Meso 스케일 입자 이미지 Velocimetry 혈관 흐름에서 체 외에서 의 연구

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

여기 우리가 투명 neurovascular 유령 조작 및 거기에 흐름에 대 한 단순화 된 방법을 제시. 우리 여러 중요 한 매개 변수를 선택 하 고 필드 정확도에 그들의 관계를 보여 줍니다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

입자 이미지 velocimetry (PIV)는 다양 한 분야, 그것은 정확 하 게 시각화 하 고 큰 spatiotemporal 범위에 걸쳐 흐름 측정에 대 한 제공 하는 기회 때문에 사용 됩니다. 그러나, 구현은 일반적으로 그것의 광범위 한 유틸리티 제한 비싸고 특수 장비의 사용을 해야 합니다. 또한, 생명 공학 분야, 내 생체 외에서 흐름 시각화 연구는 또한 종종 더 원하는 해 부 구조, 특히 그에 대 한 정리는 상업적으로 공급된 조직 팬텀의 높은 비용에 의해 제한 하는 mesoscale 정권 (, submillimeter 밀리미터 길이 가늠 자에) 스팬. 여기, 우리는 핵심 요소 mesoscale 조직 유령 3 차원 인쇄 및 실리콘 주조를 사용 하 여 날조를 위한 1)는 상대적으로 낮은 비용 방법 포함, 이러한 한계를 해결 하기 위해 개발 된 간단한 실험 프로토콜 제시 및 2) 오픈 소스 이미지 분석 및 프로세싱 프레임 워크 mesoscale 흐름을 측정 하기 위한 계측 시 수요를 감소 시키는 (, 밀리미터의 10 최대 속도/초). 이 많은 생명 공학 연구원의 처리에서 이미 리소스를 활용 하 여 유추에 대 한 진입 장벽을 낮추고. 우리 혈관 흐름 특성;의 컨텍스트 내에서이 프로토콜의 demonstratethe 적용 그러나, 그것은 광범위 한 mesoscale 응용 공학에 관련이 있을 예정 이다.

Introduction

PIV 흐름 시각화 및 microcirculatory 흐름1,2,3대기에서 길이 규모에서 변화 하는 움직임의 양적 조사에 대 한 유체 역학 실험에 널리 사용 됩니다. 그것의 실시의 세부 사항으로의 응용 프로그램으로 널리 다를 수 있습니다, 거의 모든 PIV 연구에 공통 한 측면은 연속적인 이미지 프레임의 한 쌍 단위로 분석 하 여 다음 작동 유체 내에서 시드 추적 입자의 비디오 영상의 사용 추출 흐름 특성을 원하는. 일반적으로,이 첫 번째 심문 윈도우 라고 하는 작은 지역으로 각 이미지 프레임 분할에 의해 수행 됩니다. 분산 된 입자의 무작위 위치 결과로 픽셀 농도의 독특한 유통을 각 심문 창에 포함 되어 있습니다. 창 크기 및 데이터 수집 속도 적절 하 게 선택 하는 경우 그 지역 내에서 평균 변위 추정 하 각 창에 강도 신호의 교차 상관 관계를 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 확대 및 프레임 속도 알려진 실험적인 매개 변수, 그 순간 속도 벡터 필드 수 있습니다 쉽게 계산 될.

싱글 포인트 측정 기술을 통해 PIV의 가장 큰 장점은 2 또는 3 차원 도메인 전체 벡터 필드를 매핑하는 기능입니다. Hemodynamic 응용 프로그램, 특히, 혜택이 기능에서 혈관 질환 또는 (예를 들어, 아 테 롬, 신생) 리 모델링에서 중요 한 역할을 알려져 있습니다 로컬 흐름의 철저 한 수사를 수 있기 때문 4 , 5 , 6. 이것은 또한 혈관 흐름의 평가 대 한 진정한 고 수 같은 응용 프로그램에 관련 된 길이 비늘 이후 혈관 내 수술 장치 (예를 들어, 흐름 diverters, 텐트, intrasaccular 코일), 그 상호 작용 종종 하나 이상의 크기 순서 (예를 들어, 밀리미터에 마이크로 미터에서), 및 장치 형상 스팬 및 배치 지역 유체 역학7영향을 크게 수 있습니다.

PIV 기반 hemodynamic 연구를 실시 하는 대부분 그룹을 밀접 하 게 혈관 흐름7,8에 텐트 영향의 초기 수사 중 일부 모방 실험 설정에 의존 했습니다. 일반적으로,이 포함 한) 펄스 레이저와 고속 카메라, 높은-속도 흐름; 캡처 b) 동기화, 레이저의 펄스 주파수와 카메라 수집 프레임 속도; 앨리어싱을 방지 하 c) 원통형 광학, 빛 시트를 형성 하 고, 따라서, 추적 입자 위와 심문 비행기; 아래에서 배경 형광을 최소화 d)의 경우 상업 턴키 시스템, 교차 상관 분석을 수행 하기 위해 독점 소프트웨어 패키지. 그러나, 일부 응용 프로그램에서는 성능 및 공동으로 이러한 구성 요소에서 제공 하는 다양성, 그러나 많은 다른 사람 하지 않습니다. 또한, 상업적으로 공급된 조직 원하는 혈관 구조를 정리 하는 환영 또한 증명할 수의 높은 비용 많은 생체 외에서 연구에 대 한 제한으로 유령에 대 한 특히 기능 그 다리 mesoscale 정권 (> 500 원 / 팬텀)입니다. 여기, 우리가 시험관에 시각화 공간 모두 거짓말 일반적으로 혈관 흐름의와 일시적으로 (, 길이 비늘까지 mesoscale 정권 내에서 대 한 PIV를 구현 하기 위한 단순한 프로토콜의 개발 보고 밀리미터, 밀리미터의 10까지 속도를 submillimeter에서 / 초). 프로토콜 이미 처분에 따라서 유추에 대 한 진입 장벽을 낮추는 많은 생명 공학 연구원의 자료를 활용 하고자 합니다.

이 프로토콜의 첫 번째 요소로 투명입니다 (PDMS)의 사내 제작 수 있도록 투자 주조 기술의 사용을 포함-기반 3 차원 인쇄 희생 금형에서 조직 환영. 최근 몇 년 동안, 특히 그 공유/다중 사용자 시설 (예를 들면, 기관 시설 또는 공공 makerspaces)에 3 차원 프린터의 증가 가용성을 활용 하 여이 방법론 크게 비용 인하 (예를 들어, < 여기에 제시 하는 경우에 100 원/팬텀), 다양 한 디자인 및 형상 제조에 대 한 신속한 처리를 가능 하 게 하면서. 현재 프로토콜 융합된 증 착 시스템 모델링 건축 자재로 아크릴로 니트 릴 부 타 디 엔 스 티 렌 (ABS) 함께 사용 됩니다 그리고 인쇄 된 부분 이후의 가상 캐스팅에 대 한 희생 형 역할. 우리의 경험 나타났습니다 ABS 사용 적합 때문에 (예를 들어, 아세톤), 일반적인 용 매에 용 해 하 고 충분 한 강도와 강성이 지원 물자의 제거 후 금형 무결성을 유지 하는 (예를 들어, 방지는 변형 또는 소형 금형 기능의 골절). 현재 프로토콜에서 금형 무결성 더 보장 된다 단단한 인쇄 된 모델을 사용 하 여 비록이 증가 해체 시간을 희생 해 서 온다. 빈 모델의 사용 용 매 접근을 강화 하 고 따라서 해체 시간을 감소, 어떤 경우에도 수 있습니다. 그러나, 신중 하 게 고려해 야 효과에이 있을 수 있습니다 금형 무결성에. 마지막으로, 여기 조작 유령 혈관 구조는 일반적인 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 생성의 이상적인된 대표를 기반으로, 하는 동안 프로토콜 것으로 예상 된다 더 복잡 한 제조 의무가 있을 뿐만 아니라 환자 전용 형상 (예를 들어, 사용을 통해 임상 영상 데이터의 변환에 의해 생성 된 모델 파일의는. STL 파일 형식 대부분 3 차원 프린터에서 사용). 팬텀 제조 공정에 대 한 자세한 내용은 프로토콜의 2 절에서 제공 됩니다.

프로토콜의 두 번째 요소는 오픈 소스 ImageJ9교차 상관 분석 실시 하기 위한 플러그인의 사용을 포함. 이 간단한 통계 임계 처리 계획의 구현과 함께 결합 (, 강도 상한)는 정규화 postcorrelation 벡터 유효성 검사 체계, 뿐만 아니라 교차 상관, 이전 이미지 신호를 개선 하기 위해10 중간 시험 (NMT), 그것의 가장 가까운 이웃11각각의 비교를 통해 가짜 벡터를 제거 하. 이미징 장비에서 일반적으로 있다 많은 생명 공학 실험실, 전형적인 PIV 시스템 (예를 들어, 펄스 레이저의 비용이 많이 드는 구성의 많은 것의 수집에 대 한 필요를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 동기화, 원통형 광학, 및 독점 소프트웨어). 비디오 수집, 이미지 프로세싱 및 데이터 분석에 대 한 자세한 내용은 섹션 5와 6의 프로토콜에서에서 제공 됩니다.

그림 1 에 대 한 이미징, 외부, 뿐만 아니라 연속 화이트 라이트 소스 (, 금속 할로겐 램프)에 대 한 고속 카메라를 갖춘 형광 현미경에 의존이 프로토콜에 사용 되는 PIV 설정 설명 목표를 통해 체적 조명. 가변 속도 기어 펌프는 혈관 조직 환영을 통해 투명 한 모의 피 솔루션의 반복 흐름을 부과 하는 데 사용 됩니다. 솔루션은 이온 (DI) 물과 글리세롤, hemodynamic에서 혈액으로 인해12,,1314, 연구에 대 한 일반적인 대용품 인과 혼합물의 구성 된) 그것의 비슷한 밀도 점도 (, 1080 kg/m3 와 3.5 cP 1050 k g/m3 와 혈액에 대 한 3-5 cP)15,16; 보이는 범위; b)의 투명성 c) 그것의 유사한 굴절률 PDMS (1.38 1.42 PDMS에 대 한)17,18,,1920, 광학 왜곡을 최소화 하 d)는 비 뉴턴 동작 소개 될 수 있다, 필요한 경우 쉽게 통해 xanthane21의 추가. 마지막으로, 형광 폴리스 티 렌 구슬 추적 입자 (직경에서 10.3 µ m; 480 nm/501 nm 여기/방출)로 사용 됩니다. 중립 부 력 구슬은 원하는 동안 최적의 유체 기계적 특성 (예를 들어, 밀도, 크기, 구성)와 방출 파장 추적 입자를 소싱 어려운 증명할 수 있다. 예를 들어 여기서 구슬 글리세롤 솔루션 (1050 k g/m3 1080 kg/m3) 보다 약간 적은 밀도 있습니다. 그러나, 그 유체 효과, 주어진 전형적인 실험 기간 부 력 효과와 관련 된 시간 규모 보다 훨씬 짧습니다 (, 5 분 및 20 분 각각). 더 모의 피 솔루션 수립 및 체 외 순환 시스템 설정에 관한 세부 사항은 섹션 3 및 4의 프로토콜에서에서 제공 됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ABS 기반 희생 금형 제조

  1. CAD 소프트웨어를 사용 하 여 원하는 조직 팬텀의 역 모델 디자인.
  2. 건축 자재로 ABS와 3 차원 프린터를 사용 하 여 모델을 인쇄 합니다.

2. PDMS 기반 혈관 팬텀 제조

  1. 혼합
    1. PDMS 중합체 기지와 경화제 10:1 비율에서 (중량); 혼합 66 g 혼합 50 cm3최대 볼륨으로 환영의 제조에 대 한 충분 한 자료를 제공합니다.
    2. 에 드 거품 함정을 최소화 하 고 60 분 동안 진공 desiccator 혼합물을 놓습니다. 순환 가압/depressurization를 사용 하 여 거품 파열을 촉진 하기 위하여.
  2. 캐스팅
    1. 인쇄 된 ABS 몰드 성형 퍼 티를 사용 하 여 인터페이스를 밀봉 하는 유리 슬라이드에 탑재 합니다.
    2. 조심 스럽게 부 어 PDMS 혼합물 금형에 거품 함정을 최소화 하기 위해 노력 하는 동안. 느린 거품은 바늘을 사용 하 여 수동으로 파열 수 있습니다.
    3. 실내 온도 (25 ° C)에 캐스트 팬텀 적어도 24 h에 대 한 치료.
      참고: 높은 온도에서이 과정 가속된22될 수 있습니다.
  3. Demolding
    1. 아세톤에 팬텀 잠수와 70 w.까지 힘을 사용 하 여 적어도 15 분 동안 sonicating ABS 분해
      주의: 아세톤은 실내 온도 낮은 인화점에 높은 증기압. 따라서, 항상 연기 후드 및 잠재적인 점화 소스에서 작동 합니다. 적절 한 개인 보호 장비 (예를 들어, 고글 또는 얼굴 방패, 실험실 코트, 아세톤 방지 장갑)을 착용.
    2. 철저 하 게 린스와 이소프로필 알코올, 다음, 용 매 잔류물을 제거 하려면 디 물 팬텀.
      참고: PDMS 아세톤;에 노출 시 부 그러나, 붓기는 일단 팬텀은 씻어 서 충분히23건조 앉 다.
  4. 광학 현미경을 사용 하 여 팬텀 충실도의 확인
    1. 광학 현미경을 사용 하 여 연결 된 카메라와 이미지 캡처 소프트웨어, 보기의 필드 내에서 기능을 최대화 하는 배율에서 팬텀 내의 중요 한 기능은의 이미지를 캡처하십시오.
    2. 동일한 배율에서 적절 한 교정 십자선의 이미지를 캡처하십시오.
    3. 도구 모음에 드래그 하 여 ImageJ를 두 이미지를 로드 합니다.
    4. 활성 하 게 교정 십자선 이미지를 클릭 하십시오 및 다음 도구를 선택 합니다. 알려진된 거리와 선택의 기능에 따라 선을 그려 마우스를 사용 하 여 분석 > 설정 규모 ImageJ 메뉴에서.
      참고: 비율 설정 창에서 픽셀에서 거리 를 표시 하는 필드 해야 합니다 수 채워집니다 픽셀 단위로 그려지는 선의 길이.
    5. 알려진 거리, 그리고 단위의 길이표시 하는 필드에는 단위 필드에는 특징의 길이 입력 합니다. 열려 있는 모든 이미지에이 보정 계수를 적용할 글로벌 상자를 확인 하십시오.
    6. 활성 유령 중요 한 기능의 이미지를 확인 하 고 관심의 기능을 따라 선을 그리려면 도구를 사용 하 여. ImageJ 메뉴에서 선택 분석 > 측정 (또는 Ctrl+ M) 줄의 길이 측정 하.
    7. 팬텀 충실도 확인 하려면 결과 창에서 길이 표시 하는 열에 있는 값에 대 한 예상 값을 비교 합니다.

3. 모의 피 솔루션 배합

  1. (볼륨)에 의해 디 물과 글리세롤과 비율에 혼합.
    참고: 100 mL 볼륨은 체 외에서 순환 시스템 여기에 설명 된에 대 한 충분 한.
  2. 모의 피 솔루션을 2.5 %w / v 형광 폴리스 티 렌 비드 솔루션 (, 추적 입자)의 1 mL를 추가 합니다.
  3. 10 분 동안 400 rpm에서 자기 저 어 접시에 혼합 균질

4. 체 외에서 순환 시스템 설정

  1. 펌프 설치
    1. 와이어 스 트리 퍼 도구를 사용 하 여 AC / DC 어댑터 전원에서 DC-엔드 플러그를 잘라.
    2. 힘에서 코팅을 제거 하 고 와이어를 접지는 펄스 폭 변조 (PWM) 전압 레 귤 레이 터의 입력된 단자에 연결.
    3. 펌프의 DC 모터 PWM 전압 레 귤 레이 터의 출력 단자에 전원 및 접지 와이어를 연결 합니다.
      참고: PWM의 7 세그먼트 디스플레이 출력 듀티 사이클 (0%-100%) DC 모터에 가변 전압을 달성 하는 데 사용 합니다.
  2. 펌프 캘리브레이션
    1. 200ml 모의 피 솔루션 (섹션 3 참조)를 준비 합니다.
    2. 펌프 입구에서 모의 피 솔루션을 들고 비 커 튜브를 배치 합니다.
    3. 튜브 펌프 콘센트에서 빈 비 커를 놓습니다.
    4. (0%-100%)를 원하는 듀티 사이클 설정 포인트를 선택 합니다. 버튼 누르고 타이머를 시작 합니다.
    5. 일단 펌프 모의 피 솔루션의 전체 볼륨을 전송는 타이머를 중지 합니다. 체적 유량을 계산 하기 위해이 시간을 사용 합니다.
    6. 단계 4.2.1-4.2.5 최소 제곱 회귀 곡선을 설정 하려면 적어도 5 다른 듀티 사이클 세트 포인트에 대 한 반복 합니다.
      참고: 최소 듀티 사이클 설정 포인트 당 3 개의 복제 포인트는 것이 좋습니다. 이 관계는 필요한 PWM 듀티 사이클을 원하는 유량을 상관 관계를 사용할 수 있습니다.

5. 비디오 컬렉션

  1. 이미지 보정
    1. 비디오 영상 (섹션 2 참조)에 대 한 보정 비율을 결정 합니다.
  2. 장치 설정
    1. 형광 현미경의 스테이지 PDMS 팬텀을 놓습니다.
    2. 기어 펌프에 팬텀을 연결 하 고 모의 피 솔루션 소개.
      참고: 필요한 경우, prefill 전체 촉진 하기 위하여 에탄올과 모델 일로; 그리고, 플러시 모의 피 솔루션을 작성 합니다. 이 특히 작은 혈관 또는 블라인드 기능 모델에 대 한 도움이 될 수 있습니다.
    3. 펌프 보정 곡선에 따라 원하는 유량 펌프 모터 컨트롤러를 설정 합니다.
    4. 정상 상태 조건을 위해 실험 전에 1-5 분 동안 펌프를 실행 합니다.
    5. 보기의 필드를 밝히는 외부 램프를 켭니다. 형광 구슬의 여기 파장에 따라 적절 한 필터를 선택 합니다.
    6. 선박 중앙판을 이미징 초점 비행기를 조정 합니다.
      참고:이 이미지 선박 횡단면을 최대화 하는 초점 거리를 사용 하 여 달성 될 수 있다 (예를 들어, 원형 용기와 유령 개체를 사용 하 여 횡단면); 또는 선박 중간 비행기의 식별을 용이 하 게 하는 팬텀 기능에서 인덱싱.
  3. 비디오 녹화
    1. 신호 대 잡음 비율 (SNR)를 최적화 하려면 비디오 녹화 매개 변수를 선택 합니다. 키 매개 변수는 노출 시간, 프레임 속도, 및 이득.
      참고:이 프로토콜을 사용 하 여 2000 fps의 프레임 속도 1.0의 이득. 그러나, 이러한 매개 변수는 응용 프로그램에 따라 달라질 수 있습니다 (자세한 내용은 토론 섹션 참조).
    2. 비디오를 수집 하 고 그것을 AVI 포맷에 저장.
  4. 팬텀-정리
    1. 실험 후 비드 고집을 관찰 하는 경우 sonicate 70 w.까지 힘을 사용 하 여 세제 용액에 팬텀

6. 이미지 프로세싱 및 데이터 분석

  1. 이미지 전처리
    1. 저장 된 AVI 파일 가져올 ImageJ 창을 끌어다 놓습니다. 회색조로 변환표시 상자를 선택 합니다.
    2. ImageJ 메뉴에서 선택 분석 > 히스토그램 생성 (또는 Ctrl+ H) 이미지 픽셀 휘도의 히스토그램을 생성 하. 평균 및 표준 편차는 처리 되지 않은 이미지를 기록해 둡니다.
      참고: 높은 프레임 속도로 특이 하지 않다 0으로 무 겁 게 왜곡 된 배포에 대 한 (, 신호 없음).
    3. ImageJ 메뉴에서 선택 이미지 > 조정 > 밝기 및 대비 (또는 Shift + Ctrl+ H) 밝기/대비 필터를 적용 하려면.
    4. 밝기 및 명암 메뉴에서 이미지 한계를 정의 하 고 설정 단추를 누릅니다. 평균 값 플러스 1 개의 표준 편차, 그리고 (둘 다 단계 6.1.2에서에서 얻은 통계에 따라) 이미지의 최대 강도를 최대 값 최소 값을 설정 합니다.
      참고:이 일반적으로 픽셀 농도의 상위 10%를 제외한 모든 제거합니다. 표준 편차의 수는 원하는 픽셀 농도 분포에 따라 다양 한 수 있습니다. 상한 작업 강도 수행 하기 위한 사용자 지정 매크로 스크립트 보충 자료에 제공 됩니다.
    5. ImageJ 메뉴에서 선택 과정 > 잡음 > Despeckle 포화 픽셀의 수를 줄이기 위해.
      참고:이 작업은 픽셀 채도의 밝기 및 대비, 후속 교차 상관 동안 가짜 벡터를 생산할 수 있는 최적화 하는 동안 발생에 대 한 증가 잠재력으로 필요한.
    6. ImageJ 메뉴에서 선택 과정 > 필터 > 가우시안 흐림 3 x 3 이웃에 조명된 픽셀의 비정 기 제거에서 사전 작업을 despeckling에 의해 발생 하는 아티팩트를 줄이기 위해 1.5의 반경으로.
    7. 다각형 도구를 클릭 하 고 이미지 관심이 (ROI) 개요를 클릭 합니다.
    8. ImageJ 메뉴에서 선택 편집 > 분명 외부 신호 위치에 센서 잡음을 제거 하 예상 (예를 들면, 혈관 벽 경계를 넘어 영역)는 전반적인 SNR을 줄일 수 있습니다.
  2. PIV 계산
    참고: 프로토콜의이 부분 서브 픽셀 정확도와 변위의 추정 수 있도록 가우스 피크-피팅 시 의존 ImageJ 제 PIV 플러그를 사용 하 여.
    1. ImageJ 메뉴에서 선택 플러그인 > 매크로 > 실행... 저장된 매크로 추가 코드 2 ijjm 크로스-상관 연속 이미지 쌍을 이동.
      참고: 매크로 다음과 같이 진행 됩니다. 1) 간 상관 관계 연속 이미지 내에서 강도 필드의 처음 advected 추적 입자 (, 쌍의 첫 번째 및 두 번째 이미지, 두 번째 이미지 쌍으로 구성 되어 첫 번째 이미지의 로컬 변위를 결정 하기 위해 수행 이루어져 있다 두 번째 및 세 번째 이미지, ). 2) 2 단계 multipass 평가 다음 수행 초기 및 최종 심문 창 크기의 256 x 256 픽셀 및 128 x 128 픽셀, 각각. 마지막으로, 3) 매크로 수행 더 스 퓨 리 어스 벡터의 모양을 줄이기 위해 시간 평균.
  3. 정규화 된 중간 테스트 (NMT)
    1. ImageJ 메뉴에서 선택 플러그인 > 매크로 > 실행... 저장된 매크로 추가 코드 3. ijjm 는 속도 필드를 통해 유효성을 검사 하는 정규화 된 중간 테스트 이동.
      참고: 매크로 다음과 같이 진행 됩니다. 1) 각 벡터 순간 벡터 필드에 중간 값을 계산 하는 8 명의 가까운 이웃 먼저 비교 됩니다. 2) 잔여 오류 배열 다음 각 인접 벡터 계산된 중앙값의 차이로 계산 됩니다. 3) 차이 조사 벡터 및 인접 벡터 중앙값은 다음 오차의 중간값으로 정규화 됩니다. 4)이 변화 될 수 잡음의 선험적 지식에 따라 이미지 수집 동안 임계값 값 (일반적으로 0.2 픽셀), 다음 비교 됩니다. 마지막으로, 5)으로이 벡터 필드 품질24증가 표시 되었습니다 모든 유효한 순간 벡터 필드의 시간 평균 합성 필드를 생산 하 수행 됩니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

그림 2 에서는 PDMS 조직 팬텀 제조 프로세스를 보여 줍니다. 여기에 디자인 마스터가 이상적인된 넓은 센 saccular, intracranial 동맥 류로 근 분기 perforator 동맥 흐름의 연구에 대 한 위한 것입니다. 중요 한 설계 기능 포함 1) 물방울 형성; 작은 그릇 매장에서 발생할 수 있습니다 방해 유체 출구 팬텀-그렇지 않으면에서 위해, 모든 혈관 유출 일반적인 저수지 거품 제거;을 촉진 하기 위하여 2)는 거품 트랩 3) 외부 캐비티 벽, 수평 비행기와 선박의 병렬 처리 뿐만 아니라 최종 팬텀 슬 래 브 높이, 길이 및 너비;의 정확한 정의 위해 충분 한 충실도와 같은 기능을 정의 프린터의 무 능력으로 인해 perforator 동맥의 성형에 대 한 21 G 피하 주사 생크 (공칭 외경에서 820 µ m)의 4)를 사용 합니다. 모든 설계 특징의 충실 한 재생산을 통해 관찰 됩니다.

현재 프로토콜을 사용 하 여 수행 하는 PIV 기반 흐름 특성의 대표적인 결과 그림 3그림 4에 표시 됩니다. 팬텀 입구 유량 100 mL/min, 2000 fps의 데이터 수집 속도 사용 하 여 이러한 연구 수행 및 전후 perforator 동맥 내 대표 이미지 프레임 표시 시간 평균 0.05 s. 그림 3 의 범위에 강도 상한으로 8 비트 픽셀 강도 값의 해당 표면 플롯. 둘 다 그 (, 증가 SNR), 이후 간 상관 관계를 수행할 때 정확도 보장 하는 잡음 플로어 위에 피크 정의 증가 크게 강도 상한 보여줍니다. 그림 4 강도 상한 및 속도 벡터 필드에 NMT 작업의 효과 보여 줍니다. 따라서 데이터 강하를 최소화 하기 위해 SNR을 극대화의 중요성을 더욱 강조 표시 필드 균일성 향상은 관찰 된다.

Figure 1
그림 1 : 입자 이미지 velocimetry 설정. 오픈 소스 이미지 분석 및 전/후 처리 프레임 워크를 따라 mesoscale 흐름, 많은 일반적인 PIV 시스템 (예를 들어, 펄스의 비용이 많이 드는 구성 요소에 대 한 필요를 측정 하기 위한 계측 시 수요 감소 레이저, 동기화, 원통형 광학, 및/또는 독점 소프트웨어). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : PDMS 기반 조직 팬텀 제조 공정. 이미지 설명 (a) 혈관 유령 형, (b) 인쇄 된 ABS 지원 자료, (c) 주조의 제거 후 금형의 CAD 모델 및 ABS 형, ABS의 (d) 부분 해체 내 PDMS의 치료 금형 소재, 및 (e) 완성 된 PDMS와 인세트는 관심 영역 (ROI) perforator 동맥에서 PIV 측정 되었다 뿐만 아니라 중요 한 기능에의 최종 크기를 보여주는 팬텀. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : 작업 이미지 SNR에 상한 강도의 효과. 이러한 패널 대표 이미지 프레임 및 상응 하는 픽셀 perforator 동맥, (ab) 강도 표면 플롯 하기 전에 표시 하 고 (cd) 상한 작업 강도 적용 한 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 효과 강도 상한 및 속도에 NMT 작업의 벡터 필드. 이 패널에서 파생 된 perforator 동맥 내에서 대표적인 순간 속도 벡터 필드 설명 () 처리 되지 않은 이미지 데이터, (b) 강도 출장 데이터, 그리고 (c) 강도 출장 데이터 + NMT 포스트 프로세싱 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 상관 관계 품질에 심문 창 크기 조정의 효과. 최적의 창 크기 조정 제로 정규화 된 상관 계수 값을 최대화 하 고 표준 편차 최소화 될 때 발생 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

프로토콜 설명 여기 윤곽선 순수 관련 차원 및 흐름 조건 생체 외에서 흐르는 PIV 연구 혈관 시각화를 수행 하기 위한 간단한 방법. 이렇게, 그것은 또한 단순화 정량화의 벡터 필드, 하지만 훨씬 더 큰 길이 고려 조정25 또는 더 낮은 흐름을 필요로 하는 매우 다른 컨텍스트 내에서 초점을 다른 사람에 의해 보고 하는 프로토콜을 보완 하는 역 요금26,27 (, 대기 또는 microcirculatory 흐름), 그리고 따라서, 현재 응용 프로그램에 호환 되지 않는 스키마에 대 한 신뢰.

PIV의 성공적인 구현에 대 한 가장 중요 한 고려의 흐름 필드 유물 최소화 및 이미지 품질의 극대화에 거짓말. 조직 팬텀 제조 프로세스의 여러 단계는 이러한 기준 모두 중요 합니다. 이후 공기는 PDMS 내에서 혼합 하는 동안 최 기능 충실도 및 광학 선명도 저하 될 수 있습니다 마지막 팬텀 내 거품 형성으로 이어질 수 있습니다 예를 들어 철저 한 degassing 결정적 이다. 또한, ABS 금형의 표면 거칠기의 최소화는 원하는 PDMS 주조 과정 충실히 재현 (예를 들어, 빌드 라인, 표면 숨 구멍, 긁힌 자국), 심지어 가장 작은 결함 때문에 표면 거칠기에 따라서 결과 광학 선명도 줄일 수 있는 구슬 축적을 위한 잠재력을 증가 최종 팬텀 여기에 설명 된 프로토콜은 현재 응용 프로그램에 대 한 충분 한 입증, 수많은 보고서에에서는 이러한 거칠기 감소의 의미의 문학 필요 있을 (예를 들어,28 를 부드럽게 아세톤 증기 또는 레이어 두께 및 부분 방향 건물 방향의 최적화)29

비디오 캡처에 대 한 매개 변수 선택 또한 높은 충실도 벡터 필드를 위해 긴요 하다. 최적의 SNR 일반적으로 여전히 충분 한 구슬 노출 (최소 노출 시간에 의해 제한 되 고 최대 프레임 속도)를 허용 하는 높은 달성 프레임 속도로 이루어집니다. 이득, 신호를 증폭 사용할 수 있습니다 하지만 이것 또한 센서 잡음을 증가 합니다. 최대 속도 다른 흐름 매개 변수 (예를 들어, 입구 체적 유량)에서 예상할 수 있는, 경우 다음 필요한 프레임 속도에 하한값 수 수 추정30다음 관계 사용 하 여.

Equation 1(1)

여기에서, f샘플링 은 카메라 수집 속도 (Hz), v최대 최대 예상된 속도 (mm/s), c교정 은 교정 상수 (픽셀/m m), 그리고 h심문 창 심문 창 (픽셀)의 크기입니다. 그러나, 더 많은 최적의 값 0 정규화 된 상관 계수11등 소위 상관 관계 품질 평가 기술을 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 이 기술에서는, 각 프레임 쌍에서 보완 신호의 평균 먼저 빼고 그리고, 다음, 그들의 농도11의 표준 편차에 의해 정규화. 있으면 원래 신호의 변위를 일치 하는 모든 봉우리와 계곡,이 신호의 시간 이동 값 하나를 같을 것입니다. 반대로, 이러한 신호를 정렬할 수 없습니다 변위는, 값 ' 0 '이 됩니다. 이 정보는 각 벡터에 대 한 ImageJ PIV 출력에 포함 하 고 공간 효과 가난한 상관 관계에 기여 하 고 있는지 여부를 확인 하는 자신의 필드로 그릴 수 있습니다 (예를 들어, 고르지 못한 조명). 상관 계수는 품질의 전반적인 견적으로 필드 평균 수 있습니다. 마지막으로,이 또한 다양 한 프레임 속도 또는 최적의 결정을 심문 창 크기에 대 한 그릴 수 있습니다. 그림 5 몬테카를로 합성 입자 필드를 사용 하 여 변위 우리의 실험적으로 측정 된 흐름 (전형적인 기술 상관 관계 품질11 대상이 일치와 같은 분석에서 결과를 보여 줍니다. ). 결과 표시는 입자 필드의 변화를 최소화 하면서 상관 계수를 극대화 하기 위해 프레임 쌍 당 심문 창 크기의 ≤ 20%에 의해 전치 심문 창 크기와 프레임 속도 선택 되어야 한다.

여기에 설명 된 프로토콜은 현재 응용 프로그램의 요구를 충족에 대 한 충분 한 입증 하고있다, 비록 그것은 그 한계를 인정 하는 것이 중요. 예를 들어 대비 향상을 통해 강도 상한 구현의 용이성 제공, 픽셀 농도의 전체 분포의 변환을 SNR 추가31높일 수 있습니다. 마찬가지로, 상관 관계 기반 추적 잘 설립 하 고 안정적으로 hemodynamics (예를 들어, 내 aneurysmal 속도)에 관련 된 1 차 흐름 특성을 예측에 대 한 충분 한 해상도 제공, 다른 기술을 수 있습니다. 제공 하는 더 높은 공간적 해상도 (예를 들어, 하이브리드 PIV/PTV, 최소 제곱 일치)32,33 그리고, 따라서, 정확성 속도 필드 해상도에 더 민감한 특성을 고려할 때 (예: , 벽 전단 응력, 평면 전단). 마찬가지로,는 NMT 교차 상관 후 속도 벡터 필드를 향상 시키기 위한 수단을 제공 한다, 그것은 단지 사용된24,34, 각각 될 수 있는 많은 벡터 유효성 검사 방법 중 하나 임을 강조 하는 것이 중요 그들의 자신의 독특한 장점 및 단점을 그들의 사용을 여기에 설명 된 응용 프로그램에 대 한 더 적합 한 만들 수 있습니다. 마지막으로, 여기에 설명 된 실험 설정 순수 관련 유량을 모방 하고자 길이 neurovasculature에 대 한 확장 하는 동안 그것은 허용 하지 않습니다 현재 타악기 흐름의 분석. 이 하지 이후 현재 응용 프로그램에 대 한 제한 범위 Womersley 숫자는 neurovasculature의 대부분에 경향이 있다 ≤ 1 (, 여러 심장 주기의 최소한의 첨가제 효과)35, 제안 그는 정상 상태 조건은 유량 비교에서는 심장 파형에 따라 개별 시간 포인트를 정리 하기에 충분 합니다. 그러나, 응용 프로그램 소개는 Arduino 사용 하 여 pulsatility에 대 한 더 큰 (예를 들어, 맥 관 구조 가까이 마음에), 우리는 잠재력을 구상 Womersley 수가 있는 수를 보내는 데 사용 펌프 시간 가변 PWM 전압 파형 심장 흐름 프로필36,,3738을 흉내 낸 수 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 선언할 수 없다.

Acknowledgements

저자는 공동 씨 그랜트 연구의 사무실 및 UC 리버 사이드에서 경제 개발에서에서 제공 하는이 프로젝트에 대 한 부분 지원을 인정 한다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211, (1), 55-76 (1997).
  2. Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9, (17), 2551 (2009).
  3. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
  4. Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73, (11), 1983-1992 (2009).
  5. Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23, (11), (2013).
  6. Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104, (4), 448-454 (2001).
  7. Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25, (3), 460-469 (1997).
  8. Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
  9. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  10. Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42, (2), 225-240 (2007).
  11. Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. Springer. New York, NY. (2007).
  12. Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74, (3), 321-334 (2014).
  13. Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30, (6), 768-777 (2002).
  14. Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37, (7), 1310-1321 (2009).
  15. Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19, (1), 117-122 (1964).
  16. Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370, (1), 25-29 (1977).
  17. Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26, (3), 329-332 (1934).
  18. Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
  19. Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9, (12), 113762 (2014).
  20. Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134, (8), 084505 (2012).
  21. Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46, (6), 841-848 (2018).
  22. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, (3), 035017 (2014).
  23. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75, (23), 6544-6554 (2003).
  24. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122, (2), 285 (2000).
  25. Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. (2006).
  26. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27, (5), 414-419 (1999).
  27. Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10, (2), 153-167 (2008).
  28. Kuo, C. -C., Mao, R. -C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31, (8), 1113-1118 (2016).
  29. Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12, (1), 014105 (2018).
  30. Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79, (1), 51-60 (2000).
  31. Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39, (32), 5978-5990 (2000).
  32. Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22, (3), 199-211 (1997).
  33. Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14, (3), 175-187 (1985).
  34. Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8, (12), 1493-1501 (1997).
  35. Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191, (1), 63-78 (1998).
  36. Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
  37. Tsai, W., Savaş, Ö Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (2), 197-201 (2010).
  38. Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23, (8), 1346-1351 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics