バイオ セーフティ レベル 2 の設定で高病原性コロナを勉強する新規微粒子の製造

Immunology and Infection
 

Summary

ここでは、高病原性ウイルス中東呼吸器症候群、重症急性呼吸器症候群コロナのスパイク ・ プロテインを組み込む BSL 2 設定で新規のパーティクルを生成するプロトコルを提案する.これら新規粒子には、ターゲット ホストの細胞にウイルスのエントリの定量化を許可するルシフェラーゼ レポーター遺伝子が含まれています。

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Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H. L., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).

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Abstract

プロトコルは、コロナ ウイルス (CoV) スパイク (S) 融合タンパク質を生成することを目的とマウス白血病ウイルス (MLV) コアとルシフェラーゼ レポーターと広く利用可能の HEK 293 t の簡単な導入手順を使用して新規粒子細胞します。一度形成されたプロデューサー細胞から放出された、これらの型は、ルシフェラーゼ遺伝子を組み込みます。だけを含んでいるので、異種のコロナ ウイルス スパイクの表面にタンパク質、粒子のエントリ手順の対応するネイティブ コロナ ウイルスのような動作します。そのため、宿主細胞にウイルスのエントリを勉強のためネイティブ ウイルス粒子の優秀なサロゲートです。成功したエントリと標的細胞に感染、ルシフェラーゼ レポーターは宿主細胞のゲノムに統合され、表現されます。単純なルシフェラーゼ アッセイを使用して、導入された細胞を簡単に定量化することができます。プロシージャの重要な利点は、それをバイオで行えるように、中東呼吸器症候群コロナ ウイルス (MERS コロナ ウイルス) など高病原性コロナで仕事に必要な BSL 3 施設ではなく 2 (BSL-2) 設備をレベルと重症急性呼吸器症候群コロナ ウイルス (Sars-cov)。別の利点は、その汎用性からインフルエンザ ヘマグルチニン (HA) とエボラ ウイルス糖蛋白質 (GP)、クラス II セムリキ森林ウイルス E1 クラスなどのウイルス融合蛋白質のすべての 3 つのクラスに属する私エンベロープ蛋白質に適用できます。蛋白質、またはクラス III の水疱性口内炎ウイルス G 糖蛋白質。方法論の限界、それはのみ検討されているエンベロープ蛋白を介したウイルス エントリ手順を要約することができます。他のウイルスのライフ サイクルの手順を勉強して、他の方法が必要です。これらの疑似タイプの粒子で使用できる多くのアプリケーション ホスト細胞感受性と親和性ウイルス エントリ経路を分析するウイルス エントリ阻害剤の効果をテストの調査があります。

Introduction

ホスト セルのエントリは、ウイルスの伝染のライフ サイクルの初期の段階を構成します。エンベロープ ウイルスは、単一のホスト細胞受容体またはウイルスおよび細胞膜の融合が続くいくつかの受容体へのバインドが含まれます。これらの基本的な機能はウイルスの封筒の糖蛋白質1,2によって遂行されます。コロナ ウイルスの封筒の糖蛋白質 (S) のスパイク蛋白質と呼びます、クラスのメンバーである私はウイルス融合蛋白質2,3,4,5,6。など特定のウイルスの多くの重要な特徴を理解するために重要なはウイルスの封筒の糖蛋白質の勉強: ライフ サイクルの開始、ホスト、細胞親和性、種間伝播、ウイルスの病因と同様、ホスト セルのエントリ経路。型とも呼ばれます、新規ウイルスの粒子は、簡単にウイルス融合蛋白質の機能を研究することを可能にする強力なツールです。新規粒子も型キメラ ウイルス粒子表面で異種ウイルスのエンベロープ蛋白のサロゲート ウイルス コアで構成されます。取得する方法を示すプロトコルの主な目的はコロナ ウイルス スパイク新規粒子マウス白血病ウイルス (MLV) のコアに基づいており、ルシフェラーゼ レポーター遺伝子を含んでいます。例として、高病原性の重症急性呼吸器症候群 (SARS) と中東呼吸器症候群 (MERS) コロナのスパイク蛋白質と新規パーティクルを生成する方法が掲載されています。プロトコルでは、ルシフェラーゼ アッセイによって関与、影響を受けやすいターゲットに感染する細胞のどのようにトランスフェクション プロシージャと感染性定量化について説明します。

型のエントリ手順は、その表面にコロナ ウイルス S によって支配されるので、入るセル同様にネイティブ対応します。そのため、機能性感染性アッセイの優秀なサロゲートです。新規粒子、通常 (MLV7,8,9,1011,12,13レトロ ウイルスなどのウイルスは保護者モデルから派生します。,14,15,16,17,18,19,20,21,22レンチひと免疫不全ウイルス、HIV23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35) またはラブド (水疱性口内炎ウイルス-VSV36,39,40,41,42,,4344,45,46,47). 親のウイルスのゲノムが完全なレプリケーション サイクルを達成するため不良のレンダリングに必須の遺伝子を削除する変更 pseudotyping で使用する場合。この機能は、中間のバイオ セーフティ レベル設備 (BSL-2) で使用することができます、高いバイオ セーフティ施設 (BSL 3、BSL 4 として容易に利用可能ではない) を必要とする高病原性のネイティブ ウイルスを使用して上の重要な利点は、ときにウイルス エントリ研究を実施します。ここでは、リスクの S 蛋白質グループ 3 の病原体が SARS コロナ ウイルスと MERS コロナ ウイルスが組み込まれて MLV のウイルスのエンベロープ蛋白の例として使用されます Sars-cov S および MERS コロナ ウイルスの型を生成する新規の粒子 (SARS Spp、及び、MERS Spp、それぞれ)。これらの型は、これらウイルス48,49,50,51のエントリ イベントに着目した研究で正常に使用されています。別の利点は、ここで説明する手法は pseudotyping S コロナ ウイルス蛋白質に限定しない: それは非常に柔軟なウイルス融合蛋白質のすべての 3 つのクラスの代表の組み込みに使用することができます。などインフルエンザ血球凝集素 (HA、クラス I)52、エボラ ウイルスの糖蛋白質 (GP クラス I)、アルファウイルス セムリキ森林ウイルス (SFV、クラス II) と VSV 糖蛋白質 (G、クラス III) の E1 蛋白質53。さらに、ウイルスの糖蛋白の 1 つ以上の種類することができます新規粒子組み込まれ、共同インフルエンザの場合、HA ・ NA 新規粒子51

MLV の世代について説明しますこのプロトコル Bartosch ら20によって実行される作業に基づいて、新規粒子 3 プラスミドの共トランスフェクション法トランスフェクション有能な広く利用可能な HEK 293 t 細胞54. 最初のプラスミド MLV コア遺伝子ギャグポルエンコードしますが、MLV 封筒env遺伝子を欠いています。2 番目のプラスミドはホタル ルシフェラーゼ レポーター遺伝子 5' と一緒に、MLV Ψ RNA 包装信号をエンコード転送ベクトル- と 3' 側上流 MLV 長いターミナル繰り返し (LTR) 地域。3 番目のプラスミド エンコード、興味の融合蛋白質この場合どちらか Sars-cov S または MERS コロナ ウイルス S 蛋白質。トランスフェクション試薬を用いた 3 つのプラスミドの共トランスフェクション時にウイルス RNA およびタンパク質を得る新規パーティクルの発生を許可する transfected セル内で表明しました。MLV は pseudovirion のバックボーンとして使用されるため、これはプラズマ膜で発生します: ルシフェラーゼ遺伝子レポーターおよび包装信号を含む Rna を得る細胞膜発現コロナ ウイルスのスパイクはまた組み込む初期粒子にカプセル化蛋白質。細胞から芽を粒子表面でコロナ ウイルス S 蛋白質が含まれてし、感染性の試金で使用するために収穫されます。新規粒子港コロナ ウイルス S タンパク質や MLV エンベロープ蛋白質ではなく、細胞への感染に使用する場合ので、エントリの手順の対応するネイティブ コロナ ウイルスのような動作します。ルシフェラーゼ レポーターを含むと並ぶ LTRs ウイルスの RNA は細胞内それから解放され、レトロ ウイルスのポリメラーゼの活動の DNA にその逆のトランスクリプションおよび宿主細胞のゲノムへの統合を有効にします。単純なルシフェラーゼ活性測定法では、感染細胞でのウイルスの新規粒子の感染性の定量化が実行されます。宿主細胞のゲノムに統合 DNA シーケンスには、ルシフェラーゼ遺伝子と MLV またはコロナ ウイルス蛋白質符号化の遺伝子のどれもだけ含まれている、ためを使用するネイティブ ウイルスより本質的に安全です。

安全な代理であることに加えてとエンベロープ糖蛋白質の様々 な種類の設立を許可するように適応性の高い、ここで説明されている新規の粒子も汎用性の高いウイルスのエントリの多くの側面を研究に使用することができます。これは含まれていますに限定されない: ウイルス感染に対する宿主細胞感受性をテスト、エンベロープ ウイルスを使用して携帯電話の入力経路の分析、薬理学的阻害剤と薬物スクリーニングの効果を勉強、中和抗体を実施アッセイ、培養できないエンベロープ ウイルスのホスト セルの入力の特性と遺伝子送達用ウイルスのベクトルの生成は、金利、または遺伝子サイレンシングの遺伝子の細胞発現を安定しています。

Protocol

1. 新規粒子生産のため播種細胞

注:バイオ セーフティ キャビネットでこの手順を実行します。

  1. 標準的な細胞培養の技術により完全なダルベッコの継代 HEK 293 t/17 細胞の 80-90% コンフルエント 75 cm2フラスコの変更イーグル培地 (DMEM C) を含む 10% (巻/巻) ウシ胎児血清 (FBS) 10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、100 IU/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン。(その組成が同じ DMEM C として抗生物質なし) transfections を DMEM T 培地を準備します。
  2. 10 mL の予め温めておいた (37 ° C) ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) でセルを 2 回洗います。
    注:彼らは簡単にデタッチ HEK293T/17 細胞ケアを処理します。
  3. 上清を吸引し、37 ° C に加温 0.25% トリプシン溶液 1 mL と細胞を切り離す37 ° C、5% CO2インキュベーター 3−5 分や細胞を切り離し開始までに細胞のフラスコを配置します。
    注:これは通常細胞凝集につながるよう、5 分以上トリプシンで細胞を培養は避けてください。
  4. トリプシンを無効するには、スライドおよび光学顕微鏡を数えるセルを用いた DMEM C 中小企業数セルの 4 つの mL を追加します。
    注:あまりにも多くの細胞をカウントすることを避けるために追加希釈手順はあらかじめ要求されるかもしれない。この希釈トリプシンの細胞の実際のセル密度を計算する際に考慮してください。
  5. DMEM C. と 5 x 10 の5セル/mL に細胞を希釈します。
  6. シード/ウェルの細胞液 2 mL で 6 も組織培養プレート プレートを前後移動し、優しく円運動を回避するセルを均等に分散する側に側します。
    注:これは重要なステップです。均等に配置された細胞細胞が井戸の中心に塊を行うようになります。ターンでは、これにより、良いトランスフェクションの効率は、新規粒子生産。
  7. プレート一晩 (16-18 h) 37 ° C、5% CO2細胞培養孵卵器で孵化させなさい。

2. 3 プラスミド共トランスフェクション

注:バイオ セーフティ キャビネットでこの手順を実行します。

  1. 細胞の形態や密度をチェックする倒立顕微鏡下で細胞を観察します。
    注:理想的には、細胞密度は 40-60% の合流の範囲にする必要があります。セルにもどちらもあることが重要です合流 (80−90% 合流) (20−30% 合流) を各ウェルにも散在も。40−60% の confluency の細胞密度は良い新規粒子生産をいたします。
  2. プラスミド ミックス
    1. 次の表 1に示す 6 ウェル プレートの 1 つの井戸の数量各封筒の糖蛋白質のためのプラスミド ミックスを計算します。数量を乗算する場合、いくつかの井戸を株とミックスの不足を防ぐために余分な井戸があります。
      注:Sars-cov S とプラスミドをエンコーディング MERS コロナ ウイルス S など肯定的な制御の糖タンパク質と共にウイルスの封筒糖蛋白質 (Δenv 粒子) が無いネガティブ コントロール パーティクルの世代に空のベクター コントロールを含む小胞口内炎ウイルス (VSV) G 糖蛋白質細胞 (VSV Gpp) の非常に広い範囲に感染確実に知られています。プラスミドのリクエストも承ります。
    2. ミックスは、微量遠心チューブにプラスミドと減少血清培 (材料の表参照) のボリュームを計算されます。
  3. 脂質ベースのトランスフェクション試薬を混ぜる(材料の表を参照)
    1. 1 つの井戸 (1:3 トランスフェクション比、乗算量に応じて) の表 2に示された数量からトランスフェクション試薬ミックスのボリュームを計算します。トランスフェクション試薬ミックスの不足を防ぐために余分な井戸があります。
    2. ミックス計算脂質ベースのトランスフェクション試薬 (3 μ L/ウェル) と微量遠心チューブに減らされた血清培 (47 μ L/ウェル) のボリューム減少血清培養液およびない他の方法にトランスフェクション試薬を追加することを確かめる周り。
  4. 両方のミックスを孵化させなさい (1 つの井戸のため: 50 μ L プラスミドのミックスとミックス、脂質ベースのトランスフェクション試薬を 50 μ l 添加) 室温で 5 分間個別に。
  5. トランスフェクション試薬ミックスの内容を 1:1 の比率でプラスミドのミックスに追加 (よく 1: 各ミックスの 50 μ L)
  6. 結果ミックスの徹底した上下ピペッティングを実行します。
  7. 室温で少なくとも 20 分のミックスを孵化させなさい。
  8. セルの使用済み培地を吸引します。
  9. 予め温めておいた (37 ° C) 低血清培ウェルあたりのゆっくり 1 mL を追加します。
  10. 滴状 100 μ L の各ウェルにトランスフェクション ミックス。
    注:彼らは簡単に切り離すと HEK 293 t の井戸にトランスフェクション ミックスを追加するときは注意が必要です。
  11. 37 ° C、5% CO2セル文化振興 4-6 時間のセルを孵化させなさい。
  12. 抗生物質が含まれていない、予め温めておいた (37 ° C) DMEM T 中の井戸あたり 1 mL を追加します。
    注:これは重要なステップです。トランスフェクション試薬はセル透磁率を増加し、抗生物質に感受性を高めます。良いトランスフェクション効率および新規粒子生産を確保するため、抗生物質を含む細胞培養液を使用しないようにすることが重要です。
  13. 37 ° C、5% CO2セル文化 48 h のインキュベーター内のセルを孵化させなさい。

3. 新規粒子の捕集

注:バイオ セーフティ キャビネットでこの手順を実行します。

  1. 細胞の形態や全身状態をチェックするため倒立顕微鏡下で細胞を観察します。また光をする必要があります中の色のチェック ピンク/わずかにオレンジ色。
    注:これは重要なステップです。これ、通常感染の新規粒子で利回りが低いに関連付けられます、トランスフェクションに関連付けられているあまりにも多くの細胞死や中の色はオレンジ/黄色 (酸性 pH) になっている場合、
  2. 50 mL コニカル遠沈管に transfected セルの培養上清を転送します。
  3. 290 x g細胞の残骸を削除する 7 分間でチューブを遠心します。
  4. 滅菌の 0.45 μ m 孔サイズのフィルターを通して明らかにした培養上清をフィルターします。
  5. 少量の因数を作る (例えば.、 500 μ L または 1 mL) クリオバイアルの新規ウイルス ソリューションの。
  6. -80 ° C でストア
    注:プロトコルはここで一時停止することができます。新規粒子が何ヶ月も-80 ° C で安定しているが、解凍後、彼らは感染性を失うと再凍結を避ける

4. 新規粒子感染感受性細胞の

注:バイオ セーフティ キャビネットでこの手順を実行します。

  1. 24 ウェル プレートで感受性細胞の細胞播種
    1. スタンダードセル文化技術 80−90% コンフルエント 75 cm2フラスコ感受性細胞の投稿を取得: SARS コロナ ウイルスの Vero E6 セル新規粒子 (SARS Spp) と許 7 セル MERS コロナ ウイルス S の新規粒子 (MERS Spp)。
      注:生産されている新規の粒子が感染かどうかを確認するには、pseudovirion 感染の試金の適切な感受性細胞ラインを慎重に選択することが重要です。寛容な悪い細胞を用いた、低感染に します。
    2. 予め温めておいた (37 ° C) の DPBS 10 mL で 2 回細胞を洗浄します。
    3. 上清を吸引し、37 ° C に加温 0.25% トリプシン溶液 1 mL と細胞を切り離す37 ° C、5% CO2インキュベーター 3−5 分や細胞を切り離し開始までに細胞のフラスコを配置します。
      注:これは通常細胞凝集につながると 5 分以上インキュベート トリプシンで細胞を避けてください。ハァッ 7 セルはこの効果に特に敏感です。
    4. スライドおよび光学顕微鏡を数えるセルを用いた DMEM C 中小企業数のセルを追加してトリプシンを無効します。
    5. DMEM C. と 5 x 10 の5セル/mL に細胞を希釈します。
    6. 24 ウェルの種子井戸プレートのウェルあたりセル溶液 0.5 mL をゆっくりでプレートを前後移動や円運動を回避するセルを均等に分散する側に側
      注:これは重要なステップです。均等に配置された細胞細胞が井戸の中心に塊を行うようになります。ターンでは、これは良い感染性アッセイが保証されます。各新規粒子 (SARS Spp、MERS Spp) と条件は、3 つの実験的複製の 3 つの井戸を準備します。非感染 (N.I.)、空のベクター Δenv 粒子および VSV Gpp のような肯定的な制御粒子の井戸があります。
    7. プレート一晩 (16−18 h) 37 ° C、5% CO2セル文化インキュベーターで孵化させなさい
  2. 新規パーティクルの感染症
    1. 光学顕微鏡による細胞観察し、細胞の合流のカーペットがあることを視覚的に確認します。
    2. 氷の上の解凍が新規ウイルスのクリオバイアルをもたらします。
    3. 3 回 0.5 mL (37 ° C) DPBS で加温でセルを洗浄します。
      注:これは重要なステップです。適切にされていない細胞洗浄通常貧しい感染読み出しにつながる感染する前に
    4. 細胞の培養上清を吸引します。
    5. 解凍新規粒子溶液 200 μ L で細胞を接種します。
    6. 37 ° C、5% CO2セル文化 1−2 h のインキュベーター内のセルを孵化させなさい。
    7. 予め温めておいた (37 ° C) の C DMEM 培地 300 μ L を追加します。
    8. 37 ° C、5% CO2セル文化 72 h のインキュベーター内のセルを孵化させなさい。

5 ルシフェラーゼ アッセイ読み出しによる感染性の定量化

注:バイオ セーフティ キャビネットの最初の手順を実行します。

  1. 雪解けルシフェリン基板 (-80 ° C で保存) と 5 x ルシフェラーゼ アッセイの換散バッファー (-20 ° C で保存) まで部屋の温度に到達します。
  2. 滅菌水で 1 x にルシフェラーゼ アッセイ換散バッファーで希釈します。
  3. 新規粒子感染細胞の培養上清を吸引します。
  4. 各ウェルに 100 μ L の 1 x ルシフェラーゼ アッセイ換散バッファーを追加します。
  5. ロッカーのプレートを置き、ロッキング (この時点からバイオ セーフティ キャビネットの外プレートを処理できます) 室温で 15 分間インキュベートします。
  6. 各チューブの基質ルシフェリンの 20 μ L を追加することによって、各ウェルのマイクロ遠心チューブ用を準備します。
  7. ルミノを入れます。
  8. 溶解液の 10 μ L をルシフェリン基板の 20 μ L を含む 1 つのチューブに移すことによって一度にうまく 1 つルシフェラーゼ活性測定を実行します。
  9. ミックス内容しますが、管の壁に液体の変位を避けるために優しくはじきます。
  10. デバイスで、チューブを置き、蓋を閉じます。
  11. ルミノを使用して管の発光値を測定します。
  12. 相対光ユニットの測定を記録します。
  13. 5.8-5.12 の手順を繰り返してすべての井戸を分析します。
    注:ルミノを読んでプレートなど適切な装備では、このプロセスを自動的に実行できます。アッセイは、プレート形式 (例えば 96 ウェル プレート形式) に調整する必要があります。

6. データの分析

  1. 計算および相対的なルシフェラーゼ ユニットの平均値と標準偏差をプロット
    1. ルシフェラーゼ アッセイの測定の平均値し、実験と生物の標準偏差の複製を計算するのにソフトウェアをプロット グラフを使用します。
    2. 標準偏差バー グラフとしてデータをプロットします。
      注:データの統計解析を実行すると、データ セットの少なくとも 3 つの生物学的複製を確認します。

Representative Results

代表的な結果 Sars-cov S および MERS コロナ ウイルスの感染性アッセイの新規粒子は図 1に示します。予想通り、両方図 1A と 1 b、VSV G 新規コントロール パーティクル (VSV Gpp) は、10 の非常に高い平均感染を与えた肯定的な6 107相対ルシフェラーゼ ユニット (RLU) の範囲はそれぞれ。Sars-cov s 新規粒子 (図 1A) 感染 vero-e6 細胞の強くて平均で測定した約 9.8 × 104 RLU。この値はほぼ 3 桁の非感染コントロールの測定値よりも高い (1.1 × 102 RLU)、または Δenv 粒子 (1.5 × 102 RLU)、これは表面で任意のウイルスの封筒の糖蛋白質を抱いてないです。MERS コロナ ウイルス S の同様に、ハァッ 7 細胞の新規粒子 (図 1B) 感染症、高い平均感染で測定した約 1.0 × 106 RLU。これはほとんど 4 桁の非感染コントロールの測定値よりも高い (0.8 × 102 RLU)、または Δenv 粒子 (2.0 × 102 RLU)。追加感染性アッセイ、SARS Spp と MERS Spp が連続希釈と行った vero-e6 細胞 (図 2A) に感染するために使用します。この試金は、ルシフェラーゼ活性は細胞に感染するため粒子の濃度に依存しているを確認します。不十分な寛容の HEK 293 t 細胞を用いて添付ファイル、新規パーティクルのエントリを媒介にアンジオテンシン変換酵素 2 の役割 (ACE2) およびジペプチジルペプチダーゼ ペプチダーゼ 4 (DPP4) MERS コロナ ウイルス、SARS コロナ ウイルスの受容体をそれぞれ確認し、ACE2 や DPP4 を表現するそれらを導入した (図 2B)。Transfected セル生物検定法のために使用されました。この分析ことを示して ACE2 と DPP4 の過剰発現は、時にある SARS Spp、及び、MERS Spp 感染 〜 4 ログと 2 ~ ログ増加、それぞれネイティブのウイルスに似ている型の受容体の使用状況を確認します。

ここで示す例重要性を示すなどの否定的な (非感染 Δenv 粒子) 肯定的な制御 (VSV Gpp) 条件だけでなく、新規パーティクルを生成するとき。確かに、肯定的な制御 VSV Gpp 粒子新規粒子の特定のバッチ機能と感染型を降伏に成功したかどうかを評価することができます。ほとんどの哺乳類セルの行は、106− 107 RLU 範囲で VSV Gpp 粒子によって一般的な感染症の結果を予想しました。HEK 293 t/17 プロデューサー細胞 (高い通路番号、細胞の密度の問題) の問題または貧しいトランスフェクションの効率はすることができます全体の新規粒子生成と感染性に影響を与えます。陰性対照条件に重要 RLU 特定のセル行 (非感染状態) 単位の基準とを介したない粒子 (Δenv 感染症) の非固有の内面化を評価することができる彼らはまた、ウイルスのエンベロープ蛋白質。理想的には、関心のエンベロープ蛋白粒子の新規の特定の種類、数桁のマイナス コントロールの値よりも高いは、図 1A、Bで示されている値を取得する勧めします。ただし、特定のセル型の新規ウイルス感染はほとんど感染を与える場合 (すなわち,近く N.T. 条件の非導入で図 2Bのような否定的なコントロールに) それは必ずしもわけ、新規粒子生産が故障していた。それはことができるよく使用特定のセル行がないまたは不十分な感染に寛容な。特定のセル型が検討されているウイルスによって感染を受ける必要なかどうかを確認することをお勧めします。Plasmid(s) より効率的なウイルス エントリと ACE2 と DPP4 受容体の場所に図 2に示すようにBとして発生する感染ウイルスの受容ができる表現する不十分な寛容な細胞株対象 HEK 293 tセル、〜 4 がある- と 〜 2-ログそれぞれ感染力の増加します。

プラスミド ・試薬 数量
pCMV MLVgagpol MLV ギャグとポルをコードしているプラスミド 300 ng
ルシフェラーゼ レポーター pTG リュック転送ベクトル 400 ng
pcDNA-SARS-S、pcDNA-MERS-S または空のベクトル 300 ng
低血清培 50 μ L に

表 1: プラスミッドおよび減らされた血清の量細胞培地新規粒子生産の HEK 293 t/17 セルの 6 ウェル プレートの 1 つの井戸を使って必要な。プラスミッドの準備の濃度からプラスミド DNA の必要量に到達するための必要量を計算します。以上 1 つの井戸は同じプラスミドをトランスフェクトした、ボリュームは transfect に井戸の必要な数で乗算し、余分な井戸は、後の手順でミックスの不足を防ぐために計算。トランスフェクションする DNA 量は 1 μ g/ウェルです。プラスミドの作者にリクエストも承ります。

試薬 数量
トランスフェクション試薬 3 Μ L
低血清培 47 Μ L

表 2: トランスフェクション試薬および減らされた血清の量細胞培地新規粒子生産の HEK 293 t/17 セルの 6 ウェル プレートの 1 つの井戸を使って必要な。ボリュームは transfect、後の手順でミックスの不足を防ぐために計算で余分な井戸井戸の必要な数で乗算します。トランスフェクション試薬: 使用されるプラスミッド DNA の比は 3:1。

Figure 1
図 1: マウス白血病ウイルス (MLV) バックボーンとルシフェラーゼ レポーター遺伝子を用いた感受性宿主細胞でコロナ ウイルス S 新規粒子感染性アッセイ。(A) Sars-cov S 新規粒子試 Vero E6 セルに。(B) 許 7 セルの MERS コロナ ウイルス S 新規粒子試。(A)、(B)、プロットされたデータに対応して平均相対ルシフェラーゼ単位に 3 つの独立した実験から誤差範囲 (標準偏差) の標準偏差に対応します。データは、y 軸が対数10スケールにプロットします。N.I.: 非感染制御;Δenv: 新規粒子ウイルスの封筒の糖蛋白質と VSV Gpp を欠いている感染: 軸受の肯定的な制御 VSV G 封筒糖蛋白質新規粒子の感染。他の略称を使用すると、SARS Spp: Sars-cov S 感染新規粒子、MERS Spp: MERS コロナ ウイルスの感染新規粒子。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: CoV S pseudovirion 感染や SARS Spp と MERS Spp の ACE2 と DPP4 受容体の役割の濃度依存性。(A) 濃度依存性ルシフェラーゼ活性測定法によって測定される SARS Spp、及び、MERS Spp の感染。型連続希釈され vero-e6 細胞に感染するために使用します。(B) 感染性 SARS Spp と不十分な寛容な HEK 293 t 細胞の MERS Spp のアッセイ エクスプレス ACE2 をトランスフェクションと DPP4 受容体、それぞれ。データは、誤差範囲 (標準偏差) の標準偏差に対応する重複する実験から図 1のように y 軸にログ10スケールにプロットされ。N.T.: 非 transfected 制御 HEK 293 t 細胞;ACE2: アンジオテンシン変換酵素 2 (Sars-cov 受容体) と DPP4: ジペプチジルペプチダーゼ ペプチダーゼ 4 (MERS コロナ ウイルス受容体)。他の略語は、図 1のように同じです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

このプロトコルでは、効率的にリスク グループ 3 コロナ、SARS コロナ ウイルス、MERS コロナ ウイルス、BSL 2 設定での S タンパク質を軸受新規パーティクルを生成する方法について説明します。ルシフェラーゼ レポーター遺伝子を組み込むには、これらの粒子は、比較的単純なルシフェラーゼ アッセイ48,49,50,51でコロナ ウイルス S を介した進入イベントを簡単に定量化することを有効にします。感染性の試金の感受性細胞を使用して、我々 はルシフェラーゼ活性の測定が粒子の濃度に依存するを確認します。また、ACE2 と DPP4 受容体遺伝子導入は HEK 293 t 細胞などの悪い感受性細胞ラインでより効率的なエントリのことができます。メソッドが他のウイルスの封筒の糖蛋白質に適応性の高い、広く使用されている48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, 生化学的解析やネイティブ ウイルス感染のような他のアッセイを補完するために多くの場合。

我々 はここで説明するプロトコルは、レトロ ウイルス ルシフェラーゼ レポーターが組み込まれた MLV に基づいています。ただし、正常にために開発された包装コロナ ウイルス S12,13,25,26,他の pseudotyping システムの非常に広い配列があることを強調することが重要です。30,31,32その他ウイルスの封筒の糖タンパク質10,11,14,16,17,23,24,29,33,38,40,42,44,46しますいくつかのこれらの他のシステムは、一般的に使用される MLV レトロ ウイルスのコア7,8,9,10,11,12,13 に基づいています。 ,14,15,16,17,18,1920、または広く使用されているレンチ ウイルスの HIV-1 に基づいてpseudotyping を用いた異なる戦略23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35、またはコアとしてラブド ウイルスについて水胞性口炎ウイルス (VSV)、さまざまなを組み込むことができます37,38,39,40,41,42,43 封筒糖蛋白質のと、再び様々 な戦略が採用 ,44,45,46,47。さらに、蛍光タンパク質など他の記者以外の β-ガラクトシダーゼ16,17のようなルシフェラーゼ酵素や RFP36、GFP11,13のように、分泌アルカリホスファターゼ (SEAP)42は、正常に測定のために採用されています。さらに、このプロトコルでのアッセイで一過性トランスフェクションが MLV、CoV の S 遺伝子と蛋白質を表現する使用されました。ただし、新規ウイルス7,14の生産のため安定したセルラインの世代のような表現の他の方法があります。それぞれ長所と短所があるこれらの各システムは、治験責任医師のニーズに合った最高の pseudotyping システムを決定するときに、次の重要なパラメーターを考慮することが重要です: pseudovirion コア (MLV、HIV 1 や VSV) 方法特定 pseudotyping コアは特定のウイルスの封筒の糖蛋白質・ アッセイ読み出し (GFP、ルシフェラーゼ、SEAP または他) のためのレポーター ・ トランスフェクション戦略 (プラスミドの共トランスフェクション、過渡に関与の数を組み込む選択トランスフェクションや安定したセルラインの世代)。

強調する重要な方法で重要な手順の数があります。HEK 293 t/17 プロデューサー セルラインの特にの細胞密度は、トランスフェクションの成功を確保する上で重要な要素です。40-60% の confluency の範囲の細胞密度は、最適なことが判明しました。高い密度は通常、低トランスフェクションの効率と低粒子生産。また、HEK 293 t/17 細胞が他の細胞よりも少なく付着性を留意することが重要です。不必要にそれらをデタッチを避けるためにそれらを処理するときに注意が必要があります。1 つのオプションは、携帯文化プラスチック表面の付着を強化するポリ-D-リジンを扱うことです。さらより高い細胞の通路はしばしば貧しいトランスフェクション率の結果します。HEK 293 t/17 細胞へのトランスフェクション試薬の追加後、それはまた、セル透磁率が増加することに注意してください。だからこそ、この時点でそれは最高の彼らは細胞毒性を高める可能性がありますので、中含まれている抗生物質を使用しないでください。新規パーティクルを収集する前に transfected HEK 293 t/17 細胞培養上清の色を確認します。通常、トランスフェクションの 48 時間後、細胞培養培地の色はオレンジ ピンクの色合いをかかります。黄色の媒体は通常貧しい新規粒子収量に変換し、しばしば細胞播種密度または高通過数に関する問題の結果であります。

このプロトコル 6 ウェル プレート形式で新規粒子生産が行われます。作り出された粒子の量を増加するには、6 ウェル プレートのいくつかの井戸は同じプラスミド ミックスで発現することが、培養上清を一緒にプールすることができます。プールは、フィルター処理された明確にし、検体、できます。また、生産量は、容器の他の種類を拡張する (25、または 75 cm2フラスコなど) 使用できます。この場合、トランスフェクション条件拡大縮小に応じてする必要があります。このプロトコルでは、24 ウェル プレート形式と同時に測定が 1 つの管だけ可能ルミノ使って、試が行われます。高スループット スクリーニングのため、他の形式も可能、96 ウェル プレート形式、プレート リーダー ルミノなどです。ボリュームとルシフェラーゼ アッセイ用試薬は、それに応じて適応する必要があります。クリオバイアル-80 ° c における新規粒子のストレージは、数ヶ月間感染性を落とすことがなくその安定性を維持します。凍結融解サイクルこれは時間とともに感染性を減少するようにそれらを服従させることはお勧めしません。したがって、それは最高の 0.5-1 などの小さい因数でそれらを格納する mL と感染する前にそれらを解凍。

ここで紹介する方法には、いくつかの制限があります。重要なものだけウイルス エントリ イベントを新規粒子に要約事実であります。伝染のライフ サイクルの他のステップを分析、その他のアッセイが必要です。さらに、MLV 粒子芽細胞膜で負担することが重要だと気をニーズの製造時に混入型膜へのトラフィックも検討されているエンベロープ糖蛋白。など、セルの特定のウイルスの封筒の糖蛋白質が表されるトランスフェクション条件のように蛍光アッセイと細胞内局在を可視化および/または範囲の保持信号をチェックして知っていることが重要です。蛋白質。また、プロトコルは、生産し、感染性をテストする手順を説明します、一方、ウイルスの封筒の糖蛋白質の新規粒子への取り込みを測定する方法を詳述されません。1 つの方法は、前述50,51 MERS コロナ ウイルス S 体用として粒子の濃厚溶液の西部のしみの試金を行うことです。これらのアッセイの MERS コロナ ウイルスのエンベロープ糖蛋白が、S タンパク質の粒子への取り込みを正常化できるようにする、MLV のキャプシド (p30) と共にプローブされます。このような試金分析ウイルスのエンベロープ糖蛋白質混入型の他の例は Sars-cov S 体用、HIV 1 レンチ pseudovirion システム32 、別 MLV 新規でエボラ糖タンパク質 (GP) に行われています。粒子システム17、インフルエンザ血球凝集素 (HA) とノイラミニダーゼ (NA) VSV 型38。新規粒子生産の特性の最近の発展は Nanosight など革新的イメージング デバイスの使用: 直接可視化、定量化、およびウイルス粒子50をサイズすることが出来ます。デバイスは、全体的な粒子生産されて詳細情報を提供します。ただし、エンベロープ糖蛋白結合に関する情報を提供はいないことを留意することが重要です。これらの汎用性の高い pseudovirion 粒子のアプリケーションの将来の方向性は単一粒子追跡、マイクロ流体システムと全反射蛍光顕微鏡60,61 を使用して個々 のウイルス融合イベントを分析するには ,62。このようなアプローチは、インフルエンザ ウイルス、猫コロナ ウイルス粒子、インフルエンザ HA- と NA-新規 VSV ベース型63に応用しました。コロナ ウイルス S 新規 MLV ベースの粒子に適用されるこのような技術の展開は、現在開発中です。

Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

有用なコメントのウィテカーとダニエルのラボのすべてのメンバーに感謝したいです。NIH によって提供された研究資金助成金 R21 AI111085 や R01 AI135270。技術移転を認めているコーネル大学、国立科学財団大学院研究フェローシップ プログラム番号の下で大統領の生命科学フェローシップからのサポートDGE-1650441。記念は、サミュエル ・ c. フレミング家族大学院特別研究員、国立科学財団大学院研究フェローシップ プログラム番号の下からサポートを認めています。DGE-1650441。この作品は、(標準偏差 G.R.W. し) 国立科学財団 1504846 に支えられています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100

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