pic de l’IRF pour une courbe donnée a la valeur au temps t = 0, et la fine pointe de la courbe de décroissance de fluorescence correspondant a la valeur chevauche le bord d’attaque de l’IRF, comme illustré à la Figure 3 b. Celle-ci définira toutes les courbes du registre de temps même pour une analyse ultérieure.

S’il n’est pas nécessaire pour la construction de la DAS, normaliser toutes les courbes à la même hauteur de pic à ce stade permet une comparaison utile entre les courbes à faire comme une première analyse des données. Dans la Figure 3, les courbes de décroissance même pour LHCII présenté dans la Figure 3 a sont indiqués après l’enregistrement du temps, comme dans la Figure 3 b, ainsi que la normalisation de hauteur de pic. Comme le montre la Figure 3D, courbes de décroissance pointe normalisée des différents complexes peuvent ensuite être superposées avec un autre à une longueur d’onde donnée, ce qui permet des différences de comportement entre les complexes à visualiser. Par exemple, LHCII possède une fluorescence caractéristique de longue durée qui se désintègre lentement, alors que la fluorescence de PSI est fortement trempé, en décomposition très rapidement. La courbe de décroissance de fluorescence de bande 5 fournit un exemple intéressant des données très suggestifs, en partie parce qu’il est clairement biphasique. La courbe de décroissance de la fluorescence initiale pour la bande 5 complexes suit le même rythme que les PSI pour environ 500 ps encore pourrit encore plus rapidement par la suite. Intriguant les résultats de ce type peut être analysé plus en détail par les spectres associés à désintégration construction (DAS).

Dans la Figure 4, représentant DAS cascade emplacements sont prévus pour LHCII et la bande 5 complexes. Construction de DAS nécessite tout d’abord que les courbes de décroissance pour un immeuble donné queue-mise en correspondance avec le spectre de fluorescence de température ambiante pour le complexe, tel que décrit à l’étape 11.2. Les résultats du filtrage de queue des courbes de décroissance pour LHCII sont indiquées dans la Figure 4 a. DAS sont ensuite créées à partir de ces courbes, comme indiqué au point 11.3. DAS pour LHCII ont été construits à partir des courbes de décroissance, illustrés à la Figure 4 a et les résultats sont présentés dans la Figure 4 b. DAS entre 0 et 100 ps ont été omis par souci de clarté et seulement présentés chaque 100 ps par la suite en raison de la décomposition lente caractéristiquement pour LHCII isolé. Le DAS pour LHCII se caractérise par le manque de fonctionnalités dynamiques, et la forme du spectre de fluorescence LHCII reste les mêmes que les désintégrations de signal au fil du temps. La décomposition du spectre de fluorescence est également retardée, nécessitant 100 ch à atteindre fluorescence maximale. Cela donne à penser, comme serait prévu pour isolé lumière complexes protéiques de la récolte, cette énergie n’est pas transférée entre pigments énergétiquement distinctes au sein du complexe comme les désintégrations de fluorescence. L’exception à cette règle est le passage dans le spectre qui se produisent durant les 100 premiers ps, probablement en raison de la redistribution initiale d’énergie d’excitation dans tout le complexe.

DAS pour la bande 5 complexes sont indiquées dans la Figure 4, construit de manière similaire à celle montrée pour LHCII. Bande 5 offre un contraste intéressant à LHCII de plusieurs façons. Par rapport à LHCII, fluorescence de bande 5 se désintègre beaucoup plus rapidement, atteignant une intensité maximale en seulement 30 ps et en décomposition à moins de 20 % de l’intensité initiale après 500 ps. Le spectre de fluorescence de la bande 5 complexe présente aussi un certain nombre de dynamiques intéressantes comme les désintégrations des émissions. En comparant les spectres à 0 et 60 ps montre clairement une augmentation en fluorescence à 720 nm au détriment de la fluorescence à 680 à 710 nm. Par la suite, le pic à 680 nm déplacements vers 690 nm et élargit, tandis que le pic à 720 nm déplacements vers 710 nm (e.g., comparer 60 ch à 500 ps). Données de ce type aide à infirmer la présence de protéines d’antenne LHCII non connectés tout en fournissant des preuves de transfert d’énergie de LHCII à l’antenne PSI et finalement le noyau de la PSI.

Ces dynamiques suggèrent également qu’il risquent d’être non résolues pics environ 680 nm, 690 nm, 710 nm et 720 nm. Ces données fournissent donc un exemple où caractéristiques spectrales pourraient être mieux résolus en recueillant des données TCSPC à intervalles plus étroites (par exemple tous les 5 nm plutôt que tous les 10 nm). Même en l’absence de la plus haute résolution spectrale, cependant, le DAS pour la bande 5 complexes sont un exemple de preuve pour le transfert d’énergie entre plusieurs espèces fluorescentes au sein d’un complexe. Il semble aussi être un pic rapidement en décomposition au-dessus de 740 nm, ce qui laisse supposer que les données doivent être également recueillies sur un spectre plus large pour inclure davantage les caractéristiques spectrales.

Figure 1
Figure 1 : résultats de gel vert représentant. Bandes de gel vert soumis à l’analyse TCSPC sont étiquetés PSI-LHCII (photosystème j’ai LHCII megacomplexes), PSI (photosystème j’ai LHCI), bande 5 (PSI-LHCII complexe), PSII-LHCII (photosystème II et associé de lumière-récolte complexe II), PSII (photosystème II cœurs complexe) et LHCII (complexe II lumière-récolte). Lane 1 montre un idéal marquage chromosomique résultant de l’isolement des chloroplastes avant la solubilisation et vert électrophorèse sur un gel d’acrylamide de dégradé de 4 à 7 %. Voies 2 et 3 montrent les résultats moyens de thylakoïdes simple isolement et électrophorèse sur un gel d’acrylamide de 5 % de non-gradient. Voies de 4 à 6 montrent la gravité croissante des sous-solubilisation. Voie 7 montre des résultats représentatifs d’Arabidopsis utilisant le protocole simple. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : schéma de corrélation temps de photon unique instrument de comptage. Source lumineuse est une façon passive mode bloqué NdYVO4 laser qui pompe un laser à colorant sous-évaluées cavité. impulsions 5-ps au taux de redoublement variable et longueurs d’onde sont caractérisées par une autocorrelator. Les impulsions sont divisées, avec une partie va vers une photodiode de référence et le reste passionnant de l’échantillon. Emission de l’échantillon est recueillie à l’aide d’un objectif de microscope et composants polarisés sont détectés à l’aide de deux canaux de détection. Emission de l’échantillon est temps résolu à l’aide de l’électronique de détection indiquée, où CFD = discriminateur de fraction constante, TAC = convertisseur temps-à-amplitude et MCA = analyseur multicanal. Résolution temporelle est déterminée par la fonction de réponse de l’instrument (ca. 40 ch). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : données brutes représentatives de TCSPC et fluorescence normalisée de désintégration courbes. (A) la superposition des données brutes de TCSPC pour LHCII. TCSPC données ont été recueillies tous les 10 nm entre 670 nm et l’affichage de courbe représentative 740 nm (B) A temps enregistrement des données de fluorescence à la fonction de réponse de l’instrument (IRF). (C) les données LHCII de (A) normalisés à une hauteur maximale de 1 après que toutes les courbes ont été enregistrés à leurs IRFs respectifs. (D) superposition de décroissance de la fluorescence courbes à 680 nm pour PSI, PSII, PSII-LHCII, LHCII et bande 5. Toutes les courbes de décomposition ont été normalisées à une hauteur maximale de 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Construction de style cascade DAS. (A) correspondant à des courbes de décroissance pour LHCII en préparation pour la construction de DAS parcelles de queue. (B) DAS parcelles pour LHCII pour un temps t = 0, pour chaque 100 ps de 100 à 500 ch et 1000 PS (C) DAS parcelles à bande 5 chaque 30 ps de t = 0 à 210 ch et chaque 100 ch par la suite à 500 ps. Pour les deux (B) et (C), temps = 0 est défini par l’IRF, qui est le Psaume 40 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Une solubilisation de thylakoïdes réussie et le gel natif exécuter seront traduira par la résolution de plusieurs bandes distinctes de verts visibles sur le gel sans distorsion importante ou bavures des bandes. Surcharge le gel, une forte concentration de détergent, un pH de l’échantillon incorrect, non dissous matériel, tourne le gel trop rapidement ou à une température trop élevée, et un gel mal coulé sont autant de facteurs qui peut-être contribuer aux complexes de thylakoïdes mal résolus. Tout en optimisant les conditions de gel lui-même (e.g., acrylamide concentrations dégradé), il peut aider à optimiser la résolution des groupes d’intérêt. C’est notre expérience, que les conditions de solubilisation et de la biologie de l’échantillon lui-même sont les principaux facteurs qui contribuent à la qualité et la quantité des thylakoïdes complexes résolu sur gels natifs de verts. Il est important de se rappeler que pas tous les complexes seront présents dans toutes les conditions biologiques.

Les gels verts natifs sont versées dans essentiellement la même manière que les gels minis normales de SDS-PAGE. Gels peuvent être versés dans la matinée et êtes prêts à utiliser le jour même, ou ils peuvent être stockés à 4 ° C pour plusieurs jours avec le peigne dans le gel et aucun changement important dans les performances. Standard, facilement disponible 39 : 1 C acrylamide solutions peuvent être utilisées pour verser les deux gels empilage et de résoudre. Ce qu’on appelle « grand pore » gels peuvent être faites à l’aide d’acrylamide:bis supérieur-acrylamide ratios (e.g., 100 : 1 C) afin d’accroître la séparation des megacomplexes en haut des gels, mais nous avons constater que cela a aussi tendance à entraîner en moins fortement résolu bandes. Dans notre expérience, la plus haute résolution de bande (avec le plus grand nombre de bandes séparées) est atteint le plus faible ratio de C et avec un gradient de concentration d’acrylamide linéaire de 5 à 7 %. Toutefois, si un ancien dégradé n’est pas disponible, séparation de bande très satisfaisante et la résolution peuvent être obtenus avec une concentration de gel résolution d’environ 5 % l’acrylamide. Il est important que l’électrophorèse effectués à relativement basse tension pour réduire le chauffage du gel, qui pourrait dénaturer les complexes, et autoriser des complexes natives séparer les uns des autres avec une haute résolution.

La méthode pour l’isolement de thylakoïdes donnée ici est rapide mais relativement « sale » (c.-à-d., il ne cherche pas à séparer les chloroplastes des autres organites ou les membranes des thylakoïdes des autres membranes cellulaires). Cela suffit aux fins de visualisation complexes de thylakoïdes et basés sur la fluorescence des mesures ultérieures, étant donné que les protéines contenant de la chlorophylle seulement sont visualisées. Il est à noter que pour d’autres applications en aval (e.g., deuxième dimension détection SDS-PAGE et protéine), protéines non-thylakoïdes seront présents. Il est à noter également que la meilleure résolution est obtenue quand les chloroplastes sont isolées avant de solubilisation, probablement en raison de l’enlèvement des matières insolubles avant la solubilisation. Lorsque selon la méthode décrite ici, les autres méthodes d’homogénéisation comme un mélangeur peut être utilisé, mais un verre Dounce homogénéisateur est rapide et efficace et permet de tout matériel de feuille homogénéisé à conserver quantitativement. Le ratio du matériau tampon à feuilles ne semble pas important, à notre connaissance. Environ 2 mL de tampon pour une moitié d’une feuille d’épinard de bébé est un bon point de départ mais peut être réglé selon les besoins expérimentaux.

Le rapport approprié de tampon de solubilisation de la chlorophylle est crucial pour l’optimisation des performances de gel vert et devrait être déterminé par l’expérimentateur pour une espèce végétale donnée ou le montage expérimental. Bonne solubilisation entraînera un surnageant vert émeraude clair et profond au-dessus un granule d’amidon blanc. Une couche de matière verte sur le dessus de la pastille blanche indique que les thylakoïdes ont été solubilisées en vertu. Sous-solubilisation doit être évitée, car elle se traduira par une mauvaise migration sur gel, y compris les bavures des bandes et ne fournira pas un motif précis de bandes. Les granules de thylakoïdes produites par cette méthode devraient être faciles de remettre en suspension et solubiliser. Dans le cas de granulés compacts qui ne peuvent pas être remises en suspension rapidement et de façon homogène une méthode alternative est recommandée. Échantillons peuvent d’abord être remis en suspension dans la moitié du volume du TMK-glycérol tampon, à laquelle s’ajoute ensuite un demi-volume supplémentaire du TMK-glycérol tampon contenant une concentration de X 2 de détergents.

Solubilisation excessive devrait également être évitée, car elle peut entraîner la perte de densité de certaines bandes de la mégastructure. En outre, il n’est pas possible de compenser une solubilisation en chargeant un plus grand volume d’échantillon sur le gel - nous avons trouvé que plus de 15 μl de l’échantillon / puits sur un gel de 1,5 mm de chargement réduit la qualité de la séparation ; bien que, ce faisant peut être souhaitable afin de visualiser les complexes peu abondantes. À l’inverse, chargement inférieur à 15 μL peut améliorer résolution de bande et réduire les bavures mais permettra de réduire la visibilité de certaines bandes de faible densités. En général, la concentration de protéines accrue tant de concentration accrue du détergent contribuent à une distorsion de la bande et gel bavures.

Pour le temps-corrélé photon unique comptant l’analyse des complexes gel vert (TCSPC), les longueurs d’onde d’excitation et d’émission doivent être choisies par l’expérimentateur à leur discrétion. Pour nos besoins, la longueur d’onde d’excitation choisie était de 435 nm, ce qui va exciter la chlorophylle a et la chlorophylle b. différentes longueurs d’onde peut, toutefois, être utilisé pour exciter les chlorophylles spécifiques ou autres pigments plus sélective (p. ex., une excitation longueur d’onde autour de 465 nm va exciter préférentiellement la chlorophylle b). De même, un spectre de d’émission de fluorescence qui couvre une région de 680 à 740 nm a été sélectionné sur les spectres d’émission signalés pour LHCII, PSI et PSII. Cette région couvre donc tous les éléments pertinents spectrales d’intérêt pour nos besoins. Les intervalles de longueur d’onde à laquelle les données sont récoltées sont également à la discrétion de l’expérimentateur. Des intervalles plus courts, comme tous les 5 nm au lieu de 10 nm, rendra possible de construire un spectre lié à la décomposition plus détaillé, mais cela nécessite plus de temps et peut ne pas être nécessaire. À l’inverse, intervalles plus longs peuvent échouer à résoudre les détails pertinents de spectrales.

Simplement superposer fluorescence normalisée des courbes de décomposition des différents complexes peut fournir des informations révélatrices sur les complexes. Fluorescence de LHCII, par exemple, est typiquement longue durée de vie, tout en fluorescence de PSI se désintègre beaucoup plus rapidement. Il faut à ce stade d’examiner les données par rapport à la fonction de réponse de l’instrument (IRF) pour s’assurer que la cinétique de dégradation observés sont temporairement résolu depuis le temps de réponse de l’instrument.

Construction de spectres associés à décroissance (DAS) d’après les données TCSPC crée une image beaucoup plus détaillée du transfert d’énergie entre les chromophores au sein d’un complexe que ce qui est possible simplement en regardant les courbes de décroissance isolés. Lors de la construction DAS, queue correspondant à des courbes de décroissance TCSPC pour le spectre de fluorescence de l’état stationnaire est nécessaire parce que l’intensité du signal recueilli par TCSPC est arbitraire. Aux points de longtemps comme 5 000 ch, cependant, l’intensité de fluorescence à une longueur d’onde donnée (la « queue » de la décroissance) est le même que l’intensité de fluorescence de l’état stationnaire pour cette longueur d’onde. Le spectre de fluorescence en état stationnaire peut donc servir de normaliser toutes les désintégrations TCSPC afin que leurs queues sont équivalentes pour le spectre de l’état stationnaire. Cela donne la véritable intensité relative du signal de fluorescence pour chaque courbe de décroissance. Toute la série de DAS, lorsque superposées ensemble dans le style de tracé de cascade, fournit une représentation graphique de la décomposition du spectre de fluorescence au fil du temps. Si les parcelles sont effectués pour assez longtemps points dans le temps (à la queue de la courbe de décroissance), l’intrigue de cascade décroîtra tout le chemin pour le spectre de fluorescence en état stationnaire. Le point de temps plus tôt, en revanche, est déterminé par la fonction de réponse de l’instrument TCSPC.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.

Acknowledgments

Financement et le soutien ont été fournis par le département de chimie à la Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycine Sigma G8898
Tris base Sigma #648310
SDS Sigma L3771
Decyl Maltoside Sigma D7658 n-decyl beta d maltopyranoside, not dodecyl maltoside or alpha decyl maltoside
Octyl Glucoside Sigma O8001
Acrylamide BioRad 161-0148 37.5/1 C 40% solution
TEMED BioRad 161-0800
Ammonium Persulfate BioRad 161-0700
Magnesium Chloride Sigma M2670
Potassium Chloride Sigma P9333

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References

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