Polyethyleneimine-belagda järnoxid nanopartiklar som ett fordon för leverans av små störande RNA till makrofager In Vitro och In Vivo

* These authors contributed equally
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi beskriver en metod för att använda polyethyleneimine (PEI)-belagda superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar för transfecting makrofager med siRNA. Dessa nanopartiklar kan effektivt leverera siRNA att makrofager in vitro- och in-vivo och tystnad mål genuttryck.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C., Wang, K., Zhang, Y., Mao, X. Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (144), e58660, doi:10.3791/58660 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

På grund av sin kritiska roll i reglering av immunsvar, makrofager har kontinuerligt varit föremål för intensiv forskning och innebära en lovande terapeutiskt mål i många sjukdomar, såsom cancer, åderförkalkning och autoimmuna sjukdomar. RNAi-medierad nedtystning är en värdefull metod val sond och manipulera makrofag funktion; dock transfection av makrofager med siRNA anses ofta vara tekniskt utmanande, och för närvarande finns några metoder tillägnad siRNA överföring till makrofager. Här presenterar vi ett protokoll med polyethyleneimine-belagda superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar (PEI-SPIONs) som ett fordon för riktade leverans av siRNA till makrofager. PEI-SPIONs klarar av bindande och helt kondenserande siRNA när den Fe: siRNA viktförhållandet når 4 och ovan. In vitro, dessa nanopartiklar effektivt kan leverera siRNA primära makrofager, men även in i makrofag-liknande RAW 264,7 cell linje, utan att kompromissa med cellviabilitet på den optimala dosen för transfection, och, slutligen, de inducerar siRNA-medierad mål nedtystning. Frånsett används för in vitro- siRNA transfection, är PEI-SPIONs också en lovande verktyg för att leverera siRNA till makrofager i vivo. Med tanke på dess kombinerade funktioner av magnetiska egendom och nedtystning förmåga förväntas systemiskt administrerade PEI-DEMOLERADES/siRNA partiklar inte bara att modulera makrofag funktion, utan också att aktivera makrofager som ska avbildas och spåras. I huvudsak PEI-SPIONs representerar en enkel, säker och effektiv nonviral plattform för siRNA leverans till makrofager både in vitro- och in vivo.

Introduction

Makrofager är en typ av medfödda immunceller som distribueras i alla kroppens vävnader, om än i olika mängder. Genom att producera en mängd cytokiner och andra mediatorer, spelar de avgörande roller i värd försvar mot invaderande mikrobiella patogener, i vävnad reparera efter skada och att upprätthålla vävnad homeostas1. På grund av sin betydelse, har makrofager kontinuerligt varit föremål för intensiv forskning. Men trots dess förekomst i genreglering och funktion studier, siRNA-medierad nedtystning är mindre sannolikt att lyckas i makrofager eftersom dessa celler — särskilt primära makrofager — är ofta svåra att transfect. Detta kan tillskrivas en relativt hög grad av toxicitet associerad med mest väletablerade transfection metoder där cellmembranet är kemiskt (t.ex., med polymerer och lipider) eller fysiskt (t.ex., av elektroporation och gen kanoner) stört för att låta siRNA molekyler korsa membranet, därmed drastiskt minska makrofager bärkraft2,3. Makrofager är dessutom dedikerad fagocyter rik på nedbrytningsvägar enzymer. Dessa enzymer kan skada integritet siRNA, försvaga dess tysta effektivitet även om gene-specifika siRNA har levererats till den cell3,4. En effektiv makrofag-riktade siRNA leveranssystem måste därför skydda integriteten och stabiliteten av siRNA under leverans4.

Det är alltmer uppenbart att dysfunktionella makrofager är inblandade i initiering och progression av vissa gemensamma kliniska sjukdomar som cancer, åderförkalkning och autoimmuna sjukdomar. Av denna anledning, modulerande makrofag funktion med, exempelvis siRNA, har trätt fram som en attraktiv metod för behandling av dessa sjukdomar5,6,7. Även om stora framsteg har gjorts, är en stor utmaning för siRNA-baserad behandlingsstrategi dålig cell specificitet systemiskt administrerade siRNA och otillräcklig siRNA upptaget av makrofager, som följaktligen leder till oönskade bieffekter. Jämfört med gratis nukleinsyra therapeutics som oftast saknar optimal cell selektivitet och ofta leder till biverkningar, drog-loaded nanopartiklar (NPs), på grund av deras spontana benägenhet av fångas upp av det retikuloendoteliala systemet, off-target kan vara konstruerad för passiv inriktning att makrofager i vivo, vilket möjliggör förbättrad terapeutisk effekt med minimal biverkningar8. Nuvarande NPs utforskade för leverans av RNA-molekyler är oorganiska nanocarriers, olika liposomer och polymerer9. Bland dem visar polyethyleneimine (PEI), en typ av katjoniska polymerer kan bindande och kondenserande nukleinsyror i stabiliserad NPs, den högsta RNA levererar kapacitet9,10. PEI skyddar nucleic syror från enzymatisk och nonenzymatic nedbrytning, förmedlar deras överföring över cellmembranet och främjar deras intracellulära release. Även om ursprungligen infördes som en DNA leverans reagens, visades därefter PEI för att vara en attraktiv plattform för i vivo siRNA delivery, antingen lokalt eller systemiskt9,10.

Superparamagnetiska järnoxid nanopartiklar (SPIONs) har visat mycket lovande i biomedicin, på grund av deras magnetiska egenskaper, biokompatibilitet, jämförbar storlek till biologiskt viktiga objekt, hög yta-området-till-volym förhållande, och lätt att anpassa yta för bioagent bilaga11. Exempelvis på grund av deras potentiella nytta som kontrastmedel och snabbt upptag av makrofager dykt SPIONs upp som en favorit kliniska verktyg till bild vävnad makrofager12. Medan SPIONs har också studerats som nukleinsyra leverans fordon11,13,14,15, att vår kunskap, innehåller litteraturen några rapporter om SPIONs som bärare för makrofag-riktade siRNA delivery. För gen leverans av SPIONs, är deras yta oftast belagda med ett skikt av hydrofil katjoniska polymerer som negativt laddade nukleinsyror kan elektrostatiskt lockade och uppbundna. Här presenterar vi en metod för att syntetisera SPIONs vars yta är modifierad med låg molekylvikt (10 kDa), förgrenade PEI (PEI-SPIONs). Dessa magnetiska nanoplatforms anställs sedan kondensera siRNA, bildar PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex som aktiverar siRNA transport in i cellen. Vi anledning att spontan fagocytos av SPIONs av celler i det retikuloendoteliala system16, tillsammans med stark förmåga av bindande och kondenserande nukleinsyror av PEI, återger PEI-SPIONs lämplig för effektiv transport av siRNA in makrofager. De data som presenteras här stöder genomförbarheten av PEI-DEMOLERADES/siRNA-medierad nedtystning i makrofager i kultur samt i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som involverar levande djur utfördes i enlighet med djuret hand och använda riktlinjerna i sydost University, Kina.

1. beredning av PEI-SPIONs

  1. Beredning av oljesyra modifierade SPIONs
    1. Lös upp FeCl3•6H2O och FeSO4•7H2O i vatten under skydd av N2.
      1. Lägg till 28 g FeCl3•6H2O och 20 g FeSO4•7H2O i 80 mL avjoniserat vatten i en bägare. Införa N2 i vattnet genom ett glas conduit och rör tills den fast materia har upplöst.
      2. Värme reaktionsblandningen att 72 ° C vid en omrörningshastigheten av 800 rpm, följt av tillsats av 40 mL ammoniak vatten (28%). Rör om 5 minuter.
    2. Tillsätt 9 mL oljesyra droppvis i ovannämnda lösning och rör det vid 72 ° C för 3 h.
    3. Cool den resulterande lösningen till rumstemperatur (RT). Fällningen lösning via magnetisk separation.
    4. Tvätta fällningen som innehåller SPIONs 3 x med absolut etylalkohol och, sedan, skingra fällningen i 100 mL N-hexan.
  2. Beredning av dimercaptosuccinic syra-modifierade SPIONs
    1. Lägga till 800 mg oljesyra (OA)-modifierade SPIONs dispergerade i 200 mL N-hexan, och 400 mg dimercaptosuccinic syra (DMSA) spridda i 200 mL aceton, i en tre-hals kolven i ett vattenbad vid 60 ° C.
      Obs: För att bestämma koncentrationen av OA-modifierade DEMOLERADES erhållits från föregående steg, ta en liten volym (t.ex. 1 mL) av DEMOLERADES spridningen, avdunsta N-hexan och väga det resulterande pulvret.
    2. Tillsätt 200 µL av trietylamin droppvis i ovannämnda lösningen med omrörning vid 1000 rpm och refluxing.
    3. Efter 5 h omrörning och refluxing, skaffa en svart fällning av magnetisk separering.
    4. Skingra de hydrofila SPIONs avjoniserat vatten homogeneously genom att justera pH-värdet i lösningen med tetrametylammoniumhydroxid.
  3. Beredning av PEI-SPIONs
    1. Tillsätt DMSA-modifierade DEMOLERADES kolloidal lösning droppvis i PEI lösning (10 kDa) i en 500 mL-kolv för tre-hals under omrörningen vid 1000 rpm för 2 h (WFe: WPEI = 1:3).
      Obs: Den avgift och storleken på PEI-SPIONs varierar beroende på förhållandet mellan WFe till WPEI. WFe: WPEI förhållandet 1:3 kan vara en bra utgångspunkt för syntetisera PEI-SPIONs passar siRNA delivery.
    2. Tillsätt den resulterande lösningen i en ultrafiltrering röret med en molekylvikt cutoff av 100 kDa och en halt av 15 mL; sedan Centrifugera vid 5 400 x g i 10 min tills återstående lösningen är 1 mL. Tillsätt avjoniserat vatten till lösning att göra volymen 15 mL igen och upprepa ovanstående process 10 x att få den slutliga produkten. Sedan filtrera lösningen genom ett 0,22-μm filter och spara slutprodukten vid 4 ° C.
    3. Att bestämma Fe koncentration PEI-SPIONs av den kolorimetriska metoden med phenanthroline17. Späd PEI-SPIONs med avjoniserat sterilt vatten till en koncentration av 1 mg Fe/mL och förvara den vid 4 ° C.
    4. Späd 10 μL av PEI-DEMOLERADES lösning (1 mg Fe/mL) till 1 mL med avjoniserat vatten. testa sedan, dess hydrodynamiska storlek och zeta potential genom en dynamisk ljus-scattering enhet.
      Obs: Förbereda PEI-SPIONs i spänna av ca 30-50 nm. I denna storleksordning visas effekten av NP storleken på siRNA bindande och cellernas upptag inte vara betydande. PEI-SPIONs bär en genomsnittlig zeta potential över + 37 mV kan vara giftiga i dosintervallet för transfection, och en cytotoxicitet analys bör utföras för att garantera säkerheten. Den ytladdning och hydrodynamiska storleken på nanopartiklarna kan styras inom ett önskat intervall genom att justera PEI innehållet.

2. upprättande och agaros gelelektrofores av PEI-DEMOLERADES/siRNA NPs

  1. Späd siRNA med RNase-fritt vatten för att ge en slutlig koncentration av 20 μM (0,26 μg/μL).
  2. Förbereda fem RNase-fri mikrocentrifugrör märkt 0, 1, 2, 4 och 8. Etiketterna representerar olika Fe: siRNA vikt nyckeltal. Pipettera 3 μL av siRNA lösningen till alla rör (~0.8 μg av siRNA/rör).
  3. Lägga till 0, 0,8, 1.6, 3.2 och 6,4 μg FE i form av PEI-SPIONs rören märkt 0, 1, 2, 4 och 8, respektive. Hålla den totala provvolymen av varje rör mindre än 20 μL. Blanda genom pipettering försiktigt upp och ner.
  4. Inkubera blandningar på RT för 30 min att tillåta PEI-DEMOLERADES/siRNA komplexa bildande. Under denna period, att göra en 3% agaros gel med hög renhet agaros.
    Obs: Ytterligare PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex med andra Fe: siRNA-förhållanden (t.ex., 5 eller 6) kan förberedas och testade.
  5. Tillsätt 1 μL av 6 x DNA-lastning buffert per 5-μL prov och blanda försiktigt. Ladda alla prover och köra elektrofores vid 5 V/cm tills den bromophenol blå migrerar så långt som två tredjedelar av längden av gelen. Fläcken gelen med etidiumbromid (EB) för 15-20 min.
    Obs: Nylagade elektrofores buffert och EB lösning bör användas.
  6. Visualisera siRNA band i en UV-imaging system. Kontrollera Fe: siRNA nyckeltalen på vilka siRNA bildar komplex med PEI-SPIONs och, som ett resultat, de band som representerar gratis siRNA är utvecklingsstörd eller inte upptäckas.

3. transfection av RAW264.7 makrofager In Vitro

  1. Kultur mus makrofag-liknande RAW264.7 celler i en 10-cm skålen med DMEM komplett medium innehållande 10% fetalt bovint serum (FBS) per 100 U/mL penicillin per 100 μg/mL streptomycin vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
  2. En dag före transfection, aspirera medium från cellerna och skölj dem med fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4). Tillsätt 1 mL av 0,25% trypsin till 10-cm skålen. Trypsinize RAW264.7 celler i ca 5-10 min vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
  3. När majoriteten av cellerna har lossnat (efter 5-10 min), tillsätt 5 mL av DMEM komplett medium i skålen att inaktivera trypsin. Pipettera upp och ner för att skingra cell kluster i enstaka celler.
  4. Överföra cellsuspensionen till ett sterilt 15 mL koniska rör. Centrifugera det 300 x g under 3 minuter vid RT. ta bort supernatanten.
  5. Omsuspendera cellerna med 5 mL färsk DMEM komplett medium och räkna cellerna.
  6. Plattan 9 x 104 celler per väl i en 6-well platta med 2 mL av komplett DMEM medium och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator för ca 24 h.
    Obs: Om du använder en platta med en annan storlek, justera guldpläterade cell densiteten i proportion till den relativa yta så att cellerna nå 80% konfluens vid tidpunkten för transfection.
  7. När cellen konfluens är 80%, ta bort mediet från cellerna och ersätta det med 1 mL DMEM komplett medium per brunn. Tillbaka plattan till inkubatorn tills PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex har upprättats och är redo för användning (ca 30 min).
  8. Förbereda PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex: beräkna mängden PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex behövs för ett transfection experiment. I ett 1,5 mL RNase-fri mikrocentrifug rör, blanda en lämplig mängd PEI-SPIONs med siRNA vid en given Fe: siRNA-förhållande. Exempelvis för att förbereda PEI-DEMOLERADES/siRNA NPs innehållande 100 µg FE i Fe: siRNA förhållandet 4, tillsätt 100 µL (1 mg Fe/mL) av PEI-SPIONs till 96 μL av siRNA (0,26 μg/μL), följt av blanda det försiktigt med en mikropipett. Inkubera i 30 min på RT.
    Obs: Förbereda en volym av PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex som är 10% utöver den totala slutliga massan till svars för eventuella oförutsedda förluster. Gör PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex vid låga Fe: siRNA förhållanden, under vilka siRNA molekyler är helt lastades på PEI-SPIONs och, därmed, små mängder av PEI-SPIONs kan användas för att minimera potentiella cytotoxicitet. Pilotförsök (gel utvecklingsstörning assay) för optimering av Fe: siRNA förhållandet är nödvändiga.
  9. Ta ut 6-väl plattan från inkubatorn (steg 3,7). Lägga till en volym som krävs av PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex droppvis i varje brunn och snurra plattan försiktigt för att säkerställa en jämn fördelning. Tillbaka plattan till inkubatorn till bedömningen av cellulärt upptag eller gen knockdown effektivitet (1-3 d).
    Obs: Transfecting makrofager med PEI-DEMOLERADES/siRNA vid en koncentration på ~ 15 µg Fe/mL kan maximera transfection effektivitet och minimera potentiella cytotoxicitet.

4. systemisk leverans av siRNA till makrofager hos råttor med experimentell artrit

  1. Få specifikt patogenfria manliga Wistar råttor som är 7 veckor gamla. Habituerar råttorna för 7 d före användning och ge dem tillräckligt med mat och vatten. Inducera adjuvant artrit (AA) i råttor som tidigare beskrivits18.
  2. Förbereda PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex som beskrivs i steg 3,8.
  3. Injicera PEI-DEMOLERADES/siRNA NPs (0,3 mg siRNA/kg) i den AA råttor via svans venen. Bedöma cellernas upptag viatill exempel flödescytometri, vävnad biodistribution via, till exempel en realtid fluorescens imaging system, eller terapeutiska effekter utifrån, till exempel kliniska, histologisk och röntgenologiska analyser på önskad tid pekar18.
    Obs: För studier av cellulär och vävnad biodistribution, behandla råttorna med en enda injektion av de önskade NPs; för terapeutiska studier, injicera råttorna med NPS-servern vara testade 1 x per vecka i tre veckor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Storlek och zeta potential PEI-SPIONs tillagade detta protokoll var i intervallet 29-48 nm (polydispertion index: 0.12 - 0,23) och 30-48 mV, respektive. De var stabilt i vatten vid 4 ° C över 12 månader utan uppenbara aggregering. För att utvärdera deras siRNA bindande förmåga, blandades PEI-SPIONs med siRNA på olika Fe: siRNA vikt nyckeltal. Figur 1 visar att när den Fe: siRNA viktförhållandet når 4 och ovan, bandet av gratis siRNA var helt saknas, vilket innebär framgångsrika siRNA bindning till PEI-SPIONs. Ett stort bekymmer av PEI i biomedicinska programmet är dess toxicitet, som är ett resultat av den starka positiva laddningen, särskilt vid hög molekylvikt och höga doser. Som visas i figur 2A, PEI-SPIONs med en zeta potential 30,5 och 37 mV inte ställde ut uppenbar cytotoxicitet vid koncentrationer upp till 30 µg Fe/mL, vilket är ungefär dubbelt högre än koncentrationen (15 µg Fe/mL) normalt används för cellen transfection. Dock PEI-SPIONs med zeta potential av 48 mV var giftiga även vid den lägsta dosen som undersökt (10 µg Fe/mL). PEI-SPIONs besitter därför en avgift-beroende toxicitet. Eftersom katjoniska kostnad inte är viktigt för NP upptaget av makrofager19, vi föreslår att PEI-SPIONs med en genomsnittlig zeta potential inte högre än + 37 mV används för siRNA överföring, men siRNA bindande skulle minska avgiften till viss del och lindra cytotoxicitet18.

För att testa potentiella tillämpningen av PEI-SPIONs för siRNA leverans till makrofager, utfördes av in vitro- transfection med murin makrofag cell linje RAW 264,7. Som analyseras med flödescytometri, var mer än 90% av cellerna transfekterade med fluorescently märkt PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex på 15 µg Fe/mL (figur 2B). När det gäller transfection effektivitet var det faktiskt ingen skillnad mellan PEI-DEMOLERADES/siRNA NPs bildas Fe: siRNA vikt förhållandet mellan 4 och 8, även om, enligt det sistnämnda villkoret, de nationella parlamenten som bildades var mindre i storlek och svagare i positiv laddning eftersom en mindre mängd siRNA lästes per partikel. Vi bedömde också effekten av PEI-DEMOLERADES/siRNA koncentration på cellulär internalisering av Prussian blå färgning. Som visas i figur 2 c, var de blå fläckarna inom de transfekterade cellerna minimalt detekterbara 7,5 µg Fe/mL, men väl synlig på 15 µg Fe/mL. Intressant, ökade öka PEI-DEMOLERADES/siRNA koncentrationen 32 µg Fe/mL inte stödnivåerna som färgning, förmodligen eftersom PEI-DEMOLERADES/siRNA upptaget var mättad vid koncentrationer runt 15 µg Fe/mL. Dessutom PEI-SPIONs förmåga för att förmedla siRNA överföringen bekräftades i primära makrofager18, och metoden presenteras här hade en hög siRNA transfection effektivitet i rat peritoneal makrofager, motsvarar den som i RAW264.7 celler. Peritoneal makrofager transfekterade med PEI-SPIONs härbärgerat specifika siRNA visade en signifikant minskning av mRNA målnivån jämfört med ospecifik siRNA (figur 2D), vilket innebär att siRNA kunde fly från endocytos blåsor i den cytoplasman och reach RNAi maskiner.

Vi tidigare undersökt också i vivo cellulära upptaget av systemiskt administrerade PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex hos råttor med adjuvant artrit18. Vi analyserade PEI-DEMOLERADES/siRNA transfection effektivitet i fagocytiska makrofager och nonphagocytic T-lymfocyter. I figur 3visas CD11b + celler tog upp PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex mer effektivt än CD3 + celler vid någon tidpunkt i alla de organ som undersöks, som anger att PEI-DEMOLERADES/siRNA NPs prioriterat mål makrofager18. Bland annat observerades en hög ansamling av NPs i inflammerade leder18, vilket tyder på att den PEI-DEMOLERADES kan vara en attraktiv plattform för systemisk leverans av siRNA therapeutics reumatoid artrit vars patogenes är kopplad till makrofag dysfunktion och för vilka lokala siRNA administration är inte en favorit val på grund av medverkan av flera organ av sjukdomen.

Figure 1
Figur 1: agaros gel-elektrofores av PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex bildas på olika Fe: siRNA (w/w) nyckeltal. Fe: siRNA förhållandet 0 representerar gratis siRNA duplex utan PEI-SPIONS. Den genomsnittliga storleken och zeta potential de gratis PEI-SPIONs används här var 30 nm och 45 mV. siRNA kunde helt binda till PEI-SPIONs när förhållandet Fe: siRNA når 4 och ovan överensstämmer med tidigare resultat med PEI-SPIONs med en genomsnittlig storlek på 48 nm och en zeta potential 30,5 mV18. Avsaknad av utvecklingsstörda band (PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex) kan avspegla otillgänglighet av siRNA till EB under färgning, en indikation på stark siRNA bindande eller kondenserande förmåga PEI-SPIONs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: biologiska karakterisering av PEI-DEMOLERADES och PEI-DEMOLERADES/siRNA NPs. (A) denna panel visar en cell lönsamhet analysen. RAW 264.7 celler behandlades för 16 h med angivna doser av PEI-SPIONs med olika zeta potential och sedan en MTS-analysen utfördes. Cellviabiliteten var normaliserade mot kontrollen (ingen partikel exponering). Uppgifterna är det medelvärde ± SD för dubbla brunnar. (B) denna panel visar en flöde flödescytometrisk analys av PEI-DEMOLERADES/Cy3-siRNA upptaget av RAW 264,7 celler. Cellerna var inkuberas i 24 h med 15 µg Fe/mL (övre panelen) eller 5 µg Fe/mL (nedre panelen) PEI-SPIONs komplex med Cy3-märkt siRNA på en Fe: siRNA (w/w) förhållandet mellan 4 och 8, respektive. Ospecifik (NC) siRNA representerar ickefluorescerande siRNA. M2: gated regionen. PE-H: Cy3 fluorescensintensiteten. SiRNA transfection effektivitet PEI-SPIONs används här (37,8 nm, 48 mV) liknade en tidigare studie med PEI-SPIONs med en genomsnittlig storlek på 48 nm och en zeta potential 30,5 mV18. (C), denna panel visar en analys av PEI-DEMOLERADES/siRNA upptag genom att visualisera cellulärt järn insättningar. RAW 264.7 celler inkuberades med 7,5, 15 och 32 µg Fe/mL PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) komplex med siRNA (Fe: siRNA = 8) och färgad med berlinerblått. Skala barerna är 20 μm. (D) i denna panel visas en in vitro- validering av ljuddämpningssystemet effektiviteten av siRNA levereras av PEI-SPIONs. En specifik siRNA-targeting råtta IL-2 /-15 receptor β kedja var lastades på PEI-SPIONs (48 nm, 30,5 mV) på Fe: siRNA = 8 och sedan transfekterade i rat peritoneal makrofager. En NC siRNA användes som kontroll. Den nedtystning effekten bedömdes genom kvantitativ PCR. Cellerna inkuberades med komplexen på 15 µg Fe/mL. Uppgifterna är det medelvärde ± SD av tre exemplar brunnar. Panelen D har ändrats från Duan et al. 18 med tillstånd från förlaget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: In vivo cellernas upptag av PEI-DEMOLERADES/siRNA NPs. Tre artros råttor var injiceras intravenöst med en enda dos på 0,3 mg/kg Cy3-siRNA formulerad med PEI-DEMOLERADES (48 nm, 30,5 mV). En råtta som injiceras med PBS användes som kontroll. Blod, mjälte, lever, njure och inflammerade leder samlades på 2, 8 och 24 timmar efter injektionen. Cellulära upptaget av PEI-DEMOLERADES/Cy3-siRNA NPs bedömdes av flödescytometri med (A) anti-CD3 och (B) anti-CD11b monoklonala antikroppar. Procentandelarna är av Cy3-siRNA upptag inom gated CD3 + eller CD11b +-celler. De resultat som visas här är representativa för två oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från Duan et al. 18 med tillstånd från förlaget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Makrofager är refraktära mot transfect av vanliga nonviral tillvägagångssätt, såsom elektroporation, katjoniska liposomer och lipid arter. Här beskrivs vi en pålitlig och effektiv metod för att transfect makrofager med siRNA. Använder detta protokoll, kan över 90% av makrofag-liknande RAW 264,7 celler (figur 2B) och rat peritoneal makrofager18 vara transfekterade med siRNA utan betydande försämring av cellviabiliteten. Denna metod beror på plattformen PEI-DEMOLERADES, vilket är nanocarrier består av en kärna av järnoxid och ett skal av PEI. Så är det första viktiga steget i protokollet syntesen av PEI-SPIONs passar siRNA delivery. Vanligtvis, förbereds PEI-belagd SPIONs från oljesyra-belagd SPIONs av en ligand-exchange metod där oljesyra utbyts direkt från ytan av SPIONs av PEI eller dess derivat15, generera hydrofil NPs med ett positivt laddade yta. I fallet presenteras här, den oljesyra utjämnade på ytan av SPIONs ersattes av vattenlösliga dimercaptosuccinic syra och sedan PEI lästes på DEMOLERADES ytor genom elektrostatisk interaktioner. Denna metod är skonsamt och lätt att tillaga i stora mängder, och de syntetiserade NPs har utmärkt stabilitet i vatten20. Det är välkänt att PEI är cytotoxiska och toxicitet korrelerar starkt med dess molekylvikt21. För att garantera säkerheten, är en viktig faktor när syntetisera PEI-SPIONs att dessa partiklar är belagda med låg molekylvikt PEI, vilket är 10 kDa i detta protokoll. Oönskade toxiska effekter av PEI medieras främst av dess positiva laddning; Därför mätning av PEI-SPIONs zeta potential är viktigt, och värdet bör inte vara högre än 37 mV. En minskning av positiv laddning kan uppnås genom att minska halten PEI. En annan avgörande steg för en framgångsrik tillämpning av detta siRNA delivery system är optimering av Fe: siRNA förhållandet i gel utvecklingsstörning. Det verkar rimligt att PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex vid låga Fe: siRNA förhållanden under vilka siRNA molekyler är fortfarande kan binda till PEI-SPIONs. I denna omständighet, kan små mängder av PEI-SPIONs användas, vilket minskar dess potentiella cytotoxicitet.

I fall en önskad ljuddämpningssystemet effektivitet eller terapeutiska effekt inte produceras, kolla transfection effektiviteten av flöde flödescytometri eller fluorescence mikroskopi använda transportören laddad med en fluorescently märkt siRNA. PEI-DEMOLERADES/siRNA upptaget kan alternativt granskas av konventionella Prussian blue färgning, vilket är tillräckligt känslig för att upptäcka enda granulat av järn i cellerna. Om transfection effektivitet är verkligen låg, kan det krävas att optimera transfection villkor såsom cell densiteten, transfection tid och dosen av PEI-DEMOLERADES/siRNA partiklar. Antalet cell passage kan också påverka effektiviteten i transfection22. I de flesta fall orsakas en otillräcklig ljuddämpningssystemet effekt inte av en otillräcklig PEI-DEMOLERADES/siRNA upptag, som det nuvarande PEI-DEMOLERADES systemet har visat sig underlätta en effektiv siRNA överföring till makrofager. Ibland kan kombinerar flera siRNAs inriktning samma gen vara en bra strategi att effektivisera knockdown. Det är anmärkningsvärt att, även om RNAi uppstår vanligen inom 24 h av transfection, uppkomsten och varaktighet nedtystning beror på Omsättningshastigheten av målet, graden av utspädning och livslängd av siRNA och även koncentrationen av serum på medellång. Således dags kurs experiment kan behövas för att exakt fastställa tidpunkten av maximal effekt2,22. För in vivo application, den terapeutiska effekten beror också på om och i vilken utsträckning målet siRNA bidrar till sjukdom fenotyper; valet av ett lämpligt siRNA mål är således avgörande för förväntade resultat.

I området i närheten finns det flera fördelar med detta protokoll för att leverera siRNA till makrofager. (1) metoden är lätt att utföra och är ett billigt sätt att producera PEI-SPIONs i stora mängder, och de nationella parlamenten som produceras är stabila i vatten i över 12 månader om de förvaras vid 4 ° C. (2) spontana fagocytos av SPIONs av makrofager underlättar en effektiv PEI-DEMOLERADES-medierad siRNA överföring, vilket medför hög transfection effektivitet. Det förväntas att förutom RAW 264,7 celler och rat peritoneal makrofager, denna metod är tillämplig på andra makrofag cellinjer och primära makrofager, så länge dosen för transfection är optimerad. (3) siRNA transfection är snabb och lätt att genomföra jämfört med andra makrofag transfection metoder såsom nucleofection, vilket är tidskrävande och kräver en Nucleofector enhet2. (4) PEI-DEMOLERADES kan vara en perfekt fordon för makrofag-riktade systemisk siRNA leverans i vissa sjukdomsmodeller. Makrofager spela avgörande roller i utvecklingen och utvecklingen av olika kroniska inflammatoriska sjukdomar, liksom tumörer; och en iögonfallande histologiska funktion av dessa sjukdomar är onormala blodkärlen med läckande endotelet. Därför på grund av den förbättrade permeabilitet och kvarhållande verkan, systemiskt administrerade läkemedel-loaded NPs tenderar att ackumuleras i sjuk vävnad fångas lätt av lokala makrofager, vilket leder till förbättrad specificitet, minskat biverkningar, och förbättrat terapeutisk effekt. I en råtta modell av adjuvant artrit togs intravenöst injicerad PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex upp av ~ 40% av cellerna CD11b + under de första 24 h efter injektion18. Däremot när katjoniska Liposom användes som bärare för systemisk siRNA leverans hos möss, anhållna mindre än 5% av CD11b + celler i artritiska lederna siRNA lipoplexes23. Dessutom på grund av deras magnetiska egenskaper, kan tillämpningen av ett yttre magnetfält ytterligare underlätta ackumuleringen av PEI-DEMOLERADES/siRNA komplex i målvävnaderna och öka deras cellernas upptag. Också är anmärkningsvärt att sådana siRNA-loaded NPs kan användas inte bara för modulerande makrofag funktion, utan också för imaging makrofag för att ge diagnostisk information, övervaka behandlingseffekt, och förutsäga patienternas kliniska resultat12.

Dock existerar begränsningar som är associerade med detta protokoll. PEI-DEMOLERADES systemet uppvisar ett snävt intervall av dosering för siRNA delivery. Maximala upptaget inträffade när RAW264.7 celler exponerades till PEI - DEMOLERADES/siRNAs med en koncentration på 15 µg Fe/mL (figur 2B och 2 C). Öka koncentrationen 32 µg Fe/mL inte ledde till en ökning av cellernas upptag (figur 2 c) men, tvärtom, kan öka risken för att inducera celldöd på grund av den inneboende toxiciteten av PEI PEI-DEMOLERADES/siRNA. Däremot, minskat minskar PEI-DEMOLERADES/siRNA 5 eller 7,5 µg Fe/mL uppenbarligen dess upptag av RAW264.7 celler (figur 2B och 2 C). Vi föreslår således att den optimala PEI-DEMOLERADES/siRNA koncentrationen för in vitro- makrofag transfection är ~ 15 µg Fe/mL (den slutliga koncentrationen i en brunn). En annan begränsning som måste beaktas är den möjliga effekten av PEI-SPIONs makrofag verksamhet. Nanopartiklar kan framkalla immunsvar24, beroende på deras ytmodifiering ytladdning, storlek, form, och även på den metod som används för att syntetisera dem. Mulens-Arias et al. rapporterade nyligen att PEI-belagd SPIONs utlösa makrofag aktiveringen25. Metoden av PEI-DEMOLERADES syntes presenteras här skiljer sig avsevärt från Mulens-Arias et al., och därför om PEI-SPIONs förberedda grundas på utlösaren förevarande protokoll makrofag aktiveringen väntar ytterligare utredning. Dock för att entydigt lösa detta problem, vi föreslår att, utöver den PEI-DEMOLERADES komplex med rusning siRNA, fordonet självt (endast PEI-DEMOLERADES) kan fungera som en annan kontroll när du använder detta protokoll. Slutligen är detta protokoll inte lämplig för leverans av DNA på grund av sin relativt stora storlek.

I sammanfattning presenterade vi här en metod att använda PEI-belagd SPIONs som ett fordon för siRNA transfection i makrofager. Dessa NPs kan effektivt leverera siRNA förevigade makrofag cellinjer, men även till primära makrofager i vitrooch funktionellt inducera nedtystning påverkar cellernas viabilitet vid den optimala dosen för transfection. Dessutom PEI-SPIONs kan användas för in-vivo siRNA leverans till makrofager, vilket gör det möjligt att bild, samt modulera, makrofager vars dysfunktion bidrar till utvecklingen och utvecklingen av många kroniska inflammatoriska sjukdomar och cancerformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av den National Natural Science Foundation i Kina (81772308) och nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina (nr. 2017YFA0205502).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China
for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11, (11), 723 (2011).
  2. Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  3. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. Springer. 123-143 (2009).
  4. Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10, (3), e0118472 (2015).
  5. Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52, (4), 590-598 (2012).
  6. Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23, (13), 3241-3250 (2017).
  7. Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2, (7), e1600224 (2016).
  8. Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
  9. Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5, (5), 484-501 (2013).
  10. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8, (2), 129 (2009).
  11. Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7, (19), 2742-2749 (2011).
  12. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13, (2), 125 (2014).
  13. Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861, (11), 2802-2810 (2017).
  14. Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
  15. Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4, (8), 4733-4743 (2010).
  16. Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53, (2), 283-318 (2001).
  17. Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27, (1), 26-29 (1955).
  18. Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9, (6), 789-801 (2014).
  19. Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
  20. Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22, (22), 225703 (2011).
  21. Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3, (10), 3273-3286 (2009).
  22. Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2, (1), 39 (2004).
  23. Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116, (18), 3505-3516 (2010).
  24. Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151, (2), 458-465 (2010).
  25. Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics