En In Vivo -Metod för att studera mus blod-Testis barriär integritet

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att bedöma den blod-testis-barriär integriteten genom att injicera inulin-FITC i testiklarna. Detta är en effektiv i vivo metod att studera blod-testis-barriären integritet som kan äventyras av genetiska och miljömässiga faktorer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Liu, M., Zhu, C., Bai, S., Li, X., Fu, K., Ye, L., Zheng, K. An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity. J. Vis. Exp. (142), e58512, doi:10.3791/58512 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spermatogenesen är utvecklingen av spermatogonier till mogna spermier i sädeskanalerna i testiklarna. Denna process stöds av Sertoli celler korsningar på den blod-testis-barriären (BTB), som är snäv vävnad barriären i däggdjur kroppen och segregerar sädesproducerande epitel i två fack, en basal och en adluminal. BTB skapar en unik närmiljön för könsceller i meios I / II och för utvecklingen av postmeiotic spermatids till spermier via spermiogenesis. Här beskriver vi en tillförlitlig test för att övervaka BTB integritet mus testiklarna i vivo. En intakt BTB blockerar diffusionen av FITC-konjugerad inulin från den basala i apikala facket av sädeskanalerna. Denna teknik är lämplig för att studera genen kandidater, virus eller miljögifter som kan påverka BTB funktion eller integritet, med ett enkelt förfarande och ett minimalt krav på kirurgisk kompetens jämfört med alternativa metoder.

Introduction

Däggdjur spermatogenes anses vara en mycket strukturerad process som omfattar spermatogoniala självförnyelse och differentiering genom spermatocyter in haploida spermier via Mitos, meios och spermiogenesis, under vilken dramatisk biokemiska och morfologiska förändringar inträffar. Utveckla könsceller transporteras gradvis från basen av de seminifera tubuli mot lumen. Denna process regleras av cell-cell kontakter mellan könsceller och Sertoli celler1,2. Angränsande Sertoli celler bildar den BTB som ligger nära basen av de seminifera tubuli. BTB delar fysiskt epitelet i en basal och en adluminal fack. Under skeden VIII - IX av epitelial cykeln, migrerar preleptotene/leptotene spermatocyter från de basala fack över de BTB, in adluminal fack3. Funktionen av BTB därför att ge en immunoprivileged närmiljön för slutförandet av meios och spermiogenesis4,5,6. Till skillnad från andra blod-vävnad hinder (t.ex., blod - hjärnbarriären) som endast består av åtsittande föreningspunkter (TJs), bildas BTB av fyra olika korsningar (TJs, ektoplasmiskt inriktningar, gap-junctions och intermediär filament-baserade desmosomes) mellan Sertoli celler1,7.

Många studier har använt genetiskt modifierade möss, virusinfektioner och miljögifter för att undersöka mekanismer BTB integritet7,8,9. BTB störningar inducerar försämrad spermatogenes och stamcellsforskningen eller infertilitet. Eftersom BTB bildning och integritet har bekräftats för att påverkas av kontakter mellan Sertoli celler8, en in vitro- modell baserad på primära kultur av isolerade Sertoli celler har använts för BTB studie. Denna modell inte kan dock noggrant efterlikna BTB dynamics in vivo. Dessutom har ingen sådan samtidig kultur av könsceller med Sertoli celler etablerats som kan återspegla alla relevanta strukturella och funktionella komponenter i BTB10,11.

I allmänhet baseras i vivo BTB integritet analyser vanligtvis på små molekyler, såsom EZ-anknyter Sulfo-NHS-LC-Biotin och FITC-konjugerad inulin (inulin-FITC). Normalt blockeras av biotin eller inulin-FITC från den basala kupén diffusion av BTB struktur. Därför är vi kunna använda denna metod för att bedöma omfattningen av BTB skador jämfört med kontrollgrupperna. Medan BTB kan äventyras med vissa typer av stimuli, såsom behandling med kadmium klorid (CdCl2)12, blir BTB tillgänglig för små molekyler, som så småningom in i adluminal facket som indikatorer.

Ett tidigt i vivo BTB integritet test innebär att injicera biotin eller inulin-FITC i halsvenen, som innebär kirurgi och invasiva, komplicerade och tidskrävande. Förutom, som reporter ämnen diffunderar genom hela kroppen via cirkulationen, lokala koncentrationen av biotin eller inulin-FITC i sädeskanalerna är begränsad. Systemisk exponering kan dessutom framkalla immuna reaktioner. Här presenterar vi en enkel och effektiv i vivo BTB integriteten analysen möjliggör direkt injektion av en liten alikvot av inulin-FITC i interstitium av en testikel. Använder den fluorescerande märkning metoden, är färgning processen bekvämt, eftersom sekundära antikroppar inte krävs. Här är processen av fluorescerande färgämne in testiklarna visualiseras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla genomförda djurförsök har godkänts av utskottet för Nanjing Medical University. Manliga C57BL/6 möss var hålls under kontrollerade fotoperiod förhållanden och försågs med mat och vatten.

1. förberedelser

  1. Mikroskop kapillärer
    1. Använda Mikroskop kapillärer med en yttre diameter och inre dimeter längd 1,0 mm, 0.8 mm och 10,0 cm, respektive.
    2. Dra glas kapillärer med en kapillär avdragare (figur 1A). Testa och justera inställningarna beroende på maskinens kapillär avdragare som används.
    3. Bryta pipettspetsarna med pincett att använda att få kapillärerna i en 50 µm diameter på spetsen.
      Obs: Tips kan vara för lång tid att penetrera testiklarna.
    4. Vässa spetsen i en 30° vinkel med hjälp av en mikropipett Fasmaskin (figur 1 c).
  2. Reagenser
    1. Förbereda 1% pentobarbital natrium: upplösa pentobarbital natrium 100 mg i 10 mL fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (steg 2.3.3).
    2. Förbereda 10 mg/mL inulin-FITC: upplösa inulin-FITC 1 mg i 100 μL av PBS (steg 2.1.6).
    3. Förbered 4% PARAFORMALDEHYD: upplösa PARAFORMALDEHYD (PFA) 4 g i 100 mL PBS (steg 2.3.3).
    4. Förbereda 30% sackaros: upplösa sackaros 3 g i 10 mL PBS (steg 2.3.4).
    5. Förbereda 0,1% kadmium klorid: Lös upp kadmium klorid 10 mg i 10 mL PBS (steg 2.1.1).

2. metoder

  1. Anestesi och presurgery förberedelse
    1. Väga 8-vecka-gammal C57BL/6 hanmöss och beräkna den erforderliga dosen av CdCl2. Behandla en grupp möss (n = 3) med CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) för 3 d före operation. Behandla en annan grupp av 8 veckor gamla C57BL/6 hanmöss (n = 3) med PBS som kontroll.
    2. Utföra operationen under aseptiska förhållanden med steril spruta, nål, sax och pincett.
    3. Förbereda anestesi arbetslösning nymalen. Den erforderliga dosen av anestesi är 70 mg natrium pentobarbital/kg kroppsvikt. I genomsnitt väger en vuxen C57BL/6 mus vid 8 veckors ålder ~ 25 g, vilket motsvarar 175 μl 1% pentobarbital natrium (1,75 mg per mus).
      Obs: Pentobarbital natrium löses i steril fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Lösningen filtreras av 0.22 um filterenheten innan det används.
    4. Rengör området för kirurgi med 75% etanol och täcka området med en ren trasa handduk.
    5. Slå på termostatstyrd värmare och justera temperaturen till 37 ° C.
    6. Förbereda inulin-FITC fungerande lösning (10 mg/mL) på dagen för operationen.
  2. Kirurgiskt ingrepp
    1. Väga 8-vecka-gammal C57BL/6 hanmöss och beräkna den erforderliga dosen av anestesi.
    2. Utföra en intraperitoneal injektion pentobarbital natrium med en 1 mL steril spruta. Håll musen i en ren bur.
    3. Observera öga reflex svar och andningsmönster av musen för att bekräfta att det är under fullständig anestesi.
      Obs: Vanligt, 10-15 min behövs tills musen är djupt sövda, med en total avsaknad av tå nypa svar och underhåll av långsam, stadig andning.
    4. Flytta musen till området och täcka dess ögonområdet med en fuktig läskpapper för att undvika torrhet under anestesi (figur 2A).
    5. Raka dess buk hår med en rakapparat och desinficera området kirurgi med 75% etanol.
    6. Med vass sax, göra ett 1 cm huden snitt ovanför preputiala körtlar att exponera den buk-väggen. Lyft den buk-väggen med liten pincett och gör en 0,5 cm snitt att exponera i bukhålan (figur 2B).
    7. Använd tången för att söka efter fett kuddar runt bitestiklarna och testiklarna. Dra försiktigt de fett kuddar ut för att exponera bifogade testiklarna tydligt (figur 2 c och 2D). Vanligtvis fungera på en testikel åt gången.
      Obs: Undvik att vidröra den fett kuddar och testiklarna med händerna.
    8. Placera ett papper (9 cm i diameter) under fett kuddar och testiklarna (figur 2 c).
    9. Injicera inulin-FITC i Mikroskop pipett och Anslut den till den micromanipulator enheten (figur 1 d). Försiktigt sätt Mikroskop pipetten under tunica albuginea och läsa in sammanlagt 20 μL av inulin-FITC i interstitium av testiklarna (figur 2E och 2F).
      Obs: Tryck försiktigt Mikroskop pipetten för att undvika att flytta den.
    10. Övervaka förflyttningar av inulin-FITC i testiklarna (figur 2 g).
    11. Omedelbart tillbaka testiklarna i bukhålan efter slutförandet av injektionen.
    12. Upprepa proceduren på den kontralaterala testikeln. Detta testiklarna injiceras med 20 μL av PBS som kontroll.
    13. Nära huden med en kirurgisk sutur och flytta musen till en värme pad av en termostatstyrd värmare (figur 1B). Administrera en dos av 1 mg smärtstillande (buprenorfin) per 1 kg kroppsvikt via subkutan injektion.
  3. Skörda testiklarna och frusna snitt förberedelse
    1. 40 min efter injektionen euthanize mottagarens musen av cervikal dislokation enligt djurens vård och använda riktlinjer.
    2. Använd en vass sax för att samla testiklarna. Placera testiklarna i 1 mL iskallt PBS att avlägsna all blod nedsmutsning.
    3. Fixa testiklarna i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) vid 4 ° C i 12-24 h. kasta 4% PFA och tvätta vävnaden 3 x med 1,5 mL 1% PBS i rumstemperatur.
    4. Torkar ut vävnaden i 30% sackaros över natten. Lägg testiklarna i ramen inbäddning och täcka vävnaden med optimal skärtemperatur förening (ULT). Efter ULT är fryst, fylla inbäddning ramen med OCT så att hela testiklarna kan täckas med OCT.
    5. Skär 5-μm tjock, frysta tvärsnitt av testiklarna i en kryostat vid-20 ° C och låt dem följa objektglas.
      Obs: Omfrysning inbäddade vävnader i torris kan öka styvhet för kapning.
  4. Bild rekvisitionen
    1. Placera glasen i en fuktad ruta. Varma bilder i rumstemperatur i 10 min.
    2. Tvätta i avsnitt 3 x med Tris-buffrad koksaltlösning (TBS) vid rumstemperatur.
    3. Lufttorka för 5 min i mörker. Torka bort eventuella kvarvarande TBS med dammfri papper.
    4. Täcka tvärsnitt med 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI). Placera det inverterade täckglaset på ett objektglas.
    5. Hämta bilder med confocal Mikroskop. Sammanlagt 20 X förstoring är normalt tillräckligt för att upptäcka ljust fluorescerande signalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Experimental set-up för att utföra BTB integriteten analysen visas i figur 1. Dra och vässa Mikroskop kapillärer med kapillär avdragare och mikropipett fasmaskin, respektive (figur 1A och 1 C). Termostatstyrd värmare och utrustning för Mikroskop illustreras i figur 1B och 1 D.

Figur 2 visar några av de viktigaste stegen för injektion av inulin-FITC. Använd sax för att göra ett litet snitt efter musen har genomgått fullständig anestesi (figur 2A och 2B). Mus testiklarna är utsatt och injiceras med fluorescerande färgämne med Mikroskop pipett (figur 2 c - 2 G).

Figur 3 visar typiska bilder av en studie för att bedöma BTB integritet baserat på ett in-vivo -test. Möss i CdCl2-behandlingsgrupp injiceras med en akut dos av CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) i 3 dagar. Diffusion av inulin-FITC från basal facket är blockerat av BTB struktur i kontrollgruppen, medan BTB byggandet är skadad och inulin (grön fluorescens) passager i apikala facket av sädesproducerande epitel i CdCl2 -behandlingsgrupp. Vit linjesegment ange det avstånd som tillryggalagts av inulin från basalmembranet (figur 3A). Omfattningen av BTB skada bestäms av avståndet. För en elliptisk lumen är radien genomsnittet av de kortaste och längsta avståndet från den basala facket till mitten av tubuli. Vi använder sådan förhållandet som ett index över omfattningen av skadan som BTB:
Equation
Här Dinulinsirap är tillryggalagd sträcka av inulin från basal fack och Dradie är radien av den samma seminifera tubuli (figur 3B). Den intakt BTB i Rictorfl / + möss blockerar diffusionen av inulinsirap över barriären ange den apikala facket. Däremot har Rictorcko möss en komprometterad BTB tillåter inulin diffusion (figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: utrustning för mus testikelcancer interstitiell Mikroskop. (A) dra glas kapillärer med en vertikal kapillär avdragare. ()B) i denna panel visas de termostatstyrd värmaren. (C) tips slipas med hjälp av en mikropipett fasmaskin. (D), enheten för Mikroskop innehåller en Mikroskop pump och en stereo Mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Representativa bilder av ett in-vivo testikelcancer interstitiell Mikroskop fortsätter i en mus. (A) denna panel visar avlägsnande av buken hår genom en rakapparat. (B) denna panel visar 0,5 cm bukväggen snittet att exponera i bukhålan. (C) dra fett kuddar för att exponera bifogade testiklarna tydligt. (D), denna panel visar positionen för den testikel- och bitestikelvikt. (E), denna panel visar positionen för Mikroskop pipetten. (F) infoga Mikroskop pipetten till interstitium av testiklarna. (G), denna panel visar en testiklarna med en framgångsrik injektion i interstitium av testiklarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: En studie för att bedöma BTB integritet baserat på ett i vivo funktionella test. Vuxna manliga möss (n = 3 i både behandlingsgruppen och kontrollgruppen) behandlas med CdCl2 (5 mg/kg b.w., i.p.) i 3 dagar (behandlingsgruppen) eller behandlats med PBS för 3 dagar (kontrollgrupp). Inulin-FITC (grön fluorescens) ligger nära basen av de seminifera tubuli i kontrollgruppen, medan inulin-FITC initierar en passage över BTB i gruppen CdCl2-behandling. (A) i denna panel vit linjesegment ange det avstånd inulin-FITC invaderar. Skala barerna är 20 μm. (B) Data från BTB integritet analyserna visas i histogrammet, som visar den sträcka av inulin (Dinulinsirap) vs. radien av den samma tubuli (Dradie). Åttio tubuli väljs slumpmässigt. P < 0,001 (Student's t-test). (C) BTB integritet äventyras i testiklarna av Rictorcko möss. I Rictorcko mus tubuli penetrerar inulinsirap djupt inne i de sädesproducerande epitel, når tubuli lumen. Skala barerna är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Spermatogenes sker i de sädesproducerande epitelet och är en mycket ordnad och dynamisk process som styrs av könsceller och somatiska celler (t.ex., Sertoli celler)13. BTB struktur, som är konstruerad av Sertoli celler, delar av sädesproducerande epitel i en basal och en apikal fack. Utvecklingen av meiotiska och haploida könsceller uppstår i apikala facket som bildar en immunologisk barriär14.

Funktionen BTB kan äventyras av gifter eller på grund av defekter i gener som är involverade i bildandet av cell korsningar, leder till manlig infertilitet. För att undersöka BTB integritet, härmar en in vitro- Sertoli cellodlingssystem har fastställts som kan bilda funktionella epitel det nära de BTB i vivo15. In vitro- systemet ger en enkel modell för att studera struktur och funktion av Sertoli celler korsningar. Dock Sertoli celler isolerade från testiklarna och odlade i vitro är begränsade när det gäller djurens ålder och cell densitet15,16. Dessutom övervakas renheten i Sertoli celler och förekomsten av ultrastructures symtom liknande BTB funktioner måste vara17. Viktigare, BTB struktur och integritet kräver också samverkan mellan könsceller och Sertoli celler, som framgår av studier av groddar-cell-specifika null muterade möss med BTB defekter10,18,19. Således, att skapa en gemensam kultur av könsceller med Sertoli celler in vitro för syftet med går igenom alla avgörande i vivo funktion av BTB förblir utmanande11,20.

Det här protokollet beskriver en metod för att bedöma BTB integritet i vivo genom att injicera inulin-FITC, som ändrades från ett förfarande av Chen et al. 21. protokollet beskriver anestesi av manliga möss, exponeringen av bukhålan, Mikroskop färgämne in i interstitium av testiklarna, skörd testiklarna och skär dem i frysta sektioner och förvärvet av bilder. För ett framgångsrikt slutförande, bör flera steg noteras. För det första är det viktigt att använda en lämplig dos av anestesi, eftersom allvarligt djup anestesi kan leda till döden. Längden på spetsen av injektionen kapillär bör också inte vara för lång; annars pipetten kan inte tränga igenom testiklarna.

Proceduren presenteras här kan användas för att analysera roll virus, kemiska gifter eller kandidat proteinerna som är inblandade i regleringen av BTB. Denna analys är känsliga, tillförlitlig och tillgänglig att övervaka BTB integritet i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgements

Detta arbete fick stöd av den nationella tangenten R & D Program i Kina (2016YFA0500902), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (31471228, 31771653), Stiftelsen Jiangsu vetenskap för framstående unga forskare (BK20150047), den naturliga vetenskapen Grunden i Jiangsu-provinsen (BK20140897, 14KJA180005) och programmet innovativa och entreprenöriella i Jiangsu-provinsen till K.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Capillary puller  SUTTER INSTRUMENT (USA) P-97
10x PBS Hyclone (USA) SH30258.01 dilution to 1× in ddH2O
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Sigma (USA) F6057
Adhesion microscope slides CITOGLAS (China) 80312-3161
Cadmium chloride Sigma (USA) 655198-5G
Confocal microscope Zeiss (Germany) LSM700
Dust-free paper Kimberly-Clark (USA) 34120
Inulin-FITC Sigma (USA) F3272
Microinjection capillaries Zhengtianyi (China) BJ-40 1.0 mm × 0.8 mm  × 100 mm
Micropipette beveler NARISHIGE (JAPAN) EG-400
OCT SAKURA (JAPAN) 4583
Paraformaldehyde Sigma (USA) P6148
Pentobarbital sodium Merck (Germany) P11011
Shaver  Yashen (China)
Stereo microscope Nikon (JAPAN) SMZ1000
Sucrose  Sangon Biotech (China) A610498
Surgical instruments Stronger (China) scissors, forceps, needle holder
Syringe KDL (China) 20163150518 0.45 mm × 0.16 mm RW LB
thermostatic heater KELL (Nanjing, China) KEL-2010
10x TBS, pH 7.6
0.2 M Tris Sangon Biotech (China) A600194
1.37 M Nacl Sangon Biotech (China) A610476

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Endocrine Reviews. 25, (5), 747-806 (2004).
  2. Wen, Q., et al. Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons. Tissue Barriers. 4, (4), e1265042 (2016).
  3. Wang, C. Q., Cheng, C. Y. A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis. Journal of Cell Biology. 178, (4), 549-556 (2007).
  4. Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).
  5. O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue? Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).
  6. Li, N., Wang, T., Han, D. Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis. Frontiers in Immunology. 3, 152 (2012).
  7. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation. Endocrine Review. 36, (5), 564-591 (2015).
  8. Govero, J., et al. Zika virus infection damages the testes in mice. Nature. 540, (7633), 438-442 (2016).
  9. Jenabian, M. A., et al. Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults. AIDS. 30, (18), 2777-2786 (2016).
  10. Holembowski, L., et al. TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis. Journal Of Cell Biology. 204, (7), 1173-1190 (2014).
  11. Legendre, A., et al. An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential. Biomaterials. 31, (16), 4492-4505 (2010).
  12. Setchell, B. P., Waites, G. M. Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat. Journal of Endocrinology. 47, (1), 81-86 (1970).
  13. Griswold, M. D. The central role of Sertoli cells in spermatogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology. 9, (4), 411-416 (1998).
  14. Cheng, C. Y., Mruk, D. D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacological Reviews. 64, (1), 16-64 (2012).
  15. Mruk, D. D., Cheng, C. Y. An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics. Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).
  16. Orth, J. M. Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study. Anatomical Record. 203, (4), 485-492 (1982).
  17. Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis? Biology of Reproduction. 68, (2), 489-508 (2003).
  18. Bai, S., et al. A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis. Molecular Human Reproduction. 24, (5), 244-259 (2018).
  19. Korhonen, H. M., et al. DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium. Biology of Reproduction. 93, (6), 139 (2015).
  20. Loir, M. Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study. Gamete Research. 24, (2), 151-169 (1989).
  21. Chen, H., et al. Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay. Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics