Isolering, rensning og differentiering af Osteoklastprækursorer fra rotte knoglemarv

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Osteoklaster er vævsspecifikke makrofag polykaryoner afledt af monocyte-makrofag-Lineage af hæmatopoietiske stamceller. Denne protokol beskriver, hvordan man isolerer knoglemarvsceller, så der opnås store mængder osteoklaster, samtidig med at risikoen for ulykker, der findes i traditionelle metoder, mindskes.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wang, L., Zheng, S., Guo, Y., Pan, Y., Sun, J., Xu, W., Lu, J., Li, W., Ma, Y. Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow. J. Vis. Exp. (147), e58895, doi:10.3791/58895 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Osteoklaster er store, fler umægede og knogle resorberende celler i monocyte-makrofag-Lineage, der dannes ved fusion af monocytter eller makrofag-prækursorer. Overdreven knogleresorption er en af de mest betydningsfulde cellulære mekanismer, der fører til osteolytiske sygdomme, herunder osteoporose, periodontitis og periprostetisk osteolyse. De vigtigste fysiologiske funktion af osteoklaster er at absorbere både hydroxyapatit mineral komponent og den organiske matrix af knogle, genererer den karakteristiske resorption udseende på overfladen af knogler. Der er relativt få osteoklaster sammenlignet med andre celler i kroppen, især i voksne knogler. Nylige undersøgelser har fokuseret på, hvordan man får mere modne osteoklaster på mindre tid, hvilket altid har været et problem. Flere forbedringer i isolation og kultur teknikker har udviklet sig i laboratorier for at opnå mere modne osteoklaster. Her introducerer vi en metode, der isolerer knoglemarv på mindre tid og med mindre indsats i forhold til den traditionelle procedure, ved hjælp af en særlig og enkel anordning. Med brugen af densitets gradient centrifugering, vi får store mængder af fuldt differentierede osteoklaster fra rotte knoglemarv, som er identificeret ved klassiske metoder.

Introduction

Knogle homøostase er en kompleks fysiologisk proces, der reguleres af knogle resorbing osteoklaster og knogledannende osteoblaster1. En balance mellem osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet medieret gennem osteoblaster og osteoklaster, henholdsvis, er meget vigtigt for at opretholde knogle sundhed og homøostase, fordi forstyrrelser i knogle homøostase kan føre til knoglesygdomme, såsom som unormal knoglevækst eller tab af knogletæthed. Som unikke knogleresorption celler, osteoklaster er vigtige i sygdomme relateret til unormal knogle ødelæggelse, herunder osteoporose, periodontitis, og periprosthetic osteolyse2,3.

Udviklingen af en osteoklast kultur er hovedsageligt opdelt i to etaper. De metoder, der blev fastlagt af Boyde et al.4 og Chambers et al.5 , bestod af første etape i 1980 ' erne. De opnåede relativt rigelige osteoklaster fra knoglerne hos nyfødte dyr, som er den hurtige remodeling periode. Osteoklaster frigives ved at fragmentere og omrøre knoglerne i et særligt medium. Men, cellerne opnået ved denne metode er lav i mængde og renhed. Den anden fase var udviklingen af langtrækkende kulturer af osteoklast dannelse, ved hjælp af hæmatopoietiske Lineage celler afledt af knoglemarv6. Cytokiner, såsom 1α, 25-dihydroxyvitamin D3, prostaglandin E2 (PGE-2) og parathyreoideahormon (pth), som tilsættes til dyrkningsmediet, virker gennem systemet af osteoblaster/stromale celler for at stimulere osteoklast-dannelsen på7,8 . Den renhed og mængde af osteoklaster, der opnås ved denne metode, kan imidlertid ikke opfylde behovene i forbindelse med moderne molekylær biologi forskning. Derefter, opdagelsen af makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator for nuklear faktor-κb ligand (rankl) gøre osteoclastogenesis lettere9,10,11, og metoden til at bruge M-CSF og RANKL til direkte at stimulere osteoklast dannelse er almindeligt anvendt rundt om i verden. Der er dog stadig nogle detaljer i den metodologi, der skal forbedres.

I øjeblikket kræver den hyppigst anvendte osteoklast kultur metode, som beskrevet af Marino et al.12 og Pei et al.13, ofte fjernelse af det omgivende væv omkring knoglen og bruger en steriliseret nål til at skylle knoglemarv hulrummet med afsluttede medier. Der er nogle ulemper ved denne proces, herunder det faktum, at (1) fjernelsen af det omgivende væv omkring knoglen kræver meget tid og stor kirurgisk teknik, (2) knoglerne er skrøbelige og kan føre til knoglemarv udstrømning, (3) knoglemarvs hulen kan være for lille til at skylle, og (4) der er risiko for nålestikskade. For at undgå disse problemer centrifugeres de rør, der indeholder knoglerne til knoglemarv, i stedet for nåle skylning af knoglemarven. Her introducerer vi en stabil og sikker metode, der isolerer knoglemarv på mindre tid og med mindre indsats i forhold til den traditionelle procedure. Sammen med brugen af densitets gradient centrifugering, vi får store mængder af fuldt differentierede osteoklaster in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle de metoder, der involverer de dyr, der er beskrevet her, er godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Nanjing University of Chinese Medicine.

1. opsætning af

  1. Der tilberedes flere længde-og udskåret 1 mL pipettespidser (1 cm) og flere 1,5 mL mikrocentrifugerings glas. Sæt pipette spidserne og mikrocentrifugerings rørene på 103 kPa og 121 °C i 20 minutter, og sørg for, at de er sterile.
  2. Forbered en æske med is og flere sterile retter for at bevare det isolerede væv under isolations proceduren.

2. forberedelse af kultur medium

  1. Forbered det komplette dyrkningsmedium. Brug minimum alfanumerisk medium Alpha (α-MEM), der indeholder en endelig opløsning på 1% penicillin/streptomycin og 10% føtale kvægserum (FBS).
  2. Filtrer mediet fra trin 2,1 ved hjælp af et 0,22 μm-filter.
  3. Forbered knoglemarv induktions mediet. For 50 mL af opløsningen tilsættes 125 μL M-CSF ved en koncentration på 10.000 ng/mL (tabel over materialer) til 49,875 ml komplet dyrkningsmedium (fra trin 2,2) for at opnå en endelig opløsning på 25 ng/ml M-CSF.
  4. Forbered osteoklast induktions mediet. For 50 mL af opløsningen tilsættes 500 μL RANKL i en koncentration på 10.000 ng/mL (tabel over materialer) til 49,5 ml knoglemarvs induktions medium (fra trin 2,3) for at lave en endelig opløsning på 25 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml rankl.

3. isolering af knogle-Mmarv-afledte celler

  1. Eutanasi
    1. Euthanize fire Sprague Dawley rotter ved CO2 indånding efterfulgt af cervikal dislokation, og Fordyb dem i 75% ethanol i 1 min.
      Bemærk: Sørg for, at dyrene er af samme køn og i en tilsvarende alder. Dyr, der er 2 til 3 uger gamle anbefales. To rotter er forberedt til centrifugal metoden, mens de to andre er for den traditionelle metode.
  2. Traditionel metode
    1. Anbring dyrene på et desinficerende bræt i en liggende position. Lav en lille indsnit (ca. 1 cm) ved den proximale femur at skrælle huden, ved hjælp af steril saks.
    2. Dissekere lårben og tibias. Skær de bilaterale tilslutnings dele rundt om hofte, knæ og ankel samlinger for at isolere skinneben og lårben forsigtigt og forsigtigt. Skær en del af vævet rundt om knoglen af. være grundige. Undgå at fraktur skinneben og lårben under hele processen.
    3. Sæt de rengjorte knogler i en skål med 5 mL af det komplette dyrkningsmedium. Skær den lange knogle af med en steril saks, og brug en 1 mL sprøjte kanyle til at skylle knoglemarven forsigtigt med 10 mL af det komplette medie, indtil marv hulen bliver hvid.
    4. Cellesuspensionen overføres fra trin 3.2.3 til et 50 ml rør, og derefter filtreres den med en 70 μm si for at fjerne det resterende væv.
    5. Tilsæt 5 mL røde blodlegemer lysis buffer (tabel af materialer) til cellesuspensionen. Cellerne inkuieres i 8 minutter på is. Derefter centrifugeres cellerne ved 250 x g i 5 minutter for at give celle pellet.
    6. Aspirer fra mediet, og resuspender cellerne i 10 mL af hele mediet. Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer og Beregn den tid, der er brugt på trinene fra dette afsnit (afsnit 3,2).
  3. Forbedret metode
    1. Anbring dyrene på et desinficerende bræt i en liggende position. Lav en lille indsnit (ca. 1 cm) ved den proximale femur med steril saks til at skrælle huden.
    2. Dissekere lårben og tibias. Korrekt afskåret den del af vævet omkring knoglen (ingen grund til at fjerne helt). Undgå at fraktur skinneben og lårben under hele processen.
    3. Skyl skinneben og lårben med 12 ml fosfat-bufferet saltvand (PBS) og skær dem i halve. Skinneben og lårben anbringes i en 1 ml pipettespids (fra trin 1,1), som derefter anbringes i et mikrocentrifuge glas og centrifugeres 3x ved 1.000 x g i 45 s ved 4 °c.
    4. Efter centrifugering fjernes pipettespidsen, der indeholder knoglen, og knoglemarven lades i røret. Der tilsættes 200 μL af det komplette medie til mikrocentrifuge røret og gentages pipettering for at opløse knoglemarven grundigt.
    5. Overfør cellesuspensionen fra trin 3.3.4 til et 50 ml-rør, og Filtrer den derefter med en 70 μm-si for at fjerne det resterende væv.
    6. Tæl cellerne ved hjælp af et hemocytometer, og Beregn den tid, der er brugt på trinene fra dette afsnit (afsnit 3,3).

4. rensning ved tæthed gradient centrifugering

  1. Juster cellesuspensionen fra trin 3.2.6 eller trin 3.3.5 til 2 mL med α-MEM.
  2. Forbered et sterilt, silicificeret centrifugal rør og tilsæt 8 mL af celle separations opløsningen (tabel over materialer) til røret.
  3. Føj cellesuspensionen fra trin 4,1 til celle separations opløsningen. Overhold pipettespidsen til den indvendige overflade af røret og holde en 45 ° til den indvendige overflade. Når suspensionen er tilføjet, vil der blive vist en klar grænse mellem cellernes lag og separations opløsningen.
    Bemærk: Operationen kræver stor omhu og skal udføres langsomt.
  4. Den lagdelte opløsning centrifugeres i en vandret centrifuge ved 500 x g i 30 min. Efter centrifugering Aspirer det overskyede andet lag, som indeholder målcellerne, fra top til bund.
    Bemærk: Centrifugeringen og Decelerationen annulleres før centrifugering. Der er seks lag efter centrifugering; det første lag er fortyndingsmiddel lag, det andet lag er monocytter lag, det tredje lag er det lag af mononukleære celler, det fjerde lag er den transparente separation flydende et lag, den femte er den granulerede cellelag, og det sjette lag er den røde celle Lag.
  5. Overfør målcellerne til et nyt rør. Tilsæt 5 mL PBS til vask af cellerne 3x. Efter hver vask centrifugeres målcellerne ved 250 x g i 5 min. for at give celle pillen.
  6. Resuspender celle pellet med knoglemarv induktion medium og tælle cellerne ved hjælp af en hemocytometer. Der tilsættes 5 – 8 mL knoglemarvs induktions medium fra trin 2,3 for at opnå en endelig celle opløsning på 300.000 celler/mL. Der tilsættes 1 mL til hver brønd af en 24-brønd plade.

5. kultur og differentiering

  1. Efter inkuering af cellerne ved 37 °C i 24 timer, aspirerer forsigtigt mediet og tilsæt 1 mL af det osteoksidste induktions medium til hver brønd. Omrystes forsigtigt pladen, og den sættes i en inkubator ved 37 °C.
  2. Skift osteoklast induktions medium hver 48 h. Mens du gør det, skal du ændre 0,8 mL af mediet i brønden og omryste pladen forsigtigt.
    Bemærk: Store, motile og fler kantede osteoklaster skal observeres i brønden under et inverteret mikroskop, typisk omkring dag 4-6.

6. tartrat-resistent syre fosfatase farvning

Bemærk: Multi-cleate osteoklaster vil være til stede efter 4 – 6 dage, hvis induktionen (punkt 5) er vellykket.

  1. Den fiksativ opløsning tilberedes ved at kombinere 4 ml 37% formaldehyd, 32,5 ml acetone og 12,5 ml af en citrat opløsning. Den fikative opløsning opbevares ved 4 °C.
  2. Forbered tartrat-resistent syre fosfatase (TRAP)-plet opløsning (tabel over materialer) ved tilsætning af 50 μl natriumnitrit, 50 μl fast Garnet GBC base opløsning, 50 μl naphthol as-bi fosfat opløsning, 200 μl acetat opløsning og 100 μl tartrat opløsning i 4,55 mL afioniseret vand, der er forvarmet til 37 °C. Derefter blandes forsigtigt ved inversion i 1 min, og lad det stå i 2 min.
  3. Efter vellykket induktion af osteoklaster, Aspirér fra mediet, og vask forsigtigt brøndene 3x med PBS.
  4. Bring den fiksativ opløsning til stuetemperatur (RT). Tilsæt 2 mL fikativ opløsning til brøndene i 30 s, og lad ikke cellerne tørre.
  5. Aspirér den fikserede opløsning, vask den forsigtigt 3x med deioniseret vand, der er forvarmet til 37 °C, og udsug derefter vandet.
  6. Der tilsættes 2 mL TRAP-bejdsning i 1 time ved 37 °C, og prøven opbevares i mørke.
  7. Efter 1 h, Aspirér pletten, og vask forsigtigt prøven med deioniseret vand, der er forvarmet til 37 °C, og udsug derefter vandet.
  8. Counterstain cellerne i 1 min i en hematoxylinlegemer opløsning. Efter farvning, Aspirér hæmatooxylin opløsningen og vask forsigtigt cellerne 3x med deioniseret vand.
  9. Billede osteoklaster ved hjælp af lysfelt mikroskopi, og Trap+ celler med tre eller flere kerner vil blive vist lilla.

7. knogleresorption analyse ved hjælp af toluidin blå farvning

  1. Forbehandling af knogle skiver
    1. Skær den friske bovin femoral knogle cortex i 2 cm tykke skiver langs længdeaksen ved mikroelektrisk sav. Derefter klippe og male skiver med hårde væv kværne i 80 μm.
    2. Udvasknings skiver vaskes i et bægerglas med deioniseret vand og 100 Hz ultralyd i 1 time og Gentag 3x.
    3. Lad udsnittene fordybe sig i 75% alkohol i 2 timer. Derefter aspirerer alkoholen og udsætter hver side af skiver til ultraviolet lys for 1 h på en ren platform.
    4. Før plantning af cellerne, Fordyb udsnittene i dyrkningsmediet i mindst 2 timer.
  2. Toluidin blå farvning
    1. Anbring de forbehandlede knogle skiver i 24-brøndens plade. Plant cellerne som nævnt i trin 4,6 og inducerer cellerne som nævnt i afsnit 5.
    2. Efter fremkomsten af osteoklaster (efter 4 – 6 dage), vask skiver med 1 mL 0,25 M ammoniumhydroxid, og sonider dem 3x for 5 min hver til at fjerne de levende celler for at tillade analyse af resorption Gruber på knogle skiver. Fjern derefter ammoniumhydroxid og pletten skiver med 1 mL 1% (WT/vol) toluidin blå opløsning pr. skive i 2 min.
    3. Vask skiver med PBS. Tilfældigt vælge fem visninger og udføre en semikvantitativ analyse af resorption området ved hjælp af en billedanalyse software.

8. scanning af elektronmikroskopi

  1. Knogle skiverne fra trin 7.2.1 forstaveres med 1 mL 2,5% glutaraldehyd pr. skive i 2 timer ved RT, og derefter soniserer du skiver 3x i 3 min hver med 1 M ammoniumhydroxid for at fjerne cellerne og fjerne ammoniumhydroxid.
  2. Vask knogle skiver 3x i 12 min hver med PBS.
  3. Fastgør knogle skiver med 1% osmic syre i 2 timer ved RT.
  4. Udfør ethanol gradient dehydrering, med 50%, 70%, 80%, 90%, og 95% ethanol, for 15 min for hver gradient, og derefter udskifte ethanol med isoamylacetat i 15 min.
  5. Coat skiver med guld Palladium, og derefter analysere ved scanning elektronmikroskopi.

9. immunofluorescens farvning af calcitonin receptor

Bemærk: Multi-cleate osteoklaster vil være til stede efter 4-6 dage, hvis induktionen er vellykket (afsnit 5).

  1. Aspirér fra mediet og vask forsigtigt brønden 3x med PBS.
  2. Cellerne fastsættes til 10 min med 4% PARAFORMALDEHYD, som er forkølet til 4 °C.
  3. Der tilsættes 1 mL PBS med 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof pr. brønd i 30 minutter på is. Derefter, aspirere fra PBS med 0,3% nonioniske overfladeaktive stof og tilsæt 1 mL PBS med 5% FBS pr brønd for 30 min på is.
  4. Der aspireres fra PBS, og membraner med anti-calcitonin receptor (anti-CTR) ved en 1:100 fortynding i PBS ved 4 °C om natten.
  5. Udsug opløsningen, og inkube membranerne med Alexa-488-konjugeret anti-kanin IgG antistoffer ved en 1:1000 fortynding i PBS i 1 time ved RT.
  6. Aspirér opløsningen, og vask forsigtigt cellerne 3x med PBS. Counterstain kerner med Hoechst 33342 plet i 3 min ved RT.
  7. Aspirér opløsningen, og vask forsigtigt cellerne 3x med PBS. Vær opmærksom på intensiteten af CTR ved Fluorescens mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Formålet med protokollen var at isolere og rense et stort antal osteoklast prækursorer bekvemt og inducere osteoklaster med succes. Ved at supplere med M-CSF og RANKL, blev gigantiske osteoklaster set på dag 5 – 6. Dannelsen af osteoklaster blev med held identificeret ved TRAP-farvning (figur 1a). Store og lilla celler blev betragtet som TRAP-positive celler med flere kerner (typisk ≥ tre kerner). Gennem denne metode, det var typisk at opnå 800 osteoklaster, der indeholder så mange som 30 kerner pr osteoklast, i en 24-brønd plade (figur 1b). Sammenlignet med den traditionelle metode reddede den forbedrede metode ca. 20 min i hele isolations forløbet (figur 1c).

Brug af knogle skiver til at vurdere aktiviteten af knogleresorption er typisk in vitro-metode. Gennem toluidin blå farvning, blev resorption området visualiseret som lysegrøn (figur 2a) og blev beregnet. Knogle hulens struktur og karakteristika blev tydeligt observeret ved scanning af elektronmikroskopi (figur 2b).

CTR, en af de osteoklast-specifikke celle markører, er afgørende for at identificere osteoklaster og studere dannelsen af osteoklaster i knogle. Det positive udtryk for CTR identificerer tydeligt osteoklaster og adskiller dem fra makrofag-polykaryoner. CTR blev detekteret ved immunofluorescens assays. Den grønne farve indikerede et udtryk for CTR, og den blå indikerede kerner (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Osteoklastogenese fra knoglemarv-afledte celler. A) repræsentativt billede af Trap-farvningen. Den lysfelt Mikrograf ved 10x forstørrelse demonstrerer flere gigantiske, fler kantede osteoklaster, der er Trap-positive og blev observeret ved 20x forstørrelse. En rød pil viser et eksempel på en kerne i en multi poleret osteoklast. (B) den lysfelt Mikrograf ved 10x forstørrelse viser, at et stort antal Trap-positive osteoklaster var til stede. Et eksempel på en stor, multinukleeret osteoklast er skitseret af den røde stiplede linje. C) sammenligning af den tid, der er brugt på de to isolations metoder. Alle operationer blev udført af den samme gruppe af experimenters. Dataene repræsenterer middel ± standardafvigelsen. * P < 0,05, n = 3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: knogleresorption analyser af knogle skiver. (A) den lysfelt Mikrograf ved 4X forstørrelse demonstrerer knogleresorption område, er farvet lys grøn af toluidin blå bejdsen, og er rund-, oval-, eller pølse-formet. Et eksempel på knogleresorption område er vist ved den røde pil. (B) resorption Gruber observeret med scanning elektronmikroskopi ved 500x forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: karakterisering af CTR-udtrykket i osteoklaster ved hjælp af immunofluorescens farvning. Panelet viser et klart CTR-signal omkring cellerne. (A) CTR-positive celler. B) kerner. (C) fusioneret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til at opnå og studere osteoklaster in vitro er en kritisk og grundlæggende færdighed for enhver forsker, der ønsker at studere knogle metabolisme, som kan hjælpe med at forstå mekanismerne i knogle absorberende sygdomme og udvikle nye terapeutiske midler. Den foreliggende undersøgelse beskrev en protokol med nogle ændringer baseret på tidligere metoder.

Ved at bruge pipettespidser og mikrocentrifugerings slanger til at opnå knoglemarv reducerede det i høj grad operationstiden for opnåelse af knoglemarv og laboratoriepersonalets arbejdsbyrde i forhold til de traditionelle metoder. I mellemtiden undgår metoden risikoen for knoglemarvs tab eller nålestikskade. I en tidligere undersøgelse blev knoglemarv-afledte celler belagt umiddelbart efter isolation12,13. Densitet gradient centrifugering blev brugt til at vælge knoglemarvs monocytter i henhold til forskellene i udligningskoefficienterne. I processen med tæthed gradient centrifugering, tilsætning af celle adskillelse medier skal udføres forsigtigt og forsigtigt langs væggen, for at gøre grænserne klar. Teknikken er imidlertid begrænset af Centrifugerings funktionen og af, om den er sat op med parametrene acceleration og deceleration. Såning tæthed er den vigtigste betingelse for dyrkning af osteoklaster. Flere gange, protokollen mislykkedes på grund af en forkert Seedning tæthed, når plating cellerne. Således, ca 300.000 celler pr 24-brønd plade godt anbefales i denne protokol. Denne protokol er også velegnet til at opnå forskellige former for knoglemarv-afledte celler i rotter eller andre dyr (f. eks. mus, kanin og kylling).

Den mest klassiske metode til at evaluere aktiviteten af osteoklaster er resorption pit assay. Bovin knogle cortex er almindeligt anvendt til resorption pit assay, fordi dens kilder er bredt tilgængelige. Ved hjælp af et moderne skæresystem kan vi lettere få tynde knogle skiver. Resorption pit assay har tre faktorer. For at opnå en vellykket resorption pit i skiver, skal udsnittene behandles strengt som beskrevet for affedt ting i protokollen. Desuden aktiveres rotte osteoklaster for at danne resorption Gruber i et let surt miljø, og resorption funktionen vil i det væsentlige "lukke", når pH går op over 7,214,15. Det er således bemærkelsesværdigt, at åbningen af inkubator døren hyppigt under forløbet af eksperimenterne kan føre til forstyrrelser af pH-og pCO2 -værdierne, selv påvirke osteoklaster16's resorption funktion. Endelig bør knogle skiver forblive i bunden af brøndene og bør ikke flyttes eller flyde op, når du skifter medium, for at undgå irritation.

CTR er et medlem af klasse II-under familien til de 7-transmembran G-protein-koblede receptorer, der også indeholder parathyreoideahormon og udskilning af receptorer17. Ud over TRAP-farvning og resorption pit-analysen identificeres osteoklaster ved morfologi og funktion, og CTR-positive identificerer osteoklaster i immunologi. Nu kan vi også bruge fluorescerende farvning af aktin ringen og måle pyridinolin Crosslinks i supernatanten at identificere osteoklaster.

Selv om forskellige forskere har forskellige familiaritet med eksperimentelle teknikker og den samlede mængde af celler i knoglemarv er sikker, vi opnåede knoglemarvsceller i en kortere tid, relativt, og i sidste ende, opnået store mængder af fuldt differentierede osteoklaster fra rotte knoglemarvs marv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (81473692) til Yong ma. Forfatterne takker alle ansatte i Medical Research Center i det første kollegium af klinisk medicin i Nanjing Universitet for kinesisk medicin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Automatic Hard Tissue Slicer Lecia RM2265
Bovine femoral bone Purchased by ourselves
Cell Incubator Heraus BB16/BB5060
Fetal Bovine Serum Sarana s-fbs-au-015
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150077
Hard Tissue Grinders Lecia SP-2600
Histopaque Kit TianJing Haoyang TBD2013DR Silicified centrifugal tube amd cell separation solution
Hochest33342 Sigma-Aldrich B2261
Inverted Phase Contrast Microscope Olympus CKX31
Inverted Fluorescence Microscope Lecia DMI-3000
MEM, no Glutamine Gibco 11090-081
Penicillin-Streptomycin, Liquid Gibco 15140122
Rabbit Anti-Calcitonin receptor Bioss bs-0124R
Recombinant Rat M-CSF PeproTech 400-28
Recombinant Rat sRANK Ligand PeproTech 400-30
Red Blood Cell Lysis Buffer Absin abs47014932
Scanning Electron Microscopy FEI Quanta 200
Toluidine Blue Sigma-Aldrich 89649

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Kular, J., Tickner, J., Chim, S. M., Xu, J. K. An overview of the regulation of bone remodelling at the cellular level. Clinical Biochemistry. 45, (12), 863-873 (2012).
  3. Park, S. J., et al. Apoptosis of the reduced enamel epithelium and its implications for bone resorption during tooth eruption. Journal Of Molecular Histology. 44, (1), 65-73 (2013).
  4. Boyde, A., Ali, N. N., Jones, S. J. Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. British Dental Journal. 156, (6), 216-220 (1984).
  5. Chambers, T. J., Revell, P. A., Fuller, K., Athanasou, N. A. Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. Journal of Cell Science. 66, 383-399 (1984).
  6. Takahashi, N., et al. Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouse bone marrow cultures. Endocrinology. 122, (4), 1373-1382 (1988).
  7. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, (5), 2600-2602 (1988).
  8. Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine Reviews. 13, (1), 66-80 (1992).
  9. Yoshida, H., et al. The murine mutation osteopetrosis is in the coding region of the macrophage colony stimulating factor gene. Nature. 345, (6274), 442-444 (1990).
  10. Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America. 95, (7), 3597-3602 (1998).
  11. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  12. Marino, S., Logan, J. G., Mellis, D., Capulli, M. Generation and culture of osteoclasts. BoneKEy Reports. 3, 570 (2014).
  13. Pei, J. R., et al. Fluoride decreased osteoclastic bone resorption through the inhibition of NFATc1 gene expression. Environmental Toxicology. 29, (5), 588-595 (2014).
  14. Arnett, T. R., Dempster, D. W. Effect of pH on bone resorption by rat osteoclasts in vitro. Endocrinology. 119, (1), 119-124 (1986).
  15. Arnett, T. R., et al. Hypoxia is a major stimulator of osteoclast formation and bone resorption. Journal of Cellular Physiology. 196, (1), 2-8 (2003).
  16. Orriss, I. R., Arnett, T. R. Rodent osteoclast cultures. Methods in Molecular Biology. 816, 103-117 (2012).
  17. Quinn, J. M., et al. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. Bone. 25, (1), 1-8 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics