診断テストのための前提条件として外植体腫瘍スライスの樹立と解析

Immunology and Infection
 

Summary

世代、栽培、マウス肺腫瘍由来の切片スライスの系統的解析の手段します。我々 はまたスライス厚の最適化する方法とスライスの腫瘍を治療するために薬物濃度を選択する方法について説明します。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nagaraj, A. S., Bao, J., Hemmes, A., Machado, M., Närhi, K., Verschuren, E. W. Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing. J. Vis. Exp. (141), e58569, doi:10.3791/58569 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

精密カット スライスが含まれ、この切片一次組織植文化は、ネイティブの組織の細胞の相互作用と同様、三次元 (3 D) 組織アーキテクチャを表しています。たて切除から直ちに切断切片は、生物体内の有用なサロゲートのため腫瘍の不均一性の空間的な面を保持します。組織スライスの準備、栽培条件の最適化は基本的な注意してください腫瘍の予測診断可能性スライス外植片します。この点で、これらは複製、再現可能な実験を実行する腫瘍材料の一貫した流れを提供するマウスモデルは貴重です。このプロトコルはマウス肺腫瘍由来組織スライス回転潜伏ユニット、酸素と栄養素を組織の断続的な露出を可能にするシステムを使用しての養殖について説明します。私たちの前の仕事を示したインキュベーション ユニットを回転を使用するスライスを特にフローティング他の培養法と比較して組織の生存率向上し、停滞のフィルターをサポートしています。ここでは、さらにスライス厚生存率に影響を及ぼすことを示す培養スライスのスライス厚の最適化が提案されるべきである異なったティッシュのタイプのため。発音信号活動、間質の細胞浸潤または分化マーカーの発現などの関連する発癌性機能の ITH を要する薬物治療によって変更マーカーの発現の隣接組織スライスの評価や栽培自体。要約すると、このプロトコルが回転潜伏ユニットのマウス肺腫瘍スライスの世代と彼らの文化をについて説明し、前提条件として異種組織マーカーの発現のためスライスを体系的に分析する必要がある方法を示します薬物応答研究する前に。

Introduction

肺がんなどの固形癌は、遺伝子と表現型の多様性を示すし、複雑な微小1,2を抱きます。腫瘍細胞と薬剤感受性および抵抗性メカニズム3周辺微小環境への影響との間の相互作用。これは、生物の複雑さとネイティブ腫瘍に作用の機能を正確にモデルすることができます前臨床モデルの必要性を強調表示します。彼らは時間、空間的に分散個々 の腫瘍の表現型を含む短いウィンドウの少なくとも生物生体内でを表すプリンシパルの容量を持っていると、すぐに新鮮な腫瘍由来精密カット スライスは一意のリソースを提供します。切除の臨床腫瘍癌患者から得られるいくつかのパーソナライズされた標本の 1 つ、診断使用の精査に値する。

ひと頭蓋内腫瘍が組織部分に手をカットし、いわゆるを使用して培養されたとき早い 19 世紀に戻って切片の文化の歴史には、ドロップがぶら下がっています。組織片は観察に添付され、ヘパリンのひと血漿、その後、coverslips を反転、密封し、いくつかの週間4培養に手をつけること。腫瘍部分以来されているプラズマの塊5、液体メディア6など様々 な他の方法を使用して培養または 0.45 μ m の細孔サイズ フィルター6を手動でカットします。「切片」の用語、ニワトリ胚目7網膜分化能に関する研究で、1954 年最初に使用されました。これは、ひよこの胚の8、およびラット9から脳外植片から派生した肺や心臓の組織移植片を使用する研究が続いた。

説明、すなわちマニュアル チョッパー10,11, Krumdieck 組織スライサー12,13, と vibratomes11,14,15、様々 な加工方法がされています。 16。Krumdieck 組織スライサーは、円筒形のティッシュのコアは、ミクロトームを使用して循環組織スライスは、スライスを生成します。Vibratome は、他の一方で、振動刃ミクロトームを使用します。肝スライスに関する、ライカ vibratome Krumdieck スライサー15と比較してより多くの再現性と一貫性のあるスライスを生成することが示されました。250 から 500 μ m に至るまでスライス厚は、使用されているし、報告が 16 日14,10,17,18までも生存率および形態学的特徴の維持。しかし、腫瘍栄養の要件に影響を与えることができる変数の代謝プロファイルと通気と養分の流れに組織の剛性とマトリックスの組成などのパラメーターに影響を与えることができます。したがって、それぞれの組織型にスライスとその培養条件の最適化が必要とする可能性が高いです。

栽培方法はスライスのカルチャをサポートする使用されている: 私) 固定相間文化、停滞サポート文化、培養液中に浸漬半多孔性膜挿入の上にスライスを配置するとも呼ばれます。これは、スライスの上にさらされて空気下部は多孔質挿入14,19; を介して栄養素を添加した中ii)、こてのメソッド、もともと文化全臓器または萌芽期ティッシュのスライスに開発されました。これでは、スライスは綿シートや金属グリッドでサポートされているフィルターの上に配置され、フィルターが培養液中に浸漬します。組織の潤いを保つ、スライス20,21,22の上に培地の薄層を追加します。これらの最初の 2 つは気液界面培養; と呼ばれるiii) ローラー チューブ文化、スライスは、媒体を含んでいるプラスチック管の平らな面の中に配置し、低速管回転により組織が、サイクルの最初の部分の間に媒体で覆われているか、2 番目の23の中に曝気iv) 回転インキュベーション ユニット、スライスが栄養素と曝気中に断続的にさらされています。スライスが培246 ウェル プレートは、多孔質チタン グリッド上に配置されますこの方法では、ローラ チューブとは異なる。

組織スライス生存率の評価を行うこと、抗がん剤での治療応答をテストするための魅力的なex vivoモデル切除腫瘍論理的に存在から派生した、経路活動と分子プロファイルをターゲットにそのネイティブの腫瘍微小環境の存在下で特定の腫瘍。しかし、腫瘍スライスで測定された薬物応答その場で応答の予測しているかどうかを評価するためどの程度の切片細胞増殖など腫瘍固有の生物学的機能を維持するために評価することが重要です。特異的病理組織学的細胞の分化や発癌シグナル伝達活動。スライス標本、スライス処理または文化誘起 adaptions 品質と生体組織スライスの中に誘発される機械的ストレスの影響は、基本的な質問、腫瘍由来を実装する機能に密接に結びついた機能診断のためのスライス。

IMI-資金を供給されたコンソーシアム事業 PREDECT (http://www.predect.eu) はこれらの基本的な質問、さまざまなソースからスライスを外植体を研究することによって体系的にアドレスに乗り出します。乳がん、前立腺、肺のがんモデルから派生したスライスを使用すると、この共同の努力利用質的進みますと同様、定量的ヘマトキシリンとエオシン (H & E) - 基づく大気中の酸素と停滞しているフィルターのための要件を示すリードアウト72 時間まで培養スライスの実行可能性を維持するためにサポートしています。さらに、培養スライスの免疫組織染色 (IHC) 解析はイントラ スライス生存グラデーション、マウスの非小細胞肺癌 (NSCLC) エストロゲン受容体 (ER)、HIF1α から派生したスライスの壊死の勾配として証明を明らかにし、γH2AX乳房癌のスライス、グラデーションまたは前立腺癌のアンドロゲン受容体 (AR) 式勾配25をスライスします。興味深いことに、24 h 培養マウス非小細胞肺癌におけるイントラ スライス生存グラデーションの回転培養装置で栽培に救出され、私たちの最近の研究は、生存率が 72 h26に拡張されたことを示した。特にトップ側に残った最も実行可能な26、支持組織のこちら側スライスに薬物応答解析は最高運ばれています。

組織スライスは上皮内腫瘍機能を要約することができます、ターゲットを絞った薬、モノクローナル抗体療法剤など、抗がん剤への応答をテストするのには広く使用されるにもかかわらず、それまでどのように疑問のまま10,11,13,14,18,27。最近マウスの非小細胞肺癌スライス増殖の動的変化が表示、発癌シグナル伝達活動栽培新鮮なカット 0 h と比較した場合が26をスライスしました。これは摂動実験前に栽培中対象となるその場での生物学的機能が適切に保持されるかどうかを調査することが重要であることを示します。これらの調査結果にもかかわらず示した腫瘍スライスが空間に対して目標とされた療法、薬物治療が残っている真っ只中をモデルすることができます (24 h) を簡単なし、26を養殖の発症で開始されます。次のプロトコルでは、確立と応用薬理学的薬剤のテストの前に、腫瘍のスライス文化の分析に関連する重要な検証の側面について説明します。

Protocol

本研究で説明されているすべてのマウス実験、フィンランド国立委員会の動物実験から、ガイドラインに従うことによって行われた、ヘルシンキ大学と州地方の実験動物委員会によって承認されました。南スオミ州 (ライセンス番号 ESAVI/9752/04.10.07/2015) のオフィス。

1. スライス前の準備

  1. 以下の資料を準備ができた保つ: vibratome 試料ホルダー、vibratome バッファー トレイ 10 cm 培養プレート、24 ウェル プレート、10 mL ピペット、ピペット少年、ゴミ袋 70 %50 mL のチューブにエタノール消毒器具、組織接着剤。
  2. 準備、vibratome: 70% のブレード ホルダーを拭く EtOH、新しい刃を取り付けるし、マニュアル (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf) の指示に従って vibrocheck を実行します。
    注: それは刃の垂直たわみを最小限に抑え、確実に質の良いスライス vibrocheck ステップを実行することが重要です。
  3. 塗りつぶしは各 1 ml のハンクス平衡塩ソリューション (HBSS) 100 U/mL ペニシリンと 100 μ g/mL ストレプトマイシン (HBSS + P/S); 補足 24 ウェル プレートの氷の上のプレートを保ちます。
  4. F12 文化培と 100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、glutamax 2 mM、22 mM グルコース 10% 牛胎児血清 (FBS) を準備します。
    注: 腫瘍スライス培養培地および成長因子サプリメント腫瘍組織25によって異なります。
  5. 1.4 の手順で説明されているように同じ構図を使用してが、FBS を省略する薬物治療の f12 キー中の必要量を準備します。
    注: 成長因子培養スライスでがん化シグナルに影響可能性があります、無血清培地は短期薬摂動試験で腫瘍のスライスに推奨します。長期的なスライスの文化を分析し、組織の生存率および未処理スライス培養における腫瘍特異的マーカー発現に及ぼす無血清培地を先に評価することが重要です。

2. 腫瘍肺のコレクション

  1. 呼吸の症状は、体重減少率を示すとき頚部転位による担癌マウスを安楽死させます。
    注: CO2-仲介された安楽死はスライスの生存率または低酸素の応答を引き出すことによる発癌性の活動に影響を与えるかもしれない肺低酸素状態を誘導するために知られています。
  2. 胸を露出するよう、すべての 4 つの足で 30 G の針を挿入することで発泡スチロールの蓋の上に euthanized マウスをストレッチします。
  3. 皮膚をカット オープン腹部から胸へと首の地域まで。胸郭は、し、肺や心臓を公開するダイヤフラム開いてカットします。組織の損傷を避けるために斜めの位置にはさみをしてください。
  4. 一緒に心臓腫瘍肺を解剖し、冷たい HBSS + P/S の 30 mL を含む 50 mL のチューブチューブを冷たい保つため、できるだけ早く次のステップに進みます。
    注: 肺腫瘍の処理の遅延可能性があります変更 oncogenic 機能、たとえばシグナリング経路の活動。

3 精密カット肺腫瘍の発生をスライスします。

  1. 層流フードの内部保持 10 cm 組織培養プレートに HBSS + P/S 担肺を転送します。別の肺葉滅菌はさみや鉗子を使用して、スライスのために表面上の腫瘍に葉を選択します。
    注: 腫瘍 > サイズ 3 mm スライスに適しています。正常肺組織の剛性の違いによりスライス大きな腫瘍妥協を取り巻く、以来クリア腫瘍領域 vibratome 刃に直面しているような腫瘍組織スライスを受ける正常組織からに区切る必要があります。
  2. 滅菌メスで腫瘍を囲む正常肺組織の一部を切断してフラット組織作品表面を生成、シアノアクリ レート系接着剤のドロップのフラット スライドを浸しなさい。腫瘍が直立位置にブレードを向くように、vibratome の試料ホルダーにこちら側をマウントします。せ 2-3 分で乾燥接着剤。
    注: 試料ホルダーにくぎ付けに正常肺組織、腫瘍組織のスライスとは干渉しないし、正常組織に達する前に停止をスライスします。腫瘍組織は時々 その直立した位置を損なうこと、試料ホルダーにくぎ付けに正常肺組織の海綿状の質により します。このような場合は、直立位置 (図 1 a iii) に腫瘍を保持する取付済の正常肺組織の横にある追加の正常肺サポート組織片を接着します。
  3. 金属バッファー トレイに試料ホルダーを配置し、組織はバッファーに浸漬するまで冷たい HBSS + P/S でそれを埋めます。白い氷浴に金属バッファー トレイを置き、スライスしながら組織の冷静さを保つように氷を追加します。
  4. 白い氷浴を vibratome に接続します。適切なスライス設定を選択: 0.10 0.14 間速度をスライス 2.5 から 2.8 まで振幅 ms と 160-250 μ m まで切削厚さ。
    メモ: スライスの設定は、組織の硬さに応じて調整する必要があります。硬組織は柔らかい組織よりもスライスしやすく、柔らかい組織は、低い速度でスライスが必要です (0.1-0.12 ms) と高い振幅 (2.6 〜 2.8)。4-5 mm の大きな腫瘍は通常 15-20 200 μ M の厚さのスライスを提供します。短期栽培の層流フードの外準無菌条件下でマウスの腫瘍をスライスできます。ただし、臨床腫瘍はヒト組織における可能な感染性微生物への暴露を避けるためにクラス II バイオ層流フードの内部常にスライスする必要があります。
  5. 滅菌鉗子を使用して、密接にスライス、スライスした順序の追跡氷の上開催 24 ウェル プレートの別の井戸で HBSS の 1 mL にスライスを収集します。各マーク実験計画に従って 24 ウェル プレートのも。たとえば、マーク シーケンシャル井戸 24 ウェル プレートの文化時点、または 0 h、車両制御 (C) として薬物治療 (T) (図 1 b ii) です。
    注: いない邪魔か、スライスを収集しながら腫瘍を引いてその後スライスの厚さで不整合が生じて、ブレードの角度に対して腫瘍の方向が変更されます。
  6. すべてのスライスを収集すると、チタン グリッド (グリッドあたり 2-3 スライス) ウェルあたり培養液 2.5 mL を含む 6 ウェル プレートの配置にそれらを転送します。チタン グリッドと媒体との間に気泡が形成されることはないことを確認します。
    1. グリッドにスライスをロードし、斜め位置に 6 ウェル プレートを保存媒体の部分をカバー、グリッド、グリッドの中にスライスを配置するにはそれはカールする場合スライスを広げるためには、鉗子を使用します。95% の空気と 5% CO2、37 ° C で維持される加湿インキュベーター内に配置、回転のインキュベーション ユニットに 6 ウェル プレートをロードし、(図 1 i ii) の回転サイクルを開始します。
      注: 金属グリッドと 6 ウェル プレート回転ユニットの電源を入れる前にバランスのとれた体重を正確にする必要があります。グリッドの中央のスライスを配置することが重要だ、彼らは完全に空気と回転サイクル中に液相を切り替える。低すぎたり高に置かれているスライスは、酸素または組織存続を危険にさらすことができます (図 1 栄養素に適切には公開されません。スライスすることができます時折スライド ダウン スライスの位置をグリッドの栽培中に従うことが重要です。文化発症 1-2 時間以内場合は、その位置を修正し、このサンプルが壊れていることを注意してください。組織の生存率が不適切な酸素および栄養供給によって著しい影響を受けると、長期間の適合がスライスを破棄しなければなりません。
  7. 0 h、教養、参照として培養スライスに隣接する組織スライスを収集します。トップ、中間、スライスされる組織の中心を表すために少なくとも 3 つの参照スライスを収集します。5.1 で説明するようすぐに 0 h スライスとプロセスを修正します。
    メモ: スライスの数が限られている場合など、複数の化合物の治療または技術的なレプリケートを行うとその隣の 0 h サンプルを各処理のサンプルの比較難しくなります。このような場合、相対的な組織の生存率または文化発症に関連するマーカーの発現を評価する最も近い 0 h スライス (少なくとも 400-600 μ m 離れて) を使用します。
  8. 長期栽培は、毎日培養液を補充するため。滅菌鉗子を使用して組織スライスを含むグリッドを持ち上げて 6 ウェル プレートの空のウェルに配置新鮮な培養液を培地の 70% を置換し、媒体に戻ってグリッドを配置します。3.6 の手順で説明したように回転サイクルを続行します。

4. 小分子阻害剤による腫瘍片の治療

  1. 治療中の化合物の必要な濃度を準備します。通常、培養細胞の測定 IC50s と比較して 10 倍高い薬物濃度は、ターゲット組織スライス抑制を達成するために必要です。非特異的細胞傷害を避けるためには、各化合物の最小有効濃度を取得する濃度の範囲をテストします。ここでは、我々 は 0.1-1 テスト PI3K/mTOR 阻害剤 dactolisib と 0.05-0.5 の μ M のマウスの非小細胞肺癌のスライスに MEK 阻害剤 selumetinib μ M。
  2. 6 ウェル プレートに希釈薬、DMSO または他の車両制御とメディアの 2.5 mL を追加します。井戸にチタン グリッドを配置します。
  3. 手順 3.6 でグリッド上に組織のスライスを配置します。
  4. ティッシュの固定とパラフィン セクション 5 で説明されているように、スライスの処理 24 時間進むの車両や薬物治療を実行します。
    注: 薬物治療の期間を最適化できます実験の目的に応じて組織機能の in situ培養期間中に分析を保持する組織スライスの能力を考慮しました。

5. 固定と組織スライスの処理

  1. 教養 0 h 参照または PBS に浸したろ紙上に培養スライスを慎重に持ち上げます。
    1. これを行うには、10 cm のプレートで 2-3 mL の PBS を追加、PBS でスライスのフロートを聞かせて、'魚' それ鉗子のペアを持つフィルター紙の上にスライスを持ち上げることによってです。
    2. フィルター ペーパーを histocassette に転送し、明らかに後続処理ステップ (図 1) の中にスライスの位置をマークする組織スライスの上に希釈したヘマトキシリン (脱イオン水 1:1) のドロップを追加します。
    3. カセットを閉じて 4% 中性緩衝ホルマリン液にそれを転送します。4 ° C で一晩組織を修正します。
      注: フィルター紙の上にスライスを配置しながらスライスの最上部のセクションが上向きに直面していることを確認してください。これ断面および分析手順 6.3 中に上部、中間、およびスライスの下のセクションに従うことが必要です。
  2. 次の日は 70% にカセットを転送エタノール、パラフィン包埋組織処理手順にすぐに進むと。
  3. ティッシュの処理の前に 100% に、histocasettes を洗ってエタノール 2 x 10 分。この場合、ティッシュの処理のため電子レンジ駅を使用します。1 mm 厚に使用されるプログラムを選択、マニュアル (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf) の指示に従ってください。
    注: 加工機その他の組織を使用するときは、薄い組織サンプルに適したプログラムを使用します。
  4. パラフィン包埋用、histocassette を開き、フィルター ペーパーからスライスを持ち上げながらメスを使用します。フィルター紙を破棄し、流動パラフィンを含む鋳型にスライスを転送します。
    1. 例えばも断面を確保するためのフラットの重量と、埋め込み型の底面に対して組織を押します。金型の上に histocasette の底の部分を置き 30 分冷たいパテに金型の涼しい許可しなさいパラフィン ブロックから金型を分離します。
      注: 水平埋め込む代わりに、垂直に直立位置でスライスを配置することで腫瘍のスライスを埋め込むことが可能です。垂直部分は容易に生存率または単一のセクション25機能マーカー式のグラデーションの解析を許可します。水平方向に埋め込まれたスライスとグラデーションの分析には、パラフィン切片作製手順 6.2 で説明が必要です。

6. 処理と (FFPE) に解析ホルマリン固定、パラフィン包埋組織

  1. ミクロトームを使用して FFPE 組織スライス ブロックの 4 μ m の薄いセクションを準備します。断面しているとき、ブロックの角度を調整、ブロックの表面がブレード; に対して水平方向これもセクション組織全体を取得する必要です。
  2. 培養スライスのスライス、またはグラデーション バイオ マーカー式の間で文化による生存率の電位勾配、細胞遊走のキャプチャを有効にするには、各組織スライスのトップ、センター、下のレイヤーからオブジェクトのスライドのセクションを収集する.下記のとおり。
  3. パラフィン包埋組織スライスの連続切片をスライド ガラスの上の部分に最初に集め。(図 1E) スライド ガラスの下の部分が続く中央に深い組織層のセクションを収集を継続します。
    注: スライド ガラス上の 3 つのセクションに合わせて、トリム パラフィン埋め込まれた組織スライスを周囲の過剰。
  4. 37 ° C で一晩乾燥してセクションを許可する、下記のとおり H & E 染色や免疫組織化学的に進みます。
    注: 高温や長時間の FFPE のセクションが格納されているとき、抗原の消失する場合が生じる。パラフィン セクションが 4 ° C で保存する推奨され、IHC 解析をセクショニング後 6 ヶ月以内に実施されなければなりません。
    1. H & E 染色、deparaffinize およびパラフィン セクションを次のように水分補給: キシレン 3 x 5 分、100% エタノール 3 x 1 分、96% の江藤 2 x 1 分、70% のエタノール 1 x 1 分と脱イオン水 2 1 分 x。
    2. 酸アルコールのセクション 5 分ディップのため水道水を実行して下させたてフィルター ヘマトキシリン液, 10 分間のセクションを孵化させなさい (1% 70% の塩酸エタノール) 2 回の 5 分の 2 m の 0.5% エオシンと孵化によって続いての水道の流水下で洗浄で。
    3. アルコール、キシレン溶液中のスライドを次のように浸すことによってセクションを脱水エオシン ステップを次: 96% EtOH 2 15 x s、100% エタノール 3 30 x s、キシレン 3 1 分の x。最後に、セクションを埋め込むキシレン ベース取付中。

7. 組織生存率とバイオ マーカーの発現の解析

  1. 高解像度の画像を取得するには、H & E 染色スライド スキャナーを使用してすべてのスライドのスキャンを生成します。組織の実行可能性を評価するためにスライスの上、中、下のセクションを表す組織のスキャンからのスナップショットを取る。
    1. マニピュレーターの写真のソフトウェアを使用して、手動で MATLAB を使用して壊死領域の定量化に続いて、組織の壊死領域にマスクを描画します。
    2. 異なる時間ポイントでは私たちの以前の研究 (Närhi et al., 図 S2BC)260 h スライスに最も近い比較栽培スライスの相対生存率を計算します。同様に、培養スライスの上、中間および底で生存率を定量化することで潜在的なイントラ スライス生存率勾配を評価し、その最も近い 0 h スライスに各セクションの相対生存率を計算します。
      注: マウスの非小細胞肺癌のスライスの単なる栽培は、壊死性細胞死を誘導する、間前のヴィヴォ培養条件に対する生体の応答は腫瘍組織によって異なります。たとえば、HIF1α、ER、および F4/80 でマークされたマクロファージのグラデーションは乳房がんモデル25から派生したフィルターでサポートされているスライス培養で検出されました。したがって、H & E-だけでなく、培養スライスの IHC に基づく分析は組織の種類ごとに考慮する必要があります。
  2. パラフィン セクションの IHC を実行します。以下 IHC プロトコルは開始ポイントを他の抗体のための最適化がさらに必要があります。簡潔に、deparaffinize し、パラフィン セクションを次のように水分補給: キシレン 3 x 5 分、100% エタノール 3 x 1 分、96% のエタノール 2 x 1 分、70% のエタノール 1 1 分と脱イオン水 2 の x 1 分 x。
    1. 通常ヤギ血清 (NGS) 周囲温度 (21-23 ° C) で 30 分の 1 × PBS で 1% ウシ血清アルブミン (BSA) と 10% ブロックすることによって続いて抗原エピトープを公開し、ph 6 PT モジュールで 10 mM クエン酸を使用して熱を介した抗原検索を実行します。
    2. 1 %bsa と 5% で希釈した一次抗体の孵化 NGS 1 × pbs は、周囲温度 1-2 h のいずれか。3, 3 '-ジアミノベンジジン (軽打) を用いた検出に続いて、周囲温度で 30 分間、抗家兎の二次抗体とインキュベートします。
    3. セクションは 30 s、5 min のとおりアルコール、キシレンのソリューションでスライドを浸すことによって脱水が続くため水道水で洗浄、ヘマトキシリン (1:10 に脱イオン水で希釈) と counterstained: 70% EtOH 1 96% x x、100% エタノール 2 エタノール キシレン 3 x (× 31 分ステップ)。最後に、セクションを埋め込むキシレン ベース取付中。
  3. IHC 染色スライドのスライド全体スキャンを取得、画像ビューアーを使用して、1:4 の倍率で TIFF 画像としてエクスポートし、ImageJ を用いた数量を実行します。
    注: スキャナーに代わる、20 倍または 40 倍の倍率での顕微鏡画像は、数量の取得ことができます。定量化する; マーカーによって画像の倍率を選択できます。細胞質中に核染色に高倍率画像お勧めします。 または 20 倍画像を用いて膜マーカーを定量化することができます。
    1. 核マーカーの定量化, この場合 NKX2 1 式フィジー-ImageJ を使用して 16 ビット画像を各画像に変換し、画像解析用の画像をアップロードします。
    2. 分析によってイメージ解析パイプラインをカスタマイズします。このプロトコルでは NKX2 1 肯定的な核の定量化のため次のパイプラインを使用して、:を識別するプライマリ オブジェクト |オブジェクトの強度を計測 |オブジェクトをフィルター処理 (最小値 = 0.0025) |計算理学結果は DAB 染色核原子核の総数の割合として表されます。

Representative Results

図 1は、世代、栽培、マウスの非小細胞肺癌腫瘍由来精密カット組織スライスの分析のワークフローを表します。このデモでは、我々 は条件付きの活性化KrasG12D Lkb1 (セリン/スレオニン キナーゼ 11 として知られている) の損失と呼びますをかくまっている遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム) から腫瘍を利用KL。マウスの繁殖と肺腫瘍の開始を行った26,28の説明に従って。図 2 aは、スライス回転のインキュベーション ユニットを使用して 24 時間培養の生存率に及ぼす組織スライス厚を示します。結果表示を 160 μ m の薄いスライスはスライス間で大きな壊死部分を含みます。また、250 μ m の薄いスライスは、スライス 200 μ m の薄いスライスと比較して全体のグラデーションする、壊死を表示します。薄 160 μ m の貧しい人々 の全体的な生存がこれらは壊れやすい、カールする傾向があるように、グリッドの上にスライスの位置決め中に技術的な処理によって引き起こされる可能性が高いです。その一方で、スライスは、スライスの間で酸素や栄養素の拡散不足になりやすいになる、あまりにも厚い、壊死死勾配25外植体マウス非小細胞肺癌では立証されます。ただし、同一 vibratome 設定の使用にもかかわらず、1 つの腫瘍から変数厚さのスライスが出来ます。したがって、異なる腫瘍サンプルから複数の複製を分析することをお勧めします。重要なは、各組織のタイプは酸素と窒素の流れに影響することができます組織質感と硬度最大生存率を達成するためにスライス厚最適化する必要があります。図 2B-2C NKX2 1 発現定量 IHC 解析を示しています、分化型肺腺癌 (AC) 試料中のマーカーは 72 h までを栽培し、0 h スライスを一致します。結果は、NKX2 1 式が 0 h 難スライス、栽培のプロセスがあからさま AC 腫瘍組織の分化状態を与えないことを示唆するいると比較して培養スライスで大幅変更されていないことを示します。図 2 Dは、対象となる薬の有効性を評価するための腫瘍組織スライスの有用性を示しています。我々 は最近、そのKras変異マウス ACs 展示の高発現リン酸 ERK1/2 (MAPK 経路活動の増加をマーキング) 示した (マーキング mTOR 活性リン酸 4EBP1 の式中の扁平上皮 (ASC) 腫瘍に比較すると)、同様に AC と ASC の腫瘍で表されます。これらの経路は、切片に効果的に対象とすることができますをテストするため KL AC 組織スライス DMSO 処理したまたは化合物、すなわち 0.1-1 の量を滴定対象とする mTOR 経路または 0.05 – 0.5 μ dactolisib μ M selumetinib MAPK 経路を対象とします。Selumetinib の 0.5 μ M または 1 μ M dactolisib がそれぞれ 4EBP1 または ERK1/2 のリン酸化を抑制することで有効であることを示した。さらに、ターゲットを絞ったリンタンパク用量依存的な抑制は、リン酸化特異的抗体を検証する利用組織スライスできますを示します。

Figure 1
図 1: マウスの非小細胞肺癌腫瘍由来スライス植の確立と解析のワークフローの略図。(A) 回路図コレクションおよび担癌肺のスライスの準備を記述します。肺がマウスから収穫され、正常組織から腫瘍組織を解剖しました。黒い矢印とアスタリスクを示す約 4 mm と 1 mm の腫瘍。白い矢印は、試料ホルダーの表面に接着された肺組織を示します。正常肺の追加部分で赤い矢印のポイントは、直立位置で腫瘍を保持する組織をサポートします。(B) Vibratome スライスと組織スライスのコレクション。白い矢印は、スライス方向を示します。冷たい HBSS + P/s. を含む 24 ウェル プレートに逐次スライスのコレクションスライスはどちらか異なる時間ポイント (ここで 24-72 h) 栽培 (上の行)、腫瘍特異的マーカー発現を評価するために培養することができます。 または、薬物治療を実行する使用することができます。C: 車両制御、t: 薬物治療。(C) 回転培養装置を用いた栽培の組織スライスを配置すること。傾け 6 ウェル プレートを使用して、グリッドの上部をカバーするいくつかの媒体、媒体上にグリッドの中央組織スライスを置き、鉗子を使用してスライスを広めます。6 ウェル プレートがスムーズな回転サイクルのバランス重量であることを確認します。X: を示しますが正しくありませんとEquation: スライスの正確な位置を示します。(D) 腫瘍スライスの FFPE ブロックの写真です。パラフィン埋め込まれたティッシュのスライスで黒い矢印は、ヘマトキシリンで染色。FFPE ブロックでスライスの断面の順序を示す (E) 回路図組織の生存率および特定の腫瘍マーカー式を評価するためには、これらのセクションを処理できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 生存率と histotype 特定のマーカー発現の非小細胞肺癌組織スライスの標的化薬物治療評価します。(A) 代表 H & E 画像 24 時間 200 μ m 薄くスライス培養示された厚さのスライスを AC 非小細胞肺癌の維持 160 μ m または 250 μ m の薄いスライスと比較してよりよい生存率。濃い青が H & E 染色可能な組織を表し、ピンクが pseudocolored 壊死領域を示します。水色は、いずれかにより、貧しい人々 の組織の品質や腕組の存在の分析から除外する領域を示します。T1 と T2 の 2 つの異なる腫瘍由来生物の複製を表します。スケール バー = 500 μ m。 (B) 代表的な IHC AC スライス培養示された時間ポイントにおける NKX2 1 発現の画像。矢印は、高倍率で表示される領域を示します。結果は、NKX2 1 式が 0 h スライスに比べて培養スライスで変更されていないことを示します。スケール バー 500 μ m、50 μ m の低、高倍率をそれぞれ =。(C) (B) に示すようにデータの定量化。(D) 代表 IHC 画像リン酸 4EBP1 の 0 h に pERK1/2 式スライス、スライス DMSO 処理または dactolisib (dact、一番上の行) の量を滴定または 0 h スライス、または DMSO 処理スライスの pERK1/2 式をリン酸化やselumetinib (sel、下段)。黒正方形のボックスは、高倍率で示されている領域を示します。スケール バー 1 mm または 50 μ m 低または高の倍率をそれぞれ =。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

様々 な複雑な体外腫瘍モデル、3 D 文化 organoids などは、アーキテクチャと生体内で腫瘍組織29,30の oncogenic 機能を要約する開発されています。ただし、組織の解離と単一の細胞型の選択成長または人工的な環境において選択いくつかのセルタイプの共培養 3 D 文化またはオルガノイドの確立が含まれます。結果として、このようなモデルは不完全な腫瘍の不均一性と腫瘍間質相互作用の複雑さをキャプチャします。脊髄腫瘍のスライス、その一方で、広範な操作なく上皮内腫瘍の組織アーキテクチャと生物学的複雑さを維持します。組織スライスのネイティブの微小環境のモデルがん細胞へのこの能力は、前臨床試験の特に魅力的なテンプレートします。我々 は以前報告した確立および腫瘍精密カット スライスの解析のために最適化されたワークフローと回転潜伏ユニットが短期マウス非小細胞肺癌スライス文化25の生存率を向上させることを示した、サポートをフィルターと比較して、,31します。 ただし、回転ユニットでの栽培は技術的に難しく、常に監視が必要です。腫瘍組織スライス世代の実用的な使用、回転、それらを文化にインキュベーション ユニットと同様の上皮内腫瘍生物学薬の前に前提条件をキャプチャするスライスの機能を監視する方法に伴うプロトコルが紹介します。応答テスト。

プロトコルのいくつかの重要な手順は、組織の整合性と腫瘍スライスの有効性を確認します。正常肺組織が腫瘍を囲む、vibratome は一貫性のない厚さでスライスを生成したり、スライス、質感や剛性の違い正常細胞と腫瘍組織からに損傷を与えます。したがって、腫瘍をスライスする前に周囲の正常肺組織を削除することが重要です。もう一つの重要なステップは、スライスの厚さは、組織の種類ごとに慎重に最適化する必要があります。さらに、一度スライス、スライスが培養液中の酸素露出浸漬断続的なので精度を確保する、グリッドの中央に約置かれることが重要です。最後に、それはその回転期間中にスライスの位置を従うことが重要培地へのスライスすることができますドロップ ダウンこのような場合さらにアクションはプロトコルの手順 3.6 で説明したように撮影できます。

ティッシュの処理の整合性を確保する、に加えてスライスがネイティブの組織に似ている解釈に IHC における重要なステップも。私たちの以前の研究は、マウスの非小細胞肺癌腫瘍が顕著な内腫瘍発癌シグナル伝達活動26の空間的不均一性を示すことを示した。つまりは、異なる組織の使用のスライスをコントロールまたは薬剤を投与したサンプルは信頼性の高い実験データの解釈に影響を与える、したがって密接に隣接するスライスは、コントロールとテスト サンプルとして使用する必要があります。我々 はさらに増殖しながらことを示したまたは新鮮なカットの教養 0 h スライスで発癌性リン蛋白質発現培養スライスを示した変更された発癌性リン蛋白質表現、具体的に変更された p4EBP1上皮内腫瘍に類似していたpSRC と変更された増殖キ67 IHC によって分析します。変更された p4EBP1 式同様に 24 時間に検出されたヒト非小細胞肺癌、前立腺癌スライス文化 (Narhi et al。、補足図 S3B S3C、S5 と S7)26。これらの調査結果は、最も近い 0 h 難スライス培養スライスの比較は培養スライスの上皮内腫瘍機能の保全を評価するために重要なことを支持します。

切片スライス25の生存率を改善するにもかかわらず、回転子システム技術的の面で制限があります。チタン グリッド上に組織のスライスを置くことは挿入、フィルターに比べて難しく、回転潜伏ユニットを利用できない場合があります。代わりに、停滞フィルター サポートを使用できますが、生存率および HIF1α 式で測定した低酸素のエアフィルターにグラデーションがフィルターでサポートされているスライス急速に形成されるとは、スライスの空気にさらされた側だけが分析する必要がありますその場合は文化 (デイヴィス。 図 5、図 7A 7B)25。我々 はさらに腫瘍スライス培養が変更された増殖および彼らのネイティブ腫瘍の26、おそらく創傷治癒反応や代謝適応前のヴィヴォにスライスの原因に比べて発癌シグナル伝達活動を表わすことができることを示しています。32の文化します。72 時間培養中にマウスの非小細胞肺癌腫瘍の総の形態学的特徴を維持しましたが文化による増殖変化栽培スライスの正確な等級があります。したがって、組織スライスは短期的な機能の研究に対してのみ使用する必要があります。

回転培養装置の使用は少なくとも部分的に文化の最初の 24 時間、特に中にイントラ スライス生存率やバイオ マーカー式グラデーションを救助します。完全性および機能のメッセージが表示されましたら、これは薬物治療研究などの機能的な研究組織材料を提供します。薬物応答プロファイリングに加えて薬物治療に続く変更されたターゲット式抗体検証を利用できます。これは、これらが高い染色の背景を与える傾向があるマウスのモノクローナル抗体をマウスの抗原の検出のために特に関連。また、よく検証された抗体は、診断および臨床設定で信頼性が高く、再現性のあるデータを達成するために必要です。したがって、豊かさの変調または関連するエピトープ組織スライスの薬物治療の後のリン酸化抗体検証に便利な実用的なアプリケーションを提供します。腫瘍スライス文化の主な利点は、前のヴィヴォ魅力的なモデルになる腫瘍や間質細胞における発癌シグナル伝達活動や薬剤応答など、モデル空間分布関数に機能です。しかし、スライス回転栽培中、栽培のプロセスは、特に端組織を損傷することがさらに。それしたがってに挑戦正確にオーバーレイ 0 h スライスのバイオ マーカー染色 IHC 画像培養スライスの検出壊死領域の薬剤応答にバイオ マーカーの空間的活動を正確にリンクする機能を妥協します。さらに、腫瘍組み込み、文化による、薬剤性の壊死反応ではありません区別少なくとも空間薬剤応答の正確な定量を損なうこと、マウスの非小細胞肺癌組織スライス。最後に、腫瘍スライス培養の使用は、テストする研究者に対し、動物、従って精製、縮小、および実験動物に実験を交換する必要はなく、同じ腫瘍で複数化合物を許可します。

将来のアプリケーションとして臨床腫瘍サンプルに記載されているプロトコルを適用できます。さらに組織型に依存する変更または最適化が腫瘍テクスチャまたは剛性の最適化 vibratome 設定スライス厚と振動速度などを調整から始まる可能性が求められます。さらに、異なる腫瘍組織の栄養と成長因子の要件が異なる場合があります。例として、乳房がんスライス中13,18で補ったインスリン培養があります。手術または生検中に限られた組織材料を取得すると、そのレプリケーション サンプルの十分な数を得ることの難しさによる患者由来腫瘍スライス培養の最適化は難しい。さらに、データの再現性がによって挑戦も、特に線維化領域または間質浸潤、壊死組織と腫瘍細胞の割合で患者にサンプルの不均一性を発音します。最後に、設定の診断で腫瘍のスライスのアプリケーションには、薬物に前処理生検のスライスを外植体の反応に生体内で治療後の応答に一致する範囲の調査が必要となります。

Disclosures

著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgments

この研究では、金融サポート革新的な医薬品イニシアチブ共同事業から受信作業契約 no 115188、生物医学奨学金 (バトルシティ)、ヘルシンキ大学の博士プログラムおよびシグリッド Juselius を付与し、オリオン Farmos 基礎 (E.W.V.)。私たち PREDECT 組織スライス プラットフォームのコンソーシアム メンバーお礼申し上げます (プレミア タイトル af リク Turkki MATLAB 分析とサポートのための回転子システムのセットアップをサポートする Siv Knaappila と Hällström。居てサンシーロは図 1 写真のキャプチャに感謝の意を。我々 は組織学的のスライドをスキャンするための定額料金制の WebMicroscope チームに感謝し、実験動物飼育センターをサポートします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s Balanced salt solution (HBSS) Sigma H6648
Penicillin Streptomycin solution Thermo Fischer Scientific 15140-122
Ham's F-12 medium Thermo Fischer Scientific 21765-037
Glucose VWR 101174Y
FBS Thermo Fischer Scientific 10270-106
Glutamine 200mM Thermo Fischer Scientific 25030-024
Cyanoacrylate adhesive (GLUture) Abbott 32046-90-1
Leica VT1200 S vibrating blade microtome Leica Biosystems 14048142066
Slicing blade VWR PERS60-0138
Titanium grids Albamma Research and Development MA0036
Slice incubation unit Albamma Research and Development MD2500
10 cm tissue culture plate Sarstedt 83.1802
24-well plate Sarstedt 83.1836
6-well plate Sarstedt 83.1839
Neolus Hypodermic Needles Terumo Neolus NN2525R
50 mL falcon tube Greiner  227261
PBS Lonza BE17-517Q
Formaldehyde Fisher F/1501/PB08
Trifold histo cassette paper Cancer Diagnostics DX26280
Histo cassettes VWR 720-2199 
KOS The microwave multifunctional tissue processor Milestone SRL CAT307EN-003
Microtome Thermo Fischer Scientific HM355S
Superfrost Ultra plus slides VWR 631-0099
BSA Sigma A2153
NGS Thermo Fischer Scientific 16210-064
Citric acid Sigma C1909
PT-Module Thermo Fischer Scientific A80400012
Hematoxylin for H&E staining Merck 1.09249.0500
Hematoxylin for counter staining Dako S3309
Eosin Sigma E4382
NKX2-1 antibody Abcam ab133638 Lot Number: GR98031-12
pERK 1/2 antibody Cell Signaling Technologies CST 4370 Lot Number: 17
p4EBP1 antibody Cell Signaling Technologies CST 2855 Lot Number: 20
BrightVision poly-HRP Goat anti-rabbit secondary antibody ImmunoLogic VWRKDPVR-110HRP
Mounting medicum pertex VWR MEDT41-4021-00
DAB  ImmunoLogic VWRKBSO4-110
Dactolisib (NVP BEZ-235) Selleckchem S1009
Selumetinib (AZD2644) Selleckchem S1008
Pannoramic 250 slide scaner 3DHISTECH
MATLAB MathWorks https://se.mathworks.com/products/matlab.html
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER  3DHISTECH https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer
Adobe Photoshop CS6 Adobe https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s
Fiji-ImageJ ImageJ https://imagej.net/Fiji
CellProfiler CellProfiler cell image analysis software http://cellprofiler.org/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruin, E. C., McGranahan, N., Swanton, C. Analysis of intratumor heterogeneity unravels lung cancer evolution. Molecular and Cellular Oncology. 2, (3), e985549 (2015).
  2. Travis, W. D., et al. The 2015 World Health Organization Classification of Lung Tumors: Impact of Genetic, Clinical and Radiologic Advances Since the 2004 Classification. Journal of Thoracic Oncology. 10, (9), 1243-1260 (2004).
  3. Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, (7467), 346-354 (2013).
  4. Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. The American Journal of Pathology. 4, (4), 337-340 (1928).
  5. Wright, J. C., et al. Further investigation of the relation between the clinical and tissue culture response to chemotherapeutic agents on human cancer. Cancer. 15, 284-293 (1962).
  6. Roller, M. R., Owen, S. P., Heidelberger, C. Studies on the organ culture of human tumors. Cancer Research. 26, (4), 626-637 (1966).
  7. Reinbold, R. [Organotypic differentiation of the eye of the chick embryo in vitro]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 148, (15-18), 1493-1495 (1954).
  8. Loffredo Sampaolo, C., Sampaolo, G. [Organotypic cultures of chick embryo lung; some histologic and histochemical aspects]. Bollettino della Societa Italiano di Biologia Sperimentale. 32, (7-8), 797-801 (1956).
  9. Bousquet, J., Meunier, J. M. [Organotypic culture, on natural and artificial media, of fragments of the adult rat hypophysis]. Comptes rendus des séances de la Société de biologie et de ses filiales. 156, 65-67 (1962).
  10. Merz, F., et al. Organotypic slice cultures of human glioblastoma reveal different susceptibilities to treatments. Neuro-Oncology. 15, (6), 670-681 (2013).
  11. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. The British Journal of Cancer. 110, (2), 479-488 (2014).
  12. Estes, J. M., et al. Efficacy of anti-death receptor 5 (DR5) antibody (TRA-8) against primary human ovarian carcinoma using a novel ex vivo tissue slice model. Gynecologic Oncology. 105, (2), 291-298 (2007).
  13. Kuip, H., et al. Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment. The British Journal of Cancer. 6, 86 (2006).
  14. Vaira, V., et al. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, (18), 8352-8356 (2010).
  15. Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61, (3), 145-152 (2009).
  16. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 308, (9), H1112-H1125 (2015).
  17. Jaamaa, S., et al. DNA damage recognition via activated ATM and p53 pathway in nonproliferating human prostate tissue. Cancer Research. 70, (21), 8630-8641 (2010).
  18. Naipal, K. A., et al. Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer. The British Journal of Cancer. 16, 78 (2016).
  19. Gahwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. Preparation and maintenance of organotypic slice cultures of CNS tissue. Current protocols in neuroscience. Chapter 6 Unit 6.11 (2001).
  20. Alfaqeeh, S. A., Tucker, A. S. The slice culture method for following development of tooth germs in explant culture. Journal of Visualized Experiments. 10, (81), (2013).
  21. Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development? Stem Cells International. 959807 (2015).
  22. Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16, (1), 118-147 (1959).
  23. Gahwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20, (10), 471-477 (1997).
  24. Kiviharju-af Hallstrom, T. M., et al. Human prostate epithelium lacks Wee1A-mediated DNA damage-induced checkpoint enforcement. Proceedings of the National Academy of Science. 104, (17), 7211-7216 (2007).
  25. Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: histological and molecular characterisation of precision cut slices. Scientific Reports. 5, 17187 (2015).
  26. Narhi, K., et al. Spatial aspects of oncogenic signalling determine the response to combination therapy in slice explants from Kras-driven lung tumours. The Journal of Pathology. 245, (1), 101-113 (2018).
  27. Majumder, B., et al. Predicting clinical response to anticancer drugs using an ex vivo platform that captures tumour heterogeneity. Nature Communications. 6, 6169 (2015).
  28. Nagaraj, A. S., et al. Cell of Origin Links Histotype Spectrum to Immune Microenvironment Diversity in Non-small-Cell Lung Cancer Driven by Mutant Kras and Loss of Lkb1. Cell Reports. 18, (3), 673-684 (2017).
  29. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14, (6), 6999-7010 (2017).
  30. Weeber, F., Ooft, S. N., Dijkstra, K. K., Voest, E. E. Tumor Organoids as a Pre-clinical Cancer Model for Drug Discovery. Cell Chemical Biology. 24, (9), 1092-1100 (2017).
  31. Hoogt, R., et al. Protocols and characterization data for 2D, 3D, and slice-based tumor models from the PREDECT project. Scientific Data. 4, 170170 (2017).
  32. Davidson, S. M., et al. Environment Impacts the Metabolic Dependencies of Ras-Driven Non-Small Cell Lung Cancer. Cell Metabolism. 23, (3), 517-528 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics