Explorando a imagem ao vivo aos núcleos de pista durante a diferenciação de Myoblast e fusão

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Diferenciação de músculo esquelético é um processo altamente dinâmico, que particularmente se baseia no posicionamento nuclear. Aqui, descrevemos um método para controlar movimentos de núcleos por imagens de células vivas durante a formação de diferenciação e myotube myoblast e executar uma caracterização quantitativa da dinâmica de núcleos extraindo informações de rastreamento automático.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Careccia, G., Colombo, F., Tirone, M., Agresti, A., Bianchi, M. E., Zambrano, S., Vénéreau, E. Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion. J. Vis. Exp. (146), e58888, doi:10.3791/58888 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Posicionamento nuclear dentro de células é importante para vários processos celulares em desenvolvimento e regeneração. O exemplo mais intrigante de posicionamento nuclear ocorre durante a diferenciação do músculo esquelético. Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas, formadas pela fusão de células precursoras dos músculos (mioblastos) derivadas de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação. Correto posicionamento nuclear dentro de myofibers é necessária para a regeneração muscular adequada e função. O procedimento comum para avaliar a formação de diferenciação e miofibras myoblast se baseia em células fixas analisadas por imunofluorescência, que dificulta o estudo do comportamento de movimento e célula nuclear ao longo do tempo. Aqui, descrevemos um método para a análise da formação de diferenciação e miofibras myoblast por imagens de células vivas. Nós fornecemos um software automatizado de controle nuclear obter uma caracterização quantitativa da elevado-produção de nuclear dinâmica e comportamento de myoblast (ou seja, a trajetória) durante a diferenciação e fusão.

Introduction

Músculo esquelético é o tecido maior no corpo humano, totalizando 35% - 40% da massa do corpo1. Células satélites são células-tronco musculares, anatomicamente caracterizadas por sua posição (justaposta a membrana plasmática, por baixo da lâmina basal das fibras musculares), que dão origem à proliferação de mioblastos (células progenitoras miogênico), que eventualmente diferenciar e integrar myofibers existentes e/ou fusível para formulário novo myofibers2,3,4. O progresso no estudo de sua biologia e sua descoberta levou a insights significativos sobre o desenvolvimento muscular e regeneração.

Protocolos para isolar e diferenciar mioblastos em myotubes foram desenvolvidos há muitos anos e ainda são largamente usados para estudar o músculo esquelético diferenciação5,6,7. No entanto, a maioria desses métodos representa procedimentos estáticos que dependem da análise de células fixas e, consequentemente, não permitir que os cientistas a explorar plenamente os processos altamente dinâmicos, como fusão de myoblast e maturação de miofibras. O exemplo mais marcante é o posicionamento nuclear, que é fortemente regulamentado, com núcleos inicialmente no centro das miofibras e, em seguida, localizada na periferia das miofibras maturação8,9. Imagem ao vivo é a técnica mais apropriada para obter ainda mais insights sobre um fenômeno tão peculiar.

Aqui, descrevemos um método que permite aos cientistas para gravar myoblast formação de diferenciação e myotube pela microscopia de lapso de tempo e realizar análises quantitativas do rastreamento automático de núcleos myoblast. Este método fornece uma caracterização quantitativa da elevado-throughput de nuclear dinâmica e myoblast comportamento durante a diferenciação e fusão. O protocolo é dividido em quatro partes diferentes, ou seja, (1) a coleção dos músculos de um dos membros posteriores dos ratos, (2) o isolamento dos mioblastos primários que consiste na digestão enzimática e mecânico, (3) myoblast proliferação e diferenciação e (4) viva da imagem latente para rastrear núcleos dentro o primeiro 16 h de diferenciação myoblast.

No procedimento a seguir, mioblastos são isolados de ratos H2B-GFP e tratados com 1 µ g/mL de doxiciclina para induzir a expressão H2B-GFP, como descrito anteriormente,10. Alternativamente, é possível isolar os mioblastos de outros ratos transgénicos que expressam uma proteína fluorescente no núcleo ou transfect as células isoladas de ratos do selvagem-tipo de expressar uma proteína fluorescente no núcleo, conforme descrito por Pimentel et al. 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo assuntos animais foram aprovados pelo Comitê de uso e San Raffaele institucional Cuidado Animal.

1. a dissecação dos músculos do membro posterior de rato

  1. Esterilize as pinças e tesouras (retas e curvas) em autoclave.
  2. Preparar e filtro (0,22 µm) todas as mídias (bloqueio médio, médio de digestão, proliferando médio e diferenciando médio) antes de iniciar o experimento (ver Tabela de materiais).
  3. Colocar 5 mL de tampão fosfato salino (PBS) em uma placa de Petri para coleção de músculo de 35mm.
  4. Sacrificar o mouse por deslocamento cervical ou usando o CO2 e esterilizar a pele com álcool etílico. Retire a pele dos membros superiores e membros posteriores usando uma tesoura e pinça, a fim de facilitar o isolamento dos músculos.
    Nota: Os músculos podem ser isolados de ratos neonatais ou adultos. Os ratos neonatais têm um aumento do número de células satélites em comparação com ratos adultos. No entanto, o número total de células satélites que pode ser isolado de um único rato adulto é suficiente para realizar o experimento descrito abaixo.
  5. Isolar o tibial, extensor longo dos dedos (EDI), sóleo, gastrocnêmio, quadríceps e tríceps e colocá-los na caixa de Petri contendo PBS. Deixe o prato no gelo. Retire cuidadosamente os tendões e gordura com pinça e tesoura esterilizada.

2. isolamento de mioblastos primários

Nota: Todos os procedimentos para cultura de células são feitos em condições estéreis.

  1. Remova os músculos a PBS. Cortar e picar os músculos, usando tesouras curvas estéril, até obter uma massa uniforme. Coloque os pedaços de músculo em um tubo de 50 mL.
  2. Adicionar 10 mL do meio de digestão para os pedaços de músculo e incubar a 37 ° C por 30 min, sob forte agitação (250 min-1) em um banho de água, para digerir enzimaticamente os músculos.
  3. Adicione 10 mL de Dulbecco modificado médio da águia (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS), glutamina 1%, 1% penicilina/estreptomicina e gentamicina 1% (bloqueio médio) para parar a digestão.
  4. Centrifugar a 40 x g por 5 min e recolher o sobrenadante em um tubo de 50 mL. Salve a pelota no gelo.
    Nota: Após a centrifugação, o sobrenadante contém algumas células satélites, células sanguíneas, células endoteliais e fibroblastos, enquanto a pelota contém pedaços de músculo não digerido e tecido conjuntivo. Para aumentar o número de células isoladas, a pelota deve ser submetida a etapas adicionais de digestão conforme descrito abaixo.
  5. Centrifugue o sobrenadante a 650 x g por 5 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de DMEM contendo 10% FBS. Manter o ressuspenso em gelo.
  6. Repita as etapas de 2.2 – 2,5 x 2 para o resto do pellet obtido na etapa 2.4 e adicionar as pelotas posteriormente ressuspensa primeiro ressuspenso conservado no gelo.
  7. Passe as ressuspensão de pelotas através de um filtro de 70 µm e, em seguida, através de um filtro de 40 µm. Adicione 15 mL de DMEM com 10% FBS e centrifugar a 650 x g por 5 min.
  8. Ressuspender as células em 3 mL de tampão de lise de células vermelhas do sangue para esgotar os glóbulos vermelhos. -Incube durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 40 mL de PBS para parar a Lise das células vermelhas do sangue e centrifugar a 650 x g por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender o em 5 mL de DMEM com 10% FBS.
  9. Como passo preplating, as células em 20 mL de meio de proliferação em uma placa de Petri 150 mm sem revestimento da placa. Após 1 h de incubação numa incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO2), recolha o meio.
    Nota: Fibroblastos, anexar a placa, então são descartados, enquanto as células satélites permanecem em suspensão.
  10. Repita a etapa 2,9 3 x e, no último passo preplating, recolher o meio, que contém as células satélites em suspensão.
  11. Centrifugar a 650 x g por 5 min.
  12. Enquanto as células são centrifugação, revesti dois pratos de Petri 150mm com colágeno (10 mL de uma solução 0,1% de ácido acético 0,1 M). Para fazer isso, coloque o colágeno no prato, incubar durante 5 min e removê-lo. Deixe a placa secar por 30 min.
  13. Descartar o sobrenadante obtido na etapa 2.11 e ressuspender as células em 40 mL de meio de proliferação (Tabela de materiais). As células em dois pratos de Petri 150mm revestida de colágeno (20 mL por prato) da placa e manter as células em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) em meio de proliferação por 2 – 3 dias com 1 µ g/mL de doxiciclina para induzir a expressão H2B-GFP.
    Nota: Este passo permite a proliferação de mioblastos para obter um maior número de células para mais ensaios. Densidade da célula é mantida muito baixa, para evitar uma diferenciação espontânea dos mioblastos em myotubes.

3. ensaios de proliferação e diferenciação de Myoblast

Nota: Quando myoblast densidade é elevada, algumas células iniciar o alongamento, e em seguida, é necessário dividir as células. Geralmente, é possível dividir células 2 x x-3 sem afetar seu fenótipo.

  1. Descartar o meio, lavar as células com 5 mL de PBS, adicionar 2 mL de tripsina (1x) e incubar a placa a 37 ° C numa incubadora de célula 5 min. Verifique sob o microscópio e, quando cilìndricas desanexar, adicionar 5 mL de DMEM com 10% FBS para inactivar a tripsina. Contar o número de células (geralmente é possível obter cerca de 1 x 106 células/rato).
    Nota: A incubação com tripsina por 5 min geralmente é suficiente para separar os mioblastos proliferando.
  2. Submeta as células a um dos ensaios descritos a seguir.
    1. Ensaio de proliferação
      1. Placa de 50.000 células/poço em 1 mL/bem do meio de proliferação em um colágeno-revestido 12 placa e incubar as células chapeadas em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO2). Corrigir e contar as células em 24, 48 ou 72 h.
        Nota: O meio é substituído a cada 48 h para evitar o esgotamento de nutrientes.
    2. Ensaio de diferenciação
      1. Revesti uma placa de 12 com 350 µ l de proteína média (1: 100) do membrana basal matriz contendo de diferenciação. Incubar a placa a 37 ° C por 30 min e remova o meio.
      2. Placa de 200.000 células/bem no meio de diferenciação na placa matriz-revestido. Incubar as células em uma incubadora de cultura celular (37 ° C, 5% CO2, 5% O2) até que aderem à placa (2 h são geralmente o suficiente para as células para aderir e começar a diferenciação).
      3. Para avaliar a diferenciação, realize coloração para cadeia pesada de miosina e núcleos, como descrito anteriormente,11. Alternativamente, realizar análises de imagens ao vivo, conforme descrito abaixo.

4. Live-imagem de diferenciação myoblast e rastreamento nuclear

  1. Para a célula viva de imagem, colocar as células, obtido na seção 3.2.2 e banhado em uma placa de 12, sob um microscópio confocal, equipado com um sistema de incubação para manter as células a 37 ° C em 5% CO2.
  2. Use um objectivo seco 20 x (0,7 NA) para obter campos de visão com centenas de células, suficiente para monitorar a formação de miofibras. Células de H2B-GFP podem ser fotografadas com um laser de argônio da baixo-intensidade de 488 nm.
    Nota: Uma pinhole aberto garante que a profundidade da imagem (~ 10 µm) contém a espessura da célula para que as células são mantidas em foco durante todo o experimento. Usar um microscópio confocal é vantajosa desde que melhora a relação sinal-ruído das imagens, apesar de microscopia de campo amplo também poderia ser usada. Formação de miofibras pode ser monitorada através do canal de transmissão.
  3. Adquira imagens de 16 bits e 1.024 x 1.024 pixels por quadro cada 6 min para 16 h. Para cada posição adquirida, gerar um arquivo de multiframe.tif (ver exemplo nos Arquivos complementares).
    Nota: No presente protocolo, software comercial, associado com o microscópio (Tabela de materiais) tem sido utilizado; Use o software adequado para alcançar o mesmo objectivo, quando usando outros microscópios.
  4. Baixe o software fornecido como um arquivo suplementar. zip.
    Nota: As rotinas são scripts que devem ser executados em MATLAB. O software é uma adaptação de um software publicado12 otimizado para o acompanhamento dos núcleos durante a formação de myotube. Este software é dividido em duas partes: a primeira que identifica os núcleos em cada quadro segmentando-os, enquanto a segunda gera "faixas" (trajetórias) do movimento de núcleos. O código completo para segmentação nuclear e um guia passo a passo para começar e acompanhamento são fornecidos em Arquivos complementares.
  5. Extraia o arquivo zip e salve-o em um caminho desejado no computador pessoal (PC) em uso. Executar todas as abaixo passagens em um PC com o software necessário instalado. Observe que o arquivo. zip é composto de três pastas, como mencionado abaixo.
    Nota: Rotinas de segmentação contém as funções a ser executado para a segmentação. Rotinas de acompanhamento, em vez disso, contém as funções necessárias para o acompanhamento. Exemplo de segmentação de rastreamento fornece a base scripts e arquivos para se familiarizar com o sistema. O software usado para segmentação e acompanhamento dos núcleos é executado corretamente no MATLAB, R2015a ou versões posteriores.
  6. Para segmentar os núcleos do arquivo. tif, nomeie o arquivo, por exemplo, NameFile.tif.
    1. Abra a pasta Exemplo segmentação de rastreamento e clique em DoSegmentation.m. Isto abrirá a janela de comando em MATLAB.
    2. Verifique a janela de Pasta atual à esquerda para ver todos os elementos na pasta de Exemplo de segmentação de rastreamento . Clique duas vezes em DoSegmentation.m.
      Nota: Informações detalhadas sobre as modificações que precisa ser feito no script podem ser encontradas no arquivo StepbyStep.txt. É obrigatório para modificar o script para que a variável filenameinput é NameFile.tif e folderinput é a pasta onde o arquivo. tif é contido.
    3. Execute o script (clicando no green botão executar ). O resultado da segmentação serão salvas como um file.mat (SegmentedNameFile.mat), enquanto a segmentação dos núcleos pode ser visualizada na figura a saída.
      Nota: Parâmetros para a segmentação, descrito no script, podem ser modificados, se necessário. A qualidade da segmentação pode ser verificada usando o script CheckSegmentation.m (consulte o arquivo de StepbyStep.txt). Com base nisso, se a qualidade da segmentação é pobre (apenas alguns núcleos detectados), ajustar os parâmetros da segmentação, claramente indicado no script DoSegmentation.m e repita o procedimento.
  7. Para gerar as faixas (ou seja, as trajetórias de cada um dos núcleos no tempo), usar as posições nucleares obtidos na segmentação, execute o script GenerateTracks.m na mesma pasta de trabalho. Não se esqueça de adicionar o arquivo segmentação apropriada como uma entrada, obtidos antes (Veja o arquivo StepbyStep.txt para mais informações).
    Nota: Como uma saída, o usuário irá obter um arquivo de TrackedNameFile.mat, com uma matriz para os x-coordenadas e outra matriz para o y-coordenadas das faixas geradas.
  8. Avaliar a qualidade das faixas usando CheckTracking.m (consulte o arquivo StepbyStep.txt para mais informações). Use a figura de saída desta última passagem para ajudar a visualizar cada posição de núcleos no tempo. Verifique no lado esquerdo para cruzes verdes que indicam cada núcleo segmentado. Para selecionar um núcleo específico, use a barra de rolagem inferior. Observe que o núcleo selecionado irá ser circulado em vermelho, enquanto à direita, a trajetória da célula selecionada pode ser seguida no tempo (usando a barra de rolagem superior).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Para seguir automaticamente o movimento nuclear durante a diferenciação de myoblast em imagens ao vivo, os núcleos devem preferencialmente ser fluorescente etiquetados. É importante notar que usar moléculas de DNA-intercalante não é viável porque estas moléculas interferem com a proliferação e diferenciação de mioblastos primária13. Como exemplo, proliferação e diferenciação foram analisados em mioblastos primários cultivados com ou sem Hoechst (Figura 1). É evidente que a proliferação (figura 1A, B) e diferenciação (Figura 1, painel do meio) são fortemente prejudicadas em mioblastos cultivados com Hoechst 33342. Inversamente, os mioblastos isolado de ratos H2B-GFP e cultivadas com doxiciclina têm núcleos com fluorescência verde e diferenciam-se da mesma forma que mioblastos isolados do selvagem-tipo ratos (painéis deFigura 1, direito e esquerdo, respectivamente).

Imagem de célula viva com mioblastos primários expressando a proteína GFP-H2B permite o acompanhamento dos núcleos durante a diferenciação (Figura 2 e 1 de vídeo suplementar). Fundiu-se imagens de transmissão e canais GFP na inicial (Figura 2A) e hora final pontos (Figura 2B) durante a diferenciação dos mioblastos H2B-GFP permitam aos cientistas identificar myotubes e, consequentemente, núcleos que acabam integrando um myotube (por exemplo, o núcleo do círculo azul) ou núcleos que não se fundem em um myotube (por exemplo, o núcleo do círculo vermelho).

Para extrair informações sobre movimentos de núcleos/célula a partir dos dados de imagens de células vivas, é possível usar o software fornecido para rastrear a trajetória dos núcleos. O software usa a imagem do canal H2B-GFP (núcleos; Figura 3A) para criar uma máscara e segmentar os núcleos em cada quadro. Para segmentação nuclear em um quadro, um limiar "conservador" é selecionado usando o método de Otsu na imagem após Gaussian Filtragem14. Em seguida, os objetos são mais ou menos segmentado; para obter uma melhor segmentação, cada objeto é mascarado novamente usando um limiar baseado na média em sua caixa delimitadora. Transformar uma bacia hidrográfica é usada para separar-se nas proximidades de objetos (Figura 3B). Em nossas mãos, uma transformação de bacias hidrográficas tem sido incapaz de separar a maioria dos núcleos nas proximidades (Figura 3B, * inserir). Assim, usamos a área para selecionar os objetos maiores na imagem e aplicar uma nova transformação de bacia hidrográfica (Figura 3B, * * baixo-relevo), que é capaz de separar adicionais nas proximidades de núcleos. Com esta abordagem, a maioria dos núcleos é identificada na imagem (Figura 3).

Para rastrear os núcleos, melhoramos as rotinas, incorporando as rotinas de acompanhamento, publicadas pela Tinevez15. Em suma, o algoritmo de rastreamento links núcleos detectados em quadros consecutivos com o objectivo de minimizar a soma das distâncias entre a posição de cada núcleo em um quadro e a posição do mesmo núcleo no próximo, usando o algoritmo"húngaro" para tal minimização de16. A etapa é repetida para vincular os núcleos desvinculados que são até um determinado número máximo de quadros fora. Também é fixado um limiar para a distância máxima entre a posição de um objeto em um quadro e o próximo. Para os dados aqui apresentados, um número máximo de cinco quadros e uma distância máxima de 20 pixels por passo dar um elevado número de faixas corretas (Figura 3D). Importante, podemos usar essas rotinas para verificar a qualidade do acompanhamento. Também é possível usar este script para localizar as células que têm um determinado comportamento, por exemplo, formando (ou não) um miofibras e posteriormente analisar os recursos dinâmicos do conjunto de células de interesse.

O software aplicado gera as faixas com o x-coordenadas e y para cada célula no quadro n, Equation 1 , por centenas de células (Figura 3D). Podemos usar essa informação para extrair informações sobre o movimento de núcleos. Como exemplo, o deslocamento total entre o frame inicial (n = 0) e o quadro final N é definido como segue.

Deslocamento de uma trajetória = | | Equation 2 ||

Aqui, "| | · | |" defende a norma do vetor (Figura 4A).

A velocidade de cada núcleo no quadro n é a seguinte.
Equation 3

Então, podemos definir o comprimento de uma trajetória para uma determinada célula como segue.

Comprimento da trajetória =Equation 4

Como um exemplo de como esses parâmetros simples já podem dar informações relevantes, nós calculado o comprimento de trajetórias de núcleos de mioblastos incubadas com ou sem Hoechst. Parece que o comprimento total das trajectórias é ligeiramente maior para células manchadas com a Hoechst, embora a diferença não é significativa (Figura 4B). No entanto, quando nós computado o deslocamento total durante um lapso de tempo, observamos que o deslocamento total de células coradas com Hoechst foi significativamente menor do que o das células imaculadas (Figura 4). Isto indica que o movimento de células coradas tem uma direcionalidade inferior. Para reforçar esta hipótese, nós quantificada a direção do movimento de uma célula calculando o ângulo da velocidade em cada quadro (Figura 4A).

Equation 5

Nós também quantificar a variação do ângulo entre os quadros.

Equation 6

A variação do ângulo total ao longo de uma trajetória pode então ser definida como segue.

Variação do ângulo total =Equation 7

Como previsto, a variação do ângulo total das células imaculado é significativamente menor em comparação com células coradas com Hoechst (Figura 4). Portanto, esta medida simples de direcionalidade, obtida a partir de cálculos simples, indica que os mioblastos manchados com Hoechst são menos propensos a manter a direção de seu deslocamento, o que reflete sua capacidade prejudicada na formação myotubes (Figura 1).

Em suma, dados de imagem de célula viva gerados conforme descrito aqui fornecem uma relação quantitativa entre nuclear dinâmica e a capacidade de forma myotubes e podem ser usados como entrada para uma caracterização quantitativa da elevado-produção de dinâmica nuclear e myoblast comportamento durante a diferenciação e fusão.

Figure 1
Figura 1: incubação com Hoechst interfere com a proliferação e diferenciação dos mioblastos. (A) imagens representativas de mioblastos primários manchado com Hoechst após 24 h no meio de proliferação (painel esquerdo) ou cultivadas por 24 h no meio de proliferação com Hoechst (painel direito) e (B) a quantificação relativa. Os dados são da média ± SEM, e a significância estatística foi avaliada com Student t-teste. P < 0,05. (C) imagens representativas de mioblastos primárias de tipo selvagem, cultivadas por 24 h em diferenciar meio sem (painel esquerdo) ou com a Hoechst (painel central) e de mioblastos H2B-GFP cultivadas por 24 h em diferenciar médio (painel direito) e manchado com a Hoechst (azul) e um anticorpo antimiosina de cadeia pesada (MyHC; vermelho). As barras de escala = 500 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: viver de imagem de H2B-GFP mioblastos durante a diferenciação. Canais de imagens mescladas de transmissão e GFP no (A) a inicial (t = 0 h) e (B) pontos de tempo final (t = 16 h) durante a diferenciação dos mioblastos H2B-GFP (objetivo de x 20). Alguns exemplos de myotubes são realçados com setas pretas no painel B. As barras de escala = 50 µm. (C) Magnified pontilhada áreas de painéis A e B , no qual é possível identificar um núcleo único que acaba de integrar em um myotube (em azul) ou não (em vermelho) em t = 0 h, t = 8 h e t < / C12 > = 16 h. As barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: segmentação de mioblastos H2B-GFP rastreamento durante a diferenciação. (A) exemplo de um quadro dos lapsos de tempo mostrando os núcleos de aproximadamente 400 células. (B) exemplo de núcleos mascaramento e segmentação. Objetos brilhantes são segmentados usando uma global e um limiar local, e uma transformação de bacias hidrográficas é aplicada para separar-se nas proximidades de núcleos. Núcleos nas proximidades podem ser difíceis de segmento (* inset), então uma segunda segmentação baseada em bacias hidrográficas é executada em objetos de grandes áreas para segmentar um maior número de núcleos (* * inserir). (C) detectado posições nucleares (cruzes vermelhas), que são posteriormente usado no algoritmo de rastreamento. (D) faixas geradas usando o algoritmo de rastreamento que minimiza a soma das distâncias entre a posição de cada objeto em dois quadros consecutivos. Um valor máximo possível de uma distância tão grande para cada objeto é fornecido como uma entrada que permite aos cientistas vincular núcleos separados por mais de um quadro. As barras de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: análises quantitativas da dinâmica de núcleos de descobrir a capacidade prejudicada de mioblastos incubadas com Hoechst manter direcionalidade celular. (A) Descrição das medições de parâmetro. É possível definir a velocidade de um núcleo, considerando a posição em dois quadros consecutivos. O ângulo de trajetória e a variação do ângulo podem então facilmente calculados a partir das posições conforme indicado no esquema. (B) distribuição do comprimento de trajetórias, deslocamento total (C) e (D) variação do ângulo de trajetórias de mioblastos incubado sem Hoechst (linha verde) ou com a Hoechst (linha azul). As duas distribuições não são significativamente diferentes, enquanto o deslocamento total é significativamente maior, e a variação do ângulo é significativamente mais baixa para células imaculadas (teste de Kolmogorov-Smirnov unilateral, *p < 0,05 e * *p < 0.005). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Complementar Video 1: viver de imagem de H2B-GFP mioblastos durante a diferenciação. Imagem de mioblastos H2B-GFP cultivados em diferenciar médio da inicial (t = 0 h) para pontos de tempo final (t = 16 h) usando transmissão e canais GFP (objetivo de x 20). Clique aqui para baixar este arquivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fibras musculares (myofibers) são células multinucleadas que são formadas pela fusão de células precursoras de músculo (mioblastos) derivada de células-tronco musculares (células satélites) que se submetem a proliferação e diferenciação2,3, 4. Para avaliar a diferenciação de myoblast, o procedimento comum consiste de cultivo mioblastos em diferenciar médio e fixação das células em pontos de tempo diferentes para realizar a mancha para MyHC, um marcador de diferenciação e coloração de núcleos com DNA-intercalante de moléculas (por exemplo, Hoechst)5. Este método é útil para avaliar a diferenciação myoblast medindo parâmetros diferentes, tais como o índice de diferenciação (número de número de celular de células/total MyHC-positivo) ou o índice de fusão (número de myotubes pelo menos dois núcleos/célula número total) . No entanto, myoblast fusão e formação de myotube são processos altamente dinâmicos que contam com a motilidade do8núcleos. Com efeito, posicionamento nuclear dentro de myofibers é necessária para a regeneração muscular adequada e função17. A mobilidade dos mioblastos e de seus núcleos pode tornar-se um parâmetro fundamental para avaliar a diferenciação de myoblast e descobrir novos defeitos em distúrbios musculares. Portanto, é essencial para desenvolver novos procedimentos para estudar o comportamento da célula e movimento nuclear durante a diferenciação de myoblast e formação de miofibras.

Aqui, descrevemos um método que permite aos cientistas a seguir a formação de diferenciação e myotube myoblast por imagens de células vivas e para realizar análises quantitativas do rastreamento automático de núcleos. A vantagem desse método é a possibilidade de rastrear durante a diferenciação dos núcleos fluorescentes de mioblastos, isolados de ratos H2B-GFP, sem qualquer transfection da pilha ou coloração adicional. Os H2B-GFP ratos são comercialmente disponíveis e, consequentemente, facilmente acessível. Como alternativa, é possível isolar os mioblastos de outros ratos transgénicos que expressam uma proteína fluorescente no núcleo ou ao transfect as células isoladas de ratos do selvagem-tipo de expressar uma proteína fluorescente no núcleo, como descrito anteriormente9 . Estas diferentes opções mais estendem as aplicações potenciais do método aqui apresentado.

O protocolo atual baseia-se na cultura de mioblastos primárias, e consequentemente, uma alta variabilidade pode ser observada nos procedimentos a seguir experimentais, também devido à presença de potencial de células nonmyogenic após o isolamento de músculos18 . Para contornar essa limitação, é possível isolar mioblastos por célula de triagem como descrito anteriormente,19. Outro ponto crítico no método descrito aqui é a dificuldade para gerar um controle perfeito de núcleos quando as células são próximos uns dos outros, tais como durante a formação de myotube. No entanto, as rotinas de software discutidas aqui permitir que cientistas inspecionar visualmente a qualidade de acompanhamento e, se necessário, para selecionar um subconjunto de células de interesse para uma análise posterior. Aperfeiçoamento do software pode ser necessário fornecer uma caracterização completa da dinâmica nuclear durante a formação de miofibras.

Em conclusão, este método é útil para fornecer visão quantitativa dinâmicas de núcleos durante a diferenciação de myoblast, comparando as diferentes condições, como já relatado, com incubação de Hoechst. Este exemplo ilustra a capacidade de extrair dados dinâmicos significativos de experiências de lapso de tempo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pela AFM-Teleton para E.V. (#21545) e pela Ospedale San Raffaele (OSR) semente subvenção para S.Z. (ZAMBRA5X1000). Dr. Jean-Yves Tinevez do centro de análise de imagem do Institut Pasteur é reconhecido por compartilhar publicamente suas rotinas MATLAB "Simples Tracker".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
chicken embryos extract Seralab CE-650-J
collagenase Sigma C9263-1G 125units/mg
collagen from calf skin Sigma C8919
dispase Gibco 17105-041 1.78 units/mg
doxyciclin Sigma D1515
DMEM Sigma D5671
fetal bovine serum Life technologies 10270106
gentamicin Sigma G1397
Horse serum Invitrogen 16050-098
Hoechst life technologies 33342
IMDM Sigma I3390
L-glutamine Sigma G7513
Matrigel Corning 356231
penicillin-streptomycin Sigma P0781
red blood cells lysis medium Biolegend 420301
Digestion medium
collagenase 40 mg
dispase 70 mg
PBS 20 ml
filtered 0.22um
Blocking medium
DMEM
Fetal bovine serum 10%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
filtered 0.22um
proliferation medium
IMDM
Fetal bovine serum 20%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 3%
filtered 0.22um
differentiation medium
IMDM
Horse serum 2%
L-glutammine 1%
penicillin-streptomycin 1%
gentamicin 1 ‰
chichen embryo extract 1%
filtered 0.22um

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z. M., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. Journal of Applied physiology. 89, (1), 81-88 (2000).
  2. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224, (1), 7-16 (2010).
  3. Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO reports. 14, (12), 1062-1072 (2013).
  4. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  5. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (86), e50846 (2014).
  6. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (73), e50074 (2013).
  7. Soriano-Arroquia, A., Clegg, P. D., Molloy, A. P., Goljanek-Whysall, K. Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans. Journal of Visualized Experiments. (120), e55047 (2017).
  8. Roman, W., Gomes, E. R. Nuclear positioning in skeletal muscle. Seminars in Cell & Developmental Biology. (2017).
  9. Pimentel, M. R., Falcone, S., Cadot, B., Gomes, E. R. In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging. Journal of Visualized Experiments. (119), e55141 (2017).
  10. Foudi, A., et al. Analysis of histone 2B-GFP retention reveals slowly cycling hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 27, (1), 84-90 (2009).
  11. Tirone, M., et al. High mobility group box 1 orchestrates tissue regeneration via CXCR4. The Journal of Experimental Medicine. 215, (1), 303-318 (2018).
  12. Zambrano, S., De Toma, I., Piffer, A., Bianchi, M. E., Agresti, A. NF-kappaB oscillations translate into functionally related patterns of gene expression. eLife. 5, e09100 (2016).
  13. Adamski, D., et al. Effects of Hoechst 33342 on C2C12 and PC12 cell differentiation. FEBS Letters. 581, (16), 3076-3080 (2007).
  14. Otsu, N. A Threshold Selection Method from Gray-Level Histograms. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9, (1), 62-66 (1979).
  15. Tinevez, J. -Y. Simpel Tracker - File Exchange - MATLAB Central. Available from: https://it.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34040-simple-tracker (2016).
  16. Burkard, R., Dell'Amico, M., Martello, S. Assignment Problems, Revised Reprint. SIAM. (2009).
  17. Falcone, S., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Molecular Medicine. 6, (11), 1455-1475 (2014).
  18. Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. Isolation and Purification of Satellite Cells for Skeletal Muscle Tissue Engineering. Journal of Regenerative Medicine. 3, (2), (2014).
  19. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10, (10), 1612-1624 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics