重症患者における全血エンドトキシア血症の検出に関するエンドトキシン活性アッセイ

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Medicine

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Summary

我々は、本明細書を、ヒト全血試料のエンドトキシン活性をベッドサイドで測定するプロトコルを提示する。エンドトキシン活性アッセイは、実行するための簡単なテストであり、敗血症の重症患者に有用なバイオマーカーである可能性があります。

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Pinciroli, R., Checchi, S., Bottiroli, M., Monti, G., Casella, G., Fumagalli, R. Endotoxin Activity Assay for the Detection of Whole Blood Endotoxemia in Critically Ill Patients. J. Vis. Exp. (148), e58507, doi:10.3791/58507 (2019).

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Abstract

リポ多糖類は、エンドトキシンとしても知られており、グラム陰性細菌の基本的な構成要素であり、敗血症および敗血症性ショックの発症に重要な役割を果たしている。重大な病気に急速に進化している感染プロセスの早期同定は、より迅速かつより集中的な治療を促し、それによってより良い患者の結果につながる可能性がある。エンドトキシン活性(EA)アッセイは、全身性エンドトキセミアの信頼性の高いバイオマーカーとしてベッドサイドで使用することができる。高められたエンドトキシン活性レベルの検出は、敗血症および敗血症性ショック患者における疾患重症度の増加に関連することが繰り返し示されている。アッセイは迅速かつ簡単に実行できます。簡単に言えば、サンプリング後、全血のアリコートを抗エンドトキシン抗体と添加したLPSと混合する。エンドトキシン活性は、化学発光によって検出されるプライミング好中球の相対的な酸化バーストとして測定される。アッセイの出力は、0 (不在) から 1 (最大) までのスケールで表され、「低」(<0.4 単位)、「中間」(0.4~ 0.59 単位)、または "高" (≥0.6 単位) に分類されます。EAアッセイの実施のための詳細な方法論と根拠は、この原稿で報告される。

Introduction

リポ多糖類(LPS)は、エンドトキシンとしても知られており、グラム陰性(GN)細菌の膜構造の重要な構成要素である。これは、細胞壁の約10%を構成し、外膜の完全性と恒常性のために不可欠です。また、宿主自然免疫系1、2の強力な活性化剤である。

LPSへの自然免疫系細胞のインビトロ暴露は、複数の遺伝子3の発現の変化につながる。健康なヒトボランティアにおける非常に少量のLPSの投与は急性全身性炎症のカスケードを引き起こすが、敗血症および敗血症性ショックは、より高いエンドトキシン濃度4、5で生じる可能性がある。

敗血症は生命を脅かす状態であり、速やかに認識されなければ、多臓器不全や死に至る可能性がある。敗血症患者は、積極的な蘇生、適切な抗生物質療法、最適なソース管理、迅速な臓器支援戦略を備え、タイムリーに治療する必要があります。敗血症の病因の診断は、主に臨床認識および培養ベースの病原体検出6に基づいている。しかし、微生物培養の結果は48時間までかかることがあり、症例7の30%まで決定的ではない。早期の同定と介入は、より良い患者の結果につながる可能性があります。敗血症が疑われる患者では、内分泌血症の明確な兆候なしに、生理学的および生化学的パラメータに基づいて決定が行われることが多い。

エンドトキシン活性(EA)の測定は、全血中の市販アッセイ(材料の表を参照)によって得ることができる。これは、疾患重症度の早期階層化のための全身性エンドトキシア血症のバイオマーカーとして使用することができ、特に敗血症性ショック8を発症するリスクのある患者において。このアッセイは、敗血症性ショック9の患者における最近発表された二重盲検無作為化対照臨床試験においてポリミキシンBヘモパーフュージョン療法を導くために使用された。重篤な患者では、MEDIC研究は、多臓器機能障害、集中治療室(ICU)滞在期間、および死亡率10に関連するEAレベルの増加を示した。

エンドトキシンを検出するために異なるアッセイが開発されました。Limulusアメーボサイトライサート(LAL)アッセイは、ゲル凝固、濁膜、または発色検査のいずれかとして、これまでで最も頻繁に血清エンドトキシンの推定のために採用されています。これは、エンドトキシンがホースシューカニ、リムルスポリフェムスのヘモリンフの凝固を誘導する能力に基づいている。しかし、このアッセイには特異性の点でいくつかの制限があります。特に、真菌細胞壁の成分などのエンドトキシン以外の微生物産物によって活性化することもでき、かつ種々のヒト血漿タンパク質11によって阻害することができる。

過去10年間にEAの測定は循環内分血症のバイオマーカーとして開発され、検証された。LALテストと比較して、EAはより速く、臨床設定で実施するのが容易である。さらに、全血中のLALよりも正確であることが示されており、感度および特異性が増加し、インビトロおよびインビボ12の両方である。

敗血症原因体としてGN細菌を迅速に同定するための早期診断ツールとしての初期の実施にもかかわらず、EAレベルは疾患重症度のバイオマーカーとしても研究されている。この文脈において、敗血症性ショックまたは心停止症候群13などの進行中の重篤な疾患による低灌流状態を評価することが特に有用であることが示されている。より最近では、殺量化システムの開発以来、このような治療14の潜在的な候補を正確に同定するためのスクリーニングツールとして肯定的なEA結果も提案されている。我々は最近、敗血症性ショック患者107人に対して、早期高レベルのEAの有病率と臨床的意義に関する観察的振り返り研究を行った。他の最近の結果に沿って、我々はEAが敗血症性ショック15の患者における疾患重症度の有望なマーカーであることを見出した。

本原稿の目的は、ベッドサイドまたは実験室でEAアッセイを行う方法を記述し、敗血症性ショックの代表的なシナリオでその潜在的な使用を記述することです。この技術は、抗エンドトキシン抗体およびLPSの複合体によるプライミングに続く好中球における増強された酸化バーストを測定することによってLPS活性を検出することができる。増加した呼吸バーストは化学体計によって検出され、放出される光の量は血液サンプル中のエンドトキシンの量に比例すると考えられる。アッセイは、少数の試薬を必要とし、実行するのに約30分かかり、全血12の40 μL程度しか使用しなす。

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Protocol

このプロトコルは、ヒト生体標本の取り扱いに関する制度ガイドラインに従い、当社の臨床検査室の現在の標準的な手術手順に従って実施されます。EAデータと検査対象の患者の臨床情報の使用は、当機関の人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。

1. 実験装置及びアッセイキット内容

  1. 使用しない場合は、EAキットを2~8°Cに保管してください。
  2. 各EAテストは、チューブの5種類で構成されています。テストの異なる部分にそれぞれを使用します(セクション2を参照)。
    1. チューブ#1(「コントロール」チューブ)を使用して、特定の抗体がない患者の好中球の非特異的酸化バーストの基底活性を測定する。
    2. チューブ#2(「サンプル」チューブ)を使用して、LPS抗体複合体に応答して酸化バーストを測定します。
    3. チューブ#3(「最大」チューブ)を使用して、エンドトキシンの過剰に応答して患者の好中球の最大酸化バーストを測定します。
    4. 外因性エンドトキシンの供給源としてチューブ#4(「LPS」チューブ)を使用してください。
    5. 血液貯蔵にはチューブ#5(「アリコット」チューブ)を使用してください。
      注:#1、#2、#3チューブの複製は、テストされる各血液サンプルに使用する合計8本のチューブ(EA試薬ボトルおよび品質管理試験は、パウチに含まれるすべての試験に使用できます)を提供しています。
  3. EDTA抗凝固剤を含む無菌チューブで患者の血液サンプルを収集します。EAテストを実行する前に、血液サンプルを室温で保存してください。
  4. テストを開始する前に、化学体計とインキュベーターシェーカーをオンにします。インキュベーターを37°Cの温度に温めます。
  5. 理想的には、採血から30分以内にサンプルの処理を開始する。

2. エンドトキシン活性アッセイ

  1. テストする必要がある各患者の血液サンプルのEA試験管を準備します。チューブをチューブラックに入れます。その後、キャップを取り外します。
  2. コンビピペットを使用して、ボトルからチューブ#1チューブ(コントロールチューブ)、#2(サンプルチューブ)、#3(最大チューブ)にEA試薬の1 mL体積をピペットし、それぞれが複製する。
    注:溶液が跳ね返らないように、チューブの側面を下にピペット。
  3. 血液採取管を20回ゆっくりと反転して患者の血液サンプルを混ぜます。次に、患者の血液のピペット0.5mLをチューブ#4(LPS最大チューブ)およびチューブ#5(アリコチューブ)に入れる。渦チューブ#410s。
  4. すべてのEA試験管を備えたチューブラックをインキュベーターシェーカーに入れます。蓋を閉め、37°Cの温度で10分間インキュベートします。
  5. 蓋を開け、インキュベーターシェーカーからチューブラックを取り外します。渦管#5(アリコチューブ)。無菌先端を使用して、チューブに40 μLの血液をチューブに#1し、#2に、複製する。
  6. 渦管#4(LPS管)。同じピペット先端を使用して、チューブ#4からチューブ#3(最大チューブ)に、重複して血液のピペット40 μLを使用します。
  7. 6つの最終試験管(#1、#2、#3、およびそれぞれの複製)を渦下し、ラックに戻します。
    注:すべてのチューブが同じ時間に渦を積んでいることを確認します。
  8. チューブラックをインキュベートシェーカーに戻し、蓋を閉じます。インキュベートシェーカーを100rpmに設定し、14分間動きを開始します。
  9. EAラベルのチップカードを化学体計に挿入し、スタートを押します。14分インキュベーションの後、化学体温計に表示される指示に従って、EAチューブを正しい順序で読み取ります。
  10. 化学体計のサンプルホルダーに置く前に、各チューブを10sのために穏やかに渦にします。サンプルドロワーを開き、チューブ#1をサンプルホルダーに入れます。次に、サンプル ドロワーを閉じて、相対ライト ユニット(RLU)の読み取りが待機します。
  11. チューブ 2 とチューブ 3 の手順 2.10 を繰り返します。
  12. 重複するチューブ 1、2、および 3 の場合は、手順 2.10 を繰り返します。
    注:ステップ2.10-2.12の間に同じ時間のためにすべてのチューブを渦にしてみてください。
  13. すべてのチューブが処理された後、EAの結果が自動的に計算され、印刷されることに注意してください。水準はEA単位で表され、同じサンプルからの重複判定の平均を表します。
  14. 検査が必要なすべての血液サンプルについて、手順 2.2 ~ 2.13 を繰り返します。
  15. アッセイが完了したら、残りの試験管とEA試薬を2~8°Cで最大30日間保管してください。

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Representative Results

72歳の男性が、学術都市病院の救急部(ED)に入院した。数日前、彼は排尿の燃焼を訴えて彼のプライマリケアの医師に提示していました。経口ホスホマイシンを用した短期療法が推奨された。彼の病歴には、高血圧、単純な2型糖尿病、良性前立腺過形成が含まれていた。彼の薬にはエナラプリル、アトルバスタチン、タムスロシン、メトホルミンが含まれていた。

EDでは、彼は無気力で、目覚めたときに混乱していました。彼の温度は39.1 °C、心拍数は毎分125拍、血圧は80/40 mmHg、呼吸数は20/分、SpO2は室空気中で94%、鼻カニューを通して4L/分酸素で99%に上昇した。腹部の検査は正常であったが、局所的に局所的な軽度の優しさを除いては正常であった。困難に、フォーリーカテーテルが置かれました。少量の暗い色の化膿性尿を排出した。

完全な血球数は18.5 x 103の白血球数を明らかにした。クレアチニンは2.7mg/dL、ブドウ糖は250mg/dL、乳酸濃度は4.5ミリモル/L.動脈血球分析で、pH 7.23、pCO2 48mmHg、pO2 88mmHg、HCO3- 15ミリモル/Lと混合アシドーシスを明らかにした。

中央静脈カテーテルは、超音波ガイダンスで、右の内部頚静脈に配置されました。カテーテルの配置に関する血液ガス分析を行い、63%のScVO2値を明らかにした。積極的な流体蘇生は、30分以上の30mL/kgの結晶性ボルス注入で速やかに開始され、ノレフィネフリン注入も開始された。患者は敗血症性ショックの診断でICUに移され、尿路感染症に起因する可能性が高い。

ICUでは、微生物培養物採取および経験的抗生物質療法投与の中で、EA検査のために全血サンプルが得られた。アッセイは、本明細書に提示されるプロトコルに従って迅速に行われた。

EAの結果を計算するために、化学水ノメーターは記録:好中球の基底発光(L1);。血液サンプル中のLPSに応答する好中球活性の発光(L2);LPS(L3)への大規模な暴露に応答して最大好中球活性。結果は、エンドトキシン活性(EA)=(L2-L1)/(L3-L1)として表されます。したがって、得られたEA値は、循環エンドトキシン(L2)の存在による患者の好中球酸化バーストの程度を反映し、それに応答して同じ血液試料中で測定することができる最高レベルの発光によって正常化される。LPS(L3)の最大濃度を超える。両方の値は、試料(L1)の基底発光のために制御される。

約30分後、臨床医は0.75 EA単位が患者のエンドトキシン活性レベルであることを認めました。

0.40 EA単位未満のEA値は、低循環LPS濃度に等しい低いエンドトキシン活性レベルを示し、重篤な疾患状態に進行するリスクが低いことを示す。0.40 EAと0.59 EA単位の間の結果は、重度の敗血症および敗血症性ショックの発症のリスクが高いことを示す中間エンドトキシン活性レベルを示す。0.60 EA単位以上の結果は、敗血症性ショックおよび貧弱な患者の転帰に対する高いリスクを表す高いエンドトキシン活性レベルを示す(表1)。

したがって、GN細菌による敗血症性ショックの診断が確認された。患者はまた、付着した臓器不全および乳酸レベルの証拠に沿って、非常に高いリスクに分類された。彼はさらに積極的な容積蘇生および血管活動サポートによって扱われた。ポリミシン-Bヘモプレーション療法は、液体および血管プレッサに対する患者の説得力のある早期応答のために、まだ実施されなかったと考えられていた。2日目に、大腸菌は陽性血液培養を通じて原因を確認した。適切な抗生物質療法により、患者は回復し、7日目にICUから排出される。ICU排出前に2回目のEA試験を行った。0.2 EA単位の結果は敗血症性ショックによって引き起こされる生化学カスケードの完全な決断を示した。

図1は敗血症性ショック患者のサンプル集団における24時間以内に測定されたEA値の分布を示す。

Figure 1
図1:重症患者集団における敗血症性ショック発症から24時間以内に測定されたエンドトキシン活性(EA)レベルの分布(n=107)。許可を持つボッティロリらから適応15.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

EA 単位 エンドトキシン活性レベル
<0.40
0.40~0.59 中間
≥0.60

表1:エンドトキシン活性レベルのカテゴリ。EA = エンドトキシン活性.

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Discussion

敗血症性ショックは、現在でも40%と高い死亡率に関連しているが、この率は考慮されたレポート16に従って変化する。新規でより良いバイオマーカーの必要性は、早期診断、より良い管理、敗血症性ショック6の患者の予後を臨床医を支援するために、分野のほとんどの専門家によって提唱されています。

EAテストを実施する際、以前の技術的知識や高度な実験装置は必要なく、医療機関はそれを簡単かつ迅速に実行する方法を学ぶことができます。高循環EAの迅速な同定は、患者のリスクを階層化し、より早く、より積極的な治療アプローチを引き起こすのに役立つ可能性がある。逆に、0.40 EA単位未満のEA結果は、多臓器不全17への進行のリスクが低いことを示している可能性がある。患者のサンプルを自分の制御として使用することは簡単であり、このテストはより敏感になり、エンドトキセミアの真の血中レベルのより正確な表現をする。

LPS抗体複合体および患者自身の好中球の使用は、EA試験が他の因子(例えば血漿タンパク質)によって阻害されるのを防ぎます。凝固カスケードの活性化を必要とするLAL検定のような他の試験についても同じことが言えません。LAL試験は、エンドトキシンが特定の受容体に結合していない場合にうまく機能しますが、血漿および全血中異なるタンパク質がLPSに結合し、アッセイを妨害します。さらに、真菌製品は、LIMULus凝固カスケードを引き起こす可能性があり、GN細菌に対する試験は特異性が低くなります。これらの理由から、EAは、エンドトキシア18の評価のためにまだ一般的に採用されているLAL試験よりも優れている。

ただし、EA テストの信頼性を高めるためには、前述の手順に細心の注意を払う必要があります。試験対象の検体のエンドトキシンレベルは、時間の経過とともに化学発光を計算し、基準値と同じ血液試料に対する基礎(チューブ#1)および最大(チューブ#3)応答を測定することによって計算されます。したがって、3本のチューブを化学体計に正しい順序で慎重に配置することが不可欠です。

臨床実践におけるEAレベルの使用は、潜在的な感染症のワークアップにおける標準的な検査(例えば、実験室検査および血液培養)を置き換えるべきではない。LPSは明らかにGN細菌膜産物の放出と関連しているかもしれないが、他の薬剤19による感染症の場合には、エンドトキセミアの上昇レベルも報告されている。エンドトキシア血症は、腸粘膜を介した細菌の転移に起因する可能性が非常によく知られており、特に組織の低灌流および増加した腸関門透過性が20、21が発生する可能性が高い場合に。このような条件下では、循環LPSが敗血症およびショックの原因ではなく、結果であると期待することができる。このシナリオでは、EAは、細菌病因15にかかわらず、進行中の組織損傷の重症度に関する情報を提供することができる。この原理を支持する, 最近の研究で Grimaldi ら.

興味深いことに、Virzíらは、5型心腎症候群の患者におけるエンドトキシン(およびそのモニタリング)の潜在的な役割を強調した。、敗血症23など。エンドトキシンは心臓筋細胞の障害を誘発することが知られているが、正確な病態生理学的メカニズムはほとんど不明である。一方、内分酸血症は、局所および全身損傷のいくつかの経路に起因する腎機能障害を誘発することが示されており、腎血流の障害、糸球体濾過率、および管状機能22を引き起こす。

ただし、EA のいくつかの制限を強調する必要があります。EAの結果に対する進行中の抗生物質療法の影響は、現在十分に確立されていない24.さらに、重篤な患者では、単一点の早期EA測定は有用であるが、0.6単位15を超える場合でも敗血症性ショック死亡率を確実に予測しないことを示唆している。シリアル繰り返し評価が必要な場合がありますが、その数とタイミングは現在不明です。他の著者は、エンドトキセミアの変動に焦点を当て、毎日の変動の増加は、多臓器機能障害高い程度に関連する可能性があるという仮説25.最後に、考慮される追加の技術的な制限は、エンドトキシン活性が測定される相対スケール(0~1単位、最小検出可能な増分0.01単位)です。これにより、必然的に最大レベルの周りに非常に高い結果が生じ、この患者のサブグループ(EA > 0.9単位)での差別化を行い、調査が困難になります。

結論として、臨床結果に対するエンドトキシンレベルのモニタリングの潜在的な影響を評価するためにさらなる研究が必要であるが、EAは現在、ICUの意思決定プロセスを容易にする可能性のある迅速でシンプルで敏感なテストとして利用可能である。重篤な病患者の臨床医。

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Disclosures

Estor SpAは、ジャーナルの出版費とビデオ制作費をカバーしました。著者は、開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgments

我々は、パオロ・ブラガノとリサ・マティアセン博士に、アッセイプロトコルの方法論のレビューに感謝する。ダリオ・ウィンタートン,MDは英語能力のための原稿のレビューに大きな助けを与えました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EAA kit Spectral Medical Inc. EAAST-20 Package with 20 tests + 1 quality control
Smart Line TL Berthold EAASL Luminometer
Incubator shaker GRANT ES-20 Mini-incubator shaker
Vortexer VWR 444-2790 Vortex instrument

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References

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