Nanopartículas de óxido de hierro recubierto de polietilamina como vehículo para la entrega de ARN interferente pequeño a los macrófagos In Vitro e In Vivo

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Summary

Se describe un método de usar polietilamina (PEI)-recubierto de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas para transfectar macrófagos con ARNsi. Estas nanopartículas pueden administrar siRNA a macrófagos in vitro y en vivo y silencio blanco genes.

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Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C., Wang, K., Zhang, Y., Mao, X. Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (144), e58660, doi:10.3791/58660 (2019).

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Abstract

Debido a su papel fundamental en la regulación de la respuesta inmune, macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación y representan una prometedora diana terapéutica en muchos trastornos, como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Silenciamiento génico mediado por RNAi es un valioso enfoque de elección para probar y manipular la función del macrófago; sin embargo, la transfección de macrófagos con siRNA se considera a menudo ser técnicamente difícil, y, en la actualidad, existen metodologías pocos dedicados a la transferencia de siRNA a macrófagos. Aquí, presentamos un protocolo del uso de nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético revestido polietilamina (PEI-SPIONs) como un vehículo para la entrega específica de siRNA a los macrófagos. PEI-SPIONs son capaces de atascamiento y condensación completamente siRNA cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y arriba. In vitro, estas nanopartículas pueden brindar de manera eficiente siRNA primarios macrófagos, así como de la línea celular RAW 264.7 de macrófago-como, sin comprometer viabilidad celular en la dosis óptima para la transfección, y, en última instancia, inducen objetivo mediado por siRNA silenciamiento génico. Además de ser utilizados para la transfección en vitro siRNA, PEI-SPIONs son también una herramienta prometedora para la entrega de siRNA a macrófagos en vivo. Teniendo en cuenta sus características combinadas de propiedades magnéticas y la capacidad de silenciamiento génico, sistémico administradas partículas PEI-SPION/siRNA se espera que para modular la función de macrófagos, pero también para activar macrófagos ser fotografiada y seguimiento. En esencia, PEI-SPIONs representan una plataforma sencilla, segura y eficaz nonviral para entrega de siRNA a macrófagos in vitro e in vivo.

Introduction

Los macrófagos son un tipo de células inmunes innatas distribuidos en todos los tejidos del cuerpo, aunque en diferentes cantidades. Produciendo una variedad de citoquinas y otros mediadores, que desempeñan papeles críticos en la defensa del huésped contra los invasores patógenos microbianos, en reparación de los tejidos posterior a la lesión y en el mantenimiento de la homeostasis del tejido1. Debido a su importancia, los macrófagos han sido continuamente objeto de intensa investigación. Sin embargo, a pesar de su prevalencia en estudios de la función y Regulación génica, silenciamiento génico mediado por siRNA es menos probable que tenga éxito en macrófagos porque estas células — particularmente, los macrófagos primarios — son a menudo difíciles transfectar. Esto se puede atribuir a un relativamente alto grado de toxicidad asociado con enfoques de transfección más bien establecidos en la cual la membrana celular es químicamente (por ejemplo, con polímeros y lípidos) o físicamente (p. ej., por electroporación y pistolas de genes) interrumpen dejó siRNA moléculas cruzan la membrana, reduciendo así drásticamente viabilidad2,3 de macrófagos. Además, los macrófagos son los fagocitos dedicados ricos en enzimas degradativas. Estas enzimas pueden dañar la integridad de los siRNA, debilitando su eficacia silenciar aunque específicos de genes siRNA se ha entregado en la célula3,4. Por lo tanto, un sistema de envío eficaz orientada a macrófago siRNA necesita proteger la integridad y estabilidad del siRNA durante el plazo de expedición4.

Es cada vez más evidente que los macrófagos disfuncionales están implicados en la iniciación y la progresión de ciertos trastornos clínicos comunes como enfermedades autoinmunes, aterosclerosis y cáncer. Por esta razón, modulando la función del macrófago con, por ejemplo, siRNA, ha ido surgiendo como una metodología atractiva para el tratamiento de estos trastornos5,6,7. Aunque se ha progresado mucho, un gran reto de la estrategia de tratamiento basada en el siRNA es la especificidad celular pobre de siRNA sistémico administrado y la siRNA insuficiente captación por los macrófagos, que por lo tanto dar lugar a efectos secundarios indeseados. En comparación con la terapéutica de ácido nucleico libre que generalmente carecen de selectividad óptima de la célula y a menudo conducen a efectos adversos, cargado de droga nanopartículas (NPs), debido a su propensión espontánea de ser capturado por el sistema reticuloendotelial, fuera del objetivo puede diseñarse para apuntar pasivo a macrófagos en vivo, lo que permite mayor eficacia terapéutica con efectos secundarios mínimos8. NPs actuales para la entrega de las moléculas de ARN son nanocarriers inorgánicos y liposomas varios polímeros9. Entre ellos, polietilamina (PEI), un tipo de polímeros catiónicos capaces de atar y condensación de los ácidos nucleicos en NPs estabilizados, muestra el ARN más alta entrega capacidad9,10. PEI protege los ácidos nucleicos de la degradación enzimática y nonenzymatic media a su transferencia a través de la membrana celular y promueve su liberación intracelular. Aunque inicialmente introducido como un reactivo de entrega ADN, PEI fue demostrado posteriormente para ser una plataforma atractiva para en vivo siRNA entrega, ya sea local o sistémicamente9,10.

Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIONs) han demostrado gran promesa en biomedicina, debido a sus propiedades magnéticas, biocompatibilidad, tamaño comparable a objetos biológicamente importantes, alta relación superficie-área-volumen y se adapta fácilmente superficie para bioterrorismo anexo11. Por ejemplo, debido a su utilidad potencial como un agente de contraste y una rápida captación por los macrófagos, SPIONs han surgido como una herramienta clínica favorita a imagen de los macrófagos de tejido12. SPIONs también se han estudiado ampliamente como ácido nucleico entrega vehículos11,13,14,15, a nuestro conocimiento, la literatura contiene algunos informes de SPIONs como un portador para el entrega de siRNA dirigidos a macrófagos. Para la entrega del gene de SPIONs, su superficie es generalmente cubierta con una capa de polímeros catiónicos hidrofílicos en que cargado negativamente los ácidos nucleicos puede ser electrostático atraídos y atados. Aquí, presentamos un método para sintetizar SPIONs cuya superficie se modifica con bajo peso molecular (10 kDa), ramificado PEI (PEI-SPIONs). Estos nanoplatforms magnéticas se emplean entonces para condensar siRNA, formando complejos de PEI-SPION/siRNA que permiten transporte de siRNA en las células. Razón fagocitosis espontánea de SPIONs por las células del sistema reticuloendotelial16, junto con la capacidad fuerte de la Unión y condensación de los ácidos nucleicos por PEI, hace conveniente para el transporte eficiente de siRNA en PEI-SPIONs macrófagos. Los datos aquí presentados apoyan la viabilidad de silenciamiento del gen PEI SPION/siRNA-mediada por macrófagos en cultivo como en vivo.

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Protocol

Todos los métodos que implican animales vivos fueron realizados según el animal cuidado y utilizan las pautas de la Universidad del sudeste, China.

1. preparación de PEI-SPIONs

  1. Preparación de SPIONs modificado con ácido oleico
    1. Disolver FECLAS3•6H2O y FeSO4•7H2O en el agua bajo la protección de N2.
      1. Añadir 28 g de FECLAS3•6H2O y 20 g de FeSO4•7H2O en 80 mL de agua desionizada en un vaso de precipitados. Introducir N2 en el agua a través de un conducto de vidrio y revolver hasta que se disuelva la materia sólida.
      2. Calentar la mezcla de reacción a 72 ° C a una velocidad de agitación de 800 rpm, seguido por la adición de 40 mL de agua de amoníaco (28%). Revuelva durante 5 minutos.
    2. Agregar 9 mL de ácido oleico gota a gota en la solución mencionada y revolver a 72 ° C por 3 h.
    3. Enfriar la solución resultante a temperatura ambiente (RT). Precipitar la solución mediante separación magnética.
    4. Lavar el precipitado que contiene SPIONs 3 x con alcohol etílico absoluto y, entonces, dispersar el precipitado en 100 mL de n-hexano.
  2. Preparación de SPIONs modificado con ácido dimercaptosuccínico
    1. Añadir 800 mg de ácido oleico (AO)-modificado SPIONs dispersadas en 200 mL de n-hexano, y 400 mg de ácido dimercaptosuccínico (DMSA) dispersos en 200 mL de acetona, a un matraz de cuello de tres en un baño de agua a 60 ° C.
      Nota: Para determinar la concentración de OA-modificado SPION obtenida del paso anterior, tomar un pequeño volumen (por ejemplo, 1 mL) de la dispersión de SPION, volatilizar el n-hexano y pesar el polvo resultante.
    2. Añadir 200 μL de trietilamina gota a gota en la solución mencionada con agitación a 1.000 rpm y reflujo.
    3. Después de 5 h de agitación y a reflujo, obtener un precipitado negro por separación magnética.
    4. Dispersa homogéneamente el SPIONs hidrofílicos en agua desionizada ajustando el pH de la solución usando el hidróxido de Tetrametilamonio.
  3. Preparación de PEI-SPIONs
    1. Añadir gota a gota solución coloidal SPION modificado de DMSA en solución de PEI (10 kDa) en un matraz de 500 mL cuello tres bajo agitación mecánica a 1.000 rpm durante 2 h (WFe: WPEI = 1:3).
      Nota: La carga y el tamaño de PEI-SPIONs varían dependiendo de la relación deFe de la W a WPEI. LaFede la W: WPEI relación de 1:3 puede ser un buen punto de partida para sintetizar PEI-SPIONs convenientes para la entrega de siRNA.
    2. Añadir la solución resultante en un tubo de ultrafiltración teniendo un corte de peso molecular de 100 kDa y un contenido de 15 mL; Luego, centrifugar a 5.400 x g por 10 min hasta que la solución restante es de 1 mL. Añadir agua desionizada a la solución para hacer otra vez el volumen de 15 mL y repetir el proceso anterior 10 x para obtener el producto final. A continuación, filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm y almacenar el producto final a 4 ° C.
    3. Determinar la concentración de Fe de PEI-SPIONs por el método colorimétrico usando fenantrolina17. PEI-SPIONs de diluir con agua desionizada estéril a una concentración de 1 mg Fe/mL y almacenar a 4 ° C.
    4. Diluir 10 μL de la solución de PEI-SPION (1 mg Fe/mL) a 1 mL con agua desionizada; a continuación, probar su tamaño hidrodinámico y potencial zeta mediante un dispositivo de dispersión de luz dinámico.
      Nota: Preparar PEI-SPIONs en la gama de unos 30-50 nm. En este rango de tamaño, el efecto del tamaño NP en la Unión del siRNA y absorción celular parece no ser significativo. PEI-SPIONs teniendo un potencial zeta media más 37 mV puede ser tóxico en el rango de dosis de transfección, y un ensayo de citotoxicidad se debe realizar para garantizar la seguridad. La carga superficial y el tamaño hidrodinámico de las nanopartículas pueden controlarse dentro de un rango deseado ajustando el contenido del PEI.

2. preparación y electroforesis del Gel de agarosa de PEI-SPION/siRNA NPs

  1. SiRNA diluido con agua libre de ARNasa para obtener una concentración final de 20 μM (0,26 μg/μL).
  2. Preparar los cinco libres de Rnasa microcentrífuga tubos etiquetados 0, 1, 2, 4 y 8. Las etiquetas representan cocientes del peso de diferentes Fe: siRNA. Pipeta de 3 μL de solución de siRNA a todos los tubos (~0.8 μg de siRNA/tubo).
  3. Añadir 0, 0,8, 1,6, 3,2 y 6,4 μg de Fe en forma de PEI-SPIONs en los tubos etiquetados 0, 1, 2, 4 y 8, respectivamente. Mantenga el volumen total de la muestra de cada tubo de menos de 20 μL. Mezclar mediante pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo.
  4. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la formación de complejos de PEI-SPION/siRNA. Durante este período, hacen una agarosa 3% gel con agarosa de alta pureza.
    Nota: Adicional PEI-SPION/siRNA complejos con otras proporciones de Fe: siRNA (por ejemplo, 5 o 6) pueden ser preparados y probados.
  5. Añadir 1 μL de 6 x de buffer de carga de ADN por muestra 5 μL y mezclar con cuidado. Todas las muestras de la carga y correr la electroforesis a 5 V/cm hasta que el azul de bromofenol emigra hasta dos tercios de la longitud del gel. Tinción del gel con bromuro de etidio (EB) durante 15-20 min.
    Nota: Deben utilizarse solución EB y tampón de electroforesis recién preparada.
  6. Visualizar bandas siRNA bajo UV sistema de imagen. Comprobar las proporciones de Fe: siRNA en que complejos de formas de siRNA con PEI-SPIONs y, como resultado, las bandas que representan gratis siRNA son retrasados o no detectable.

3. transfección de 264.7 macrófagos In Vitro

  1. Cultura ratón macrófagos 264.7 células en un plato de 10 cm con DMEM completan medio con 10% suero bovino fetal (FBS) por 100 U/mL de penicilina por 100 estreptomicina μg/mL a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .
  2. Un día antes de la transfección, aspirar el medio de las células y enjuagarlos con solución salina con tampón fosfato (pH 7,4). Añadir 1 mL de tripsina 0.25% al plato de 10 cm. Trypsinize 264.7 células para unos 5-10 min a 37 ° C en un incubador de 5% CO2 .
  3. Cuando la mayoría de las células ha separado (después de 5-10 minutos), añadir 5 mL de medio completo DMEM al plato para hacer inactivo de la tripsina. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para dispersar a los racimos de célula en las células.
  4. Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 15 mL estéril. Centrifugue lo a 300 x g durante 3 min a RT. eliminar el sobrenadante.
  5. Resuspender las células con 5 mL de medio completo DMEM fresco y contar las células.
  6. Placa 9 x 104 células por bien en una placa de 6 pozos con 2 mL de medio DMEM completo e incuban a 37 ° C en un incubador 5% CO2 por cerca de 24 horas.
    Nota: Si utiliza una placa de un tamaño diferente, ajustar la densidad celular plateado en proporción a la superficie relativa para que las células lleguen a confluencia del 80% en el momento de la transfección.
  7. Cuando confluencia celular es del 80%, retire el medio de las células y reemplazar con 1 mL de medio completo DMEM por pozo. Vuelva la placa a la incubadora hasta que PEI-SPION/siRNA complejos se han preparado y están listos para su uso (30 minutos).
  8. Preparar PEI-SPION/siRNA complejos: calcular la cantidad de complejos de PEI-SPION/siRNA para un experimento de transfección. En un tubo de microcentrífuga de libre de Rnasa de 1,5 mL, mezclar una cantidad adecuada de PEI-SPIONs con siRNA en una proporción determinada Fe: siRNA. Por ejemplo, para preparar el PEI-SPION/siRNA NPs que contiene 100 μg de Fe en una relación de Fe: siRNA de 4, añada 100 μl (1 mg Fe/mL) de PEI-SPIONs a 96 μL de siRNA (0,26 μg/μL), seguir mezclando suavemente con una micropipeta. Incubar durante 30 min a TA.
    Nota: Preparar un volumen de PEI-SPION/siRNA complejo que es el 10% superior a la masa final total para tener en cuenta las pérdidas incidentales. Hacer complejos de PEI-SPION/siRNA en proporciones bajo Fe: siRNA, bajo el cual las moléculas de siRNA están completamente cargadas en PEI-SPIONs y, por lo tanto, pequeñas cantidades de PEI-SPIONs se pueden utilizar para minimizar la potencial citotoxicidad. Experiencias piloto (análisis del retraso del gel) para la optimización de la relación Fe: siRNA son necesarios.
  9. Sacar la placa de 6 pozos de la incubadora (paso 3.7). Añadir un volumen requerido de PEI-SPION/siRNA complejo gota a gota a cada pocillo y la placa con cuidado para asegurar una distribución uniforme del remolino. Vuelva la placa a la incubadora hasta la evaluación de la celular absorción o gene precipitación eficiencia (d 1-3).
    Nota: Los macrófagos transfectar con PEI-SPION/siRNA en una concentración de ~ 15 μg Fe/mL pueden maximizar la eficiencia de transfección minimizando el potencial citotoxicidad.

4. sistémico entrega de siRNA a macrófagos en ratas con artritis Experimental

  1. Obtener ratas de Wistar machos libre de patógenos específicas que son 7 semanas de edad. Habituar a las ratas para 7 d antes de su uso y proporcionarles agua y alimentos adecuados. Inducir la artritis adyuvante (AA) en las ratas como se describió anteriormente18.
  2. Preparar PEI-SPION/siRNA complejos como se describe en el paso 3.8.
  3. Inyecte el NPs de PEI-SPION/siRNA (0,3 mg de siRNA/kg) en la AA las ratas a través de la vena de la cola. Evaluar la absorción celular mediante, por ejemplo, citometría de flujo, tejido biodistribución a través, por ejemplo, una fluorescencia en tiempo real, sistema de la proyección de imagen o efectos terapéuticos basan en, por ejemplo, clínicos, histologic y radiográficos Análisis en el tiempo deseado puntos18.
    Nota: Para estudios de biodistribución de celular y el tejido, tratar a las ratas con una sola inyección de la NPs deseado; para estudios terapéuticos, se inyectan las ratas con el NPs probadas 1 x por semana por tres semanas consecutivas.

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Representative Results

El tamaño y la zeta potencial de PEI-SPIONs preparado con este protocolo estaban en la gama de 29-48 nm (índice de polidispersidad: 0.12 - 0,23) y 30-48 MT, respectivamente. Eran estables en el agua a 4 ° C por más de 12 meses sin evidente agregación. Para evaluar su siRNA vinculante capacidad, PEI-SPIONs se mezclaron con siRNA en diferentes proporciones de peso de Fe: siRNA. La figura 1 muestra que cuando la relación de peso de Fe: siRNA alcanza 4 y superiores, la banda de siRNA gratis fue totalmente desaparecidos, lo que implica Unión exitosa siRNA a PEI-SPIONs. Una preocupación importante de PEI en aplicación biomédica es su toxicidad, que es el resultado de la fuerte carga positiva, especialmente en altos pesos moleculares y en altas dosis. Como se muestra en la figura 2A, PEI-SPIONs con una zeta potencial de 30.5 y 37 mV no mostró citotoxicidad aparente en concentraciones de hasta 30 μg Fe/mL, que es aproximadamente el doble más alto que la concentración (15 μg Fe/mL) se utiliza normalmente para la transfección de la célula. Sin embargo, PEI-SPIONs con un potencial zeta de 48 mV fueron tóxicas incluso a la dosis más baja examinada (10 μg Fe/mL). Por lo tanto, PEI-SPIONs poseen una toxicidad dependiente de la carga. Puesto que no es importante para la captación de NP por el macrófagos19carga catiónica, sugerimos que PEI-SPIONs con un potencial zeta media no superior a los 37 mV se utilizan para la transferencia de siRNA, aunque atascamiento de siRNA disminuiría la carga hasta cierto punto y aliviar la citotoxicidad18.

Para probar la posible aplicación de PEI-SPIONs para la entrega de siRNA a los macrófagos, la transfección en vitro fue realizada con la línea celular de macrófagos murinos RAW 264.7. Como analizadas por citometría de flujo, más del 90% de las células fueron transfectado con fluorescencia etiquetadas complejos de PEI-SPION/siRNA en 15 μg Fe/mL (figura 2B). Con respecto a la eficiencia de transfección, realmente no hubo diferencia entre NPs PEI-SPION/siRNA formado en proporciones de peso de Fe: siRNA de 4 y 8, aunque, bajo esta última condición, el NPs que se formaron eran más débiles y más pequeños en tamaño en carga positiva porque una menor cantidad de siRNA se cargó por partícula. También se evaluó el efecto de concentración de PEI-SPION/siRNA sobre internalización celular mediante tinción azul prusiano. Como se muestra en la figura 2, las manchas azules en las células transfected fueron mínimamente detectables en 7.5 μg Fe/mL, pero claramente visible a 15 μg Fe/mL. Curiosamente, aumento de la concentración de PEI-SPION/siRNA a 32 μg Fe/mL no aumentó la intensidad de tinción, probablemente debido a la absorción de PEI-SPION/siRNA se saturó en concentraciones alrededor de 15 μg Fe/mL. Además, la capacidad de PEI-SPIONs para mediar a la transferencia de siRNA se corroboró en los macrófagos primarios18, y el método presentado aquí una eficacia de transfección alta siRNA en macrófagos peritoneales de rata, equivalentes a la de 264.7 células. Los macrófagos peritoneales transfectados con PEI-SPIONs albergar siRNA específica mostró una disminución significativa en el nivel de mRNA en comparación con siRNA inespecífico (Figura 2D), lo que implica que siRNA podría escaparse de vesículas de endocitosis en la citoplasma y llegar a la maquinaria de RNAi.

Previamente se investigó también la absorción celular en vivo de complejos de PEI-SPION/siRNA administrados sistémicamente en ratas con artritis de adyuvante18. Hemos analizado la eficacia de transfección de PEI-SPION/siRNA en fagocíticos macrófagos y linfocitos T nonphagocytic. Como se muestra en la figura 3, las células CD11b + tomaron PEI-SPION/siRNA complejos más eficientemente que en cualquier momento en todos los órganos examinados, lo que indica que NPs PEI-SPION/siRNA dirigidos preferentemente macrófagos18las células CD3 +. En particular, se observó una acumulación alto nivel de NPs en articulaciones inflamadas18, sugiriendo que el PEI-SPION puede ser una plataforma atractiva para la entrega sistémica de siRNA therapeutics en cuya patogenia está relacionada con la artritis reumatoide disfunción de macrófagos y en que local siRNA administración no es una opción preferida debido a la participación de múltiples órganos de la enfermedad.

Figure 1
Figura 1: electroforesis en agarosa de PEI-SPION/siRNA complejos forman en diferentes proporciones de Fe: siRNA (w/w). Una relación de Fe: siRNA de 0 representa dúplex siRNA libre sin PEI-SPIONS. El tamaño promedio y el potencial zeta de las PEI-SPIONs gratis aquí eran 30 nm y 45 mV. siRNA podría atar totalmente a PEI-SPIONs cuando la relación de Fe: siRNA alcanza 4 y superior, coherentes con los resultados anteriores usando PEI-SPIONs con un tamaño promedio de 48 nm y un potencial zeta de 30,5 MT18. La ausencia de bandas retardados (PEI-SPION/siRNA complejos) puede reflejar la inaccesibilidad de siRNA a EB durante la coloración, una indicación de la Unión del siRNA fuerte, o la capacidad de condensación de PEI-SPIONs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: caracterización biológica de PEI-SPION y PEI-SPION/siRNA NPs. (A) este panel muestra un análisis de viabilidad de la célula. RAW 264,7 células fueron tratadas durante 16 horas con las dosis indicadas de PEI-SPIONs teniendo potencial zeta diferentes y, a continuación, se realizó un ensayo MTS. La viabilidad celular fue normalizada contra el control (sin exposición de la partícula). Los datos son la media ± SD de los pocillos duplicados. (B) este panel muestra un análisis de citometría de flujo de la PEI-SPION/Cy3-siRNA captación por las células RAW 264.7. Las células fueron incubadas durante 24 h con 15 μg Fe/mL (panel superior) o 5 μg Fe/mL (parte inferior) de PEI-SPIONs complexed con marcado con Cy3 siRNA en una relación de Fe: siRNA (w/w) de 4 y 8, respectivamente. Inespecífica (NC) siRNA representa siRNA fluorescente no. M2: terreno región; Intensidad de fluorescencia de PE-H: Cy3. La eficiencia de transfección de siRNA de PEI-SPIONs usado aquí (37,8 nm, 48 mV) era similar a un estudio previo con PEI-SPIONs con un tamaño promedio de 48 nm y un potencial zeta de 30,5 MT18. (C) este panel muestra un análisis de la absorción de PEI-SPION/siRNA visualizando depósitos de hierro celular. RAW 264,7 células se incubaron con 7.5, 15 y 32 μg Fe/mL PEI-SPIONs (48 nm, 30.5 mV) complexed con siRNA (Fe: siRNA = 8) y manchadas por el azul de Prusia. Las barras de escala son 20 μm. (D) este panel muestra una validación en vitro de la eficacia de silenciamiento de siRNA por PEI-SPIONs. Una rata de siRNA-targeting específica cadena de IL-2-15 receptores β se ha cargado en PEI-SPIONs (48 nm, 30.5 mV) en Fe: siRNA = 8 y, luego, transfected en macrófagos peritoneales de rata. Como control se utilizó un siRNA de NC. Se evaluó el efecto de silenciamiento del gen por PCR cuantitativa. Las células se incubaron con los complejos en 15 μg Fe/mL. Los datos son la media ± SD de pozos por triplicado. Panel D se ha modificado de Duan et al. 18 con permiso del editor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: En vivo la absorción celular de PEI-SPION/siRNA NPs. Tres ratas artríticas se inyectaron por vía intravenosa con una dosis única de 0,3 mg/kg Cy3-siRNA formulado con PEI-SPION (48 nm, 30.5 mV). Una rata inyectada con PBS se utilizó como control. Sangre, bazo, hígado, riñón y las articulaciones inflamadas se colectaron en 2, 8 y 24 h después de la inyección. La absorción celular de NPs de PEI-SPION/Cy3-siRNA se evaluó por citometría de flujo utilizando anticuerpos de monoclonales de anti CD11b (B) y (A) anti-CD3. Los porcentajes son de captación Cy3-siRNA dentro del barrio cerrado CD3 + o células CD11b +. Los resultados mostrados aquí son representativos de dos experimentos independientes. Esta figura ha sido modificada de Duan et al. 18 con permiso del editor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los macrófagos son refractarios a transfectar por enfoques nonviral utilizados, tales como especies de lípidos, liposomas catiónicos y electroporación. Aquí describimos un método confiable y eficiente para transfectar macrófagos con ARNsi. Mediante el presente Protocolo, sobre 90% de macrófagos RAW 264.7 células (figura 2B) y de los macrófagos peritoneales de rata18 puede ser transfectado con siRNA sin deterioro significativo de la viabilidad celular. Este método depende de la plataforma de PEI-SPION, que es un nanocarrier compuesto por un núcleo de óxido de hierro y una cáscara de PEI. Así, el primer paso clave del protocolo es la síntesis del PEI-SPIONs convenientes para la entrega de siRNA. Generalmente, SPIONs cubierto de PEI se preparan a partir SPIONs recubiertos de ácido oleico por un método de intercambio de ligando que el ácido oleico se intercambia directamente de la superficie de SPIONs PEI o sus derivados15, generando NPs hidrofílicas con una carga positiva superficie. En el caso presentado aquí, el ácido oleico un tope en la superficie del SPIONs fue reemplazado por el ácido dimercaptosuccinic soluble en agua y luego PEI fue cargado sobre superficies SPION a través de interacciones electrostáticas. Este método es suave y fácil de preparar en grandes cantidades, y el NPs sintetizado poseen excelente estabilidad en agua20. Es bien sabido que el PEI es citotóxico, y la toxicidad se correlaciona fuertemente con su peso molecular21. Para garantizar la seguridad, una consideración importante cuando sintetizando PEI-SPIONs es que estas partículas están cubiertas con PEI de bajo peso molecular, que es 10 kDa de este protocolo. El efecto tóxico indeseable de PEI está mediado principalmente por su carga positiva; por lo tanto, la medición del potencial zeta de PEI-SPIONs es esencial, y el valor no debe ser superior a 37 mV. Una disminución en la carga positiva se logra simplemente reduciendo el contenido de los PEI. Otro paso fundamental para la aplicación exitosa de este sistema de entrega de siRNA es la optimización de la relación Fe: siRNA en gel retraso. Parece razonable hacer complejos de PEI-SPION/siRNA en proporciones bajo Fe: siRNA bajo que siRNA moléculas son todavía capaces de unirse a PEI-SPIONs. En esta circunstancia, pueden utilizarse pequeñas cantidades de PEI-SPIONs, minimizando su potencial citotoxicidad.

En caso de que no se produce un efecto terapéutico o eficiencia silenciamiento deseado, comprobar la eficacia de la transfección por flujo citometría o fluorescencia la microscopia usando el portador cargado con un siRNA fluorescencia marcada. Alternativamente, la absorción de PEI-SPION/siRNA puede ser examinada por la coloración azul prusiano convencional, que es lo suficientemente sensible para detectar solo gránulos de hierro en las células. Si la eficiencia de la transfección es realmente baja, se requiera para optimizar las condiciones de la transfección como densidad celular de transfección y la dosis de partículas PEI-SPION/siRNA. El número de paso de la célula también puede afectar la eficiencia de transfección22. En la mayoría de los casos, un efecto de silenciamiento insuficiente no es causado por una insuficiente absorción de PEI-SPION/siRNA, como ha demostrado el actual sistema de PEI-SPION para facilitar una transferencia eficaz de siRNA a los macrófagos. A veces, combinando varios siRNAs dirigidos al mismo gen puede ser una buena estrategia para mejorar la eficiencia de precipitación. Es de destacar que, aunque ARNi ocurre generalmente dentro de 24 h de la transfección, el inicio y la duración de silenciamiento del gen dependen de la tasa de rotación del objetivo, la tasa de dilución y la longevidad de siRNA e incluso la concentración de suero en el medio. Así, tiempo de curso de los experimentos pueden ser necesarios para determinar con precisión el momento de máximo efecto2,22. Para el uso en vivo , la eficacia terapéutica también depende de si y hasta qué punto, el objetivo de siRNA contribuye a fenotipos de la enfermedad; por lo tanto, la elección de un destino de siRNA adecuado es crítica para los resultados esperados.

Hay varias ventajas de este protocolo para la entrega de siRNA a los macrófagos. (1) el método es fácil de realizar y es una forma barata de producir PEI-SPIONs en grandes cantidades, y el NPs producido son estable en agua por más de 12 meses si se mantienen a 4 ° C. (2) fagocitosis espontánea de SPIONs por los macrófagos facilita a una transferencia efectiva PEI-SPION-mediada por siRNA, dando por resultado eficacia de transfección alta. Se espera que además de RAW 264.7 células y macrófagos peritoneales de rata, este enfoque es aplicable a otras líneas celulares de macrófagos y los macrófagos primarios, mientras se optimiza la dosis para la transfección. (3) siRNA transfección es rápida y fácil de realizar en comparación con otros métodos de transfección de macrófagos como nucleofection, que lleva tiempo y requiere un dispositivo de Nucleofector2. (4) PEI-SPION puede ser un vehículo ideal para la entrega de siRNA sistémica orientada a macrófagos en ciertos modelos de la enfermedad. Los macrófagos juegan un papel crítico en el desarrollo y progresión de varias enfermedades inflamatorias crónicas, así como tumores; y una conspicua característica histológica de estas enfermedades los vasos sanguíneos anormales con endotelio agujereado. Por lo tanto, debido a la mayor permeabilidad y el efecto de retención, sistémico administrados NPs cargado de droga tienden a acumularse en los tejidos enfermos son fácilmente capturados por macrófagos locales, llevando a mayor especificidad, reducción los efectos secundarios y mejora eficacia terapéutica. En un modelo de rata de la artritis adyuvante, intravenoso inyectados complejos de PEI-SPION/siRNA son tomados por ~ 40% de las células CD11b + durante las primeras 24 h después de la inyección de18. Por el contrario, cuando el liposoma catiónico se utiliza como portador para la entrega de siRNA sistémica en ratones, menos del 5% de las células CD11b + en las articulaciones artríticas había atrapado el siRNA lipoplexes23. Por otra parte, debido a sus propiedades magnéticas, la aplicación de un campo magnético externo puede además facilitar la acumulación de complejos de PEI-SPION/siRNA en los tejidos diana y aumentar su absorción celular. También cabe destacar que estos NPs cargado de siRNA pueden utilizarse para modular la función de macrófagos, sino también para la proyección de imagen del macrófago para proporcionar información de diagnóstico, eficacia del tratamiento del monitor y predicen los resultados clínicos de pacientes12.

Sin embargo, existen limitaciones asociadas con este protocolo. El sistema de PEI-SPION exhibe una gama estrecha de dosificación para la entrega de siRNA. La absorción máxima se produjo cuando 264.7 células fueron expuestas a PEI - SPION/siRNAs en una concentración de 15 μg Fe/mL (figura 2B y 2C). Aumento de la concentración de PEI-SPION/siRNA a 32 μg Fe/mL no produjo un aumento en la absorción celular (figura 2) pero, por el contrario, podría aumentar el riesgo de inducir muerte celular debido a la toxicidad intrínseca del PEI. Por el contrario, disminución de PEI-SPION/siRNA a 5 o 7,5 μg Fe/mL obviamente reduce su absorción por las células 264.7 (figura 2B y 2C). Por lo tanto, proponemos que la concentración óptima de PEI-SPION/siRNA para la transfección en vitro macrófago es ~ 15 μg Fe/mL (la concentración final en un pozo). Otra limitación que debe tenerse en cuenta es el posible efecto de PEI-SPIONs en la actividad de los macrófagos. Nanopartículas pueden inducir la respuesta inmune24, dependiendo de su modificación superficial, carga de superficie, tamaño, forma e incluso sobre la metodología utilizada para sintetizar. Mulens Arias et al informó recientemente que SPIONs recubierto de PEI activan activación de macrófagos25. El método de síntesis del PEI-SPION presentada aquí difiere significativamente de Mulens Arias et al., y por lo tanto, si SPIONs PEI elaborado basado en el gatillo de protocolo presente activación de macrófagos espera más investigación. Sin embargo, para hacer inequívoca frente a esta preocupación, sugerimos que, además de la PEI-SPION complexed con scramble siRNA, el vehículo sí mismo (PEI-SPION solamente) puede servir como otro control cuando se utiliza el presente Protocolo. Por último, este Protocolo no es conveniente para la entrega de ADN debido a su tamaño relativamente grande.

En Resumen, se presenta aquí un método de usar SPIONs PEI-revestida como vehículo para la transfección de siRNA en los macrófagos. Estos NPs pueden administrar siRNA en líneas de células inmortalizadas macrófago, así como en macrófagos primarios en vitroy funcionalmente inducen silenciamiento génico sin afectar la viabilidad celular en la dosis óptima para la transfección. Por otra parte, PEI-SPIONs puede ser utilizados para en vivo entrega de siRNA a los macrófagos, lo que permite a la imagen, así como modular, macrófagos cuya disfunción contribuye al desarrollo y progresión de muchas enfermedades inflamatorias crónicas y tipos de cáncer.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (81772308) y el nacional de investigación clave y programa de desarrollo de China (Nº 2017YFA0205502).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China
for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

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References

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