Meso-scala Particle Image Velocimetry studi di Neurovascular scorre In Vitro

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Bioengineering

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Summary

Qui presentiamo metodi semplificati per fabbricare trasparente neurovascular fantasmi e caratterizzare il flusso in esso. Evidenziamo alcuni parametri importanti e dimostrare la loro relazione con la precisione del campo.

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Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

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Abstract

Particle image velocimetry (PIV) viene utilizzato in un'ampia varietà di campi, a causa della opportunità che fornisce per appunto visualizzare e quantificare i flussi attraverso una vasta gamma di spazio-temporale. Tuttavia, la sua attuazione richiede in genere l'uso di strumentazione costosa e specializzata, che limita la sua utilità più ampio. Inoltre, all'interno del campo della bioingegneria, studi di visualizzazione del flusso in vitro anche spesso sono ulteriormente limitata dal costo elevato dei fantasmi di tessuto commercialmente provenienza che ricapitolano desiderati strutture anatomiche, in particolare per coloro che estendono il regime di mesoscala (cioè, submillimeter a scale di lunghezza di millimetro). Qui, presentiamo un protocollo semplificato sperimentale sviluppato per risolvere queste limitazioni, i cui elementi chiavi includono 1) un metodo relativamente a basso costo per la realizzazione di mesoscala fantasmi di tessuto mediante colata di silicone e stampa 3-d e 2) un quadro di analisi ed elaborazione immagine open source che riduce la domanda degli strumenti per la misurazione di flussi di mesoscala (cioè, velocità fino a decine di millimetri/secondo). Collettivamente, questo abbassa la barriera all'ingresso per nonexperts, sfruttando le risorse già a disposizione di molti ricercatori di bioingegneria. Abbiamo dimostrare applicabilità del presente protocollo nell'ambito della caratterizzazione di flusso neurovascular; Tuttavia, si prevede per essere rilevante per una vasta gamma di applicazioni di mesoscala in Bioingegneria e oltre.

Introduction

PIV è ampiamente usato in meccanica dei fluidi sperimentale per la visualizzazione del flusso e le indagini quantitative di movimento fluido che variano nella scala di lunghezza da atmosferico a flussi microcircolatoria1,2,3. Mentre le specifiche della sua attuazione possono variare ampiamente quanto le sue applicazioni, un aspetto comune a quasi tutti gli studi PIV è l'uso di formazione immagine dei video del tracciante particelle seminato all'interno del fluido di lavoro, seguito da un'analisi pairwise di fotogrammi consecutivi per estrarre le caratteristiche di portata desiderata. In genere, ciò avviene suddividendo ogni frame di immagine in regioni più piccole chiamate windows interrogatorio. In conseguenza le posizioni casuali delle particelle disperse, ogni finestra di interrogatorio contiene una distribuzione unica di intensità di pixel. Se la velocità di acquisizione di dati e dimensioni finestra vengono scelti in modo appropriato, cross-correlazione tra il segnale di intensità in ogni finestra consente di stimare lo spostamento medio all'interno di quella regione. Infine, dato che l'ingrandimento e il frame rate sono noti parametri sperimentali, un campo vettoriale di velocità istantanea può essere facilmente calcolato.

Il maggior vantaggio di PIV su tecniche di misura punto a punto è la sua capacità di mappare i campi di vettore in un dominio di due o tre dimensioni. Applicazioni di emodinamiche, in particolare, hanno beneficiato di questa capacità, poiché permette un'indagine approfondita dei flussi locali, che sono conosciuti per svolgere un ruolo significativo nella malattia vascolare o ristrutturazione (ad es., aterosclerosi, angiogenesi) 4 , 5 , 6. anche questo è stato vero per la valutazione dei flussi neurovascolari, e le interazioni dello stesso con dispositivi endovascolari (ad es., deviatori di flusso, stent, bobine intrasaccular), poiché le scale di lunghezza rilevante in tali applicazioni possono spesso occupare uno o più ordini di grandezza (ad es., dal micrometro al millimetro) e geometria del dispositivo e posizionamento possa influenzare notevolmente la meccanica dei fluidi locale7.

Maggior parte dei gruppi conducendo studi emodinamici basati su PIV hanno contato su set-up sperimentale che imitano molto attentamente alcune delle prime indagini di stent influenza il flusso vascolare7,8. In genere, questi includono un) pulsato laser e telecamere ad alta velocità, di catturare flussi ad alta velocità; b) sincronizzatori, per evitare l'aliasing tra la frequenza di impulso del laser e la frequenza di fotogrammi di acquisizione della fotocamera; c) ottica cilindrico, a formare un foglio leggero e, quindi, ridurre al minimo la fluorescenza di fondo da particelle di tracciante sopra e sotto il piano di interrogatorio; d) nel caso di sistemi commerciali chiavi in mano, pacchetti di software proprietario, per eseguire le analisi di correlazione incrociata. Tuttavia, mentre alcune applicazioni richiedono la prestazione e/o versatilità collettivamente offerto da questi componenti, molti altri non lo fanno. Dispone, inoltre, l'elevato costo del tessuto commercialmente provenienza fantasmi che ricapitolano desiderate strutture vascolari possono anche rivelarsi limitante per molti studi in vitro , particolarmente per fantasmi con quel ponte il regime di mesoscala (> 500 USD / Phantom). Qui, segnaliamo lo sviluppo di un protocollo semplificato per l'implementazione di PIV per la visualizzazione in vitro dei flussi neurovascolare, che in genere si trovano sia spazialmente e temporalmente all'interno del regime di mesoscala (cioè, scale di lunghezza che vanno da submillimeter al millimetro e velocità fino a decine di millimetri/secondo). Il protocollo mira a sfruttare le risorse già a disposizione di molti ricercatori di bioingegneria, abbassando così la barriera all'ingresso per nonexperts.

Il primo elemento di questo protocollo prevede l'utilizzo di una tecnica di colata di investimento per consentire la realizzazione di in-House di trasparente, polidimetilsilossano (PDMS)-base di fantasmi di tessuto da 3-D-stampati sacrificale stampi. Sfruttando la crescente disponibilità di stampanti 3-d negli ultimi anni, in particolare quelle condivise/multi-utente strutture (ad es., strutture istituzionali o pubblici makerspace), questa metodologia riduce i costi in modo significativo (ad esempio, < 100 USD/phantom nel caso presentato qui), consentendo una rapida inversione di tendenza per la fabbricazione di una vasta gamma di disegni e geometrie. Il protocollo attuale, una deposizione fusa sistema di modellazione è usata con acrilonitrile butadiene stirene (ABS) come il materiale da costruzione, in parte stampata funge da uno stampo sacrificale per la successiva fusione fantasma. La nostra esperienza ha dimostrato che l'ABS è particolarmente adatto per tale uso poiché è solubile in solventi comuni (ad es., acetone), e ha sufficiente forza e rigidità per mantenere l'integrità di muffa dopo la rimozione del materiale di supporto (ad es., a prevenire la deformazione o frattura del diminutivo mold caratteristiche). Nel protocollo attuale, muffa integrità ulteriormente è assicurata utilizzando modelli stampati solidi, anche se questo va a scapito del tempo di dissoluzione aumentata. L'uso di modelli hollow può anche essere possibile in alcuni casi, per promuovere l'accesso del solvente e così, ridurre il tempo di dissoluzione. Tuttavia, un'attenta considerazione dovrebbe essere data all'effetto questo può avere sull'integrità di muffa. Infine, mentre i fantasmi fabbricati nel presente documento si basano su rappresentazioni idealizzate di strutture neurovascular generate utilizzando un pacchetto di software (CAD) computer-aided design comune, il protocollo dovrebbe essere favorevole alla realizzazione di strutture più complesse , paziente-specifiche geometrie pure (per esempio, tramite l'utilizzo di file di modello generato dalla conversione di dati di imaging clinici per la. STL file formato utilizzato dalla maggior parte delle stampanti 3-d). Maggiori dettagli riguardo il processo di fabbricazione fantasma sono fornite nella sezione 2 del protocollo.

Il secondo elemento del protocollo prevede l'utilizzo di un plug-in per ImageJ per condurre l' analisi cross-correlazione9open-source. Questo è accoppiato con l'attuazione di un regime di soglia statistica semplice (cioè, intensità tappatura)10 per migliorare il segnale di immagine prima del cross-correlazione, nonché uno schema di convalida postcorrelation vettoriale, la normalizzazione test della mediana (NMT), per eliminare spurie vettori attraverso un confronto di ciascuno ai suoi vicini di casa più vicina11. Collettivamente, questo consente di imaging essere eseguiti utilizzando apparecchiature che si trovano comunemente in molti laboratori di bioingegneria, eliminando così la necessità per l'acquisizione di molti dei componenti costosi di tipici sistemi PIV (ad es., laser pulsato, sincronizzatore, ottica cilindrica e software proprietario). Maggiori dettagli riguardo la raccolta video, elaborazione di immagini e analisi dei dati sono forniti nelle sezioni 5 e 6 del protocollo.

La figura 1 illustra il set-up PIV utilizzato nel presente protocollo, che si basa su un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una telecamera ad alta velocità per l'imaging, nonché un esterno, fonte di luce bianca continua (cioè, lampada ad alogenuri metallici) per illuminazione volumetrica attraverso obiettivo. Una pompa a ingranaggi di velocità variabile viene utilizzata per imporre il flusso di ricircolo di una soluzione di sangue finto trasparente attraverso i fantasmi di tessuto neurovascolare. La soluzione è composta da una miscela di 60: 40 di deionizzata acqua (DI) e glicerolo, che è un sostituto comune per sangue in emodinamica studia12,13,14, dovuto un) sua simile densità e viscosità (vale a dire, 1.080 kg/m3 e 3,5 cP vs 1.050 kg/m3 e 3-5 cP per sangue)15,16; b) la trasparenza nel campo visibile; c) il suo indice di rifrazione simile come PDMS (1,38 vs 1,42 per PDMS)17,18,19,20, che riduce al minimo la distorsione ottica; d) la facilità con cui possa essere introdotti il comportamento non-newtoniano, se necessario, tramite l'aggiunta di xantano21. Infine, perle di polistirolo fluorescenti vengono utilizzati come particelle di tracciante (10,3 µm di diametro; 480 nm/501 nm eccitazione/emissione). Mentre perle di galleggiamento neutro sono desiderati, particelle di tracciante con proprietà meccaniche ottimali fluido (ad esempio, densità, dimensione, composizione) e lunghezza d'onda di emissione di sourcing può rivelarsi difficile. Ad esempio, le perle utilizzate nel presente documento sono leggermente meno dense rispetto alla soluzione di glicerolo (1.050 kg/m3 vs 1.080 kg/m3). Tuttavia, gli effetti idrodinamici, della stessa, sono trascurabili, dato che la durata di un tipico esperimento è molto più breve rispetto alla scala di tempo associata a effetti di galleggiabilità (cioè, 5 min e 20 min, rispettivamente). Ulteriori dettagli riguardanti l'assetto di sistema circolatorio sangue finto formulazione e in vitro di soluzione sono contenuti nelle sezioni 3 e 4 del protocollo.

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Protocol

1. ABS-base sacrificale muffa fabbricazione

  1. Progettare un modello inverso del fantasma del tessuto desiderato utilizzando software CAD.
  2. Stampare il modello utilizzando una stampante 3D con ABS come il materiale da costruzione.

2. PDMS-base vascolare fantasma Fabrication

  1. Miscelazione
    1. Mescolare la base prepolimero PDMS e agente indurente in un rapporto di 10:1 (in peso); una miscela di 66 g fornisce sufficiente materiale per la fabbricazione di fantasmi con volumi fino a 50 cm3.
    2. Mettere il composto in un essiccatore sotto vuoto per 60 min a degas e ridurre al minimo l'allettamento di bolla. Uso ciclico pressurizzazione/depressurizzazione per facilitare la rottura della bolla.
  2. Casting
    1. Montare lo stampo ABS stampato su un vetrino utilizzando stampaggio stucco per sigillare l'interfaccia.
    2. Attentamente, versare il composto PDMS nello stampo durante il tentativo di ridurre al minimo l'allettamento della bolla. Bolle persistente possono essere rotto manualmente usando un ago.
    3. Curare il fantasma di fusione a temperatura ambiente (25 ° C) per almeno 24 h.
      Nota: A temperature più elevate, questo processo può essere accelerato22.
  3. Sformatura
    1. Sciogliere l'ABS di sommersione fantasma in acetone e sonicating per almeno 15 min, utilizzando potenze fino a 70 w.
      Attenzione: Acetone ha un'alta pressione di vapore a temperatura ambiente e un basso punto di infiammabilità. Di conseguenza, sempre lavorare sotto cappa aspirante e lontano da potenziali fonti di accensione. Indossare dispositivi di protezione personale (ad es., gli occhiali di protezione o faccia scudo, camice da laboratorio, guanti resistente all'acetone).
    2. Sciacquare abbondantemente il fantasma con alcol isopropilico e, quindi, DI acqua per rimuovere residui di solventi.
      Nota: PDMS si gonfia sopra l'esposizione ad acetone; Tuttavia, il gonfiore scompare una volta che il fantasma è sciacquato e asciugata a sufficienza23.
  4. Conferma della fedeltà fantasma usando microscopia ottica
    1. Utilizzando un microscopio ottico con una fotocamera collegata e software di acquisizione immagini, catturare un'immagine di una caratteristica critica entro il fantasma con un ingrandimento che massimizza la funzione all'interno del campo visivo.
    2. Acquisire un'immagine di un reticolo di calibrazione appropriata allo stesso ingrandimento.
    3. Caricare entrambe le immagini in ImageJ trascinando la barra degli strumenti.
    4. Fare clic sull'immagine del reticolo di calibrazione per renderlo attivo e, quindi, selezionare lo strumento linea . Usando il mouse, disegnare una linea lungo una caratteristica di una distanza nota e selezionare analisi > Imposta scala dal menu ImageJ.
      Nota: Nella finestra Imposta scala , il campo con etichettato distanza in pixel dovrebbe essere prepopolato con la lunghezza della linea disegnata in unità di pixel.
    5. Immettere la lunghezza della funzionalità nel campo Distanza conosciutae la sua unità nel campo Unità di lunghezza. La casella Global per applicare questo fattore di calibrazione per tutte le immagini aperte.
    6. Rendere attiva l'immagine della caratteristica critica fantasma e utilizzare lo strumento linea per disegnare una linea lungo una caratteristica di interesse. Selezionare il menu ImageJ Analyze > misura (o premere Ctrl + M) per misurare la lunghezza della linea.
    7. Confrontare il valore previsto contro il valore nella colonna contrassegnata lunghezza nella finestra risultati per confermare fedeltà fantasma.

3. formulazione in soluzione sangue finto

  1. Miscela DI acqua e glicerina in un rapporto di 60: 40 (in volume).
    Nota: Un volume di 100 mL è sufficiente per il sistema in vitro circolatorio descritto nel presente documento.
  2. Aggiungere 1 mL di soluzione al 2,5% p/v perla fluorescente della polistirolo (cioè, particelle di tracciante) alla soluzione di sangue finto.
  3. Omogeneizzare il composto su una piastra magnetica a 400 rpm per 10 min.

4. in Vitro confi gurazione di sistema circolatorio

  1. Set-up della pompa
    1. Utilizzare uno strumento di spogliarellista filo per tagliare la spina DC-fine dalla fonte di alimentazione adattatore AC-DC.
    2. Striscia il rivestimento l'alimentazione e i fili di terra e collegarli al terminale di ingresso del regolatore di tensione di impulso larghezza modulazione di impulso (PWM).
    3. Collegare i cavi di alimentazione e di massa dal motore di CC della pompa al terminale di uscita del regolatore di tensione PWM.
      Nota: Il display a sette segmenti di PWM uscite il duty cycle (0% - 100%) utilizzato per ottenere una tensione variabile al motore DC.
  2. Calibrazione della pompa
    1. Preparare 200 mL di soluzione di sangue finto (Vedi sezione 3).
    2. Posto della tubazione dall'ingresso della pompa per il bicchiere che tiene la soluzione di sangue finto.
    3. Posizionare il tubo dalla mandata della pompa per un bicchiere vuoto.
    4. Selezionare un punto di regolazione del ciclo desiderato dovere (0% - 100%). Premere sul pulsante e avviare un timer.
    5. Arrestare il timer, una volta che la pompa ha trasferito l'intero volume della soluzione di sangue finto. Utilizzare questo tempo per calcolare la portata volumetrica.
    6. Ripetere i passaggi 4.2.1 - 4.2.5 per almeno cinque diversi dovere ciclo set point stabilire una curva di regressione di minimi quadrati.
      Nota: È consigliabile un minimo di tre punti replicare al duty cycle set point. Questa relazione può essere utilizzata per correlare la portata desiderata per il ciclo di dovere PWM richiesto.

5. video Collection

  1. Calibrazione delle immagini
    1. Determinare il rapporto di taratura per l'imaging dei video (Vedi sezione 2).
  2. Set-up apparato
    1. Posizionare il fantasma PDMS sul palco del microscopio di fluorescenza.
    2. Collegare il fantasma per la pompa ad ingranaggi e introdurre la soluzione di sangue finto.
      Nota: Facoltativamente, prefill il modello con etanolo per facilitare la completa bagnatura; quindi, sciacquare e riempire con la soluzione di sangue finto. Questo può essere particolarmente utile per i modelli con navi più piccole e/o caratteristiche ciechi.
    3. Impostare il controller del motore pompa per la portata desiderata, basato sulla curva di taratura della pompa.
    4. Il funzionamento per 1-5 min prima dell'esperimento per garantire condizioni di stato stazionario.
    5. Accendere la lampada esterna per illuminare il campo di vista. Selezionare un filtro appropriato basato sulla lunghezza d'onda di eccitazione di perline fluorescenti.
    6. Regolare il piano focale imaging midplane la nave.
      Nota: Può essere realizzato utilizzando una lunghezza focale che massimizza la sezione trasversale del vaso imaged (ad esempio, quando si utilizza fantasmi con vaso circolare sezioni trasversali); e/o l'indicizzazione al largo di una fantasma funzionalità progettata per facilitare l'identificazione Mid-dell'aereo nave.
  3. Registrazione video
    1. Selezionare i parametri di registrazione video per ottimizzare il rapporto segnale-rumore (SNR). Parametri chiave includono il tempo di esposizione, frequenza dei fotogrammi e guadagno.
      Nota: In questo protocollo, usiamo un frame rate di 2.000 fps e un guadagno di 1.0. Tuttavia, questi parametri possono variare in base all'applicazione (vedere la sezione di discussione per ulteriori dettagli).
    2. Raccogliere il video e salvarlo in formato AVI.
  4. Pulizia fantasma
    1. Se il tallone-attaccare è osservato dopo un esperimento, Sonicare fantasma in una soluzione acquosa detergente utilizzando potenze fino a 70 w.

6. elaborazione e analisi dei dati di immagine

  1. Immagine di pre-elaborazione
    1. Trascinare il file AVI salvato nella finestra ImageJ per importarlo. Selezionare la casella di controllo Converti in scala di grigi.
    2. Selezionare il menu ImageJ Analyze > istogramma generare (o premere Ctrl + H) per generare un istogramma delle intensità di pixel di immagine. Prendere nota dei media e deviazione standard per l'immagine non trasformato.
      Nota: Al frame rate elevato, non è insolito per la distribuzione a essere fortemente sbilanciata verso lo zero (cioè, nessun segnale).
    3. Selezionare il menu ImageJ immagine > regola > luminosità e contrasto (o premere Maiusc + Ctrl + H) per applicare un filtro di luminosità/contrasto.
    4. Luminosità e contrasto dal menu, premere il tasto Set per definire i limiti dell'immagine. Impostare il valore minimo sia il valore medio oltre una deviazione standard e il valore massimo sia l'intensità massima dell'immagine (entrambi basati su statistiche ottenute nel passaggio 6.1.2).
      Nota: Questo in genere elimina tutti, ma il 10% delle intensità di pixel. Il numero di deviazioni standard può essere variato a seconda della distribuzione desiderata delle intensità pixel. Uno script di macro personalizzata per eseguire l'operazione di tappatura di intensità è fornito nei Materiali supplementari.
    5. Selezionare il menu ImageJ processo > rumore > smacchiatura per ridurre il numero di pixel saturi.
      Nota: Questa operazione è resa necessaria dal potenziale aumentato per saturazione di pixel che si pone durante l'ottimizzazione della luminosità e contrasto, che possa produrre vettori spurie durante successiva cross-correlazione.
    6. Selezionare il menu ImageJ processo > filtri > sfocatura gaussiana con un raggio di 1,5 per ridurre gli artefatti derivanti dalla rimozione occasionale di pixel illuminati in un quartiere di 3x3 dal Priore rimozione dei puntini operazione.
    7. Fare clic sullo strumento poligono e, quindi, fare clic sull'immagine per delineare l'area di interesse (ROI).
    8. Selezionare il menu ImageJ modificare > chiaro all'esterno per rimuovere il rumore del sensore in luoghi dove nessun segnale è previsto (ad esempio, aree oltre il limite di parete del vaso), che può diminuire il SNR complessiva.
  2. Calcolo di PIV
    Nota: Questa parte del protocollo impiega un PIV di terze parti plug-in per ImageJ, che si basa su gaussiana picco-raccordo per consentire una stima dello spostamento con precisione dei subpixel.
    1. ImageJ nel menu, selezionare plugin > macro > Esegui... e passare per le macro salvate codice supplementare 2. ijjm Croce-correlare coppie di immagini successive.
      Nota: La macro procede come segue. 1) una cross-correlazione del campo di intensità all'interno di immagini consecutive in primo luogo viene eseguita per determinare lo spostamento locale delle particelle può tracciante (vale a dire, la prima immagine di coppia è costituita dalle immagini prime e la seconda, la seconda coppia di immagine si compone delle immagini seconda e il terza, ecc.). 2) una valutazione multipass in due fasi viene quindi eseguita con dimensioni di finestra di interrogatorio iniziale e finale di 256 x 256 pixel e 128 x 128 pixel, rispettivamente. Infine, 3) la macro esegue una media temporale per ridurre ulteriormente l'aspetto dei vettori spuri.
  3. Test della mediana normalizzato (NMT)
    1. ImageJ nel menu, selezionare plugin > macro > Esegui... e passare per le macro salvate codice supplementare 3. ijjm per convalidare i campi velocità tramite il test mediano normalizzato.
      Nota: La macro procede come segue. 1) ciascun vettore di un campo vettoriale istantanea è prima rispetto ai suoi vicini più vicine otto per calcolare il valore mediano. 2) la matrice di errori residui viene poi calcolata come la differenza tra ciascun vettore vicini e la mediana calcolata. 3) la differenza tra il vettore sotto inchiesta e il valore mediano di vettore vicina quindi è normalizzata tramite la mediana dei residui. 4) questo viene quindi confrontato con un valore di soglia (in genere, 0,2 pixel), che può essere variato basata su conoscenza aprioristicamente di rumore durante l'acquisizione dell'immagine. Infine, 5) una media temporale di tutti i campi di vettore istantaneo convalidato viene eseguita per produrre un campo composto, come questo è stato dimostrato di aumentare la qualità di campo vettoriale24.

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Representative Results

La figura 2 illustra il processo di fabbricazione fantasma del tessuto PDMS. I fantasmi progettati nel presente documento sono destinati per lo studio del flusso in idealizzato aneurismi intracranici, saccular, collo largo, come pure le arterie perforator ramificazione prossimali. Progettazione di ulteriori importanti caratteristiche includono 1) un serbatoio comune che alimentano tutti i pescherecci, per garantire uscita fluido non gravata dal fantasma - altrimenti, formazione di goccioline può verificarsi presso i punti di vaso più piccoli; 2) un gorgogliatore, per facilitare la rimozione di bolla; 3) un muro esterno di cavità, per garantire il parallelismo della nave con il piano orizzontale, così come una definizione precisa del finale fantasma lastra altezza, lunghezza e larghezza; 4) l'uso di un gambo di ago ipodermico 21 G (820 µm di diametro esterno nominale) per lo stampaggio dell'arteria perforatore, a causa della incapacità della nostra stampante per definire tali caratteristiche con sufficiente fedeltà. Riproduzione fedele di tutte le caratteristiche di design è osservata in tutto.

Risultati rappresentativi di una caratterizzazione di flusso basato su PIV eseguita utilizzando il protocollo corrente sono presentati nella Figura 3 e Figura 4. Questi studi sono stati effettuati utilizzando i tassi di flusso di ingresso fantasma di 100 mL/min, velocità di acquisizione dati di 2.000 fps, e un temporale mediando campate di 0,05 s. Figura 3 Mostra i fotogrammi immagine rappresentativa all'interno dell'arteria di perforatore, prima e dopo intensità di coperchiamento, così come grafici di superficie corrispondente dei valori di intensità di pixel a 8 bit. Entrambe dimostrano che intensità tappatura aumenta significativamente la definizione di picco sopra il rumore di fondo (cioè, aumenti il SNR), che è fondamentale per assicurare la precisione quando si eseguono successiva cross-correlazione. La figura 4 Mostra gli effetti di intensità tappatura e NMT operazioni sul campo del vettore di velocità. Miglioramento notevole uniformità di campo è osservato, così ulteriormente sottolineando l'importanza di massimizzare il SNR per ridurre al minimo la dispersione di dati.

Figure 1
Figura 1 : Set-up di particle image velocimetry. Affidamento su un'analisi di immagine di open source e un quadro di pre/post-elaborazione riduce la domanda degli strumenti per la misurazione di flussi di mesoscala, eliminando così la necessità per molti dei componenti costosi di tipici sistemi PIV (ad es., pulsata laser, sincronizzatore, ottica cilindrica o software proprietario). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Processo di fabbricazione fantasma PDMS-basata del tessuto. Le immagini illustrano (un) un modello CAD della neurovascular fantasma muffa, (b) l'ABS stampato muffa dopo la rimozione del materiale di supporto, (c) il casting e polimerizzazione di PDMS all'interno dello stampo ABS, (d) parziale dissoluzione dell'ABS muffa materiale e (e) il PDMS completato fantasma, con l'inserto mostrando le dimensioni finali del caratteristiche critiche, così come la regione di interesse (ROI) nell'arteria perforator dove sono state eseguite le misure PIV. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Effetto dell'intensità tappatura operazione sull'immagine SNR. Questi pannelli mostrano i grafici di superficie di intensità all'interno del perforatore dell'arteria, (un e b) prima cornici immagine rappresentativa e pixel corrispondente e (c e d) dopo aver applicato l'intensità operazione di tappatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Effetti di intensità tappatura e NMT operazioni sulla velocità vettoriale campi. Questi pannelli illustrano il campo del vettore velocità istantanea rappresentante all'interno dell'arteria di perforator derivato da (un) non trasformati dati di immagine, dati di intensità-ricoperto (b) e (c) dati di intensità-capped + postprocessing NMT . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Effetto di ridimensionamento finestra interrogatorio sulla qualità correlazione. Ridimensionamento di finestra ottimale si verifica quando il valore del coefficiente di correlazione zero-normalizzato viene ingrandito e la deviazione standard è ridotto al minimo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il protocollo descritto nel presente documento delinea un metodo semplificato per l'esecuzione di studi PIV per visualizzare neurovascular scorre fisiologicamente rilevanti dimensioni e flusso condizioni in vitro. In tal modo, serve a integrare protocolli riferiti da altri che si sono concentrati anche sulla semplificazione la quantificazione di campi vettoriali, ma all'interno di contesti molto diversi che richiedono che la considerazione di gran lunga più grande lunghezza scale25 o flusso inferiore Prezzo26,27 (ad es., flussi atmosferici o microcircolatori) e così, con un affidamento di schemi che sono incompatibili con l'applicazione corrente.

Le considerazioni più importanti per il successo di PIV bugia dentro la minimizzazione degli artefatti del campo di flusso e la massimizzazione della qualità dell'immagine. Diversi passaggi nel processo di fabbricazione fantasma di tessuto sono fondamentali per entrambi questi criteri. Ad esempio, degasaggio approfondita è cruciale poiché trascinato all'interno il PDMS durante la miscelazione di aria può portare alla formazione di bolle all'interno il fantasma finale, che possa influenzare negativamente sia caratteristica fedeltà e chiarezza ottica. Inoltre, la minimizzazione della rugosità superficiale dello stampo ABS è desiderato, poiché il processo di fusione di PDMS riproduce fedelmente anche il più minute imperfezioni (ad esempio, linee di costruzione, pori di superficie, graffi), così con conseguente rugosità superficiale in il fantasma finale che possa diminuire la chiarezza ottica e aumentare il potenziale accumulo di tallone. Mentre il protocollo descritto nel presente documento ha dimostrato sufficiente per l'applicazione corrente, ci sono numerosi rapporti nella letteratura dei mezzi per ridurre tale rugosità, ci dovrebbe essere alcun bisogno (ad esempio, vapori di acetone levigante28 o la ottimizzazione della strato spessore e parte dell'orientamento rispetto alla direzione di edificio)29.

La selezione dei parametri per la cattura video è anche fondamentale per garantire un campo vettoriale ad alta fedeltà. Un ottimale rapporto SNR è tipicamente realizzato presso il più alto tasso di telaio realizzabile che ancora permette l'esposizione sufficiente perlina (la frequenza fotogrammi massima essere limitata dal tempo di esposizione minimo). Guadagno può essere utilizzato per amplificare il segnale, ma questo aumenta anche il rumore del sensore. Se la velocità massima può essere stimata dagli altri parametri di flusso (ad es., portata volumetrica di ingresso), quindi un limite inferiore al tasso di frame necessari può essere stimato mediante la seguente relazione30.

Equation 1(1)

Qui, f ilcampionamento è il tasso di acquisizione della fotocamera (Hz), vmax è la massima velocità prevista (mm/s), ctaratura è la taratura costante (pixel/mm) e hfinestra di interrogatorio è la dimensione della finestra di interrogatorio (pixel). Tuttavia, più valori ottimali possono essere determinati mediante tecniche di valutazione di qualità cosiddetta correlazione, ad esempio il coefficiente di correlazione normalizzata zero11. In questa tecnica, le medie di segnali complementari da ogni coppia cornice sono in primo luogo sottratto e, quindi, normalizzate per la deviazione standard della loro intensità11. Se esiste uno spostamento del segnale originale, tale che tutti i picchi e valli corrispondono, è possibile che il valore di differita di questo segnale sarà uguale a uno. Al contrario, se non c'è nessuno spostamento che può allineare questi segnali, il valore sarà zero. Queste informazioni sono incluse nell'output ImageJ PIV per ogni vettore, e sarà possibile stamparlo come un proprio campo per verificare se ci sono effetti spaziali che contribuiscono alla scarsa correlazione (ad es., illuminazione irregolare). Il coefficiente di correlazione possono essere mediato anche sopra un campo come una stima complessiva della sua qualità. Infine, tale quantità potrebbe essere tracciata anche contro diversi frame rate o dimensioni della finestra interrogatorio per determinare un risultato ottimale. La figura 5 illustra i risultati di tale analisi utilizzando un campo di particelle di Monte Carlo-sintetizzato con spostamenti coerenti con i nostri flussi misurati sperimentalmente (una tecnica tipica per la caratterizzazione di correlazione qualità11 ). I risultati mostrano che l'interrogatorio finestra dimensioni e frame rate deve essere scelto in modo tale che un campo di particelle è spostato da ≤ 20% delle dimensioni della finestra di interrogatorio al paio di telaio per massimizzare il coefficiente di correlazione, riducendo al minimo la variabilità.

Anche se il protocollo descritto nel presente documento è dimostrato sufficiente per soddisfare le esigenze dell'applicazione corrente, è importante riconoscere i suoi limiti. Ad esempio, mentre il contrasto valorizzazione tramite intensità tappatura offre facilità di implementazione, trasformazioni di tutta la distribuzione di intensità di pixel possono migliorare l' ulteriore SNR31. Allo stesso modo, anche se il rilevamento basato su correlazione è ben consolidata e offre una risoluzione sufficiente per stimare in modo affidabile caratteristiche di primo ordine flusso rilevanti per emodinamica (ad es., velocità intra-aneurismatica), altre tecniche possono offrire una maggiore risoluzione spaziale (ad es., ibrido PIV/PTV, minimi quadrati corrispondenti)32,33 e, quindi, una maggiore precisione quando si considera le caratteristiche che sono più sensibili alla risoluzione del campo di velocità (per esempio. , la sollecitazione di taglio della parete, la vorticità in piano). Allo stesso modo, mentre il NMT fornisce un mezzo per migliorare il campo di vettore di velocità dopo cross-correlazione, è importante sottolineare che questa è solo una delle molte tecniche di convalida di vettore che potrebbero essere usato24,34, ognuna con i propri unici vantaggi e svantaggi che possono rendere il loro utilizzo più adatto per applicazioni di là di quelle descritte qui. Infine, mentre il set-up sperimentale descritto qui cerca di imitare fisiologicamente rilevanti portate e scale di lunghezza per sistema neurovascolare grazie, non attualmente consente l'analisi dei flussi pulsatile. Questo non è stato un limite per l'applicazione corrente, dal momento che i numeri di serie di Womersley in gran parte del sistema neurovascolare grazie tende ad essere ≤ 1 (cioè, c'è un minimo effetto additivo di cicli cardiaci multipli)35, che suggerisce che condizioni allo steady-state sono sufficienti per ricapitolare i punti di tempo discreto lungo la forma d'onda cardiaca in cui la portata è paragonabile. Tuttavia, per applicazioni dove il numero di Womersley è più grande (per esempio, sistema vascolare più vicino al cuore), immaginiamo un potenziale per l'introduzione di pulsatilità attraverso l'uso di un Arduino, che potrebbero essere utilizzate per inviare la pompa una tensione PWM variabili nel tempo forma d'onda che consente la mimica di un flusso cardiaco profilo36,37,38.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono supporto parziale per questo progetto fornito da una sovvenzione seme collaborativo l'ufficio di ricerca e sviluppo economico presso UC Riverside.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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