I Vivo kalcium avbildning av sidolinje hårcellerna i Larval zebrafiskar

Neuroscience
 

Summary

Zebrafiskar är modellsystem som har många värdefulla funktioner inklusive optisk klarhet, snabb extern utveckling, och av särskild betydelse inom hörsel och balans, externt belägna sensoriska hårcellerna. Denna artikel beskriver hur transgena zebrafiskar kan användas till assay både hår-cell mechanosensation och presynaptiska funktion i sin helhet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sensoriska hårcellerna är mekanoreceptorer i innerörat som krävs för hörsel och balans. Hårcellerna aktiveras som svar på sensoriska stimuli som mekaniskt avleder apikala utbuktningar kallas hår buntar. Nedböjning öppnar mechanotransduction (MET) kanaler i hår buntar, leder till ett inflöde av katjoner, inklusive kalcium. Detta ering inflöde depolarizes cellen och öppnar spänningskänsliga kalciumkanaler ligger basally vid den hår-cell presynapse. Hos däggdjur, hårcellerna är innesluten i ben, och det är utmanande att funktionellt bedöma dessa aktiviteter i vivo. Däremot larval zebrafiskar är transparenta och besitter ett externt belägna sidolinje organ som innehåller hårcellerna. Dessa hårceller funktionellt och strukturellt liknar hår däggdjursceller och kan bedömas funktionellt invivo. Denna artikel beskriver en teknik som använder en genetiskt kodade kalcium indikator (GECI), signaler GCaMP6s, att mäta stimulus-framkallat kalcium i zebrafiskar sidolinje hårcellerna. GCaMP6s kan användas, tillsammans med confocal imaging, för att mäta invivo kalcium signaler vid apex och bas av sidolinje hårcellerna. Dessa signaler ger en realtid, kvantifierbara avläsning av både mechanosensation - och presynapse-beroende kalcium verksamhet inom dessa hårceller. Dessa kalcium signaler ger också viktiga funktionella informationen om hur hårcellerna upptäcka och överför sensoriska stimuli. Sammantaget denna teknik skapar användbara data om relativa ändringar i kalcium aktivitet in vivo. Det är mindre väl lämpad för kvantifiering av den absoluta magnituden av kalcium förändringar. Denna invivo teknik är känsliga för rörelse artefakter. En rimlig praxis och skicklighet som krävs för korrekt positionering, immobilisering och stimulering av larver. Slutligen, när korrekt utförda, det protokoll som beskrivs i denna artikel ger ett kraftfullt sätt att samla in värdefull information om aktiviteten av hår-celler i sina naturliga, fullt integrerade inom ett levande djur.

Introduction

Funktionella kalcium bildbehandling är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att övervaka aktiviteten hos många celler samtidigt1. I synnerhet har kalcium bildåtergivning med genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) visat sig vara fördelaktiga eftersom GECIs kan uttryckas i specifika celltyper och lokaliserade subcellularly2. I neurovetenskap forskning, har dessa funktioner gjort kalcium bildåtergivning med GECIs en kraftfull metod att både definiera aktivitetsmönster inom neuronala nätverk och mäta kalcium tillströmningen vid enskilda synapserna3,4. Dra nytta av dessa funktioner, används konfokalmikroskopi och GECIs i en studie för att övervaka subcellulär aktivitet inom samlingar av sensoriska hårcellerna5.

Hårcellerna är de mekanoreceptorer att upptäcker ljud och vestibulära stimuli i innerörat och lokala vatten rörelse i sidolinje systemet i vattenlevande vetebrates6,7. Hårcellerna är ofta målet för skador eller genetiska mutationer som leder till den vanligaste formen av hörselnedsättning hos människor kallas sensorineural hörsel förlust8,9. Därför är det viktigt att förstå hur dessa celler fungerar för att förstå hur att behandla och förebygga hörselnedsättning. För att fungera korrekt, utnyttja hårcellerna två specialiserade strukturer som kallas mechanosensory-hår buntar och synaptic band att upptäcka och överföra stimuli, respektive. Hår buntar ligger vid spetsen av hårcellerna och består primärt av fina, hår-liknande utbuktningar kallas sinneshår (figur 1A). I vestibulära och sidolinje hårceller har varje hår bunt också en enda lång kinocilium (cellens enda sanna cilier), som kan sträcka sig långt ovanför sinneshår (figur 1A). Mechanosensory stimuli avleda hår buntar och avböjning sätter spänning på kopplingar kallas ”tip-länkar” som interconnect sinneshår10. Denna spänning öppnar mechanotransduction (MET) kanaler ligger i den sinneshår, vilket resulterar i en apikal tillströmning av katjoner, inklusive kalcium11,12. Denna apikala aktivitet i slutändan depolarizes cellen hår och öppnar spänningskänsliga kalciumkanaler (Cav1.3) vid basen av cellen. Cav1.3 kanaler hittas intill synaptic band, en presynaptiska struktur som tjuder blåsor på aktiva zoner. Basala kalcium inflöde genom Cav1.3 kanaler krävs för vesikler fusion, neurotransmission och aktivering av afferenta neuroner13,14.

För många år, elektrofysiologiska tekniker såsom hela-cell patch fastspänning har använts sond funktionella egenskaper av hårceller i många arter, inklusive zebrafiskar15,16,17, 18,19,20. Dessa elektrofysiologiska inspelningar har varit särskilt värdefulla i fälten hörsel och balans eftersom de kan användas för att få extremt känsliga mätningar från enskilda sensoriska celler, vars syfte är att koda extremt snabb stimuli över en brett spektrum av frekvenser och stödnivåer21,22. Tyvärr kan inte hela-cell inspelningar mäta aktiviteten av populationer av hårcellerna. För att studera aktiviteten av populationer av celler i zebrafiskar lateral-linjen, mikrofonkabelsystem potentialer och afferenta handlingspänningar som har använts för att mäta de summerade mechanosensitive och postsynaptiska svar egenskaper av enskilda neuromasts23 ,24. Tyvärr har varken hela-cell inspelningar eller potentiella lokala fältmätningar den rumsliga upplösningen att lokalisera där aktivitet sker inom enskilda celler eller mäta aktiviteten i varje cell inom en befolkning. Mer nyligen, kalcium färgämnen och GECIs har använts för att kringgå dessa utmaningar25,26.

I zebrafiskar, har GECIs visat sig vara en kraftfull metod att undersöka hår-cellernas funktion på grund av den relativa lätthet att skapa transgena zebrafiskar och optisk klarhet larver27. På zebrafiskar larver föreligger hårcellerna i innerörat samt sidolinje systemet. Den laterala linjen består av rosett-liknande kluster av hårceller som kallas neuromasts som används för att upptäcka lokala förändringar i vattnets rörelse (figur 1). Den laterala linjen är särskilt användbart eftersom det ligger externt längs ytan av fisken. Denna tillgång har gjort det möjligt att stimulera hårcellerna och mäta kalcium signaler optiskt i intakt larver. Användarvänlighet genmodifiering, öppenhet av larverna, och oöverträffad tillgång sidolinje hårcellerna har sammantaget gjort zebrafiskar en ovärderlig modell att studera aktiviteten av hårcellerna i vivo. Detta är en viktig fördel jämfört med däggdjur system där håret celler omges av benstrukturer i innerörat. Denna bristande tillgång har gjort det mycket svårt att förvärva funktionella invivo mätningar av hår däggdjursceller.

Protokollet beskrivs här beskriver hur du övervakar MET kanal - och presynapse-beroende förändrad kalcium inom enskilda hårcellerna och bland celler inom neuromasts i larval zebrafiskar. Detta protokoll använder tredjeparts en etablerad transgena zebrafiskar linje som uttrycker en membran-lokaliserad GCaMP6s under kontroll av de hår-cell specifika myosin6b promotorn28. Detta membran lokalisering positioner GCaMP6s för att upptäcka kalcium inflöde genom jonkanaler i plasmamembranet som är kritiska för hår-cellernas funktion. Till exempel membran-lokaliserad GCaMP6s kan upptäcka kalcium inflöde genom MET kanaler i apikala hår buntar och genom CaV1.3 kanaler nära synaptic band vid basen av cellen. Detta kontrasterar mot med GECIs lokaliserade i cytosolen, som cytosoliska GECIs upptäcka kalcium signaler som är en kombination av MET och CaV1.3 kanal aktivitet samt kalcium bidrag från andra källor (t.ex., store release). Detta protokoll beskriver hur att immobilisera och förlama GCaMP6s transgena larver före imaging. Det beskriver sedan hur du bereder och använder en vätska-jet för att avleda hår buntarna för att stimulera sidolinje hårcellerna i ett kontrollerat och reproducerbart sätt. Representativa uppgifter som kan uppnås med detta protokoll presenteras. Exempel på data som representerar rörelse artefakter presenteras också. Kontroll experiment som används för att verifiera resultaten och utesluta artefakter beskrivs. Slutligen beskrivs en metod för att visualisera rumsliga kalcium signaler i Fiji programmet. Denna Fiji-analys är anpassat från tidigare etablerade visualiseringsmetoder utvecklas med hjälp av MATLAB5. Sammantaget beskriver här protokollet en kraftfull förberedelse-teknik som använder GECIs i larval zebrafiskar att mäta och visualisera hår-cell kalcium dynamics invivo.

Protocol

Alla djur arbete godkändes av utskottet djur användning vid det nationella Institutes of Health under djurstudie protokoll #1362-13.

Obs: Detta protokoll tar ca 0,5 till 1 h till komplett med inga avbrott om lösningar och utrustning är beredd och ställa in i förväg. Detta protokoll är optimerad för Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 zebrafiskar larver på 3 – 7 dagar efter befruktning (dpf). Denna transgena linje uttrycker en membran-lokaliserad GCaMP6s (zebrafiskar kodon-optimerade) specifikt i alla zebrafiskar hårcellerna. Innan imaging höjs larver i embryo bufferten (E3) under normala förhållanden. Se Tabell för material för katalognummer av all utrustning och läkemedel som krävs för att köra detta protokoll.

1. beredning av lösningar

  1. Laga 1 mL av α-bungarotoxin (125 µM), som används för att förlama zebrafiskar larver under funktionell avbildning.
    1. Lägg till 968.6 µL Sterilt ultrarent vatten och 33,4 µL av fenolrött 1 mg α-bungarotoxin (hel flaska). Gör 100 µL portioner och lagra dem vid-20 ° C.
      Varning: Använd handskar och göra förberedelser i huven vid hantering av α-bungarotoxin pulver. Handskar rekommenderas också vid hantering av α-bungarotoxin lösningen.
  2. Laga 1 L 60 x embryo buffert (E3).
    1. Lägga till 17,2 g NaCl och 0,76 g KCl pulver 954.4 mL av ultrarent vatten.
    2. Lägga till 19,8 mL 1 M CaCl2, 19,8 mL 1 M MgSO4och 6 mL 1 M HEPES buffert i lösningen. Lagra 60 x E3 stamlösning vid 4 ° C i upp till 6 månader.
  3. Förbereda 10 L 1 x E3 (5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4, pH 7,2), som är en lösning som larver sprids i före funktionell avbildning.
    1. Tillsätt 167 mL 60 x E3 stamlösning till 10 L ultrarent vatten att göra en 1 x E3-lösning. Lagra den 1 x E3 lösningen vid rumstemperatur (RT) för upp till 6 månader.
  4. Förbereda neuronala buffert (NB) (140 mM NaCl 2 mM KCl 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES buffert, pH 7,3), som används för att fördjupa larver under funktionell avbildning.
    Obs: 1 x E3 kan också användas för funktionell avbildning, men svaren är mer robusta och pålitliga i NB.
    1. Kombinera 28 mL 5 M NaCl, 2 mL 1 m KCl, 2 mL 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgCl2, och 10 mL 1 M HEPES buffert med 957 mL av ultrarent vatten. Ge pH 7,3 med 1 M NaOH.
    2. Filter sterilisera. Förvaras vid 4 ° C i upp till 1 månad.
      Obs: Ta till RT innan du använder lösningen.
  5. Förbereda MS-222 lager (tricaine, 0,4%), som används för att söva larver.
    1. Lös 400 mg etyl 3-aminobensoat methanesulfonate salt och 800 mg av Na2HPO4 i 100 mL destillerat vatten. Justera pH till 7. Förvaras vid 4 ° C.
    2. Använda 0,04% MS-222 att söva larver under immobilisering och α-bungarotoxin injektion.

2. beredning av Imaging kammare och Pins

  1. Förbereda imaging kammaren (figur 2A). Applicera ett tunt lager av hög vakuum silikonfett till botten av perfusion kammaren längs kanterna på torget som täckglaset kommer att följa. Lämna inte luckor i fettet. Ordentligt tryck ned runt kanterna på täckglaset att försegla det till imaging kammaren. Torka bort överflödigt fett.
    Obs: En 5 mL spruta med 200 µL mikropipett spets rekommenderas för fett ansökan.
  2. Förbereda den silikon encapsulant att fylla kammaren. Blanda förhållandet 10:1 (viktprocent) av basen till härdare. Blanda noga men försiktigt, med hjälp av en mikropipett spets för att skapa minimala bubblor.
    1. Häll den silikon encapsulant på det ditsatta täckglaset så att det är i nivå med ytan av kammaren. Ca 3 g encapsulant kommer att fylla kammaren.
    2. Försiktigt trycka kammaren mot en plan yta samtidigt som det horisontella eller Använd en mikropipett spets (under ett stereomikroskop) ta bort eller dra bubblor till kanten av kammaren.
    3. Placera kammaren i ett laboratorium ugn övernattning på 60 – 70 ° C. Plats i kammaren inne i en ventilerad låda för att säkerställa att varm luft inte direkt blåser på encapsulant att undvika att skapa ringar på vattnet.
  3. Använd fina pincett och volframtråd till mode stiften används för att immobilisera larver genom huvud och svans (figur 2B1) på de härdade encapsulant.
    1. För att göra huvudet pins, håll en bit 0,035 mm volframtråd i ena handen under ett stereomikroskop. Med fina tången i andra handen, böja tråd 1 mm upp från slutet vid 90°. Utbyta tången för fina saxar och skär 1 mm efter kurvan att skapa PIN-koden.
    2. Upprepa steg 2.3.1 använder en 0,025 mm tråd att göra svans stift, men lämna 0,5 mm tråd på vardera sidan av böjen. Använd tången för att sätt stiften i de härdade encapsulant på förbränningskammaren (för lagring).

3. beredning av nålar för förlamning och stimulering

  1. Förbereda hjärtat injektionsnålar med glas kapillärer med en glödtråd. Dra nålar till en inre spets diameter av 1 – 3 µm (figur 2C).
  2. Förbereda vätska-jet nålar använder glas kapillärer utan en glödtråd. Dra nålar med en tunn, lång spets som kan brytas till rätta spets diameter.
    1. Bryt av den tunna, långa spetsen av vätska-jet nålen genom att gnida det vinkelrätt mot en annan vätska-jet nål eller en keramiska plattor precis ovanför där nålspetsen kan vara böjda för att skapa en inre spets diameter av 30 – 50 µm [figur 2C (bilden i mitten) och Figur 3 A2]. Säkerställa att avbrottet är även över spetsen (figur 2C, mellersta bilden) och inte ojämna eller alltför stor (figur 2C, högra bilden) att garantera jämn och korrekt vätska flödet vid hår-cell stimulering.
      Obs: En nål polermaskin kan användas att fixa taggiga raster.

4. fästa och immobilisera larvaen för Imaging kammare

  1. Bada en Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) larv i ca 1 mL E3 buffert som innehåller 0,04% MS-222 för 1 – 2 min på silikon encapsulant ytan av imaging kammaren tills larven blir orörliga eller inte svarar på beröring.
    1. Under ett stereomikroskop, placera larven i mitten av perfusion kammaren så att det ligger platt på sin sida mot den silikon encapsulant.
      Obs: För enhetlighetens skull alltid montera larver på samma sida (t.ex. höger sida ner, vänster sida upp) (figur 2B1).
  2. Använda fin pincett, ge en 0,035 mm huvud pin ner vinkelrätt till larv och kammare. Sätt huvudet mellan ögat och öron vesikler och ner i encapsulant (siffror 2B1 och 2B2). Använda en andra uppsättning tång för att stabilisera larven längs dess dorsala eller ventrala sida medan fastlåsning. Se till att den horisontella delen av PIN-koden kontaktar larven och inte trycker på hela vägen in i encapsulant. Vinkla pinnen ventralt (figur 2B1) eller pekar något mot den främre av fisken att undvika störa efterföljande hjärtat injektion och hår-cell imaging.
    1. Sätt en 0,025 mm svans pin i ryggsträng så nära som möjligt till slutet av svansen (figur 2B1) med tången.
      Obs: Var noga med att undvika stretching larven. PIN larven platta. Ögonen ska vara ovanpå (figur 2B1). Detta är mycket viktigt för att underlätta hjärtat injektion (figur 2B2-B2', steg 5), underlätta ett önskvärt bildplanen (figur 1B1-B2'', steg 8 och 9), och kvantifiera intensiteten i den vätska-jet stimulansen ( Figur 3A3, steg 7).

5. injektion av α-Bungarotoxin i hjärtat hålighet att förlama larv

Obs: Använd handskar vid hantering av α-bungarotoxin.

  1. Centrifugera den α-bungarotoxin alikvoten kort före användning för att förhindra igensättning av hjärtat injektionsnålen.
    1. Återfyllning 3 µL av α-bungarotoxin lösning till en injektionsnål för hjärtat som använder en gel som laddar pipettspetsen. Ladda lösningen jämnt på spetsen med inga bubblor.
    2. Sätt hjärtat injektionsnålen i en pipett korthållaren bifogas en manuell micromanipulator. Under ett stereomikroskop, placera nålen så är det arrangera i rak linje vinkelrätt mot A-P axel larvaena fästa och sövda, pekar nedåt i ~ 30° vinkel.
    3. Anslut pipett innehavaren till trycket injektorn. Tillämpa följande föreslagna inställningar: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0.5 s och Pcompensation = 5 hPa. Injicera lösningen att testa om nålspetsen är patent en bolus.
    4. Leta efter en liten puff av röda lösningen (från fenolrött) lämna spetsen på nålen. Om ingen röd färg ses, mycket försiktigt skrapa nålens spets mot kanten av en PIN-kod och försök igen tills nålen är patent. Alternativt kan du dra en nål med en större tip öppning.
  2. Förväg nålen mot hjärtat tills den vidrör huden utanför hjärtat (figur 2B2). Tryck nålen till larv och leta efter indragningen av cellen pigment på huden framför hjärtat att se till att nålen placeras i rätt plan i förhållande till larven (figur 2B2').
    1. Förväg nålen ytterligare tills det genomborrar huden och går in i hjärtat hålrummet. Dra nålen lite. Injicera en bolusdos av α-bungarotoxin i hjärtat hålrummet. Ser för inflationen på hjärtat kaviteten eller rött färgämne in hålrummet.
  3. Skölj försiktigt larven 3 gånger med 1 mL Obs ta bort kvarstående MS-222. Aldrig bort all vätska. Bibehålla larv i ca 1 mL NB på perfusion förbränningskammaren.
    Obs: Säkerställa att larver hjärtrytm och blodflödet förbli stabil efter fästa och hjärtat injektion och under hela imaging experimentet.

6. beredning av Mikroskop och installationen vätska-jet

  1. Montera ett upprätt confocal Mikroskop med de komponenter som beskrivs i Tabellen för material: en confocal Mikroskop med en 488 nm laser och lämpliga filter, Mikroskop programvara för att styra och samordna imaging och stimulering, 10 x air mål, 60 x vatten mål, piezo-Z objektiva Avsökare (för z-stackar), höghastighetskamera, cirkulär kammare adapter, motoriserade scenen, och scenen infoga-adapter. Se Zhang et al.29 ytterligare alternativ och vägledning om Mikroskop uppställningar.
  2. Montera vätska jet består av 3 huvudkomponenter: en vakuum och tryckpump, höghastighetståg tryck klämman och huvudet scenen (som också beskrivs i tabell av material). Använda snabba tryck klämman för att styra tidpunkten och varaktigheten av tryck eller vakuum ansvarsfrihet ur huvuden scenen och in i vätska-jet pipetten.
    1. Anslut utgången på huvudet scenen till vätska-jet pipett innehavaren via tjocka silikon slangar.

7. anpassning av larv och vätska-jet

Obs: Det finns 3 plan av intresse inom varje neuromast: (1) tips av hår buntarna (figur 3A3: den kinocilia, används för att mäta stimulus intensitet); (2) hår-bundle MET planet (figur 1B1-B1': basen av de apikala hår buntar om MET-kanal-beroende kalcium signaler upptäcks); och (3) synaptic planet (figur 1B2-B2': där presynaptiska calcium signaler upptäcks vid basen av cellen hår). Dessa plan beskrivs i figur 1A.

  1. Återfyllning 10 µL av NB i en ordentligt trasiga vätska-jet-nål (från steg 3,2) använder en gel som laddar tip. Ladda lösningen jämnt på spetsen med inga bubblor. Stick in nålen i pipett innehavaren bifogas den motordrivna micromanipulator.
  2. Placera perfusion kammaren i en rund kammare adapter på Mikroskop scenen.
    Obs: För konsekvens, placera alltid larven i samma riktning (t.ex. i kammaren som innehåller larven med dess bakre mot vätska jet och ventrala sidan mot försöksledaren).
    1. Flytta motoriserad scenen så att larven är i mitten av synfältet. Aktivera cirkulär kammare adaptern så att A-P axel larven är ungefär i linje med banan för vätska-jet nålen.
    2. Med hjälp av överförda ljus och differentierad störningar kontrast (DIC), föra larven i fokus och centrera den under målet 10 x. Höja målet 10 x.
  3. Med den motorized micromanipulator, få vätska-jet nålen ner i mitten av synfältet så det är upplyst i genomlysning och knappt röra NB lösningen.
    1. Lägre syftet 10 x. Fokusera på larven att bekräfta sin plats. Fokus upp för att hitta vätska-jet nålen. Flytta vätska-jet nålen med micromanipulator i de x - och y - axeln tills det är i en position som är parallell med ryggsidan av fisken.
    2. Fokus tillbaka på larven. Sänka nålen i z-axeln. Placera nålen längs ryggsidan av fisk och ~ 1 mm från kroppen (figur 3A1).
    3. Försiktigt flytta cirkulär kammare adaptern (om nödvändigt) att se till att vätska-jet nålen justeras längs A-P mittlinje larven (figur 3A1).
    4. Flytta motoriserad scenen för att placera neuromast av intresse i mitten av synfältet. Hålla vätska-jet nålens spets längs ryggsidan av fisken. Rör inte spetsen på vätska-jet nålen till larv eller kammare yta.
  4. Växla till 60 x vatten mål. Se till att målet är nedsänkt i NB lösningen. Använd fina fokus att hitta ett neuromast som använder överförbara ljus och DIC optik.
    Obs: Denna inställning är utformad för att stimulera neuromasts längs den primära bakre sidolinje. Hårcellerna inom dessa neuromasts svara på antingen främre eller bakre riktad vätskeflöde. Se Chou et al.31 för en exakt karta över neuromast vätska känslighet inom sidolinje systemet.
    1. Placera vätska-jet nålen med micromanipulator så att det är 100 µm från den yttre kanten av neuromast (figur 3A2).
      Obs: Välja neuromasts med tydlig uppifrån utsikt (siffror 1B1'-B2' och figur 3A3) snarare än sida-vinklad utsikt (figur 1C1-C2). En tydlig uppifrån och ned Visa möjliggör samtidig avbildning av alla apikala hår buntar i en enda optiska plan eller avbildning av synaptic områden i färre optiska plan (figur 3A3).
    2. Fokus upp till tips av de apikala hår-buntarna (kinocilia) (figur 1A, siffror 3A2 och 3A3). Botten av vätska-jet nålen ska vara i fokus i detta plan.
  5. Ange höghastighetståg tryck klämman från manualen till yttre läge för att ta emot indata från avbildningsprogrammet.
    1. Noll höghastighetståg tryck klämman genom att trycka på ”noll” knappen. Använd inställt ratten för att ställa in vila trycket svagt positiv (~ 2 mmHg). Bekräfta vilande utdata för höghastighetståg tryck klämman använder PSI manometer ansluten till huvudet scenen utdata.
      Obs: Ange ett svagt positiv tryck på resten att undvika det gradvisa upptaget av vätska in i vätska-jet nålen över tid. Om vätska kommer in slangen ansluten till vätska-jet och når huvudet scenen, kan det skada utrustningen.
    2. Avgöra det tryck som behövs för att stimulera hår buntarna. Använda en 0,125 och 0,25 V ingång (6,25 respektive 12,5 mmHg) för 200 – 500 ms för att tillämpa ett test stimulus (figur 3A3-A3'').
      Obs: Snabba tryck klämman konverterar en spänningsingång (från programvara eller andra enheter som ansluter till BNC-porten på höghastighetståg tryck klämman kommandot hamnen) i trycket som släpps ut från huvudet scenen, och slutligen, vätska-jet nålen (1,0 V = 50 mmHg, medan -1,0 V =-50 mmHg). I den här konfigurationen (se steg 7,2) positiva påtryckningar (push) avleder hår buntar mot den främre, och undertryck (pull) avleder hår buntar mot bakre.
    3. Med hjälp av genomlysning och DIC optik tillsammans med en skalstapeln, Mät avståndet deformationen av de 6,25 och 12,5 mmHg stimuli av tips av hår buntarna, kinocilia (figur 1A och siffror 3A3-3''). Välja ett tryck som flyttar buntarna (som 1 sammanhängande enhet) ett avstånd av ca 5 µm (figur 3A3''). Säkerställa att tips av kinocilia förblir i fokus hela tiden.
    4. Flytta den vätska-jet ± 25 µm längs A-P-axeln för larven att hitta ett avstånd och tryck som avleder tips av kinocilia 5 µm.
      Obs: Använda GCaMP6s i larver 3 – 7 dpf, 5 µm omläggning bör uppnå nära mättar GCaMP6s kalcium signaler och bör inte skada apikala hår-bundle strukturer (figur 3A3''). Mindre cylindervolym avstånd kan användas för att leverera icke-mättar stimuli (figur 3A3'). Deplacement avstånd > 10 µm är svårt att uppskatta ( figur 3A3'' ') och kan vara skadligt över tid. Signalera mättnad är beroende av ålder av neuromast (och kinocilial höjd) samt den indikator som används. Kontrollera patency av vätska-jet nålen i varje riktning (press/push och vakuum/pull) regelbundet under imaging. Vätska-jet nålar täppa enkelt och förlora vakuum patency, men de bibehålla resttryck patency. Använda DIC optik och en kort test stimulans i varje riktning för att kontrollera för vätska-jet patency.
    5. Fokusera exemplet på planet av intresse (t.ex. basen av de apikala hår buntarna eller basen av cellen hår i synaptic planet; Figur 1 B1-B2').

8. imaging förvärv förfarande alternativ 1: Singel-plane förvärv

Obs: Alla imaging som beskrivs i detta protokoll utförs på RT.

  1. Ange tänkbar mjukvaran att förvärva en strömning eller kontinuerlig 80-frame förvärv med en fånga varje 100 ms för att uppnå en bildhastighet på 10 Hz.
  2. Ställ in gain, bländare och lasereffekt att optimera signaldetektion, men undvika mättnad, fotoblekning och buller. Exempel inställningarna för en Opterra/SFC är följande: 488 nm laser power: 50 (hår-bundle MET plan), 75 (synaptic planet); 35 µm slit; få = 2,7; EM vinst = 3900.
    Obs: Applicera 2 X binning om signaler är alltför svag eller bullriga eller har överdriven fotoblekning. 2 x binning vilja förbättra signaldetektion på bekostnad av rumslig upplösning.
  3. Välj en stimulans att leverera under 80-ramen (8 s) förvärv efter bildruta 30, 3 s.
    Obs: Några exempel stimuli är följande: 200 ms (+ eller - 0,25 V) upp till 2 s (+ eller - 0,25 V) steg i främre eller bakre riktning att identifiera riktnings känsligheten hos varje hår cell; 2 s, 5 Hz fyrkantsvåg (0.25 V för 200 ms, -0,25 V för 200 ms, upprepas 5 gånger) att stimulera alla hår celler samtidigt. Ett positivt tryck (främre stimulus) kommer att aktivera hälften av hårcellerna. Ett undertryck (bakre stimulus) kommer att aktivera den andra hälften av hårcellerna. Var noga med stimulans programvaran eller enheten återgår trycket klämman till 0 V efter stimulans är klar.
  4. Mäta mechanosensitive kalcium svaren. Fokusera på basen av de apikala hår buntarna (figurerna 1A och 1B1-B1') och börja bild förvärv.
    Obs: Om neuromast ses tydligt uppifrån och ner (figur 1B1-B1'), alla apikala hår buntar kan avbildas samtidigt i ett enda plan.
  5. Mäta presynaptiska calcium svaren. Fokus på basen av hårcellerna (figurerna 1A och 1B2-B2') och börja bild förvärv.
    Obs: Om neuromast ses tydligt uppifrån och ner (figur 1B2-B2'), presynaptiska imaging hyvlar av alla hårcellerna kan förvärvas i 2 – 3 plan uppsättning 2 µm isär. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] transgen fisk kan användas för att identifiera och lokalisera presynaptiska band och platser av kalcium posten29.

9. imaging förvärv förfarande alternativ 2: Flera plan förvärv

  1. Tune piezo-Z bifogas 60 x målet för snabb förvärv (12 – 18 ms). Se till att max-hastighet inställningar väljs.
  2. Skapa ett Z-stack förvärv med hjälp av en piezo-Z. Få hår-bundle MET verksamheten i 5 plan med stegstorlek på 0,5 µm. förvärva de presynaptiska signalerna i 5 plan med stegstorlek 1 µm.
  3. Ange bildfrekvensen till 10 Hz. Varje ram kommer att fångas varje 20 ms och varje Z-stack varje 100 ms.
  4. Ställa in förvärv för 400 bildrutor eller 80 Z-stackar vid 10 Hz för en 8 s streaming förvärv.
  5. Ange lasereffekt, bländare och vinst att optimera signaldetektion, men undvika mättnad, fotoblekning och buller. Exempelinställningar för ett Opterra/SFC system är följande: 488 nm laser power: 75 (hår-bundle MET plan), 125 (synaptic planet); 35 µm slit; få = 2,7; EM vinst = 3900.
    Obs: Applicera 2 X binning om signaler är för svag,bullriga, eller har överdriven fotoblekning. 2 x binning vilja förbättra signaldetektion på bekostnad av rumslig upplösning.
  6. Välj en stimulans att leverera under förvärvet börjar på frame 150, efter 3 s.
  7. Fortsätta protokollen som beskrivs ovan för enda plan förvärv, men centrera av Z-stacken i de apikala eller basal plan (steg 8,4 och 8,5).

10. kontroll: Farmakologiska Block av alla Evoked kalcium signaler

Obs: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) etan-N, N, N′, N′-tetraacetic acid) behandling är en kritisk kontroll när du först upprättar detta protokoll.

  1. Efter avslutad steg 8 eller 9, ersätta NB med 1 mL för NB innehållande 5 mM BAPTA klyva tip länkar krävs för att utfärda utegångsförbud för apikala MET kanaler ligger i hår buntar.
  2. Inkubera i 10 – 20 min vid RT.
  3. Tvätta BAPTA 3 gånger med 1 mL NB.
  4. Upprepa steg 8 eller 9. Efter BAPTA behandling, bör det finnas någon förändring i GCaMP6s fluorescens som svar på vätska-jet stimulering i apikala hår buntar eller synaptic planet. Om förändringar i GCaMP6s fluorescens kvarstår, dessa är inte sann kalcium signaler och kan vara rörelse artefakter.

11. kontroll: Farmakologiska Block av presynaptiska Calcium signaler (tillval)

  1. Efter avslutad steg 8 eller 9, ersätta NB med NB innehållande 10 µM isradipine med 0,1% dimetyl sulfoxid (DMSO) att blockera de L-typ kalcium kanalerna på den hår-cell presynapse.
  2. Inkubera i 10 min vid RT.
  3. Utan att utföra en tvätt, upprepa steg 8 eller 9. Efter behandling, bör det fortfarande finnas GCaMP6s fluorescens förändringar som svar på vätska-jet stimulering i apikala hår-buntar men inte synaptic planet. Om förändringar i GCaMP6s fluorescens kvarstår i synaptic planet, dessa är inte sann kalcium signaler och kan vara rörelse artefakter.

12. bild bearbetning och grafisk Representation av Data

Obs: Använda Fiji (steg 12.1 – 12.1.5) och en grafritande program (steg 12,2 – 12.2.3) för steg 12. StackReg, TurboReg (steg 12.1.3), Time Series Analyzer V3 (steg 12.1.4–12.1.6), och Fiji plugins är också nödvändig (se Tabell för material).

  1. Öppna en bildsekvens i Fiji, antingen en enda-plane tidsserier (80-frame enda plan) eller Z-stack tidsserier (400-frame multi plan). Klicka på ”File”, Välj ”Importera” från droppa-ned menyn, och klicka på ”bildsekvens”.
    1. För en Z-stack gånger serie, Z-projektet pekar varje gång (5 plan per tidpunkt) för att skapa en 80-frame bildsekvens. Klicka på ”bild”, Välj ”Stacks” från droppa-ned menyn, Välj ”verktyg” från droppa-ned menyn, och klicka på ”grupperade Z-projekt”. Välj ”genomsnittliga intensitet” som projektion, och ange ”5” för ”gruppens storlek”.
      Obs: Varje plan inom Z-stacken kan analyseras separat för ytterligare rumslig information.
    2. Ta bort de första 1 s (10 bilder) från 8 s (80 bilder) av bild förvärv. Klicka på ”bild”, Välj ”Stacks” från droppa-ned menyn, Välj ”verktyg” från den nedrullningsbara menyn och klicka på ”Make Substack”. Ange ”11-80” för ”skivor”.
      Obs: Denna substack kommer att betecknas som stk1.
    3. Registrera den bildsekvens (stk1) med hjälp av den StackReg plugin32. Klicka på ”Plugins”, Välj ”StackReg” och välj ”översättning” som metod för registrering för 70-frame tidsserien.
      Obs: Denna registrerade substack kommer att betecknas som stk2.
    4. Använda gånger serien Analyzer V3 plugin för att extrahera GCaMP6 intensitet (F) mätningarna. Placera en region av intresse (ROI) på apikala hår buntar eller presynaptiska platser i stk2. Gå till webbplatsen för ImageJ (se Tabell av material för länken) för instruktioner om hur du använder tid serien Analyzer V3.
      Obs: Använda en cirkulär 1 – 2 µm ROI för apikala hår buntar och en cirkulär 3 – 5 µm ROI på synaptic planet (siffror 4A1 och 4A2).
    5. Välj mätparametrar. Klicka på ”Analyze”, väljer du ”ställ mätning” och att bara ”betyder grå värde” är markerat.
    6. I ROI manager, Välj alla ROIs och funktionen flera mått för att generera (F) intensitetsvärden för varje ROI i tidsserien. Inom ROI Manager, klicka på ”mer >>” och väljer ”Multi mått” från droppa-ned menyn.
  2. Rita (F) värden. Klistra in värden (F) från ”Multi mäter” resultaten i en grafritande program för att skapa ett X-Y-diagram (siffror 4A1 'och 4A2').
    Obs: Skapa (X) värden manuellt eller använda tidsstämpel från metadata.
    1. Kvantifiera baslinjen (Fo) för varje ROI av genomsnitt (F) värdena i programmet grafritande från före stimulans ramar 1 – 20.
    2. För varje ROI, subtrahera (FOlofsson) (F) värden vid varje tidpunkt för att skapa ΔF (F-Fo) värden. Replot, om så önskas.
    3. Beräkna och rita ΔF/Fo. För varje ROI, dela ΔF mätning av (Fo) och replot (siffror 4A1'' och 4A2'').

13. bild bearbetning och värme karta Representation av plats och tid kalcium signaler

Obs: Tidigare arbete att skapa rumsliga värme karta representation av kalcium signaler i zebrafiskar sidolinje hårcellerna har använt anpassade programvara skriven Matlab5,28. Denna analys har anpassats för öppen källkod analys programvara Fiji33. Använd Fiji för alla steg som beskrivs nedan. StackReg och TurboReg Fiji plugins är också nödvändig (se Tabell för material).

  1. Utför steg 12.1 – 12.1.3 för varje Z-stack eller enda plan tidsserier att skapa den registrerade substack som kallas stk2.
  2. Använd stk2 för att skapa en baslinje bild. Klicka på ”bild”, Välj ”Stacks” från droppa-ned menyn och välj ”Z Project”. Välj ”genomsnittliga intensitet” för ”projektion” och ange ”1” för ”Start skiva” och ”20” för ”Stop slice”.
    Obs: Detta Z-projektion kommer att betecknas som baselineIMG.
    1. Temporally bin 70-frame (F) bildsekvens (stk2) i 14 0,5-s papperskorgar. Klicka på ”bild”, Välj ”Stacks” från droppa-ned menyn, Välj ”verktyg” från droppa-ned menyn, och klicka på ”grupperade Z Project”. Välj ”genomsnittliga intensitet” som metoden ”projektion” och ange 5 för ”gruppstorlek”.
      Obs: Denna grupperade Z-projektion kommer att betecknas som stk2bin och F i figur 5.
    2. Subtrahera pixelvärdet i baslinjen (baselineIMG) från den binned (F)-bildsekvens (stk2bin) att skapa en ΔF bildsekvens. Klicka på ”Process” och välj ”bild Calculator” från droppa-ned menyn. Välj stk2bin som ”Image1” och baselineIMG som”Image2”. Välj ”subtrahera” för ”Operation”.
      Obs: Denna baslinje-subtraheras Z-projektion benämns som stk2binBL och F-BL = ΔF i figur 5.
  3. Välja en uppslagstabell (LUT) val att Visa ΔF bildsekvens (stk2binBL). Klicka på ”bild”, Välj ”uppslagstabeller” från droppa-ned menyn, och klicka på en LUT av val.
    Obs: ”Red Hot” är den LUT som används i figur 5. Denna baslinje-subtraheras Z-projektion med LUT kallas stk2binBL-LUT och ΔF LUT i figur 5.
    1. Ange lägsta (min) och högsta (max) ljusstyrkevärden för stk2binBL-LUT. Klicka på ”bild”, Välj ”justera” och klicka på ”ljusstyrka/kontrast”. Värdet min ta bort bakgrundsljud från stk2binBL-LUT. Ange max värden att behålla signaler av intresse men undvika signalerar mättnad [t.ex. 200 till 1600 (12-bitars bild intensiteten intervall = 0 till 4095)].
      Obs: Använd samma min och max värden när att göra visuella jämförelser eller representationer. En ΔF kalibrering LUT bar kan genereras i Fiji för varje LUT bildsekvens (t.ex. stk2binBL-LUT). Klicka på ”analysera”, Välj ”verktyg” och klicka på ”kalibrering Bar”. Unclick ”Overlay” för att generera en separat, individuella bild med LUT kalibrering baren för referens.
    2. Konvertera både i ΔF (stk2binBL-LUT)med önskad LUTand temporally binned (F) bild (stk2bin) sekvenser till RGB. Klicka på ”bild”, Välj ”Type” och klicka på ”RGB-färg”.
      Obs: RGB-konverterade Z-projektionerna kommer att benämnas stk2binBL-LUT-RGB och stk2bin-RGB, respektive.
  4. Överlagra ΔF LUT bilderna (stk2binBL-LUT-RGB) på binned (F) bilder (stk2bin-RGB). Klicka på ”Process” och sedan ”bild Calculator”. Välj stk2bin-RGB som Image1 och stk2binBL-LUT-RGB som Image2. Välj ”Transparent-zero” för ”Operation”.
    Obs: Om det finns för mycket brus eller bakgrunden i överlägget ΔF LUT, upprepa steg 13,3 att öka min värdet. Om det finns mättnad, upprepa steg 13,3 och öka max värdet.

14. bild bearbetning och plats och tid värme karta Representation med ett makro: Fiji

Obs: Följande avsnitt avser ett Fiji makro kallas LUToverlay baserat på steg 13 som skapar automatiskt rumsliga värme karta representation av GCaMP6s signaler. Denna analys kräver öppen källkod analys programvara Fiji33 och StackReg och TurboReg Fiji plugins (se Tabell för material).

  1. Hämta Fiji LUT overlay makrot (LUToverlay.ijm) åtföljer detta protokoll (se Kompletterande Coding File).
  2. Öppna flera plan tidsserier eller singel-plane tidsserier (se steg 12.1).
  3. Klicka på ”Plugins”, Välj ”makron”, klicka på ”Kör” och markerar du makrot i LUToverlay. En dialogruta visas med texten, ”berätta om din bild förvärv”.
    Obs: För dialogrutan siffrorna närvarande är föreslagna värden och kan ändras enligt den inställning som används av experimenter. Värdena anges i rutan och nedan är inställda för en multi planet tidsserie med 400 bilder och 5 flygplan per tidpunkt (steg 9).
  4. Efter ”antalet flygplan per tidpunkt”, ange antalet flygplan per tidpunkt (t.ex. för steg 12.1.1 använder ett flera plan 400 tidsserier med 5 plan per tidpunkt, ange ”5”). För ett enda plan förvärv (t.ex. steg 8) ange ”1”.
    Obs: I de återstående dialogrutorna, för en multi planet tidsserie, ”tidpunkter” refererar till antalet bilder i den projicerade Z-stacken (t.ex., för steg 12.1.1 är 80 tidpunkter).
    1. Använd alternativet ”definiera intervallet till analysera” att ta bort de första 1 s av bildsekvens (t.ex. för steg 12.1.2 Välj ”11-80” att ta bort de första 10 bildrutorna och första 1 s).
    2. Efter ”definiera tidpunkter i baseline”, ange antalet bilder som ska användas att skapa baseline bilden [t.ex. steg 13,2., ange '20' att använda pre stimulans bilderna (11-30)].
    3. Efter ”tidpunkter per temporal bin” ange antalet bilder till bin för överlägget. (t.ex. för steg 13.2.2. Välj ”5” att skapa 14 0,5-s lagerplatser).
    4. Efter ”Min intensitet” och ”Max intensitet” ange lägsta och högsta ljusstyrkevärden som kommer att ta bort bakgrundsljud (minst) och behålla signaler av intresse samtidigt undvika mättnad (maximalt).
    5. Efter ”Välj en uppslagstabell”, Välj den LUT som önskas för överlägget. Klicka på ”OK”.
      Obs: Makrot avslutas analysera bilderna enligt instruktionerna i steg 13. De bilder som genereras av makrot ska också namnges enligt instruktionerna i steg 13.
  5. Stäng alla analys fönster innan du bearbetar en ny bildsekvens.

Representative Results

Efter myo6b:GCaMP6s-caax transgen fisk är ordentligt immobiliserade och vätska-jet stimulans levereras till sidolinje hårcellerna, robust kalcium signaler kan visualiseras och mätt (figurerna 4 och 5, vid 2 X binning). Vid vätska-jet stimulering signaler kalcium kan antingen mätas i apikala hår buntarna, där MET kanaler öppna som svar på stimuli, eller vid basen av hårceller, där presynaptiska kalciumkanaler i Cav1.3 utlösa neurotransmission. Ett representativt exempel på kalcium svaren i dessa regioner med en individuell neuromast visas i figur 4A1-A2''. I det här exemplet levererades en 2-s 5 Hz vätska-jet stimulans för att aktivera alla hårcellerna inom den representativa neuromast. Under stimulansen, robust kalcium signaler kan upptäckas i håret buntar (figur 4A1-A1'', svaren från 8 hår buntar visas). I detta system visar nästan alla mogna håret celler detta apikala inflöde av kalcium5. Däremot inom den samma neuromast, det finns detekterbara kalcium signaler i basal, synaptic planet i endast en delmängd (~ 30%) av hårcellerna (figur 4A2-A2'', 4 celler med presynaptiska Svaren visas)5. 4 grön ROIs Visa celler med inga betydande presynaptiska calcium signaler (figur 4A2-A2'') trots robust apikala kalcium signaler (figur 4A1-A1''). I denna representativa exemplet (figur 4A1-A2''), färgade ROIs matcha upp hår buntar i apikala MET planet (figur 4A1) med deras cell kroppar i basal synaptic planet (figur 4A2). Detta exempel belyser hur båda MET beroende - och presynaptiska-kalcium signaler kan mätas inom enskilda hårcellerna och bland populationer av hårcellerna.

Kalcium signalerna i både hår buntarna och på presynapse kan plottas grafiskt som antingen rå (F) GCaMP6s intensitet eller ΔF/Fo GCaMP6s intensitet (se steg 12, siffror 4A1'-A1'' och 4A2'-A2''). (F) GaMP6s diagrammen markera att baslinjen fluorescensintensiteten för varje cell kan variera (siffror 4A1' och 4A2'). I ΔF/Fo GCaMP6s grafer, varje cell är normaliserad till sitt utgångsvärde och relativ intensitet förändringen från baslinjen plottas (siffror 4A1'' och 4A2''). I båda (F) och ΔF/Fo GCaMP6s tomter, kalcium signalerna både i apikala hår bunt och basala presynaptiska planet inleda med uppkomsten av stimulansen (grå rutan) och minska exponentiellt efter stimulans avslutas. Under stimulansen, kalcium signaler i hår buntar stiga snabbt och mätta om styrkan i omläggning inte ändras (figur 4A1-A1''). Däremot inom delmängden av hårceller med detekterbara kalcium signaler i synaptic planet, kalcium signalerna öka mer gradvis och är mindre benägna att mättnad (figur 4A2-A2''). I hårcellerna utan presynaptiska calcium signaler (gröna ROIs) förbli kalcium signalerna nära baslinjen.

Utöver dessa grafiska representationer (figur 4), kan kalcium signaler visualiseras rumsligt inom den hela neuromast under tidsförloppet för inspelningen. Ett exempel på en spatiotemporal representation visas i figur 5 presynaptiska GCaMP6s signaler i basal planet av en neuromast. I figur 5beskrivs de viktigaste stegen att bearbeta en bildsekvens för spatial visualisering som beskrivs i steg 13. Först, raw (F) GCaMP6s-bilder skulle är kastas i temporally papperskorgen [figur 5: rad 1 (5 14 lagerplatserna visas); steg 13.2.1]. Sedan, baslinjen bilden, beräknas från före stimulans ramar (steg 13,2), subtraheras från (F) GCaMP6s fluorescens signalerna att få ΔF bilder (figur 5: rad 2; steg 13.2.2). Nästa, ΔF gråskalebilder konverteras till en färg LUT (figur 5: rad 3, Red Hot LUT; steg 13,3). Slutligen ΔF bilderna med LUT omvandlingen är överlagras på temporally binned (F) bilder (figur 5, första raden) att avslöja de spatiotemporal signalerna inom neuromast vid stimulering (figur 5: rad 4; steg 13,4). Värmekartor över ΔF GCaMP6s signaler ger både värdefull rumsliga och temporal information som inte är lätt att tolka ut från enda ROIs och diagrammen i figur 4. Värmekartor kan hjälpa till att visualisera viktig spatiotemporal information, inbegripet subcellulär information om uppkomsten och varaktigheten av kalcium signaler inom varje hår cell samt tidpunkt och intensitet skillnaderna bland hårcellerna inom hela neuromast.

Det är viktigt att kontrollera att diagrammen och rumsliga värmekartor representerar sant kalcium signaler och inte är artefakter på grund av rörelse. I detta protokoll, kan rörelse artefakter vara resultatet av överdriven avdrift eller rörelse av larv eller motion på grund av vätska-jet stimulering. Alla dessa artefakter är utmanande att helt eliminera i denna invivo beredning. Medan registrering av bildsekvenser (steg 12.1.3) kan korrigera för måste majoriteten av rörelsen i x - och y, bildsekvenser med överdriven rörelse i z-axeln identifieras och tas bort från analyser. Rörelse artefakter är lättast att identifiera genom graphing kalcium signalerna. Exempel på GCaMP6s intensitet förändringar som är artefakter inte och sant GCaMP6s signaler kan observeras vid spetsen (figur 4B1'-B1'') och bas (figur 4C1'-C1'') av hårceller.

I de apikala hår buntarna, rörelse artefakter är vanliga när den vätska-jet stimulansen är för stark (figur 3A3'' '). Under dessa överdrivet starka stimuli, apikala hår-bundle planet kan flytta ur fokus under vätska-jet stimulering sedan återgå till ursprungliga fokalplanet efter stimulans avslutar (figur 4B1'-B''). Detta gör det svårt att exakt mäta apikala MET-beroende kalcium signaler. Ett exempel på hår-bundle rörelse artefakter kan ses i figur 4B1'-B1''. Här diagrammen visar en minskning av GCaMP6s signaler under stimulansen (grå rutan) när hår buntarna är out-of-fokus. Efter stimulansen slutar, öka GCaMP6s signalerna snabbt som hår buntarna återgå till sin ursprungliga position och komma tillbaka i fokus. Detta kontrasterar med exemplet i figur 4A1'-A1'' där de apikala kalcium signalerna öka vid uppkomsten av stimulansen och minska när stimulansen slutar.

Medan rörelse på grund av överdriven vätska-jet stimuli kan också flytta synaptic planet ur fokus, är denna typ av rörelse artefakt mindre vanligt i detta plan. Istället är förändringar i fokus i z-axeln på grund av rörelse eller drift av larven de vanligaste orsakerna till rörelse artefakter. Larval rörelse eller drift kan påverka GCaMP6s mätningar vid både apex och bas av hårcellerna. Ett exempel av larval rörelse som ökar GCaMP6s i basal, synaptic planet under stimulans visas i figur 4C'-C''. Rörelse artefakter (figur 4C1'-C1'') kan särskiljas från Sant presynaptiska signaler (figur 4A2'-A2'') genom att undersöka tidsförloppet för GCaMP6s signaler. Snarare än att öka och minska exponentiellt med stimulans (figur 4A2'-A2''), den rörelse-inducerad ökningen av GCaMP6s signal har en fyrkant forma och stiga och falla abrupt med uppkomsten och förskjutning av stimulans, respektive () Figur 4 C1'-C1'').

Förutom noggrann undersökning av tidsförloppet för GCaMP6s signaler, kan kontroll experiment med farmakologi användas för att skilja sant GCaMP6s signaler från rörelse artefakter. Till exempel kan BAPTA (steg 10) tillämpas för att klyva tip-länkarna som krävs för MET-kanals funktion i hår buntar. BAPTA bör eliminera vätska-jet-framkallat apikala MET-kanal-beroende kalcium tillströmning såväl som efterföljande basala, presynaptiska calcium inflödet genom Cav1.3 kanaler. I representativa exempel på sann stimulus-framkallat kalcium signaler (figur 4A1-A2'') under vätska-jet stimulering, alla ändringar i GCaMP6s fluorescens i båda de apikala och basala plan skulle elimineras efter BAPTA behandling. Däremot förändringar i GCaMP6s fluorescens på grund av rörelse, såsom de som visas i siffror 4B1'-B1'' och 4 C 1'-C1'' skulle inte elimineras genom BAPTA behandling.

Förutom för att eliminera alla stimulans-framkallat GCaMP6s signaler med BAPTA, isradipine kan tillämpas (steg 11) för att specifikt blockera Cav1.3-beroende kalcium tillströmning i basal synaptic planet samtidigt som den lämnar apikala MET-kanal-beroende kalcium tillströmningen intakt5. Efter tillämpning av isradipine, i en individuell neuromast med ingen rörelse artefakter, förändringar i GCaMP6s fluorescens i apikala hår buntar (figur 4A1'-A1'') under vätska-jet stimulering skulle vara oförändrat, medan alla synaptic GCaMP6s fluorescens förändringar vid basen skulle elimineras (figur 4A2'-A2''). Någon förändring i GCaMP6s signal i synaptic planet efter isradipine ansökan (t.ex.,figur 4C1-C1'') skulle troligen motsvarar rörelse artefakter.

Figure 1
Figur 1 : Översikt över en sidolinje neuromast och funktionella imaging flygplan. (A) diagrammet till vänster visar en sida-vy av en neuromast med fyra hår-cell organ (svart) att kontakta postsynaptiska afferenta neuroner (blå). Band (grön) tjuder blåsor på presynaptiska aktiva platser inom varje cell. Apikala till varje cell organ är en bunt sinneshår (1 µm) som innehåller MET kanaler. Varje hår bunt har en kinocilium som överför den mekaniska kraften av vatten rörelse till basen av den hår bunten. Diagrammet till höger visar samma modell i en top-down vy. I den här uppifrån vyn svart används för att ange de fyra cellerna som skildras i diagrammet till vänster, och grå används för att ange andra celler i neuromast. Inom denna modell och dessa 2 visningar, tre viktiga plan är markerade: (1) tips av hår buntarna (kinocilia) används för att kvantifiera omfattningen av hår-bundle deformationen, (2) det apikala MET planet vid basen av hår buntarna där kalcium kommer in i cellen under stimulering, och (3) synaptic planet vid basen av cellen där kalcium kommer in nära synaptic band. (B1-B1') DIC och GCaMP6s uppifrån bilder av MET plan vid basen av hår buntarna, där mechanosensation-beroende kalcium signaler kan registreras. (B2-B2') DIC och GCaMP6s uppifrån bilder från de samma neuromast som B1-B1', men vid basen av neuromast i synaptic planet, där presynaptiska calcium signaler kan upptäckas. (C1-C2) Bilder av en neuromast som uttrycker GCaMP6s där larverna är felaktigt monterad. I det här exemplet är apikala MET planet (C1) och synaptic planet (C2) vid basen av cellen placerade i en optimal vinkel. Denna ställning tillåter inte alla hår buntar som avbildas i ett enda plan, och många fler imaging plan behövs för att fånga aktivitet på alla synapser inom detta neuromast jämfört med B1-B2'. Bilderna är av larver på 5 dpf. Skalstapeln i C2 motsvarar alla bilder i B1-C2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Imaging kammare, zebrafiskar montering och hjärtat injektion procedurer och nålar. (A) visas är en tänkbar kammare med en larv (beskrivs av en streckad rektangel) nålas till stadens ovanpå den silikon encapsulant. (B1) Visas är en 5 dpf larven orörlig med två stift. Ett stort huvud stift placeras vinkelrätt mot kroppen bara posteriort ögat. De två ögonen är helt ovanpå så botten ögat helt skyms av övre ögat. En liten svans pin korsar ryggsträng i svansen. Larven är platt och inte vridna. (B2) För att förlama larv, en hjärta injektionsnål är orienterade vinkelrätt mot kroppen och förde intill hjärtat. Hjärtat injektionsnålen bör kontakta cellen pigment framför hjärtat. (B2') Depression av nålen in i huden orsakar indrag av pigment cellen framför hjärtat. (C) nålar i ordning från vänster till höger: exempel på en hjärtat injektionsnål med en öppning på ungefär 3 µm; exempel på en bra vätska-jet nål med en öppning på ca 50 µm, exempel på en dåligt trasiga vätska-jet-nål som är stor och taggiga och kommer sannolikt producera överdrivna och oregelbundna stimuli. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Vätska-jet justering, positionering och stimulans kalibrering. (A1) Visas är en larv orienterade med huvudet fasaden till vänster och svans till höger, och en vätska-jet nål orienterad parallellt med A-P axeln av zebrafisk kroppen. Denna vätska-jet nål justeras för att stimulera den neuromasts som svarar på främre (push/tryck) och bakre (pull/vakuum) regisserad vätska-flöda. (A2) Visas är en neuromast (markerad med streckad vit linje) och tips av apikala hår buntar (kinocilia) på vänster sida i panelen och vätska-jet nålen till höger på panelen. Vätska-jet är placerade ungefär 100 µm från kanten av neuromast. (A3-A3'' ') Tips av apikala hår buntar (kinocilia) är utbuktande olika sträckor av varierande vätska-jet stimulans trycket. Banan för ett enda kinocilial tips visas för 1,5 µm (A3') och 5 µm (A3'') nedböjning avstånd. Den svarta cirkeln visar vilande position av kinocilium. Det är viktigt att kinocilia inte är avlänkas för långt, annars stimulus intensitet kan inte mätas på ett tillförlitligt sätt och kan bli skadligt (A3'' '). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Apikala träffade och basala presynaptiska GCaMP6s signaler under vätska-jet stimulering i sidolinje hårcellerna. (A1-A2'') GCaMP6s intensitet ändras under vätska-jet stimulering inom en representativ neuromast. Bilderna till vänster visar apikala MET planet (A1) och basal synaptic planet (A2) inom den samma neuromast. ROIs färg kodade i A1 och A2 har använts för att rita de tidsförloppet för (F) och ΔF/F GCaMP6s intensitet diagram till höger om varje bild. (B1-B1'') Exempel på en apikal MET bildsekvens med överskott rörelse under vätska-jet stimulering. Bilden till vänster (B1) visar de ROIs brukade tomten (F) och ΔF/F GCaMP6s intensitet diagram till höger. (C1-C1'') Exempel på en bildsekvens i basal synaptic planet att visar rörelse artefakter och GCaMP6s signal förändringar som inte är sant kalcium signaler. Bilden till vänster (C1) visar de ROIs brukade tomten (F) och ΔF/F GCaMP6s intensitet diagram till höger. Den grå rutan i varje diagram representerar varaktigheten av den vätska-jet stimulansen under varje bildsekvens. En 2-s 5 Hz vätska-jet stimulus användes för exemplet i A1-A2'' och B1-B1''. I C1-C1'', en 2 s främre stegstimulus användes. Y-axeln för (F) GCaMP6s grafer skildrar godtyckliga enheter (A.U.) erhålls från Fiji bild intensitet mätningar. Alla exempel är från larver på 4-5 dpf. Skalstapeln = 5 µm för alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Spatiotemporal visualisering av presynaptiska GCaMP6s signaler under vätska-jet stimulering. Stegen för att visualisera spatiotemporal ändringarna i GCaMP6s intensitet inom en neuromast under stimulans beskrivs. Tid är representerade från vänster till höger enligt tidsstämpeln högst upp på bilderna. Den översta raden visar 5 14 temporal lagerplatserna från en 70-GCaMP6s (F) bild bildrutesekvens (steg 13.2.1). I den andra raden, har baslinjen (steg 13,2) tagits från varje (F) GCaMP6s binned bild skapa ΔF bilder (steg 13.2.2). I den tredje raden, ΔF bilder har konverterats från gråskala (andra raden) till Red Hot LUT (steg 13,3). Min och max dessa LUT bilder ställs enligt Red Hot LUT värmekarta över relativa ΔF intensitet (A.U.) till höger (steg 13.3.1). I den nedersta raden, har den tredje raden varit överlagras på (F) bilderna i den översta raden (steg 13,4). Det grå fältet överst i figuren anger tidpunkten för den 2-s 5 Hz vätska-jet stimulansen. Exemplet är från en 5 dpf-larver. En legend av Red Hot LUT värmekarta över relativa ΔF intensitet (A.U.) visas till höger. Skalstapeln = 5 µm för alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

In vivo imaging i intakta djur är till sin natur utmanande. Flera steg i denna metod är kritiska till att erhålla tillförlitlig i vivo kalcium mätningar från sidolinje hårcellerna. Exempelvis är det mycket viktigt att larven är stiftad och förlamad ordentligt innan imaging för att minimera rörelse under imaging. Överskjutande rörelse under imaging kan leda till förändringar i GCaMP6s fluorescens som inte är sant signaler och inte motsvarar förändringar i kalciumnivåer (t.ex., siffror 4B1'-B1'' och 4 C 1'-C1''). Svans pins kan placeras mer anteriorly för att minimera rörelse, även om detta kan göra mer bakre neuromasts oåtkomlig. Dessutom efter hjärtat injektion, kan chef pins roteras så att den horisontella delen av stiftet ligger över äggulan. Förutom att ändra positionen för stift, är det också möjligt att använda en hjärna-slice harpa istället för stift för att immobilisera larverna34. När den placeras över larverna ordentligt, är en harpa ytterligare, potentiellt mindre invasiva metod för att immobilisera larver. Även betydande rörelser kan resultera från otillräcklig fastlåsning, kan underlåtenhet att korrekt utföra hjärtat injektionen för att leverera α-bungarotoxin och förlama larver resultera i ofullständig förlamning, rörelse, och i slutändan rörelse artefakter. Även om vanliga bedövningsmedel har visats påverka retbarhet av zebrafisk hårcellerna, har senaste arbete visat att den anestetiska bensokain inte stör många aspekter av hår-cells aktivitet. Likaså vanligaste mer bedövningsmedel MS-222 bara stör vissa aspekter av hår-cell aktivitet15. Därför utmanande pågrund av α-bungarotoxin injektion, kan bensokain eller MS-222 program visa sig vara ett användbart alternativ metod av förlamning att förhindra rörelse i larven under funktionella kalcium imaging.

Förutom de tekniska utmaningarna som är engagerade i detta protokoll är även ett perfekt monterade prov värdelös om den larv och hårcellerna inte är hälsosam före och under varje tänkbar experiment. För att säkerställa att larver och hårcellerna är frisk, är det viktigt att larver bibehålls i E3-buffert som är fria från skräp som chorions (äggskal), avfall och mikroorganismer. Även om ytliga sidolinje hårcellerna är fördelaktiga för avbildning, detta läge gör dem mer sårbara för cellulära skador när E3 bufferten är sotigt. En ren, vattenlösning miljö är särskilt viktig för unga larver (2-4 dpf) eller mutanter som inte kan upprätthålla en upprätt simning ställning och främst ligga på botten av petriskål. I dessa situationer, sidolinje hårcellerna och skyddande cupula omger hår buntarna kan enkelt bli äventyras. Även när börjar med friska larver och hårcellerna, under varje experiment är det viktigt att säkerställa att larven har ett hjärtslag och snabb blodflödet. Om blodflödet saktar eller slutar, kan hälsa hårcellerna bli komprometterat. I komprometterad preparat som innefattar ohälsosamma larver eller förlust av blodflödet, dör hårcellerna kan identifieras på flera sätt: första att utseendet på karyopyknosis eller nukleär kondensation, vilket yttrar sig som en bubbla inom cellen under DIC optik; det andra av cell krympning och förekomsten av snabbt rörliga partiklar inom cytoplasman; och tredje, när kinocilia tips splay i olika riktningar35. När hår buntar störs, flytta de utspärrade kinocilia inte sammanhållet tillsammans vid stimulering.

Detta preparat har flera mindre begränsningar, ett är att preparatet endast förblir robust för 1-3 timmar efter det är etablerat. Ändringar, till exempel använder mindre stift eller en hjärna-slice harpa för att immobilisera larver och att lägga till en perfusion system kan förlänga livslängden på denna in-vivo -beredning. En annan begränsning är att fotoblekning och fototoxicitet kan uppstå efter upprepad imaging studier. Ett spännande sätt att övervinna denna utmaning är att anpassa detta protokoll för ljus ark mikroskopi. Ljus-ark mikroskopi är ett kraftfullt sätt att minska ur fokus ljus, vilket leder till mindre fotoblekning och fototoxicitet36. Tillsammans kan skonsammare immobilisering och mindre foto-exponering hjälpa förlänga varje bildsession. Längre imaging sessioner kan användas för att undersöka hela varaktigheten av funktionella förändringar som åtföljer utveckling och de processer som ligger bakom hår-cell clearance och förnyelse efter skada. Det är viktigt att påpeka att, förutom ljus ark mikroskopi, detta protokoll kan anpassas till andra typer confocal system (punkt-scanning, 2-photon och roterande disk) samt relativt enkla widefield system28,34 . Sammantaget gör detta protokoll ett värdefullt verktyg som kan anpassas och användas med flera bildgivande system till dess mångsidighet.

Medan detta protokoll kan anpassas och användas med många bildsystem, kan delar av detta protokoll också anpassas och användas (1) med andra indikatorer förutom GCaMP6s och (2) till avbildningen aktivitet i andra sensoriska celler och nervceller inom larval zebrafiskar. Exempelvis i en tidigare studie har använt vi detta protokoll till bilden aktivitet med flera genetiskt kodade indikatorer inom sidolinje hårcellerna för att upptäcka cytosoliska kalcium (RGECO1), vesikler fusion (SypHy), membran spänning (Bongwoori) och membran kalcium (jRCaMP1a-caax och GCaMP6s-caax), och inom sidolinje afferenta processer för att upptäcka membran kalcium (GCaMP6s-caax)5. Transgena linjen Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) beskrivs i detta protokoll baserat på vår erfarenhet av att använda dessa indikatorer, och erbjuder en utmärkt start för imaging aktivitet i sidolinje neuromasts. Av alla de indikatorer som anges ovan, har vi funnit att GCaMP6s är den känsligaste och fotostabilt. Förutom dessa funktioner, vi belysa Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) transgena linjen eftersom det kan användas för att göra två olika mätningar: hår-cell mechanosensation och presynaptiska calcium inom en enda transgena linje.

Den teknik som beskrivs i denna artikel visar hur kalcium imaging i zebrafiskar laterala linjen kan vara en kraftfull metod för att studera hur hårcellerna fungerar i sin ursprungliga miljö. Detta tillvägagångssätt är ett komplement till studier av däggdjur i vilken hår-cell funktion studeras för närvarande i ex vivo bladsticklingar. Zebrafisk modellen kan dessutom fortsätta att användas som en plattform för att testa effekten av genetiskt kodade indikatorer som sedan kan tillämpas för att granska aktivitet i däggdjursceller hår.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av NIH/NIDCD intramurala forskning medel 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Vi skulle vilja erkänna Candy Wong för hennes hjälp skriftligen makrot Fiji. Vi vill också tacka Doris Wu och Candy Wong för deras hjälpsamma förslag med protokollet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488 nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10x air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60x water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 feet) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163, (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1833, (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19, (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9, (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167, (3914), New York, N.Y. 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. 1-19 (2006).
  8. Deafness and Hearing Loss, Key Facts. World Health Organization. Available from: http://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/deafness-and-hearing-loss (2018).
  9. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58, (9), 525-530 (2006).
  10. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7, (6), 985-994 (1991).
  11. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, (22), 10297-10301 (1995).
  12. Ricci, A. J., Wu, Y. -C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18, (20), 8261-8277 (1998).
  13. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (2), 883-888 (2000).
  14. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25, (50), 11577-11585 (2005).
  15. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594, (19), 5427-5438 (2016).
  16. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592, (10), 2041-2058 (2014).
  17. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75, (1), 508-513 (1996).
  18. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  19. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, Clifton, N.J. 471-485 (2016).
  20. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell's ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, Pt 1 7-12 (2005).
  22. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326, (2), 347-359 (2006).
  23. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 - Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  24. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  25. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  26. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7, (12), 51874 (2012).
  27. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236, (11), 3088-3099 (2007).
  28. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 - Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  29. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, (26), 6299-6313 (2017).
  30. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Available from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0091679X15002332 (2018).
  31. Chou, S. -W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8, (1), 2234 (2017).
  32. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7, (1), 27-41 (1998).
  33. Fiji is just ImageJ. Available from: https://fiji.sc/ (2018).
  34. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, (17), 7513-7525 (2013).
  35. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  36. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics