Evaluering af biomarkører i gliom af Immunhistokemi på Paraffin-Embedded 3D gliom Neurosphere kulturer

Cancer Research

GE Global Research must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Neurospheres dyrkes som 3D kulturer udgør et kraftfuldt værktøj til at studere gliom biologi. Her præsenterer vi en protokol for at udføre Immunhistokemi samtidig bevare 3D-struktur af gliom neurospheres gennem integrering af paraffin. Denne metode gør det muligt for karakterisering af gliom neurosphere egenskaber som stemness og neurale differentiering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Núñez, F. J., Mendez, F. M., Garcia-Fabiani, M. B., Pardo, J., Edwards, M., Lowenstein, P. R., Castro, M. G. Evaluation of Biomarkers in Glioma by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp. (143), e58931, doi:10.3791/58931 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analyse af protein udtryk i gliom er relevant for flere aspekter i studiet af dens patologi. Mange proteiner er blevet beskrevet som biomarkører med programmer i diagnose, prognose, klassificering, tilstand af tumor progression og celle differentiering stat. Disse analyser af biomarkører er også nyttige til at karakterisere tumor neurospheres (NS) genereret fra gliom patienter og gliom modeller. Tumor NS giver en værdifuld in vitro- model for at vurdere forskellige funktioner af tumor, som de afledes og kan mere præcist spejl gliom biologi. Her beskriver vi en detaljeret metode til at analysere biomarkører i tumor NS ved hjælp af Immunhistokemi (IHC) på paraffin-indlejret svulst NS.

Introduction

Gliomer er primære solide tumorer i det centrale nervesystem, klassificeret efter deres fænotypiske og genotypiske karakteristika ifølge World Health Organization1. Denne klassificering inkorporerer tilstedeværelsen eller fraværet af driver mutationer, som repræsenterer en attraktiv kilde af biomarkører2. Biomarkører er biologiske karakteristika, der kan måles og evalueres for at angive normale og patologiske processer, samt farmakologiske svar til en terapeutisk intervention3. Biomarkører kan påvises i tumor væv og celler, der stammer fra gliom, aktivering af sin biologiske karakterisering i forskellige aspekter. Nogle eksempler på gliom biomarkører muterede isocitrat dehydrogenase 1 (IDH1), en mutant enzym karakteristisk for lavere-grade gliomer forbundet med bedre prognose4. Muterede IDH1 udtrykkes ofte i kombination med TP53 og alpha-thalassæmi/mental retardering syndrom X-linked (ATRX)-uvirksomme mutationer, definere en specifik gliom subtype4,5. ATRX-uvirksomme mutationer også forekomme i 44% af pediatric high-grade gliomer2,6 og har været forbundet med aggressive tumorer og genomisk ustabilitet6,7. Derudover er pediatric diffuse iboende pontine gliomer (DIPG) differentieret i undergrupper efter tilstedeværelsen eller fraværet af en K27M mutation i Histon H3 gen H3F3A eller i HIST1H3B/C gen1,6. Derfor indførelsen af Molekylær karakterisering tillader inddeling, undersøgelse og behandling af gliomer som separate enheder, som tillader mere udvikling af mere målrettede behandlinger for hver undertype. Derudover kan analyse af biomarkører bruges til at vurdere forskellige biologiske processer såsom apoptose8, autophagy9, celle cyklus progression10, celle spredning11og Celledifferentiering12 .

Gensplejsede dyremodeller, der nærer de genetiske læsioner i menneskelige kræftformer er vigtige for studiet af signalering veje, der mægle sygdomsprogression. Vores laboratorium har implementeret brugen af sovende skønhed (SB) transposase system til at udvikle genetisk modificerede musemodeller af gliom husly specifikke mutationer, at sammenfatte menneskelige gliom undertyper13,14. Disse genetisk modificerede musemodeller bruges til at generere tumor-afledte NS, som aktiverer in vitro- undersøgelser i en 3D system, spejling Sukkerøkonomien i hovedtræk i tumorer in situ15. Orthotopical transplantation af NS ind i musene kan generere sekundære tumorer, der bevarer funktioner af den primære tumor og efterligne de histopatologiske, genomiske og fænotypiske egenskaber af den tilsvarende primære tumor15.

I serumfrit kultur, hjerne tumorceller med stamcelle egenskaber kan blive beriget og epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblast vækstfaktorer (FGF), de kan dyrkes som enkelt celle-afledte kolonier som NS kulturer. I dette selektive kultur system dør de fleste differentiering eller differentierede celler hurtigt, mens stamceller Divider og danner de cellulære klynger. Dette giver mulighed for generation af en NS kultur, der vedligeholder gliom tumor funktioner16,17,18. Gliom NS kan bruges til at evaluere flere aspekter af tumor biology, herunder analyse af biomarkører, som har applikationer i diagnose, prognose, klassificering, tilstand af tumor progression og celle differentiering stat. Her, vi detalje en protokol til at generere gliom NS og Integrer 3D kulturer i paraffin anvendes til IHC farvning. En fordel ved fastsættelse og indlejring gliom NS er, at morfologi af NS er vedligeholdt bedre i forhold til de konventionelle cytospin metode19, i hvilke gliom NS udsættes for stressende manipulation for celle dissociation og blive fladtrykt. Derudover slukker indlejring enhver endogene fluorophore udtryk fra gensplejsede tumor NS, aktivering af farvning på tværs af de fluorescerende spektre. Det overordnede mål med denne metode er at bevare 3D-struktur af gliom celler gennem en paraffin indlejring proces og aktiverer karakterisering af gliom neurospheres ved hjælp af Immunhistokemi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Michigan.

1. generation af hjernen Tumor Neurospheres stammer fra en musemodel

  1. Før proceduren dissektion forberede neurale stamceller medier (NSC medier: DMEM/F12 med 1 x B27 supplement, 1 x N2 supplement, 1 x normocin og 1 x antibiotikum/antimykotikum suppleret med menneskelige rekombinant EGF og basic-FGF i koncentrationer på 20 ng/mL hver). Fyld en 1,5 mL tube med 300 µL af NSC medier og reserve til senere.
  2. Vælg en mus med en stor tumor.
    Bemærk: Størrelsen af en svulst kan overvåges af bioluminescens, hvis plasmid eller virus indsprøjtes koder luciferin. Normalt, har en stor tumor en bioluminescens af > 106 fotoner/s/cm2/sr.
  3. Aflive mus med en overdosis af isofluran: indgyde en silkepapir med isofluran og indføre væv i en euthanization kammer, undgå direkte kontakt med mus til at forhindre irritation. Vent, indtil mus ikke viser en pedal refleks (normalt 5-10 min). Hug hovedet af musen og dissekere hjernen som beskrevet i Calinescu et al. 13.
  4. Hvis tumorer er fluorescerende, bruge en dissekere mikroskop udstyret med et lysstofrør til at identificere tumor massen i hjernen. Med fine pincet, dissekere tumor (normalt 5-7 mm i diameter) fra den normale hjernevæv.
  5. Sted dissekeret tumor i 1,5 mL tube med NSC medier (trin 1.1). Homogeniseres tumor med en engangs plast pistil, der passer ind i væggene af microcentrifuge rør ved at anvende blid pres.
  6. At adskille celle klumper, der tilsættes 1 mL af enzym-fri dissociation medier og Inkuber i 5 min. ved 37 ° C.
  7. Filtrere cellesuspension gennem en 70 µm celle si og vask si med 20 mL af NSC medier.
  8. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 min, den dekanteres og genopslæmmes pellet i 6 mL eller 15 mL NSC medier, afhængigt af størrelsen af toerstoffet.
  9. Plade tumor cellesuspension i en T-25 eller T-75 kultur kolbe og kultur ved 37 ° C i en vævskultur kuvøse med en atmosfære af 95% luft og 5% CO2.
  10. Efter 3 dage, overføre den sunde suspenderede NS og re plade dem ind i en T-25 eller T-75 vævskultur kolbe. Om nødvendigt tilsættes mere NSC media culture.
    Bemærk: Der vil normalt være en blandet population af celler, nogle vil være døde, nogle vil have overholdt og nogle vil danner NS, der vil flydende i medierne

2. vedligeholdelse og Passaging NS

Bemærk: Forhindre overvækst og vedligeholde celler med relativt høj tæthed. Sammenløbet bestemmes af kugler størrelse (sort centre for store kugler betyder overvækst). Vækstraten for NS afhænger onkogener bruges til at generere tumorer.

  1. Når NS kultur har nået confluency, samle kulturen i et sterilt centrifugeglas og pellet NS på 300 x g i 5 min.
  2. Supernatanten, tilsættes 1 mL af celle detachement løsning og afpipetteres for at genopslæmmes pellet.
  3. Der inkuberes ved 37 ° C i 5 min, svippede røret hver 2 min til at hjælpe celle dissociation.
    Bemærk: Når NS confluency, de kan normalt ses makroskopisk som små hvide kugler. At forsikre celle dissociation, i det mindste alle synlige NS skal være forsvundet.
  4. Der tilsættes 5 mL af HBSS 1 x og pipette flere gange. Pellet celler ved 300 x g i 5 min. supernatanten. Genopslæmmes pellet i 5 mL af NSC media suppleret med rekombinant EGF og basic-FGF.
  5. Der tilsættes 1 mL af celler til 15 mL NSC medier og kultur i en T-75 kolben ved 37 ° C i en vævskultur kuvøse med en atmosfære af 95% luft og 5% CO2.
  6. Tilføje vækstfaktorer (EGF og basic-FGF) hver 3 dage. Hvis medierne viser lys orange og cellerne er endnu ikke sammenflydende, ændre medierne. For at gøre dette, centrifugeres NS på 300 x g i 4 min og genopslæmmes i NSC media suppleret med vækstfaktorer.
    Bemærk: Afhængigt af størrelsen af toerstoffet dannet celler muligvis opdeles i flere kolber.

3. frysning NS til langtidsopbevaring

  1. Når NS kultur bliver sammenflydende, adskille cellerne som beskrevet i trin 2.1-2.4. Når pelleten er blevet re suspenderet i HBSS, fjerne en alikvot og tælle cellerne.
  2. Centrifugeres celler ved 300 x g i 4 min og fjern så meget som muligt af supernatanten.
  3. Genopslæmmes pellet i frysning medier (varme-inaktiverede FBS, 10% DMSO). Det anbefales at fryse mellem 1 x 106 og 3 x 106 celler pr. hætteglas pr. mL.
  4. Opdele re suspenderede cellerne i så mange cryovials som nødvendige og langsomt køle ned hætteglassene af første overføre dem til is, så til-20 ° C, så at-80 ° C, og endelig den næste dag til en flydende kvælstof storage container.

4. fiksering af Tumor NS

  1. Kultur tumor NS i T-25 kolbe i 2-3 dage, indtil cellerne er sammenflydende (~ 3 x 106 celler). Indsamle tumor NS i en 15 mL konisk slange fra en mindst én T-25 sammenflydende kolbe. Pellet ved 300 x g i 5 min.
  2. Genopslæmmes pellet i 1 mL 10% formalin og holde ved stuetemperatur (RT) for 10 min. tilføje 5 mL af 1 x HBSS og sammenpresse cellerne som gjort i trin 3.2. Gentag dette trin en gang mere.
  3. Sted 15 mL konisk rør indeholdende pellet på is.

5. paraffin indlejring af Tumor NS

  1. Genopslæmmes vasket NS pellet i 500 µL af 2% varme flydende Agarosen og bland forsigtigt af pipettering.
  2. Straks sted Agarosen indstøbte NS på is, indtil Agarosen polymeriserer. Fjerne Agarosen stykke husly NS. Placere polymeriseret Agarosen stykke med NS i kassette for væv forarbejdning (figur 2).
  3. Fortsætte med væv behandling (ved hjælp af en automatisk paraffin processor) og paraffin embedding (ved hjælp af en indlejring station).

6. skæring af Paraffin-indlejret IF

  1. Indstille et vandbad til 42 ° C og indsætte blad på mikrotomen omhyggeligt ved hjælp af to pensler for at sikre det er jævnet med jorden. Brug denne klinge kun til trimning.
  2. Sted paraffin blok på mikrotomen. Med den ikke-dominerende hånd, Tryk ned på håndtaget ligger på venstre side, der styrer tykkelsen af hvert afsnit. Tryk for at den anden stop, der angiver en 30 µm tykkelse.
  3. Begynde at trimme blokken (dvs., at fjerne overskydende paraffin) ved at dreje den grove hånd hjul med højre hånd, indtil overfladen af prøven er nået. På dette tidspunkt, Slip håndtaget, der styrer den trim tykkelse til enten 10 μm eller 5 μm. Stop trimning når overfladen af prøven er nået.
  4. Fyld en ice box med is og Tilføj lige nok vand, så når paraffin blok er lagt på is, vandet fungerer som en film omkring paraffin blok, beskytte det fra direkte rørende isen. Inkuber paraffin blok på isen i 20 min.
  5. Kassér den gamle klinge og indsætte en ny for skæring. Tør blok ved hjælp af gaze, Placer den på mikrotomen.
  6. Med den ikke-dominerende hånd, få et par af buet pincet, der skal bruges til at trække paraffin båndet. Holde en fugtig pensel nær højre hånd, der skal bruges til at overføre paraffin bånd til et vandbad. Begynde at sektion ved at dreje den grove hånd hjul med højre hånd i et hurtigt tempo. Bruge pincet i venstre hånd til at holde paraffin båndet.
  7. Brug en fugtig pensel overførsel paraffin bånd til vandbadet.
  8. Bruge kurven af pincet til at bryde fra hinanden sektionerne ved overfladisk markedsføring pincet i mellem to paraffinsnit og derefter skubbe de to sektioner væk forsigtigt.
    Bemærk: Denne bevægelse skal være helt på overfladen af paraffin afsnittet. Tryk ikke ned, på afsnittet.
  9. Bruge fugtig penslen til at skubbe de adskilte paraffinsnit på positivt ladede vedhæftning objektglas.
  10. Tillad dias til tørre natten inde en kemisk hætten før gemme dem i dias kasser. Opbevaring af dias afhænger af pletten udføres.

7. Immunhistokemi (IHC) af Paraffin-indlejret IF

  1. Smelte paraffin ved at placere dias i en metal-rack og inkubere dem ved 60 ° C i 20 min.
  2. Deparaffinize dias ved inkubering i et rehydrering tog på RT: 3 x xylen i 5 min, 100% 2 x ethanol for 2 min, 95% 2 x ethanol for 2 min, 70% 1 x ethanol for 2 min, og 1 x deioniseret vand i 2 min. Hereon, holde dias i postevand indtil antigen hentning , som udtørring vil forårsage uspecifikke antistof bindende.
  3. Glassene inkuberes i citratbuffer (10 mM citronsyre, 0,05% nonionisk detergent, pH 6) ved 125 ° C i 30 s og ved 90 ° C i 10 s. Lad dem køle ned, derefter skylles dias 5 gange med destilleret vand.
  4. Inkuber dias på RT i 0,3% H2O2 i 30 min.
  5. Vask dias 3 gange i vask buffer (0.025% vaskemiddel i TBS) for 5 min med blid agitation.
  6. Inkuber dias på RT med blokering løsning (10% hest serum, 0,1% BSA i TBS) i 30 min.
  7. Glassene inkuberes natten over ved 4 ° C i en fugtig kammer med primær antistof forberedt i opløsningen til fortynding (0,1% BSA i TBS). Vask dias 3 gange i vask buffer for 5 min med blid agitation.
  8. Inkuber dias på RT for 1 h med biotinylated sekundær antistof forberedt i opløsningen fortynding. Vask dias 3 gange i vask buffer for 5 min med blid agitation.
  9. Inkuber dias på RT i mørke i 30 min med begærlighed-biotinylated peberrodsperoxidase komplekse. Vask dias 3 gange i vask buffer for 5 min med blid agitation.
  10. Glassene inkuberes med DAB-H2O2 substrat mærker her for 2-5 min på RT.
  11. Skyl 3 gange med vand fra hanen. Dyp (1-2 s) dias i kontrastfarve hæmatoxylin løsning, og skyl dem grundigt i postevand, indtil clearing.
  12. Dehydrere diasene som følger: inkuberes i destilleret vand i 2 min., dyppe 3 gange i 80% ethanol, inkuberes i 95% ethanol 2 gange i 2 min., inkuberes i 100% ethanol 2 gange i 2 min. hver, og endelig i xylen 3 gange i 3 min.
  13. Coverslip dias med en xylol-baserede montering medium og lad dem tørre på en flad overflade på RT, indtil de er klar til billedbehandling.       Bemærk: Hvis udfører 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) farvning, dias kan opbevares ved RT. Hvis immunofluorescens farvning er udført, skal dias opbevares i mørke ved-20 ° C til at reducere foto-blegning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at overvåge tumor udvikling og evaluere hvis tumor har nået den størrelse, der er nødvendige for at generere NS, analyserede vi den luminescence udsendes af tumorer med bioluminescens. Dette giver mulighed for undersøgelse af transduktion effektivitet i hvalpe og tumor progression af luminescence signal af luciferase (figur 1A og 1 b). Når tumorstørrelse når et signal af 1 x 107 fotoner/s/cm2/sr (figur 1B), kan hjernen blive behandlet for NS generation. En anden fordel ved dette system er, at de kodende sekvens af forskellige fluorescerende proteiner kan føjes til plasmider bruges til gen levering og tumor generation. Vi kan derefter bekræfte udtryk for de indsatte genetiske ændringer ved hjælp af en dissekere mikroskop udstyret med et lysstofrør (figur 1C). NS genereret fra wt-IDH1 (figur 1D) og mIDH1 (figur 1E) tumorer er identificeret ved den karakteristiske kugleformede morfologi og udtryk af fluorophores forbundet med den specifikke genetiske læsion ( dvs.., normal god landbrugspraksis er forbundet med shATRX og shp53, og Katushka er forbundet med mIDH1; Figur 1 D og 1E). For at fortsætte med IHC på NS, er celler fast, så integreret i Agarosen og paraffin (figur 2). Indlejring NS i paraffinblokke har flere fordele, herunder bevarelsen af 3D strukturer af NS og giver mulighed for langtidsopbevaring. Den integrerede NS kan farves til specifikke gliom biomarkører. Brug af denne teknik, vi analyseret udtryk for ATRX, Ki67 og OLIG2 (oligodendrocyte differentiering markør) (figur 3A-3_C). Vi bekræftede lav udtryk niveauer af ATRX protein i vores NS kulturer (fig. 3A), som er en funktion af LGG gliom subtype i øjeblikket at blive studeret4. Ki-67, et godt beskrevet biomarkør for celledelingen, var også positive i mIDH1 NS (fig. 3B), viser aktive spredning, som er et centralt element i tumorceller. Interessant, var celler lokaliseret i centrum af de større gliom NS klynger negativ for Ki-67 (fig. 3B), der angiver, at de ikke prolifererende, i modsætning til de Ki-67 positive celler lokaliseret til periferien. Dette fænomen kan være at perifere celler ikke har adgang til næringsstoffer fra vækst medier. Når de når denne større størrelse, gliom NS adskilles og passaged. Endelig, wt-IDH1 NS var positiv for Olig2, en transkriptionsfaktor, der deltager i oligodendrocyte differentiering (figur 3C).

Figure 1
Figur 1 : Gliom neurospheres genereret fra normal god landbrugspraksis - og Katushka-positive sovende skønhed (SB) hjernesvulst. (A) selvlysende signal nyfødte musen injiceres med SB-transposase plasmid i kombination med plasmider husly genetiske læsioner til at fremkalde gliom (de nationale tilsynsmyndigheder/shP53/shATRX/IDH1-R132H). B luminescence der viser tumor udvikling på 132 dage efter injektion (DPI). (C) A-lysfelt og fluorescerende billedet af en hjerne, høstet fra en mus der nået end-point. Tumor området er afgrænset af den stiplede linje og positiv for de fluorescerende reportere, normal god landbrugspraksis og Katushka. (D og E) Tumor neurospheres genereret fra SB hjernetumorer udtryk for normal god landbrugspraksis forbundet til shP53 og shATRX; og Katushka er forbundet til IDH1-R132H. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentation af arbejdsgangen til paraffin-embedded gliom NS. NS er indsamlet fra en T-25 kolbe i en 15 mL konisk slange og fast i 10% formalin. Derefter, NS vaskes med HBSS og integreret i 2% agarosegelelektroforese. Polymeriseret Agarosen indeholdende gliom NS er placeret i en kassette til forarbejdning af væv og paraffin indlejring. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentative resultater af Immunhistokemi med HRP-DAB påvisning af biomarkører. (A-C) IHC udføres på paraffin-embedded mIDH1 gliom NS farvet for ATRX (A) og Ki67 (B), og wt-IDH1 gliom NS farvet for OLIG2 (C). Røde pile viser positive celler for biomarkør farvning. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikel detaljer vi en alsidig og reproducerbar metode til at udføre Immunhistokemi på paraffin-embedded gliom NS, som fastholder den karakteristiske 3D-struktur af tumorceller vokser i hjernen in situ. Denne teknik besidder følgende fordele over ved hjælp af celler belagt på glas eller plast overflader: Jeg) bevarelse af 3D-struktur af NS; II) undgå stress af celle dissociation før analyse af protein udtryk; III) quenching af enhver endogene fluorophore udtryk fra gensplejsede tumor NS, aktivering af farvning på tværs af de fluorescerende spektre; og iv) langtidsopbevaring.

Et kritisk trin i denne teknik er at sikre, at cellerne er re suspenderede godt i Agarosen til at sikre, at de er homogen måde distribueret og ikke klumpet sammen. En begrænsning af denne teknik er de tidskrævende trin relateret til celle dyrkning og NS behandling før IHC farvning procedure. En anden begrænsning er det høje antal celler, der er nødvendige for at udføre denne metode. Hvis antallet af celler er mindre end 1 x 106 celler, vil der være for få celler pr. synsfelt NS klynger i hver sektion. Derfor kunne det være vanskeligt at nå den ideelle antal celler hvis gliom cellekultur er langsomt voksende. Vi brugte en sammenflydende T-25 kolbe indeholdende mindst 3,0 x 106 celler. Antallet af celler, der anvendes kan redigeres som ønsket; Det er dog nødvendigt at indhente en NS pellet af passende størrelse til indlejring proceduren. Efter dette, den integrerede NS kan manipuleres som en almindelig paraffin-embedded blok, og det kan derefter gå videre til skæring og IHC farvning for at analysere protein udtryk ved immunfluorescens eller IHC ved hjælp af DAB farvning.

Efter skæring af blokke og følge protokollen for IHC, bør være counterstained sektioner med hæmatoxylin (blå). Hvis væv udtrykker target proteinet, bør en brun signal være synlige (figur 3). Hvis efter IHC sektionerne er også brun (høj baggrund), dette kan skyldes 1) ikke-specifikke biding sekundær antistof, 2) en ufuldstændig quenching af endogene peroxidase, eller 3) utilstrækkelig blokering. Disse problemer kan løses ved 1) ved hjælp af en negativ kontrol dias (inkuberes kun med en sekundær antistof) til at kontrollere ikke-specifik binding af den sekundære antistof, 2) øge peroxidase quenching tid eller 3) øge blokering inkubationstiden. På den anden side, hvis ingen signal er opdaget, er det muligt at epitoper er stadig maskerede, som kan være relateret til typen af buffer, der bruges til hentning af antigen. Vores erfaring, vi har haft tilfredsstillende farvning bruger citratbuffer, men dette kan være væv - og antistof-afhængige, og forskellige formuleringer for antigen hentning buffere kan bruges som 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) buffer21. Disse er nogle af de mest almindelige problemer i forbindelse med IHC farvning, men hvis der opstår andre problemer, fejlfinding skal udføres som med enhver anden IHC (dvs., forsøger forskellige fortyndinger af de primære og sekundære antistoffer, forskellige blokering reagenser, forskellige blokerende tidspunkter, osv).

En alternativ metode til at evaluere protein udtryk ved hjælp af paraffin-embedded celler blev tidligere beskrevet af Hasselbach et al. 20. denne metode omfatter ikke Agarosen skridt, som i denne protokol aktivere passende særlige distribution af 3D celle klynger. Vi beskriver også en præcis metode for NS dyrkning, passaging og frysning til langtidsopbevaring. Denne metode viser også, hvordan man kan indsamle, ordne og integrere NS uden at ændre 3D-struktur (figur 2).

Da NS kan genereres fra gliom væv fra patienter og gliom dyremodeller, er denne teknik et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at analysere biomarkør udtryk i forskellige gliom suptypes og validere de oprindelige modeller. Her beskriver vi teknikken med NS stammer fra gensplejsede mus ved hjælp af SB transposase system (figur 1). Denne teknik kan dog også bruges til at analysere protein i paraffin-integrerede menneskelige gliom celler, der vokser som 3D kulturer uden ændringer til denne protokol, bortset fra celle kultur betingelser. Så, denne metode kan også anvendes til 3D kulturer fra ender dyremodeller, menneskelige PDX modeller og andre gensplejsede modeller. Endelig, denne metode kan anvendes med andre typer af kræft, både musemodeller og menneskelige kræftformer, ud over gliomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed/National Institute af neurologiske & streg (NIH/NINDS) tilskud R37-NS094804, R01-NS074387, R21-NS091555 til M.G.C.; NIH/NINDS tilskud R01-NS076991 R01-NS082311 og R01-NS096756 til P.R.L.; NIH/NINDS R01-EB022563; 1UO1CA224160; Afdeling Neurokirurgi; Leah's Happy Hearts til M.G.C. og P.R.L.; og RNA biomedicin Grant F046166 at M.G.C. F.M.M. er støttet af en F31 NIH/NINDS-F31NS103500. J.P. blev støttet af et Fulbright-argentinske Ministeriet for sport og uddannelse Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coated microtome blade HP35 Thermo Scientific 3150734
Microtome RM 2135 Leica MR2135
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma-aldrich HT501128-4L
Rabbit polyclonal anti-ATRX, Santa Cruz Biotechnology sc-15408 IHC, 1:250 dilution
Rabbit polyclonal anti-Ki-67 Abcam Ab15580 IHC, 1:1000 dilution
Rabbit polyclonal anti-OLIG2 Millipore AB9610 IHC, 1:500 dilution
Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated Dako E0432 IHC, 1:1000 dilution
Vectastain Elite ABC HRP kit Vector Laboratories Inc PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT Biocare medical BDB2004 L/price till 12/18
N-2 Supplement ThermoFisher 17502048
N-27 Supplement ThermoFisher A3582801
Accutase® Cell Detachment Solution Biolegend 423201
AGAROSE LE GoldBio A-201-1000
Genesee Sc. Corporation Olympus 15 ml 21-103
Genesee Sc. Corporation TC-75 treated Flask 25-209
Genesee Sc. Corporation TC-25 treated Flask 25-207
DMEM/F12 Gibco 11330-057 NS media
HBSS GibcoTM 14175-103 balanced salt solution
C57BL/6 Taconic B6-f C57BL/6 mouse

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131, (6), 803-820 (2016).
  2. Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14, (4), 439-452 (2014).
  3. Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131, (10), 1627-1638 (2012).
  4. Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164, (3), 550-563 (2016).
  5. Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372, (26), 2481-2498 (2015).
  6. Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32, (4), 520-537 (2017).
  7. Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8, (328), (2016).
  8. Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99, (6), 841-846 (2008).
  9. Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10, (10), 1081-1094 (2016).
  10. Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226, (2), 352-364 (2012).
  11. Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53, (1), 39-47 (2008).
  12. Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36, (3), 1943-1953 (2015).
  13. Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
  14. Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69, (2), 431-439 (2009).
  15. Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2, (10), 1351-1363 (2015).
  16. Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
  17. Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26, (17), 2916-2924 (2008).
  18. Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133, (2), 263-282 (2017).
  19. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
  20. Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
  21. Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183, (1), 116-123 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics