Mezo-ölçek Partikül İmaj Velosimetri çalışmaları nörovasküler Vitro akar

* These authors contributed equally
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada şeffaf nörovasküler hayaletler imalatı ve akışını orada karakterize için Basitleştirilmiş Yöntem mevcut. Biz birkaç önemli parametreler vurgulayın ve alan doğruluk ile ilişkilerini göstermektedir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Peck, R. A., Bahena, E., Jahan, R., Aguilar, G., Tsutsui, H., Princevac, M., Wilhelmus, M. M., Rao, M. P. Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro. J. Vis. Exp. (142), e58902, doi:10.3791/58902 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Partikül İmaj Velosimetri (PIV) çok çeşitli alanları, tam olarak görüntülenmesi ve büyük bir kronolojik zamanmekansal aralığında akışları miktarının sağlar fırsat nedeniyle kullanılır. Ancak, onun uygulanması genellikle daha geniş yararını sınırlar pahalı ve özel araçları kullanımı gerektirir. Ayrıca, Biyomühendislik alanı içinde vitro akışı görselleştirme çalışmaları aynı zamanda daha da çoğu kez istenen anatomik yapıları, özellikle için özetlemek ticari kaynaklı doku hayaletler yüksek maliyete göre sınırlı bu mesoscale rejimi (yani, submillimeter milimetre uzunluk ölçekler için) yayılır. Burada, biz basitleştirilmiş bir deneysel protokol hangi anahtar unsurları dahil 3-b baskı ve silikon döküm kullanarak mesoscale doku hayaletler imalatı için 1) bir nispeten düşük maliyetli yöntemi, bu sınırlamaları gidermek amacıyla geliştirilen mevcut ve 2) bir talep üzerine mesoscale akar ölçme araçları azaltır açık kaynak görüntü analizi ve işleme çerçeve (yani, onlarca milimetre kadar hızları/saniye). Toplu olarak, bu giriş engel nonexperts için kaynakları zaten birçok Biyomühendislik araştırmacılar emrinde yararlanarak düşürür. Biz bu protokolde nörovasküler akışı karakterizasyonu; bağlamında demonstratethe uygulanabilirliği Ancak, mesoscale uygulama Biyomühendislik ve ötesinde daha geniş bir yelpazesi ile ilgili olması bekleniyor.

Introduction

PIV Deneysel Akışkanlar Mekaniği akışı görselleştirme ve uzunluk ölçek atmosferik microcirculatory akar1,2,3değişir kantitatif araştırmalar sıvı hareket için yaygın olarak kullanılır. Onun uygulama özellikleri uygulamaları yaygın olarak değişebilir, bir yönü neredeyse tüm PIV çalışmaları ortak çalışma sıvı, üst üste görüntü kareleri pair-wise bir analiz tarafından takip içinde numaralı seribaşı izleyici parçacıkların video görüntüleme kullanımı iken istenen akış özellikleri ayıklamak için. Genellikle, bu ilk her resim çerçevesi sorgulama windows olarak adlandırılan daha küçük bölgelere ayırmaktan tarafından gerçekleştirilir. Dağınık parçaları rasgele konumlarını sonucu olarak, her sorgu penceresi piksel yoğunluklarını benzersiz bir dağıtım içerir. Pencere boyutu ve veri toplama hızı uygun şekilde seçilirse, çapraz korelasyon yoğunluğu sinyal her penceresinde bu bölgedeki ortalama deplasman tahmin etmek için kullanılabilir. Son olarak, verilen bu deneysel parametreleri bilinen büyütme ve kare hızı, bir anlık hız vektör alanı kolayca hesaplanabilir.

Tek nokta ölçüm teknikleri bir büyük avantajı PIV iki veya üç boyutlu etki alanı genelinde vektör alanları eşleştirmek için onun yetenek var. Damar hastalıkları veya remodeling (Örneğin, ateroskleroz, anjiogenez) önemli bir rol oynamaya bilinen yerel akışlarının ayrıntılı bir soruşturma sağlar beri hemodinamik uygulamalar, özellikle, bu yeteneği, yararlandı 4 , 5 , 6. bu da nörovasküler akar değerlendirme için gerçek oldu ve bunların etkileşimleri ile ilgili uzunluğu ölçekler Bu tür uygulamalarda beri endovasküler aygıt (Örneğin, akış diverters, restenoz, intrasaccular bobinler), olabilir sık sık bir veya daha fazla büyüklük (Örneğin, mikrometre milimetre için üzerinden) ve aygıt geometri yayılan ve yerleşim7yerel akışkanlar mekaniği önemli ölçüde etkileyebilir.

Birçok grup PIV tabanlı hemodinamik çalışmalar yürüten yakından bazı damar akışı7,8stent etkisinin en erken soruşturmaların taklit deneysel set-up üzerinde yararlanmıştır. Tipik olarak, bunlar içerir bir) Geniş puls Lazer ve yüksek hızlı akar; yakalamak için yüksek hızlı kameralar b) aliasing Darbe frekansını lazer ve kamera edinme kare hızı arasında önlemek için eşitleyici, c) silindirik optik, hafif bir sayfa oluşturur ve bu nedenle arka plan floresans saçılan izleyici sorgulama uçak altında ve üstünde en aza indirmek için; d) ticari komple sistemler durumunda of, özel mülk yazılım paketleri, çapraz korelasyon çözümlemesi yapma. Bazı uygulamalar performans ve/veya toplu olarak bu bileşenleri tarafından tanınan çok yönlülük gerektirirken, ancak, pek çok diğerleri yok. Ayrıca, ticari olarak kaynaklı doku istenen vasküler yapılar özetlemek hayaletler kanıtlayabilirim aynı zamanda yüksek maliyet birçok vitro çalışmalar için sınırlama özellikle hayaletler ile o köprüyü mesoscale rejimi özellikleri (> 500 YTL / Phantom). Burada, biz genellikle her ikisi de dağınık şekilde yalan nörovasküler akar ve geçici mesoscale rejimi (yani, uzunluğu ölçekler arasında değişen içinde vitro görselleştirme için PIV uygulamak için basitleştirilmiş bir protokol gelişimi raporu submillimeter milimetre ve hızları milimetre onlarca kadar gelen/saniye). İletişim kuralı zaten birçok Biyomühendislik araştırmacılar, böylece giriş engel nonexperts için indirim emrinde kaynakları kaldıraç istiyor.

Bu iletişim kuralı ilk unsuru saydam, polydimethylsiloxane (PDMS) kurum içi imalatı etkinleştirmek için bir yatırım döküm tekniği kullanımı içerir-doku hayaletler kurban kalıpları 3 3-d baskılı üzerinden dayalı. Son yıllarda, özellikle paylaşılan/multi-kullanıcıya özellikleri (Örneğin, kurumsal tesis veya genel makerspaces) 3 boyutlu yazıcılar artan kullanılabilirliğini yararlanarak, bu yöntemi maliyeti önemli ölçüde keser (Örneğin, < 100 YTL/phantom burada sunulan durumda), çok çeşitli tasarımlar ve geometriler imalatı için hızlı bir dönüş etkinleştirme sırasında. Geçerli protokol sistem modelleme erimiş ifade Akrilonitril bütadien stiren (ABS) yapı malzemesi olarak kullanılır ve yazdırılan bölümü sonraki hayalet döküm için kurban bir kalıp olarak hizmet vermektedir. Deneyimlerimiz ABS ortak çözücüler (Örneğin, aseton) çözünür olduğu ve yeterli güçlü ve sertlik destek malzeme kaldırıldıktan sonra kalıp bütünlüğünü korumak için bu tür kullanım için uygun olduğunu göstermiştir (Örneğin, için deformasyon veya kırık küçültme kalıp özellikleri önlemek). Bu pahasına artan Çözülme zamanı gelmesine rağmen geçerli iletişim kuralında, kalıp bütünlüğü daha fazla katı yazdırılan modelleri kullanarak sağlanır. İçi boş modelleri kullanımını da bazı durumlarda solvent erişim geliştirmek ve böylece, çözülme zamanı azaltmak için mümkün olabilir. Ancak, dikkatli dikkate verilmelidir için bu kalıp bütünlüğü üzerinde etkisi. Burada fabrikasyon hayaletler bir ortak bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılım paketi kullanılarak oluşturulan nörovasküler yapıları idealize temsilleri dayalı iken, son olarak, protokol daha karmaşık imalatı için mükellef olması bekleniyor , hastaya özgü geometrileri de (Örneğin, yolu ile klinik görüntüleme verileri için dönüştürme tarafından oluşturulan modeli dosyalarının kullanımı. Çoğu 3-b Yazıcı tarafından kullanılan STL dosya biçimi). Hayalet imalat sürecine ilişkin daha ayrıntılı bilgi Protokolü'nün 2 bölümünde sağlanır.

İkinci unsur iletişim kuralının bir açık kaynak ImageJ9çapraz korelasyon analizleri yapmak eklenti kullanımını gerektirir. Bu bir basit istatistiksel eşik düzeni uygulama ile birleştiğinde (yani, yoğunluk kapatma) normalleştirilmiş bir postcorrelation vektör doğrulama düzeni yanı sıra çapraz korelasyon önce görüntü sinyallerinin geliştirilmesi için10 medyan (NMT) her onun en yakın komşular11karşılaştırılması yoluyla sahte vektörel çizimler ortadan kaldırmak için test. Toplu olarak, bu sık böylece tipik PIV sistemleri (Örneğin, lazer, pahalı bileşenlerin çoğu edinimi için ihtiyacını ortadan kaldırarak birçok Biyomühendislik laboratuvarlarda bulunan donanımları kullanarak başarılı olmak görüntüleme sağlar Eşitleyici, silindirik optik ve özel mülk yazılım). Video koleksiyonu, görüntü işleme ve veri analizi ile ilgili daha fazla bilgi 5 ve 6 protokolünün bölümlerde verilmiştir.

İçin görüntüleme, bir harici yanı sıra sürekli beyaz ışık kaynağı (yani, metal halide lamba) için yüksek hızlı bir fotoğraf makinesi ile donatılmış bir floresan mikroskop üzerine dayanır bu iletişim kuralı kullanıldığında PIV set-up Şekil 1 gösterir amacı ile hacimsel aydınlatma. Değişken hız dişli pompa nörovasküler doku hayaletler şeffaf sahte kan çözüme dolaşım akışını dayatmaya kullanılır. Çözüm deiyonize (DI) su ve gliserol, hangi ortak bir alternatiftir nedeniyle12,13,14, kan hemodinamik çalışmalar için 60:40 karışımından oluşan bir) benzer yoğunluğu ve (yani, viskozite 1080 kg/m3 ve 3,5 cP vs 1,050 kg/m3 ve 3-5 cP kan için)15,16; b) görünen aralığın kendi şeffaflık; c) benzer onun kırılma indisi hangi optik bozulma en aza indirgemek PDMS (1,38 vs 1.42 için PDMS)17,18,19,20, olarak; d) hangi ile Newton olmayan davranış tanıtılacaktır, gerekirse, kolaylığı ile xanthane21eklenmesi. Son olarak, floresan polistren boncuk izleyici tanecik (çapı 10.3 µm; 480 nm/501 nm uyarma/emisyon) olarak kullanılır. Yansıtmaya batmaz boncuk istenen süre izleyici parçacıkları en uygun sıvı mekanik özellikleri (Örneğin, yoğunluk, boyutu, kompozisyon) ve emisyon dalga boyu ile kaynak zorlu kanıtlayabilirim. Örneğin, burada kullanılan boncuklar gliserol çözüm (1,050 kg/m3 vs 1080 kg/m3) daha biraz daha az yoğun. Ancak, bunların, hidrodinamik etkileri göz önüne alındığında ihmal edilebilir, tipik bir deneme süresi kadar yüzdürme etkileri ile ilişkili zaman ölçeğini daha kısadır (yani, 5 min ve 20 dk, sırasıyla). Daha fazla çözüm formülasyonu ve vitro sahte kan dolaşım sistemi kurulumu ile ilgili detayları 3 ve 4 Protokolü'nün bölümlerde verilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ABS tabanlı kurban kalıp imalat

  1. CAD yazılımı kullanarak istenilen doku Hayalet'in ters bir modeli tasarım.
  2. 3-b Yazıcı ABS ile yapı malzemesi olarak kullanan modeli yazdırın.

2. PDMS tabanlı vasküler hayalet imalat

  1. Karıştırma
    1. Mix PDMS prepolimer Bankası ve kür Ajan 10:1 oranında (ağırlığa göre); 66 g karışım için 50 cm3hayaletler birimlerle imalatı için yeterli malzeme sağlar.
    2. Karışım degas ve kabarcık tuzak en aza indirmek için bir vakum desiccator içinde 60 dakika yerleştirin. Kabarcık rüptürü kolaylaştırmak için döngüsel basınçlandırma/depressurization kullanın.
  2. Döküm
    1. Yazdırılan ABS kalıp arabirimi imzalamaya kalıp putty kullanarak bir cam slayt üzerinde bağlayın.
    2. Dikkatle PDMS karışımı kabarcık tuzak en aza indirmek çalışırken kalıp içine dökün. Kalan kabarcıklar el ile bir iğne kullanarak yırtılmış.
    3. Döküm phantom (25 ° C) Oda sıcaklığında en az 24 saat tedavi.
      Not: daha yüksek sıcaklıklarda, bu işlem hızlandırılmış22olabilir.
  3. Demolding
    1. Operadaki hayalet aseton içinde batış ve en az 15 dakika kadar 70 W. güçlerini kullanarak, sonicating ABS dağıtılması
      Dikkat: Aseton yüksek buhar basıncı oda sıcaklığında ve düşük bir parlama noktası vardır. Sonuç olarak, her zaman bir duman başlık altında ve potansiyel ateşleme kaynakları uzak iş. Uygun kişisel koruyucu donanım (Örneğin, gözlük ya da yüz kalkan, laboratuvar önlüğü, aseton dayanıklı eldivenler) giymek.
    2. Operadaki hayalet izopropil alkol ve sonra solvent artıkları temizlemek için DI suyla iyice durulayın.
      Not: Aseton maruz üzerine PDMS şişer; Ancak, bir kez hayalet durulanır ve yeterince23kurutulmuş şişlik azalır.
  4. Hayalet sadakat optik mikroskobu kullanarak onay
    1. Bir optik mikroskobu ile bir ekli fotoğraf makinesi ve görüntü yakalama yazılımı kullanarak, Operadaki hayalet görüş alanı içinde özellik en üst düzeye çıkaran bir büyütme altında içinde kritik bir özellik yansımasını yakalayacak.
    2. Bir uygun kalibrasyon dürbün ağı aynı büyütmede yansımasını yakalayacak.
    3. Her iki resimler araç çubuğusürükleyerek ImageJ yükleyin.
    4. Etkin hale getirmek için kalibrasyon dürbün ağı resmin üzerine tıklayın ve sonra çizgi aracını seçin. Bir özellik seçin ve bir bilinen mesafe boyunca bir çizgi çizmek istimal belgili tanımlık fare Analiz > Ölçeği Ayarla ImageJ menüsünden.
      Not: Ölçeği Ayarla penceresinde uzaklığını piksel etiketli alan çizilmiş çizgiyi birimlerinde piksel uzunluğu ile doldurulmuş.
    5. Özelliğinin uzunluğu Bilinen mesafeve onun birim Uzunluk birimietiketli alana etiketli alanına girin. Bu kalibrasyon faktörü tüm açık resimlere uygulamak için Global etiketli kutuyu işaretleyin.
    6. Hayalet kritik özelliği görüntü etkin duruma getirmek ve bir özellik ilgi boyunca bir çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. ImageJ menüde Analiz > ölçü birimi (ya da Ctrl + Mtuşlarına basın) satır uzunluğunu ölçmek için.
    7. Hayalet sadakat onaylamak için uzunluğu sonuçları penceresinde işaretlenmiş sütunundaki değeri beklenen değeri karşılaştırın.

3. kan çözüm formülasyonu alay

  1. DI mix su ve gliserol 60:40 oranında (hacimce).
    Not: 100 mL cilt vitro dolaşım burada açıklanan sistemi için yeterlidir.
  2. 1 mL % 2,5 w/v floresan polistren boncuk çözeltisi (yani, izleyici parçacıklar) sahte kan ekleyin.
  3. Karışımı 10 dakika için 400 rpm manyetik heyecan tabakta lunaparkçı.

4. Vitro dolaşım sistemi kurulumu

  1. Set-up pompa
    1. AC-DC adaptörü güç kaynağından DC uç fiş kesmek için bir tel striptizci aracını kullanın.
    2. Kaplama gücü kapalı şerit ve teller yer ve onlara darbe genişlik modülasyonu (PWM) voltaj regülatörü giriş terminaline bağlayın.
    3. Güç ve zemin teller pompanın DC motor PWM voltaj regülatörü çıkış terminaline bağlayın.
      Not: PWM'ın yedi-segment ekran (% 0 - % 100) DC motor için değişken bir gerilim elde etmek için kullanılan iş hacmi çıkarır.
  2. Kalibrasyon pompa
    1. 200 mL sahte kan çözeltisi (bakınız Bölüm 3) hazırlayın.
    2. Boru pompa giriş sahte kan çözüm holding kabı yerleştirin.
    3. Boş bir kabı için pompa prizinden boru yerleştirin.
    4. İstenen görev döngüsü ayar noktası seçin (% 0 - %100). Üzerinde düğmesine basın ve bir zamanlayıcıyı başlatmak.
    5. Bir kez pompa birimin tümü sahte kan çözüm aktarmıştır sayacý durdurmak. Bu sefer hacimsel akış oranını hesaplamak için kullanın.
    6. 4.2.1 - 4.2.5 en küçük kareler regresyon eğrisi kurmak en az beş farklı görev döngüsü set puan için yineleyin.
      Not: En az üç Çoğalt puanı her görev döngüsü set noktası önerilir. Bu ilişki istenilen Debi gerekli PWM iş hacmi için ilişkilendirmek için kullanılabilir.

5. video koleksiyonu

  1. Görüntü kalibrasyonu
    1. Video görüntüleme (bakınız Bölüm 2) için kalibrasyon oranını belirler.
  2. Cihaz kurulumu
    1. Operadaki hayalet PDMS floresan mikroskop sahnesinde yerini.
    2. Hayalet dişli pompa bağlanmak ve sahte kan çözüm tanıtmak.
      Not: İsteğe bağlı olarak, prefill modeli tam kolaylaştırmak için etanol ile ıslatma; o zaman, floş ve sahte kan çözüm ile doldurun. Bu küçük gemi ve/veya kör özellikleri sahip modeller için özellikle yararlı olabilir.
    3. Pompa motor kontrolörü pompa kalibrasyon eğrisi üzerinde göre istenen akış hızı için ayarlayın.
    4. 1-5 dk önce kararlı durum koşulları sağlamak için deneme için pompa çalıştırmak.
    5. Görüş alanı aydınlatmak için dış lambayı açın. Floresan boncuk uyarma dalga boyu dayalı bir uygun filtreyi seçin.
    6. Görüntüleme odak düzlem gemi midplane için ayarlayın.
      Not: Bu görüntülü gemi kesit en üst düzeye çıkaran bir odak uzaklığı kullanarak elde edilebilir (hayaletler ile dairesel gemi kullanırkenÖrneğin, kesitleri); ve/veya gemi orta uçak tanımlaması kolaylaştırmak için tasarlanmış bir hayalet özelliği kapalı dizin oluşturma.
  3. Video kaydı
    1. Sinyal-gürültü oranı (SNR) en iyi duruma getirmek için video kayıt parametreleri seçin. Anahtar parametreleri çekim hızı, kare hızı, içerir ve kazanç.
      Not: Bu protokol için 2.000 fps kare hızı ve bir kazanç 1.0 kullanın. Ancak, bu parametreler uygulama göre değişebilir (daha fazla ayrıntı için tartışma bölümüne bakın).
    2. Video toplamak ve AVI formatında kaydedin.
  4. Hayalet temizlik
    1. Boncuk yapışmasını bir deneyden sonra gözlem yapılırsa, Operadaki hayalet güçlerini W. 70 kadar sulu bir deterjan solüsyonunda solüsyon içeren temizleyicide

6. görüntü işleme ve veri analizi

  1. Görüntü ön işleme
    1. Kaydedilmiş AVI dosyasını içe aktarmak için ImageJ pencere sürükleyin. Gri tonlamaya dönüştürmeişaretlenmiş kutusunu seçin.
    2. ImageJ menüde Analiz > çubuk grafik oluşturmak (veya Ctrl + Htuşlarına basın) görüntü piksel yoğunluklarını bir çubuk grafik oluşturmak için. Ortalama ve standart sapma için işlenmemiş görüntü dikkat edin.
      Not: yüksek kare hızlarında bu dağıtım ağır sıfıra doğru eğilmiş anormal değildir (yani, sinyal yok).
    3. ImageJ menüde Görüntü > Ayarla > parlaklık ve kontrast (ya da Shift + Ctrl + Htuşlarına basın) parlaklık/kontrast filtre uygulamak için.
    4. Parlaklık ve kontrastı menüsünde görüntü sınırlarını tanımlamak için Ayarla düğmesine basın. Ortalama değeri artı bir standart sapma ve en yüksek değere (her ikisi de 6.1.2. adımda elde istatistik dayalı) görüntü maksimum yoğunluğu en az bir değere ayarlayın.
      Not: Bu genellikle tüm ilk % 10 'un piksel yoğunluklarını ortadan kaldırır. Standart sapmalar sayıda piksel yoğunluklarını istenen dağıtım bağlı olarak farklı olabilir. İşlem kapatma yoğunluğu gerçekleştirmek için özel makro komut dosyası Ek malzemelersağlanmaktadır.
    5. ImageJ menüde işlem > Noise > Despeckle doymuş piksel sayısını azaltmak için.
      Not: Bu işlem için parlaklık ve kontrast, sahte vektörel çizimler sırasında sonraki çapraz korelasyon üretebilen en iyileştirme sırasında doğar piksel doygunluk artan potansiyel tarafından gerektirdiği.
    6. ImageJ menüde işlem > Filtre > Gaussian Blur kaynaklanan bir 3 x 3 mahallede ışıklı piksellerin ara sıra kaldırma işlemi despeckling rahip tarafından eserler azaltmak için 1.5 yarıçaplı.
    7. Çokgen aracını tıklatın ve ardından, faiz (ROI) bölge anahat için resmin üzerine tıklayın.
    8. ImageJ menüde Düzenle > net dış sinyal yok nerede yerlerde sensör gürültü çıkarmak için beklenen (Örneğin, gemi Duvar sınır ötesinde alanlarda), hangi genel SNR düşürebilir.
  2. PIV hesaplama
    Not: Bu bölümü Protokolü'nün Gauss en yüksek bir tahmin deplasman altpiksel hassasiyetle etkinleştirmek için montaj üzerine dayanır ImageJ için bir üçüncü taraf PIV eklentisi kullanır.
    1. ImageJ menüde Eklentiler > makrolar > çalıştırmak... ve kaydedilen makro çapraz-art arda gelen görüntü çiftleri ilişkili için tamamlayıcı kod 2. ijjm gidin.
      Not: Aşağıdaki gibi makro çalışır. 1) bir çapraz korelasyon ardışık görüntüler içinde yoğunluğu alanının ilk advected izleyici parçacıklar (yani, birinci ve ikinci görüntülerini, ikinci görüntü çift çifti oluşur ilk görüntü yerel yerinden belirlemek için gerçekleştirilir oluşur ikinci ve üçüncü görüntüleri, vb). 2) bir iki adım multipass değerlendirme sonra sırasıyla ilk ve son sorgulama pencere boyutlarında 256 x 256 piksel ve 128 x 128 piksel, ile gerçekleştirilir. Son olarak, 3) makro sahte vektörel çizimler görünümünü daha da azaltmak için geçici bir ortalama gerçekleştirir.
  3. Normalleştirilmiş ortalama test (NMT)
    1. ImageJ menüde Eklentiler > makrolar > çalıştırmak... ve kaydedilen makro hız alanları üzerinden doğrulamak için tamamlayıcı kod 3. ijjm normalleştirilmiş ortalama test gidin.
      Not: Aşağıdaki gibi makro çalışır. 1) bir anlık vektör alanı her vektör ilk ortanca değer hesaplamak için sekiz yakın komşuları için karşılaştırılır. 2) hataları içeren bir dizi artık sonra komşu her vektör ve hesaplanan medyan arasındaki fark olarak hesaplanır. 3) soruşturma altında vektör ve ortanca komşu vektör değer arasındaki fark sonra kalanlar sayılarının normalleştirilmiş. 4) bu sonra resim alma sırasında bir muhtemel gürültü bilgisine göre değiştirilebilir bir eşik değeri (genellikle, 0.2 piksel), karşılaştırılır. Son olarak, 5) Bu vektör alanı kalite24artırmak için gösterdiği gibi tüm doğrulanmış anlık vektör alanların zamansal bir ortalama bileşik bir alan oluşturmasını gerçekleştirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2 PDMS doku hayalet üretim işlemini göstermektedir. Burada tasarlanmış hayaletler idealize geniş yakalı, saccular, intrakranial anevrizma, hem de proksimal dallanma perforator arter akışında çalışma için tasarlanmıştır. Önemli ek tasarım) şekil katmak 1 damlacık oluşumu daha küçük gemi çıkışları; oluşabilir hayalet - Aksi takdirde, gelen ipoteksiz sıvı çıkış sağlamak için içine, tüm gemilerin tahliye ortak bir rezervuar 2) kabarcık kaldırma kolaylaştırmak için bir kabarcık tuzak; 3) bir dış boşluğu yatay düzlemde ile gemi parallelism, hem de son hayalet levhanın yüksekliği, uzunluğu ve genişliği kesin bir tanımını sağlamak için duvar, 4) gibi özellikleri yeterli sadakat ile tanımlamak için bizim yazıcının yetersizlik nedeniyle perforator arter yoğurmak için 21 G Hipodermik iğne shank (820 µm anma dış çap içinde) kullanımı. Tüm tasarım özelliklerine sadık çoğaltılması boyunca görülmektedir.

Geçerli iletişim kuralı kullanılarak gerçekleştirilen PIV tabanlı akış karakterizasyonu temsilcisi sonuçları Şekil 3 ve Şekil 4sunulmuştur. Bu çalışmalar hayalet giriş akış hızı 100 mL/dk, 2.000 fps, veri edinme oranları kullanılarak gerçekleştirilen ve zamansal 0,05 s. Şekil 3 açıklıklı ortalama temsilcisi görüntü kareleri perforator arter içinde önce ve sonra gösterir Yoğunluk kapatma, aynı zamanda 8-bit pixel yoğunluk değerleri ve karşılık gelen yüzey araziler. Her ikisi de yoğunluk kapatma önemli ölçüde sonraki çapraz korelasyon gerçekleştirirken doğruluğu sağlamak için kritik gürültü tabanından (yani, artar SNR), en yüksek tanım artırır göstermek. Şekil 4 yoğunluğu kapatma ve hız vektör alanı NMT işlemleri etkilerini gösterir. Böylece daha fazla veri çıkarma en aza indirmek için SNR en üst düzeye çıkarma önemini vurgulamış alan tekdüzelik belirgin iyileşme görülmektedir.

Figure 1
Resim 1 : Partikül İmaj Velosimetri set-up. Bir açık kaynak görüntü analizi ve bir ön/post-processing çerçeve üzerine güven mesoscale akar, böylece birçok tipik PIV sistemleri (DarbeliÖrneğin, pahalı bileşen gereksinimini ortadan kaldırarak ölçme araçları üzerine talep azaltır Lazer, eşitleyici, silindirik optik, ve/veya özel mülk yazılım). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Doku PDMS tabanlı hayalet imalat süreci. (Bir) bir CAD modeli yazdırılan ABS kalıp destek malzeme, (c) döküm kaldırıldıktan sonra nörovasküler hayalet kalıp, (b) ve ABS kalıp içinde ABS (d) kısmi dağılması PDMS kür görüntüleri göstermek malzeme ve (e) tamamlanan PDMS hayalet kritik özellikleri son boyutlarının yanı sıra PIV ölçümleri yapıldığı bölge perforator arter (ROI) ilgi gösterilen ilave ile kalıp. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : SNR görüntü işlemi kapatma yoğunluğu etkisi. Bu paneller temsili resim çerçeveleri ve karşılık gelen piksel yoğunluğu yüzey araziler perforator arter, (bir ve içinde b) önce göstermek ve (c ve d) işlemi kapatma yoğunluğu uygulandıktan sonra. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Yoğunluk kapatma ve NMT işlemleri hızı üzerinde etkileri vektör alanları. Bu paneller temsilcisi anlık hız vektör alan türetilmiş perforator arter içinde göstermek (bir) işlenmemiş görüntü verilerini, (b) veri yoğunluğu şapkalı ve (c) veri yoğunluğu şapkalı + NMT post-processing . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Sorgulama pencere boyutlandırma korelasyon kalitesine etkisi. En iyi pencere boyutlandırma sıfır normalleştirilmiş korelasyon katsayısının değeri maksimize ve standart sapma simge durumunda oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokol burada fizyolojik olarak ilgili boyutları ve akış koşulları içinde vitronörovasküler görselleştirmek için PIV çalışmaları gerçekleştirmek için basitleştirilmiş bir yöntem akar ana hatlarıyla açıklanan. Bunu yaparken, bu da miktar vektör alanlarının, ama çok daha büyük uzunluğu dikkate25 veya daha düşük akış ölçekler gerektiren çok farklı bağlamlarda içinde kolaylaştırmanın üzerinde odaklanmıştır başkaları tarafından bildirilen protokoller tamamlayacak hizmet vermektedir 26,27 (Örneğin, atmosferik veya microcirculatory akışı), oranları ve böylece, geçerli uygulama ile uyumsuzdur düzenleri üzerine bir güven ile.

PIV başarılı uygulanması için en önemli konuları akışı alan eserler indirilmesi ve görüntü kalitesi maksimizasyonu yalan. Doku hayalet imalat işleminin birkaç adımda iki ölçütü için kritik öneme sahiptir. Karıştırma sırasında içinde PDMS entrained hava kabarcık oluşumu içinde özellik sadakat ve optik netlik olumsuz yönde etkilenebilir son hayalet neden olabilir bu yana, tam gaz giderme çok önemlidir. PDMS döküm işlemi sadakatle (Örneğin, yapı satırları, yüzey gözenekleri, çizikler), hatta en dakika kusurları üretir beri Ayrıca, ABS kalıp yüzey pürüzlülüğü indirilmesi, arzu edilir böylece yüzey pürüzlülüğü elde optik netlik azaltmak ve boncuk biriktirme potansiyeli artırmak son hayalet. Burada açıklanan iletişim kuralı geçerli uygulama için yeterli kanıtlamıştır ederken, orada çok sayıda rapor böyle pürüzlülüğü azaltmak anlamına gelir literatürde orada herhangi bir ihtiyaç olması gerektiğini (Örneğin,28 yumuşatma aseton buharı veya Katman kalınlığı ve bölüm yönünün bina yönü ile ilgili olarak en iyi duruma getirme)29.

Video yakalama için parametre seçimi de yüksek kaliteli vektör alanı sağlamak için önemlidir. Bir en iyi SNR genellikle hala yeterli boncuk pozlama (maksimum frame hızı en az pozlama süresi ile sınırlı olmak) izin veren en yüksek ulaşılabilir kare hızında elde edilir. Kazanç sinyali yükseltmek için kullanılabilir, ancak bu de sensör gürültü artar. Maksimum hız (Örneğin, giriş hacimsel debi) diğer akış parametrelerinin tahmin edilebilir eğer, o zaman gerekli kare hızı bir alt sınırı aşağıdaki ilişki30kullanarak tahmin edilebilir.

Equation 1(1)

Burada förnekleme olduğunu kamera satın alma hızı (Hz), vmax olduğunu en çok beklenen hızı (mm/s), ckalibrasyon kalibrasyon sabit (piksel/mm) ve hsorgu penceresi sorgu penceresi (piksel) boyutudur. Ancak, daha fazla en iyi değerleri korelasyon katsayısı sıfır normalleştirilmiş11gibi sözde korelasyon kalitesi tahmin teknikleri kullanarak belirlenebilir. Bu teknikte, her çerçeve çifti tamamlayıcı sinyalleri ortalamalar ilk düşülen olup, o zaman, onların yoğunluklarda11tarafından standart sapması normalleştirilmiş. Orijinal sinyal bir yer varsa, tüm tepeler ve vadiler maç öyle ki bu sinyal zaman kaymıştır değeri birine eşit olacaktır. Tersine, bu sinyalleri hizalayabilirsiniz herhangi bir öteleme ise, değer sıfır olur. Bu bilgiler her vektör ImageJ PIV çıktı vardır ve mekansal etkileri için zavallı korelasyon katkıda bulunan olup olmadığını doğrulamak için kendi alanı olarak çizilebilir (Örneğin, düzensiz aydınlatma). Korelasyon katsayısı da kalite genel bir tahmin olarak bir alan ortalama. Son olarak, bu miktar da farklı kare hızları veya en uygun belirlemek için sorgu pencere boyutları karşı çizilen. Şekil 5 ile talebiyle bizim deneysel olarak ölçülen akar (korelasyon kalite11 karakterize tipik tekniği ile tutarlı bir parçacık Monte Carlo sentezlenmiş alanını kullanarak böyle bir analiz sonuçlarından göstermektedir ). Öyle ki bir parçacık alan sorgulama pencere boyutu her onun değişkenlik en aza indirerek korelasyon katsayısı en üst düzeye çıkarmak için çerçeve çifti ≤ 20 oranında yerlerinden olduğunu sorgulama pencere boyutu ve kare hızına seçilmelidir sonuçlar gösterir.

Burada açıklanan iletişim kuralı geçerli uygulama ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli kanıtlamıştır rağmen kendi sınırlamaları kabul etmek önemlidir. Örneğin, yoğunluk kapatma ile kontrast geliştirme uygulama kolaylığı sunarken, dönüşümleri piksel yoğunluklarını tüm dağıtım SNR daha fazla31artırabilir. Korelasyon tabanlı izleme iyi kurulmuş ve güvenilir bir şekilde birinci dereceden akış özellikleri hemodinami (Örneğin, içi aneurysmal hız) ilgili tahmin etmek için yeterli çözüm sağlar, ancak benzer şekilde, diğer teknikleri olabilir bir daha yüksek uzaysal çözünürlük (Örneğin, karma PIV/PTV, en küçük kareler eşleşen) teklif32,33 ve böylece, hız alanı çözünürlük için daha hassas özellikleri göz önünde bulundurarak daha doğru (Örneğin , duvar kesme stres, uçak vorticity). NMT çapraz korelasyon sonra hız vektör alanı artırmak için bir araç sağlar, aynı şekilde, bu sadece bir kullanılan24,34, her biri olabilir birçok vektör doğrulama teknikleri bu vurgulamak önemlidir kendi benzersiz avantajları ve dezavantajları bunların kullanımı için burada açıklanan dışındaki uygulamaların daha uygun hale getirebilir. Son olarak, burada açıklanan deneysel set-up fizyolojik ilgili akış oranları taklit etmek istiyor ve uzunluğu neurovasculature için ölçekler iken, bu şu anda pulsatil akımları Analizi izin vermiyor. Neurovasculature çoğunu Womersley aralığı sayı ≤ 1 olma eğilimindedir bu yana bu bir sınırlama geçerli uygulama için henüz (yani, birden fazla kalp döngüleri en az bir katkı etkisi) bu öneriyor35, kararlı durum koşulları akış hızı karşılaştırılabilir olduğu kardiyak dalga boyunca ayrı zaman noktaları özetlemek yeterlidir. Ancak, Womersley numarası (Biz bir potansiyel öngörülüyor büyükÖrneğin, damarlara yakın kalp), rezistivite bir Arduino kullanarak tanıtmak için nerede uygulamalar için hangi pompa bir saat değişen PWM voltaj göndermek için kullanılabilir bir kardiyak akışı profil36,37,38' taklit sağlayan dalga biçimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar bildirmek için bir şey yok.

Acknowledgements

Yazarlar araştırma Office ve UC Riverside, ekonomik kalkınma işbirliği tohum hibe tarafından sağlanan bu proje için kısmi destek kabul etmiş oluyorsunuz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solidworks 2015 Dassault Systems N/A CAD Software 
Dow Corning Sylgard 184 Kit Ellsworth Adhesive 184 SIL ELAST KIT 3.9KG PDMS Kit
Stratasys Dimension Elite Stratasys 9180-00105 3D printer
P430 Model Material Cartridge Stratasys 340-21202 ABS build material 
P400 SR Soluble Support Material Cartridge Stratasys 340-30200 Support material
CleanStation DT3 PM3 Technologies 00-00300R Base bath
Lindberg Blue M LGO Box Furnace  Thermo Scientific LB305745M Oven
21G BD PrecisionGlide Needle Betcon Dickenson BD 305167 Branching perforator mold segment
Desiccator (Vacuum) Polylab 55205 Desiccator
Branson 1800 Utrasonic Cleaning Branson CPX-952-116R Sonicator
Acetone Fisher Chemical A9494 Acetone
Isopropol Alcohol Fisher Chemical A4514 Isopropol Alcohol
Glycerol Fisher Chemical GW33500 Glycerol
10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles Magsphere PSF-010UM Fluorescent beads
Phantom Miro  Vision Research Miro M310 High speed camera
Micropump Cole-Parmer 81101 Recirculating pump
Leica DM2000 Leica Microsystems DM2000 Fluorescent Microscope
Leica 10X Objective Leica Microsystems 506259 Objective for perforator
Leica 2.5X Objective Leica Microsystems 11506083 Objective aneurysm sac
Leica Blue Filter Cube L5 Leica Microsystems 513840 Blue filter cube
Leica EL6000 Leica Microsystems 11504115 Light source
Alconox Alconox Inc 1104-1 Detergent
ImageJ NIH N/A Open source image analysis software
https://imagej.nih.gov/ij/
Particle Image Velocimetry PIV Plugin Qingson Tseng N/A https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211, (1), 55-76 (1997).
  2. Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9, (17), 2551 (2009).
  3. Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
  4. Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73, (11), 1983-1992 (2009).
  5. Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23, (11), (2013).
  6. Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104, (4), 448-454 (2001).
  7. Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25, (3), 460-469 (1997).
  8. Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
  9. Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (5), 1506-1511 (2012).
  10. Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42, (2), 225-240 (2007).
  11. Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. Springer. New York, NY. (2007).
  12. Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74, (3), 321-334 (2014).
  13. Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30, (6), 768-777 (2002).
  14. Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37, (7), 1310-1321 (2009).
  15. Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19, (1), 117-122 (1964).
  16. Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370, (1), 25-29 (1977).
  17. Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26, (3), 329-332 (1934).
  18. Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
  19. Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9, (12), 113762 (2014).
  20. Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134, (8), 084505 (2012).
  21. Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46, (6), 841-848 (2018).
  22. Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24, (3), 035017 (2014).
  23. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75, (23), 6544-6554 (2003).
  24. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122, (2), 285 (2000).
  25. Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. (2006).
  26. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27, (5), 414-419 (1999).
  27. Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10, (2), 153-167 (2008).
  28. Kuo, C. -C., Mao, R. -C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31, (8), 1113-1118 (2016).
  29. Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12, (1), 014105 (2018).
  30. Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79, (1), 51-60 (2000).
  31. Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39, (32), 5978-5990 (2000).
  32. Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22, (3), 199-211 (1997).
  33. Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14, (3), 175-187 (1985).
  34. Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8, (12), 1493-1501 (1997).
  35. Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191, (1), 63-78 (1998).
  36. Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
  37. Tsai, W., Savaş, Ö Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (2), 197-201 (2010).
  38. Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23, (8), 1346-1351 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics