गंभीर रूप से बीमार रोगियों में पूरे रक्त एंडोटॉक्सिया की जांच के लिए एंडोटॉक्सिन गतिविधि परख

JoVE Journal
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

हम इसके द्वारा मानव पूरे रक्त के नमूनों के endotoxin गतिविधि बिस्तर पर मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं. Endotoxin गतिविधि परख प्रदर्शन करने के लिए एक सरल परीक्षण है और सेप्सिस के साथ गंभीर रूप से बीमार रोगियों में एक उपयोगी biomarker हो सकता है.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pinciroli, R., Checchi, S., Bottiroli, M., Monti, G., Casella, G., Fumagalli, R. Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients. J. Vis. Exp. (148), e58507, doi:10.3791/58507 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

लाइपोपॉलीसैकराइड, जिसे एंडोटॉक्सिन के रूप में भी जाना जाता है, ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया का एक मौलिक घटक है और सेप्सिस और सेप्टिक सदमे के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक संक्रामक प्रक्रिया है कि तेजी से एक गंभीर बीमारी के लिए विकसित हो रहा है की जल्दी पहचान एक तेज और अधिक गहन उपचार शीघ्र हो सकता है, जिससे संभावित बेहतर रोगी परिणामों के लिए अग्रणी. एंडोटॉक्सिन गतिविधि (EA) परख प्रणालीगत एंडोटॉक्सिया के एक विश्वसनीय बायोमार्कर के रूप में बिस्तर पर इस्तेमाल किया जा सकता है। ऊंचा endotoxin गतिविधि के स्तर का पता लगाने बार बार सेप्सिस और सेप्टिक सदमे के साथ रोगियों में एक वृद्धि की बीमारी की गंभीरता के साथ जुड़े दिखाया गया है. परख त्वरित और प्रदर्शन करने के लिए आसान है। संक्षेप में, नमूने के बाद, पूरे रक्त की एक alicot एक विरोधी endotoxin एंटीबॉडी के साथ और जोड़ा LPS के साथ मिलाया जाता है. एंडोटॉक्सिन गतिविधि को प्राइमेड न्यूट्रोफिल्स के सापेक्ष ऑक्सीडेटिव फट के रूप में मापा जाता है जैसा कि केमोल्युमिनेसीसेंस द्वारा पता लगाया गया है। परख के उत्पादन से एक पैमाने पर व्यक्त की है 0 (absent) करने के लिए 1 (अधिकतम) और के रूप में वर्गीकृत "कम" (और lt;0.4 इकाइयों), "मध्यस्थ" (0.4-0.59 इकाइयों), या "उच्च" ($0.6 इकाइयों). विस्तृत पद्धति और ईए परख के कार्यान्वयन के लिए तर्क इस पांडुलिपि में रिपोर्ट कर रहे हैं.

Introduction

Lipopolysaccharide (LPS), भी endotoxin के रूप में जाना जाता है, ग्राम-नकारात्मक (जीएन) बैक्टीरिया की झिल्ली संरचना का एक प्रमुख घटक है। यह कोशिका दीवार के बारे में 10% बनाता है, बाहरी झिल्ली अखंडता और homeostasis के लिए महत्वपूर्ण जा रहा है. इसके अलावा, यह मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली 1,2का एक शक्तिशाली उत्प्रेरक है।

एलपीएस के लिए सहज प्रतिरक्षा प्रणाली कोशिकाओं के इनविट्रो जोखिम में कई जीनों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन होताहै 3. स्वस्थ मानव स्वयंसेवकों में एलपीएस की बहुत कम मात्रा का प्रशासन तीव्र प्रणालीगत सूजन के झरना को ट्रिगर करता है, जबकि सेप्सिस और सेप्टिक सदमे उच्च एंडोटॉक्सिन सांद्रता4,5के साथ उत्पन्न हो सकते हैं .

सेपसिस एक जीवन-धमकी देने वाली स्थिति है, जिसे तुरंत मान्यता नहीं दी जाती है, तो बहु-अंग विफलता और मौत का कारण बन सकता है। सेप्टिक रोगियों को एक समय पर तरीके से इलाज किया जाना चाहिए, आक्रामक पुनर्जीवन, पर्याप्त एंटीबायोटिक थेरेपी, इष्टतम स्रोत नियंत्रण, और शीघ्र अंग समर्थन रणनीतियों के साथ। सेप्सिस के ईटियोलॉजी का निदान मुख्य रूप से नैदानिकमान्यता और संस्कृति आधारित रोगज़नक़ का पता लगाने 6 पर आधारित है। तथापि, माइक्रोबियल संस्कृतियों के परिणाम 48 एच तक लग सकते हैं और7मामलों के 30% तक अनिर्णीत हो सकते हैं। प्रारंभिक पहचान और हस्तक्षेप बेहतर रोगी परिणामों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. जिन रोगियों में सेप्सिस संदिग्ध है, उनमें अक्सर एंडोक्सिमिया के स्पष्ट संकेत के बिना शारीरिक और जैव रासायनिक मापदंडों के आधार पर निर्णय किए जाते हैं।

एंडोटॉक्सिन गतिविधि (EA) की माप पूरे रक्त में एक वाणिज्यिक परख के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें)। यह रोग गंभीरता के प्रारंभिक स्तरीकरण के लिए प्रणालीगत एंडोक्रॉक्सेमिया के एक बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, विशेष रूप से सेप्टिक सदमे8के विकास के लिए जोखिम में रोगियों में. परख सेप्टिक सदमे9के साथ रोगियों में हाल ही में प्रकाशित डबल अंधा यादृच्छिक नियंत्रित नैदानिक परीक्षण में Polymyxin बी hemoperfusion चिकित्सा मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. गंभीर रूप से बीमार रोगियों में, चिकित्सा अध्ययन से पता चला कि कई अंग रोग, गहन देखभाल इकाई (आईसीयू) रहने की लंबाई, और मृत्यु दर10के साथ जुड़े होने के लिए बढ़ी हुई ईए के स्तर से जुड़ा हुआ है।

एंडोटॉक्सिन का पता लगाने के लिए विभिन्न परख विकसित की गई हैं। Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) परख, या तो एक जेल-क्लॉट, turbidimetric, या क्रोमोजेनिक परीक्षण के रूप में, अब तक सबसे अक्सर सीरम endotoxin के आकलन के लिए अपनाया गया है. यह घोड़े की नाल केकड़ा, लिमुलस पॉलीफिमसके हेमोलिम्फ के जमावकोश को प्रेरित करने के लिए एंडोटॉक्सिन की क्षमता पर आधारित है। हालांकि, इस परख विशिष्टता के मामले में कुछ सीमाएं हैं. विशेष रूप से, यह भी endotoxin के अलावा अन्य माइक्रोबियल उत्पादों द्वारा सक्रिय किया जा सकता है, इस तरह के कवक सेल दीवार के घटकों के रूप में, और यह विभिन्न मानव प्लाज्मा प्रोटीन11द्वारा बाधित किया जा सकता है।

पिछले दशक के दौरान ईए की माप विकसित किया गया है और endotoxemia घूम के एक biomarker के रूप में मान्य. LAL परीक्षण की तुलना में, ईए जल्दी और नैदानिक सेटिंग में लागू करने के लिए आसान है. इसके अलावा, यह वृद्धि की संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ, पूरे रक्त में LAL की तुलना में अधिक सटीक होना दिखाया गया है, दोनों इन विट्रो में और विवो12में.

सेप्सिस कारक एजेंटों के रूप में जीएन बैक्टीरिया की तेजी से पहचान के लिए एक प्रारंभिक नैदानिक उपकरण के रूप में अपने प्रारंभिक कार्यान्वयन के बावजूद, ईए स्तर भी रोग गंभीरता के एक biomarker के रूप में अध्ययन किया गया है. इस संदर्भ में, यह विशेष रूप से इस तरह के सेप्टिक सदमे या बाद हृदय गिरफ्तारी सिंड्रोम13के रूप में चल रही गंभीर बीमारी के कारण hypoperfusion राज्य का आकलन करने के लिए उपयोगी दिखाया गया है. हाल ही में, हेमोशुद्धि प्रणालियों के विकास के बाद से, एक सकारात्मक ईए परिणाम भी एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में प्रस्तावित किया गया है ताकि इस तरह के चिकित्सा14के लिए संभावित उम्मीदवारों की सही पहचान की जा सके। हमने हाल ही में सेप्टिक शॉक वाले 107 रोगियों में ईए के प्रारंभिक उच्च स्तर के प्रसार और नैदानिक महत्व पर एक अवलोकन पूर्वव्यापी अध्ययन किया है। अन्य हाल के परिणामों के साथ लाइन में, हमने पाया कि ईए सेप्टिक सदमे15के साथ रोगियों में रोग की गंभीरता का एक आशाजनक मार्कर है।

वर्तमान पांडुलिपि का उद्देश्य ईए परख प्रदर्शन करने के लिए विधि का वर्णन करने के लिए है, या तो बिस्तर पर या प्रयोगशाला में, और सेप्टिक सदमे के एक प्रतिनिधि परिदृश्य में इसके संभावित उपयोग का वर्णन करने के लिए. इस तकनीक को एक एंटी-एंडोटॉक्सिन एंटीबॉडी और एलपीएस के परिसरों द्वारा उनके प्राइमिंग के बाद न्यूट्रोफिल में बढ़ाया ऑक्सीडेटिव फट को मापने के द्वारा एलपीएस गतिविधि का पता लगा सकते हैं। बढ़ी हुई श्वसन फट एक chemiluminometer द्वारा पता चला है और उत्सर्जित प्रकाश की मात्रा रक्त के नमूने में endotoxin की मात्रा के लिए आनुपातिक माना जाता है. परख कुछ अभिकर्मकों की आवश्यकता है, के बारे में 30 मिनट लगते हैं प्रदर्शन और पूरे रक्त12के रूप में कम से कम 40 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करता है .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

प्रोटोकॉल मानव biospecimens से निपटने और हमारे नैदानिक प्रयोगशाला के वर्तमान मानक ऑपरेटिव प्रक्रियाओं का पालन करने से संबंधित संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया जाता है. ईए डेटा और रोगियों की नैदानिक जानकारी का उपयोग परीक्षण किया जा रहा है हमारे संस्थान के मानव अनुसंधान नैतिकता समिति के दिशा निर्देशों का पालन करता है.

1. प्रयोगशाला उपकरण और परख किट सामग्री

  1. उपयोग में न होने पर EA किट को 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें.
  2. प्रत्येक ईए परीक्षण ट्यूबों के 5 विभिन्न प्रकार के होते हैं; परीक्षण के किसी भिन्न भाग के लिए प्रत्येक एक का उपयोग करें (अनुभाग 2 देखें).
    1. एक विशिष्ट एंटीबॉडी की अनुपस्थिति में रोगी के न्यूट्रोफिल के गैर विशिष्ट ऑक्सीडेटिव फट के बेसल गतिविधि को मापने के लिए ट्यूब #1 ( "नियंत्रण" ट्यूब) का उपयोग करें।
    2. एलपीएस-एंटीबॉडी परिसर के जवाब में ऑक्सीडेटिव फट को मापने के लिए ट्यूब #2 ( "नमूना" ट्यूब) का उपयोग करें।
    3. एंडोटॉक्सिन की अधिकता के जवाब में रोगी के न्यूट्रोफिल के अधिक से अधिक ऑक्सीडेटिव फट को मापने के लिए ट्यूब #3 का उपयोग करें ( "मैक्स" ट्यूब)।
    4. exogenous अंतर्विष के एक स्रोत के रूप में ट्यूब #4 का प्रयोग करें ( "LPS" ट्यूब)।
    5. रक्त भंडारण के लिए ट्यूब #5 ("एलिकोट" ट्यूब) का उपयोग करें।
      नोट: ट्यूबों के डुप्लिकेट #1, #2 और #3 प्रत्येक रक्त नमूने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए 8 ट्यूबों की कुल के लिए प्रदान की जाती हैं परीक्षण किया जा रहा (ईए अभिकर्मक बोतल और गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण एक थैली में निहित सभी परीक्षणों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है).
  3. EDTA anticoagulant युक्त बाँझ ट्यूबों में रोगी रक्त के नमूने लीजिए. ईए परीक्षण चलाने से पहले कमरे के तापमान पर रक्त के नमूने स्टोर।
  4. परीक्षण शुरू करने से पहले, केमियुमिनोमीटर और इनक्यूबेटर शेकर चालू करें। 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान के लिए इनक्यूबेटर गर्म करें।
  5. आदर्श रूप में, रक्त संग्रह से 30 मिनट के भीतर नमूना प्रसंस्करण शुरू करते हैं।

2. एंडोटॉक्सिन गतिविधि परख

  1. प्रत्येक रोगी के रक्त के नमूने के लिए ईए टेस्ट ट्यूब तैयार करें जिसे आपको परीक्षण करने की आवश्यकता है। ट्यूब रैक में ट्यूब रखो. फिर कैप हटा दें.
  2. एक combipipette का उपयोग करना, पाइपेट एक 1 एमएल मात्रा EA अभिकर्मक की बोतल से ट्यूब में #1 (नियंत्रण ट्यूब), #2 (नमूना ट्यूब) और #3 (मैक्स ट्यूब), डुप्लिकेट में हर एक.
    नोट: वापस ऊपर splashing समाधान से बचने के लिए ट्यूब के पक्ष नीचे पिपेट.
  3. 20 बार के लिए रक्त संग्रह ट्यूब को धीरे से उलटकर रोगी के रक्त के नमूने को मिलाएं। फिर, ट्यूब #4 (एलपीएस मैक्स ट्यूब) और ट्यूब #5 (एलिकोट ट्यूब) में रोगी रक्त के पिपेट 0.5 एमएल। भंवर ट्यूब 10 s के लिए #4.
  4. इनक्यूबेटर शेकर में सभी ईए टेस्ट ट्यूबों के साथ ट्यूब रैक रखो। 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर 10 मिनट के लिए ढक्कन और इनक्यूबेट बंद करें।
  5. ढक्कन खोलें और इनक्यूबेटर शेकर से ट्यूब रैक को हटा दें। भंवर ट्यूब #5 (एलिकोट ट्यूब)। एक बाँझ टिप का उपयोग करना, पाइपेट 40 डिग्री सेल्सियस ट्यूब ों में रक्त की #1 और #2, डुप्लिकेट में.
  6. भंवर ट्यूब #4 (एलपीएस ट्यूब)। एक ही पिपेट टिप का उपयोग करना, ट्यूब से रक्त के पिपेट 40 डिग्री सेल्सियस ट्यूब #3 (मैक्स ट्यूब) में #4, डुप्लिकेट में।
  7. भंवर छह अंतिम परीक्षण ट्यूब (#1, #2, #3, और संबंधित डुप्लिकेट), तो उन्हें अपने रैक में वापस जगह है.
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी ट्यूबों समय की एक ही राशि के लिए भंवर रहे हैं.
  8. ट्यूब रैक को इनक्यूबेटिंग शेकर में वापस डाल दें और ढक्कन बंद कर दें। 100 आरपीएम पर इनक्यूबेटिंग शेकर सेट करें, फिर 14 मिनट के लिए प्रस्ताव शुरू करें।
  9. chemiluminometer में EA लेबल चिपकार्ड डालें और प्रारंभ करें. 14 मिनट ऊष्मायन के बाद, सही क्रम में EA ट्यूबों को पढ़ने के लिए chemiluminometer पर प्रदर्शित निर्देशों का पालन करें।
  10. धीरे यह chemiluminometer के नमूना धारक पर रखने से पहले 10 s के लिए प्रत्येक ट्यूब भंवर. नमूना दराज खोलें और नमूना धारक में ट्यूब #1 रखें। फिर, नमूना दराज बंद करें और सापेक्ष लाइट यूनिट (RLU) पढ़ने के लिए प्रतीक्षा करें।
  11. ट्यूब 2 और ट्यूब 3 के लिए चरण 2.10 दोहराएँ.
  12. डुप्लिकेट ट्यूब 1, 2, और 3 के लिए चरण 2.10 दोहराएँ.
    नोट: चरण 2.10-2.12 के दौरान समय की एक ही राशि के लिए सभी ट्यूबों भंवर की कोशिश करो.
  13. सभी ट्यूबों संसाधित किया गया है के बाद, ईए परिणाम की गणना और स्वचालित रूप से मुद्रित किया जाएगा कि ध्यान दें। स्तर ईए इकाइयों के रूप में व्यक्त कर रहे हैं और एक ही नमूने से डुप्लिकेट निर्धारण के मतलब का प्रतिनिधित्व करते हैं.
  14. प्रत्येक रक्त नमूने के लिए 2.2 से 2.13 तक चरणों को दोहराएँ जिनका परीक्षण किए जाने की आवश्यकता है।
  15. एक बार परख पूरा हो गया है, अप करने के लिए 30 दिनों के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर शेष परीक्षण ट्यूबों और ईए अभिकर्मकों की दुकान.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एक 72 वर्षीय व्यक्ति को एक शैक्षणिक शहरी अस्पताल के आपातकालीन विभाग (ईडी) में भर्ती कराया गया था। कुछ दिन पहले वह पेशाब पर जलने की शिकायत अपने प्राथमिक देखभाल चिकित्सक को प्रस्तुत किया था. मौखिक फॉस्फोमाइसिन के साथ एक लघु पाठ्यक्रम चिकित्सा की सिफारिश की गई थी। उनके चिकित्सा इतिहास उच्च रक्तचाप, सीधी प्रकार-2 मधुमेह और सौम्य प्रोस्टेटिक hyperplasia शामिल थे. उनकी दवाओं में एनेल्प्रिल, एटरवास्टेटिन, टैमसुलोसिन और मेटफार्मिन शामिल थे।

ईडी में, वह सुस्त था, उलझन में जब जागा. उसका तापमान 39.1 डिग्री सेल्सियस था, दिल की दर प्रति मिनट 125 धड़कता था, रक्तचाप 80/40 mmHg था, श्वसन दर 20/मिनट था, और SPO2 कमरे की हवा में 94% था, एक नाक cannula के माध्यम से 4 एल / पेट की परीक्षा सामान्य थी, खराब स्थानीयकृत हल्के suprapubic कोमलता को छोड़कर. कठिनाई के साथ, एक Foley कैथेटर रखा गया था. काले रंग की पीप मूत्र की एक कम मात्रा में सूखा था.

रक्त की पूरी गणना से पता चला कि 18.5 x 103की सफेद कोशिका ओंटगई है . Creatinine था 2.7 mg/dL, ग्लूकोज था 250 mg/dL, और लैक्टिक एसिड स्तर था 4.5 mmol/L धमनी रक्त गैस विश्लेषण मिश्रित एसिडोसिस से पता चला, पीएच 7.23 के साथ, पीसीओ2 48 mmHg, पी ओ2 88 mmHg, और HCO3- 15 mmol/L.

एक केंद्रीय शिरापरक कैथेटर रखा गया था, अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन के साथ, सही आंतरिक जुगल नस में. एक रक्त गैस विश्लेषण कैथेटर प्लेसमेंट पर प्राप्त किया गया था, एक 63% ScVO2 मूल्य खुलासा. आक्रामक तरल पुनर्जीवन तुरंत 30 मिनट से अधिक एक 30 एमएल/ रोगी को सेप्टिक सदमे के निदान के साथ आईसीयू में स्थानांतरित कर दिया गया था, जिसकी संभावना मूत्र पथ के संक्रमण से उत्पन्न होती है।

आईसीयू में, माइक्रोबियल संस्कृतियों संग्रह और अनुभवजन्य एंटीबायोटिक थेरेपी प्रशासन के बीच, ईए परीक्षण के लिए एक पूरे रक्त का नमूना प्राप्त किया गया था। इस परख को इस प्रकार प्रस्तुत प्रोटोकॉल के अनुसार तेजी से किया गया।

ईए परिणामों की गणना करने के लिए, केमियुमिनोमीटर रिकॉर्ड: न्यूट्रोफिल का आधार संदीप्ति (L1); रक्त के नमूने में एलपीएस के जवाब में न्यूट्रोफिल गतिविधि की संदीप्ति (L2); एलपीएस (L3) के लिए बड़े पैमाने पर जोखिम के जवाब में अधिकतम न्यूट्रोफिल गतिविधि. परिणाम के रूप में व्यक्त कर रहे हैं: Endotoxin गतिविधि (EA) ] (L2-L1)/(L3-L1). इसलिए, परिणामस्वरूप ईए मान रोगी के न्यूट्रोफिल ऑक्सीडेटिव फट की डिग्री को दर्शाता है परिसंचरण एंडोटॉक्सिन की उपस्थिति के कारण (L2), संदीप्ति के उच्चतम स्तर द्वारा सामान्यीकृत जो एक के जवाब में एक ही रक्त नमूने में मापा जा सकता है एलपीएस (एल 3) की उच्च-अधिकतम एकाग्रता। दोनों मूल्यों नमूना के बेसल संदीप्ति के लिए नियंत्रित कर रहे हैं (L1).

लगभग 30 मिनट के बाद, चिकित्सक ने स्वीकार किया 0.75 ईए इकाइयों रोगी के endotoxin गतिविधि स्तर हो.

एक ईए मूल्य कम से कम 0.40 ईए इकाइयों एक कम endotoxin गतिविधि स्तर इंगित करता है, एक कम घूम LPS एकाग्रता के बराबर है, जो एक गंभीर रोग राज्य के लिए प्रगति के एक कम जोखिम का प्रतिनिधित्व करता है. 0.40 ईए और 0.59 ईए इकाइयों के बीच परिणाम एक मध्यवर्ती endotoxin गतिविधि स्तर को इंगित करता है, जो गंभीर सेप्सिस और सेप्टिक सदमे के विकास के लिए एक ऊंचा जोखिम का प्रतिनिधित्व करता है. परिणाम के बराबर या अधिक से अधिक 0.60 ईए इकाइयों एक उच्च endotoxin गतिविधि स्तर को इंगित करता है, जो सेप्टिक सदमे और गरीब रोगी परिणामों के लिए एक उच्च जोखिम का प्रतिनिधित्व करता है (तालिका 1).

सेप्टिक सदमे का निदान, जीएन बैक्टीरिया के कारण होने की संभावना, इसलिए पुष्टि की गई थी। रोगी भी अत्यंत उच्च जोखिम पर होने के रूप में वर्गीकृत किया गया था, सहवर्ती अंग विफलताओं और लैक्टेट स्तर के सबूत के साथ लाइन में. वह इसके अलावा आक्रामक मात्रा पुनर्जीवन और vasoactive समर्थन के साथ इलाज किया गया. Polymixin-बी हीमोशुद्धि चिकित्सा पर विचार किया गया था, अभी तक लागू नहीं, तरल पदार्थ और vasopressors के लिए रोगी के समझाने जल्दी प्रतिक्रिया के कारण. दूसरे दिन, Escherichia कोलाई सकारात्मक रक्त संस्कृतियों के माध्यम से कारक एजेंट के रूप में पुष्टि की गई थी. उपयुक्त एंटीबायोटिक थेरेपी के साथ, रोगी ठीक हो गया, 7 दिन आईसीयू से छुट्टी दे दी गई। आईसीयू डिस्चार्ज से पहले दूसरा ईए टेस्ट किया गया। 0.2 ईए इकाइयों के परिणाम सेप्टिक सदमे से शुरू होने वाले जैव रासायनिक झरना के पूर्ण समाधान का संकेत दिया।

चित्र 1 सेप्टिक सदमे रोगियों की एक नमूना आबादी में 24 ज के भीतर मापा ईए मूल्यों के वितरण से पता चलता है.

Figure 1
चित्र 1: एंडोटॉक्सिन गतिविधि (ईए) स्तरों का वितरण गंभीर रूप से बीमार रोगियों की आबादी में सेप्टिक सदमे शुरुआत से 24 एच के भीतर मापा जाता है (द $ 107)। अनुमति के साथ Bottiroli, आदि अल से अनुकूलित15. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ईए इकाइयों एंडोटॉक्सिन गतिविधि स्तर
(lt;0.40 कम
0.40 - 0.59 मध्यवर्ती
$0.60 उच्च

तालिका 1: Endotoxin गतिविधि के स्तर की श्रेणियाँ. ईए - एंडोटॉक्सिन गतिविधि।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

सेप्टिक सदमे आजभी भी 40% के रूप में उच्च के रूप में एक मृत्यु दर के साथ जुड़ा हुआ है, हालांकि यह दर माना रिपोर्ट16के अनुसार भिन्न होता है. उपन्यास और बेहतर biomarkers के लिए की जरूरत है क्रम में जल्दी निदान में चिकित्सकों की सहायता के लिए क्षेत्रों में सबसे विशेषज्ञों द्वारा वकालत की है, बेहतर प्रबंधन, और सेप्टिक सदमे6के साथ रोगियों की भविष्यवाणी .

एक ईए परीक्षण प्रदर्शन पिछले तकनीकी ज्ञान या परिष्कृत प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता नहीं है, और किसी भी स्वास्थ्य सेवा प्रदाता आसानी से और जल्दी से इसे चलाने के लिए सीख सकते हैं. एक उच्च घूम ईए की शीघ्र पहचान रोगी के जोखिम को strateifying में मदद कर सकता है, एक पहले और अधिक आक्रामक चिकित्सीय दृष्टिकोण ट्रिगर. इसके विपरीत, कम से कम 0.40 ईए इकाइयों का एक ईए परिणाम बहु अंग विफलता17के लिए प्रगति के एक कम जोखिम का संकेत हो सकता है. अपने स्वयं के नियंत्रण के रूप में रोगी के नमूनों का उपयोग सरल है, इस परीक्षण और अधिक संवेदनशील और endotoxemia के सच्चे रक्त स्तर का एक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व करता है.

LPS-एंटीबॉडी परिसरों और रोगी के अपने न्यूट्रोफिल का उपयोग संभवतः अन्य कारकों (जैसे प्लाज्मा प्रोटीन) द्वारा बाधित होने से ईए परीक्षण की रक्षा करता है। एक ही अन्य परीक्षण के लिए नहीं कहा जा सकता है, लाल परीक्षण की तरह, जो एक स्कंदन झरना के सक्रियण की आवश्यकता है. LAL परीक्षण अच्छी तरह से करता है जब endotoxin एक विशिष्ट रिसेप्टर से बाध्य नहीं है, लेकिन प्लाज्मा और पूरे रक्त में विभिन्न प्रोटीन एलपीएस बाँध, परख के साथ हस्तक्षेप. इसके अलावा, कवक उत्पादों limulus स्कंदन झरना ट्रिगर कर सकते हैं, परीक्षण जीएन बैक्टीरिया के लिए कम विशिष्ट बना रही है. इन कारणों के लिए, ईए अभी भी आमतौर पर अपनाया लाल परीक्षण से बेहतर है endotoxemia के मूल्यांकन के लिए18.

हालांकि, ईए परीक्षण के लिए विश्वसनीय होने के लिए, ऊपर बताए गए चरणों का सावधानी से पालन करना महत्वपूर्ण है। परीक्षण किया जा रहा नमूना के endotoxin स्तर समय के साथ chemiluminscence कंप्यूटिंग द्वारा गणना की है, बेसल को मापने (ट्यूब #1) और संदर्भ मूल्यों के रूप में एक ही रक्त नमूने के लिए अधिकतम (ट्यूब #3) प्रतिक्रियाओं. इसलिए, तीन ट्यूबों को सावधानीपूर्वक को कोमीलुमिनोमीटर में सही क्रम में रखना अनिवार्य है।

नैदानिक अभ्यास में ईए के स्तर का उपयोग एक संभावित संक्रामक रोग के workup में मानक परीक्षण (जैसे प्रयोगशाला परीक्षण और रक्त संस्कृतियों) की जगह नहीं होना चाहिए. हालांकि एलपीएस स्पष्ट रूप से जीएन बैक्टीरिया झिल्ली उत्पादों की रिहाई के साथ जुड़ा हो सकता है, endotoxemia के उच्च स्तर भी अन्य एजेंटों के कारण संक्रमण के मामले में सूचित किया गया है19. यह बहुत अच्छी तरह से ज्ञात है कि एंडोटोक्मिया आंत श्लेष्म के माध्यम से बैक्टीरिया के स्थानांतरण के कारण हो सकता है, विशेष रूप से जब भी ऊतक hypoperfusion और वृद्धि हुई आंत बाधा पारगम्यता होने की संभावना है20,21. ऐसी स्थितियों के तहत, यह एक परिणाम होने के लिए LPS घूम उम्मीद करने के लिए संभव है, बजाय कारण, सेप्सिस और सदमे की. इस परिदृश्य में, ईए चल रहे ऊतक चोट की गंभीरता के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है, जीवाणु एटियोलॉजी15की परवाह किए बिना. इस सिद्धांत का समर्थन करते हुए, हाल ही में एक अध्ययन में ग्रिमाल्डी एट अल ने पाया कि ईए के स्तर की ऊंचाई को अस्पताल के बाहर कार्डियक गिरफ्तारी13के बाद सदमे की गंभीरता और अवधि के साथ जुड़ा हुआ पाया गया।

दिलचस्प है, Virz एट अल भी प्रकार के साथ रोगियों में endotoxin (और इसकी निगरानी) की संभावित भूमिका पर प्रकाश डाला 5 cardiorenal सिंड्रोम, एक हालत विभिन्न प्रणालीगत विकारों की स्थापना में सहवर्ती हृदय और गुर्दे रोग की विशेषता , जैसे सेप्सिस23 . एंडोटॉक्सिन कार्डियक मायोसाइट्स की हानि को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है, हालांकि सटीक पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र काफी हद तक स्पष्ट नहीं है। दूसरी ओर, एंडोटोक्सेमिया स्थानीय और प्रणालीगत चोट के कई रास्ते के कारण गुर्दे की बीमारी पैदा करने के लिए दिखाया गया है, गुर्दे के रक्त प्रवाह की हानि के कारण, glomerular निस्पंदन दर, और ट्यूबलर समारोह22.

हालांकि, EA की कुछ सीमाओं पर प्रकाश डाला जाना चाहिए। ईए परिणाम पर चल रहे एंटीबायोटिक थेरेपी काप्रभाव वर्तमान में अच्छी तरह से स्थापित नहीं है 24 . इसके अलावा, सबूत से पता चलता है कि महत्वपूर्ण बीमार रोगियों में एक एकल बिंदु जल्दी ईए माप, जबकि उपयोगी, मज़बूती से सेप्टिक सदमे मृत्यु दर की भविष्यवाणी नहीं करता है, यहां तक कि जब 0.6 इकाइयों15से अधिक . सीरियल दोहराया आकलन की जरूरत हो सकती है, हालांकि उनकी संख्या और समय वर्तमान में स्पष्ट नहीं हैं. अन्य लेखकों endotoxemia में उतार चढ़ाव पर ध्यान केंद्रित, hypothesizing कि एक वृद्धि हुई दैनिक परिवर्तनशीलता बहु अंग रोग के एक उच्च डिग्री के साथ जुड़ा हो सकता है25. अंत में, एक अतिरिक्त तकनीकी सीमा पर विचार किया जा करने के लिए रिश्तेदार पैमाने पर जिसके साथ endotoxin गतिविधि मापा जाता है (0 करने के लिए 1 इकाइयों, 0.01 न्यूनतम पता लगाने योग्य वेतन वृद्धि के साथ). यह अत्यंत उच्च परिणाम अनिवार्य रूप से अधिकतम स्तर के आसपास पठार बनाता है, जिससे रोगियों के इस उपसमूह में भेदभाव कर रही है (EA और 0.9 इकाइयों) कठिन जांच करने के लिए.

अंत में, जबकि आगे के अध्ययन नैदानिक परिणाम पर endotoxin स्तरों की निगरानी के संभावित प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हैं, ईए वर्तमान में एक त्वरित, सरल और संवेदनशील परीक्षण के रूप में उपलब्ध है, जो आईसीयू के निर्णय लेने की प्रक्रिया की सुविधा हो सकती है गंभीर बीमार सेप्टिक रोगियों में चिकित्सक।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Estor SpA पत्रिका के प्रकाशन और वीडियो उत्पादन शुल्क की लागत को कवर किया. लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.

Acknowledgments

हम पाओलो Bragan और लिसा Mathiasen, पीएच.डी. परख प्रोटोकॉल पद्धति की उनकी समीक्षा के लिए धन्यवाद. Dario Winterton, एमडी अंग्रेजी भाषा प्रवीणता के लिए पांडुलिपि की समीक्षा करने में पर्याप्त मदद प्रदान की.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EAA kit Spectral Medical Inc. EAAST-20 Package with 20 tests + 1 quality control
Smart Line TL Berthold EAASL Luminometer
Incubator shaker GRANT ES-20 Mini-incubator shaker
Vortexer VWR 444-2790 Vortex instrument

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Akira, S., Takeda, K. Toll-like receptor signalling. Nature Reviews Immunology. 4, (7), 499-511 (2004).
  2. Takeda, K. Evolution and integration of innate immune recognition systems: the Toll-like receptors. Journal of Endotoxin Research. 11, (1), 51-55 (2005).
  3. Ulevitch, R. J., Tobias, P. S. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system. Current Opinion in Immunology. 11, (1), 19-22 (1999).
  4. Natanson, C., et al. Endotoxin and tumor necrosis factor challenges in dogs simulate the cardiovascular profile of human septic shock. The Journal of Experimental Medicine. 169, (3), 823-832 (1989).
  5. Suffredini, A. F., et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. The New England Journal of Medicine. 321, (5), 280-287 (1989).
  6. Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA: The Journal of the American Medical Association. 315, (8), 801-810 (2016).
  7. Gupta, S., et al. Culture-Negative Severe Sepsis: Nationwide Trends and Outcomes. Chest. 150, (6), 1251-1259 (2016).
  8. Ikeda, T., Ikeda, K., Suda, S., Ueno, T. Usefulness of the endotoxin activity assay as a biomarker to assess the severity of endotoxemia in critically ill patients. Innate Immunity. 20, (8), 881-887 (2014).
  9. Dellinger, R. P., et al. Effect of Targeted Polymyxin B Hemoperfusion on 28-Day Mortality in Patients With Septic Shock and Elevated Endotoxin Level. The EUPHRATES Randomized Clinical Trial. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 320, (14), 1455-1463 (2018).
  10. Marshall, J. C., et al. Diagnostic and prognostic implications of endotoxemia in critical illness: results of the MEDIC study. The Journal of Infectious Diseases. 190, (3), 527-534 (2004).
  11. Levin, J., Bang, F. B. Clottable protein in Limulus; its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica. 19, (1), 186-197 (1968).
  12. Marshall, J. C., et al. Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Critical Care. 6, (4), London, England. 342-348 (2002).
  13. Grimaldi, D., et al. High Level of Endotoxemia Following Out-of-Hospital Cardiac Arrest Is Associated With Severity and Duration of Postcardiac Arrest Shock. Critical Care Medicine. 43, (12), 2597-2604 (2015).
  14. Klein, D. J., et al. The EUPHRATES trial (Evaluating the Use of Polymyxin B Hemoperfusion in a Randomized controlled trial of Adults Treated for Endotoxemia and Septic shock): study protocol for a randomized controlled trial. Trials. 15, 218 (2014).
  15. Bottiroli, M., et al. Prevalence and clinical significance of early high Endotoxin Activity in septic shock: An observational study. Journal of Critical Care. 41, 124-129 (2017).
  16. Kaukonen, K. M., Bailey, M., Suzuki, S., Pilcher, D., Bellomo, R. Mortality related to severe sepsis and septic shock among critically ill patients in Australia and New Zealand. JAMA: The Journal of the American Medical Association. 311, (13), 1308-1316 (2014).
  17. Biagioni, E., et al. Endotoxin activity levels as a prediction tool for risk of deterioration in patients with sepsis not admitted to the intensive care unit: a pilot observational study. Journal of Critical Care. 28, (5), 612-617 (2013).
  18. Roth, R. I., Levin, F. C., Levin, J. Optimization of detection of bacterial endotoxin in plasma with the Limulus test. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 116, (2), 153-161 (1990).
  19. Yaguchi, A., Yuzawa, J., Klein, D. J., Takeda, M., Harada, T. Combining intermediate levels of the Endotoxin Activity Assay (EA) with other biomarkers in the assessment of patients with sepsis: results of an observational study. Critical Care. 16, (3), London, England. (2012).
  20. Earley, Z. M., et al. Burn Injury Alters the Intestinal Microbiome and Increases Gut Permeability and Bacterial Translocation. PLoS One. 10, (7), (2015).
  21. Munster, A. M., Smith-Meek, M., Dickerson, C., Translocation Winchurch, R. A. Incidental phenomenon or true pathology? Annals of Surgery. 218, (3), 321 (1993).
  22. Clementi, A., Virzì, G. M., Brocca, A., Ronco, C. The Role of Endotoxin in the Setting of Cardiorenal Syndrome Type 5. Cardiorenal Medicine. 7, (4), 276-283 (2017).
  23. Virzì, G. M., et al. Cardiorenal Syndrome Type 5 in Sepsis: Role of Endotoxin. in Cell Death Pathways and Inflammation. Kidney and Blood Pressure Research. 41, (6), 1008-1015 (2016).
  24. Mignon, F., Piagnerelli, M., Van Nuffelen, M., Vincent, J. L. Effect of empiric antibiotic treatment on plasma endotoxin activity in septic patients. Infection. 42, (3), 521-528 (2014).
  25. Klein, D. J., et al. Daily variation in endotoxin levels is associated with increased organ failure in critically ill patients. Shock. 28, (5), 524-529 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics