Biosafety 수준 2 설정에 높게 병원 성 Coronaviruses 공부 Pseudotyped 입자의 생산

Immunology and Infection
 

Summary

여기, 우리가 현재 높게 병원 성 바이러스 중동 호흡기 증후군, 중증 급성 호흡기 증후군 coronaviruses의 스파이크 단백질을 통합 하는 BSL-2 설정에 pseudotyped 입자를 생성 하는 프로토콜. 이러한 pseudotyped 입자 포함 대상 호스트 세포에 바이러스 항목의 정량화를 허용 luciferase 취재 원 유전자.

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Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H. L., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).

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Abstract

코로나 (CoV) 스파이크 (S) 융해 단백질을 생성 하는 프로토콜 목적 pseudotyped 입자 murine 백혈병 바이러스 (MLV) 코어와 luciferase 기자와, 널리 HEK 293T의 간단한 transfection 절차를 사용 하 여 셀 라인. 일단 형성 하 고 프로듀서 셀에서 발표,이 pseudovirions luciferase 취재 원 유전자를 통합 합니다. 포함 이후 분리 코로나 스파이크 그들의 표면에 단백질, 입자 항목 단계에 대 한 그들의 네이티브 코로나 바이러스 대응 처럼 행동. 이와 같이, 그들은 주인 세포로 바이러스 성 항목을 공부에 대 한 네이티브 virions의 우수한 대리 모 알선입니다. 성공적인 항목 및 대상 세포로 감염, luciferase 기자 호스트 세포 게놈으로 통합 되 고 표현 된다. 간단한 luciferase 분석 결과 사용 하 여, 불리고 셀 수 있습니다. 쉽게 측정할 수 있습니다. 절차의 중요 한 장점은 biosafety에 수행할 수는 높게 병원 성 coronaviruses 중동 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (메-CoV) 등 작업에 필요한 BSL-3 시설 대신 2 (BSL-2) 시설 수준 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 (SARS-CoV) 속한 클래스와 같은 바이러스 성 융해 단백질의 세 클래스 나 인플루엔자 조류 (HA)과 에볼라 바이러스 당단백질 (GP), 클래스 II Semliki 숲 바이러스 E1 봉투 단백질에 적용할 수 있는 또 다른 이점은 그 다양성에서 온다 단백질, 또는 클래스 III vesicular 구내 염 바이러스 G 당단백질. 방법론의 한계는 그것은 바이러스 항목 단계 조사를 받고 봉투 단백질에 의해 중재를 정리만 수 이다. 다른 바이러스 성 수명 주기 단계를 공부, 다른 방법이 필요 합니다. pseudotype 입자를 사용할 수 있습니다 많은 응용 프로그램의 예로 호스트 셀 민감성 및 차 있는 굴곡 운동 테스트 바이러스 항목 억제제를 사용 하는 바이러스 항목 경로 해 부의 효과 조사.

Introduction

호스트 셀 항목 바이러스 성 전염 성 라이프 사이클의 초기 단계를 구성합니다. 엔벌로프된 바이러스에 대 한 단일 호스트 세포 수용 체 또는 바이러스 성 및 세포 막의 융합에 의해 따라 여러 수용 체에 바인딩을 해야 합니다. 이러한 필수적인 기능 바이러스 성 봉투 glycoproteins1,2에 의해 수행 됩니다. 코로나 바이러스 봉투 당단백질 스파이크 (S) 단백질 이라고 하며 클래스의 멤버인 나 바이러스 성 융해 단백질2,3,4,,56. 바이러스 성 봉투 glycoproteins와 같은 특정된 바이러스의 많은 중요 한 특성을 이해 하기 위한 중요 한입니다: 주기 개시, 그 호스트와 셀룰러 차 있는 굴곡 운동, interspecies 전송, 바이러스 성 병 인으로 호스트 셀 항목 경로입니다. 바이러스 성 pseudotyped 입자, 라고도 함 pseudovirions는 쉽게 바이러스 성 융해 단백질의 기능 연구를 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. Pseudotyped 입자 또는 pseudovirions는 그들의 표면에 분리 바이러스 성 봉투 단백질으로 대리 바이러스 코어의 구성 된 공상 virions. 프로토콜의 주요 목적은 얻을 하는 방법을 보여 코로나 스파이크 murine 백혈병 바이러스 (MLV) 코어 기반 luciferase 취재 원 유전자를 포함 하는 pseudotyped 입자. 예를 들어 pseudotyped 입자는 높게 병원 성 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)와 중동 호흡기 증후군 (MERS) coronaviruses의 스파이크 단백질을 생산 하는 방법은 제공 됩니다. 프로토콜은 luciferase 분석 결과 여 infectivity 정량화 및 참여, 어떻게 취약 대상 감염 세포, transfection 절차를 설명 합니다.

항목 단계는 pseudovirions의 그들의 표면에 코로나 S에 의해 규율 됩니다, 이후 그들은 입력 셀 비슷한 패션에 네이티브 대응 합니다. 이와 같이, 그들은 기능적인 infectivity 분석 실험의 우수한 대리 모 알선입니다. Pseudotyped 입자는 일반적으로 같은 레트로 바이러스 (MLV7,8,9,10,11,,1213 부모의 모델 바이러스에서 파생 된 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 그리고 lentivirus 인간 면역 결핍 바이러스-HIV23,24,25,26,27,,2829 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) 또는 rhabdoviruses (vesicular 구내 염 바이러스-VSV36,39,40,41,42,,4344 , 45 , 46 , 47). pseudotyping에서 사용 될 때 부모의 바이러스의 게놈 전체 복제 주기를 달성에 결함이 렌더링 필수 유전자를 제거 하 수정 됩니다. 이 중간 biosafety 수준 시설 (BSL-2)에서 사용할 수 있도록 기능과 높은 biosafety 시설 (BSL-3, BSL-4로 쉽게 사용할 수 있는)를 요구 하는 높게 병원 성 기본 바이러스를 사용 하 여 중요 한 장점 때 바이러스 항목 연구를 실시. 여기, 위험의 S 단백질 그룹 3 병원 균 SARS CoV와 메 CoV MLV에 통합 되는 바이러스 성 봉투 단백질의 예제로 사용 됩니다 pseudotyped 입자 사스 CoV S와 메 CoV S pseudovirions 생성 (SARS-Spp와 메-Spp, 각각). 이러한 pseudovirions 이러한 바이러스48,49,,5051의 항목 이벤트에 초점을 맞추고 연구에 성공적으로 사용 되었습니다. 또 다른 장점은 여기에 설명 된 기술을 pseudotyping 코로나 S 단백질에 국한 되지 않습니다: 그것은 매우 유연 하 고 바이러스 성 융해 단백질의 세 클래스의 대표를 통합 하는 데 사용할 수 있습니다. 예로 인플루엔자 조류 (하, 종류 I)52, 에볼라 바이러스 당단백질 (GP 클래스 I), E1 단백질의 alphavirus Semliki 숲 바이러스 (SFV, 클래스 II), 그리고 VSV 당단백질 (G, 클래스 III)53. 또한, 바이러스 성 당단백질의 종류 이상의 인플루엔자의 경우 공동 pseudotyped 입자에 통합 될 수 및 없음-하-pseudotyped 입자51.

Bartosch 외.20에 의해 수행 하는 작업에 따라,이 프로토콜 설명 MLV의 생성 3-플라스 미드 공동 transfection 전략을 널리 사용 하 고 높은 transfection 유능한 HEK 293T를 사용 하 여 pseudotyped 입자 셀 라인 54. 첫 번째 플라스 미드 MLV 핵심 유전자 개 그pol 인코딩하 하지만 MLV 봉투 env 유전자 부족. 두 번째 플라스 미드는 반딧불 luciferase 취재 원 유전자, 함께 5'는 MLV Ψ RNA 포장 신호를 인코딩하는 전송 벡터-3'-측면 MLV 오래 단말기 반복 (LTR) 지역. 3 플라스 미드가 인코딩합니다 관심, 융해 단백질을 경우에 사스 CoV S 또는 메 CoV S 단백질을. Transfection 시 약을 사용 하 여 3 개의 플라스 미드의 공동 transfection 시 바이러스 성 RNA와 단백질 pseudotyped 입자의 생성을 허용 하는 transfected 세포 내에서 표현 얻을. MLV pseudovirion 백본으로 사용, 이후이 원형질 막에서 발생: luciferase 진 기자와 포장 신호를 포함 하는 RNAs 또한 코로나 플라즈마 멤브레인 표현 스파이크를 통합 하는 초기 입자에 캡슐화 얻을 단백질입니다. 셀에서 밖으로 새싹 입자 그들의 표면에 코로나 S 단백질을 포함 하 고 infectivity 분석 실험에서 사용 하기 위해 수확. Pseudotyped 입자 항구 코로나 S 단백질과 하지 MLV 봉투 단백질, 세포 감염을 위해 사용 될 때, 때문에 그들은 그들의 네이티브 코로나 바이러스 대응 항목 단계 처럼 동작 합니다. 바이러스 성 RNA luciferase 기자를 포함 하 고 LTRs 측면은 다음 셀 내에 발표 하 고 retroviral 중 합 효소 활동 활성화 DNA에 그것의 반전 녹음 방송 및 호스트 세포 게놈으로 통합. 감염 된 세포에 바이러스 성 pseudotyped 입자의 infectivity의 정량화 다음 간단한 luciferase 활동 분석 결과 함께 수행 됩니다. 호스트 세포 게놈으로 통합 되 면 DNA 시퀀스 luciferase 유전자와 MLV 또는 코로나 바이러스 단백질 암호화 유전자의 포함, 때문에 그들은 본질적으로 기본 복제 유능한 바이러스 보다 사용 하기 더 안전 하다.

뿐만 아니라 안전한 대리 모 알선 및 높은 봉투 glycoproteins의 다양 한 종류의 수 있도록, 여기에서 설명 하는 pseudotyped 입자는 또한 매우 다양 한 적응력과 바이러스 항목의 여러 측면을 연구 하는 데 사용 될 수. 이 포함 되지만 국한 되지 않습니다: 바이러스 감염 호스트 셀 민감성을 테스트, 엔벌로프된 바이러스를 사용 하 여 셀룰러 항목 경로 분석, 약리 억제제 및 마약 검사의 효과 공부 하 고, 중화 항 체를 실시 분석 실험, 교양 없는 엔벌로프된 바이러스의 호스트 셀 항목 특성화 및 유전자 배달에 대 한 바이러스 성 벡터 생성 관심, 또는 유전자 침묵 시키기의 유전자의 세포질 표정 안정.

Protocol

1입니다. 셀 Pseudotyped 입자 생산에 대 한 시드

참고: Biosafety 내각에서이 단계를 수행 합니다.

  1. 표준 셀 문화 기술로 얻을 완전 한 Dulbecco에 passaged HEK-293T/17 셀의 80-90% confluent 75 c m2 플라스 크의 수정이 글의 중간 (DMEM-C) 포함 하는 10% (vol/vol) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 100 IU/mL 페니실린, 및 100 µ g/mL 스. Transfections (그것의 구성은 같은 DMEM C 하지만 항생제 없이)에 대 한 T DMEM 매체를 준비 합니다.
  2. 10 mL의 사전 예 열된 (37 ° C) Dulbecco의 인산 염 버퍼 염 분 (DPBS)에 포함 된 셀 두 번 씻는 다.
    참고: 그들은 쉽게 분리로 주의 HEK293T/17 셀을 처리 합니다.
  3. 상쾌한 발음 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 0.25 %trypsin 솔루션의 1 mL로 세포 분리 37 ° C, 5% CO2 배양 기 3−5 분 또는 때까지 분리를 시작 하는 셀에 셀의 플라스 크를 배치 합니다.
    참고: 잠복기 5 분 이상에 대 한 트립 신으로 셀이 일반적으로 세포 응집을 리드 하지 마십시오.
  4. DMEM C 매체 및 count 셀 셀 슬라이드 및 가벼운 현미경을 사용 하 여 4 개 mL를 추가 하 여 트립 신을 비활성화 합니다.
    참고: 것을 피하기 위해 너무 많은 셀, 추가 희석 단계 미리 필요할 수 있습니다. Trypsinized 셀의 실제 셀 밀도 계산할 때이 희석 요소를 기억 하십시오.
  5. DMEM c5 셀/mL 5 x 10을 셀 희석
  6. 6 잘 조직 배양 플레이트 잘 당 셀 솔루션의 2 mL와 씨앗 부드럽게 접시를 앞뒤로 이동 하 고 균일 하 게 배포 셀, 원형 모션을 피하고 측면에 사이드.
    참고: 이것은 중요 한 단계 이다. 균등 하 게 분산된 셀 셀 우물의 센터에서 덩어리 하지 않습니다 보장 됩니다. 차례 차례로, 이것은 보장 좋은 transfection 효율 및 pseudotyped 입자 생산.
  7. 접시 하룻밤 (16-18 h) 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서에서 품 어.

2. 3-플라스 미드 공동 transfection

참고: Biosafety 내각에서이 단계를 수행 합니다.

  1. 셀 셀 형태 및 밀도 대 한 확인을 거꾸로 가벼운 현미경을 관찰 합니다.
    참고: 이상적으로, 셀 밀도 40-60 %confluency 범위에 있어야 한다. 그것은 중요 한 세포는 둘 다 너무 합칠 (80−90% 합칠)도 너무 띄엄띄엄 (20−30% 합칠) 각 잘 배포. 40−60 %confluency 셀 밀도 좋은 pseudotyped 입자 생산을 보장 합니다.
  2. 플라스 미드 믹스
    1. 다음 표 1에 표시 된 6 잘 플레이트 한 우물에 대 한 양의 각 봉투 당단백질의 플라스 미드 믹스를 계산 합니다. 여러 우물을 transfecting 경우 수량을 곱하기 고 혼합 부족 하지 않도록 하는 추가 잘을 포함 합니다.
      참고: 사스 CoV S와 플라스 미드를 인코딩 메 CoV S, 긍정적인 통제 당단백질 함께 바이러스 성 봉투 glycoproteins (Δenv 입자)와 같은 부족 부정적인 제어 입자의 생성에 대 한 빈 벡터 제어 포함 기공을 구내 염 바이러스 (VSV) G 당단백질 튼튼하게 셀 (VSV Gpp)의 매우 넓은 범위를 감염으로 알려져 있다. 플라스 미드는 요청 시 사용할 수 있습니다.
    2. 혼합은 microcentrifuge 튜브에 플라스 미드 및 감소 된 혈 청 세포 배양 매체 ( 재료의 표참조)의 볼륨을 계산 합니다.
  3. 지질에 기초를 둔 transfection 시 혼합 ( 재료의 표참조)
    1. 한 음 (1:3 transfection 비율, 곱하기 수량 필요에 따라)에 대 한 표 2 에 표시 된 수량에서 transfection 시 믹스에 대 한 볼륨을 계산 합니다. Transfection 시 믹스의 밖으로 실행 되지 않도록 추가 웰 스를 포함 한다.
    2. 혼합 계산 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 (잘 당 3 µ L) 및 감소 된 혈 청 세포 배양 (잘 당 47 µ L) microcentrifuge 관에서의 볼륨 감소 된 혈 청 세포 배양 매체와 아닌 다른 방법으로 transfection 시 약을 추가 하 주위.
  4. 둘 다 믹스를 품 어 (한 우물에 대 한: 50 µ L 플라스 미드의 믹스 및 믹스의 지질에 기초를 둔 transfection 시 약 50 µ L) 실 온에서 5 분에 대해 별도로.
  5. Transfection 시 믹스의 내용을 1:1 비율로 플라스 미드에 추가 (잘 1: 각 혼합의 50 µ L)
  6. 철저 한 상하 pipetting 결과 믹스를 수행 합니다.
  7. 실내 온도에 적어도 20 분 동안 혼합 품 어.
  8. 셀의 보낸된 중간 발음
  9. 잘 당 미리 따뜻하게 (37 ° C) 감소 된 혈 청 세포 배양 매체의 부드럽게 1 mL를 추가 합니다.
  10. 추가 dropwise 100 µ L 각 잘 transfection 혼합의.
    참고: 그들은 쉽게 분리로 transfection 믹스 HEK 293T의 웰 스를 추가할 때 주의 운동.
  11. 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 4-6 h에 대 한 셀을 품 어.
  12. 항생제를 포함 하지 않는 미리 따뜻하게 (37 ° C) DMEM T 매체의 당 1 mL을 추가
    참고: 이것은 중요 한 단계 이다. Transfection 시 약은 세포 침투성을 증가 하 고 항생제에 감도 증가. 좋은 transfection 효율 및 pseudotyped 입자 생산을 보장 하기 위해, 그것은 항생제를 포함 하는 세포 배양 매체를 사용 하지 않도록 하는 것이 중요
  13. 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 48 h에 대 한 셀을 품 어.

3. pseudotyped 입자 컬렉션

참고: Biosafety 내각에서이 단계를 수행 합니다.

  1. 세포 세포 형태학 및 일반 조건에 대 한 확인을 거꾸로 가벼운 현미경을 관찰 합니다. 또한 빛이 되어야 하는 매체의 색상을 체크 핑크/약간 오렌지.
    참고: 이 중요 한 단계입니다. Transfection는와 관련 된 너무 많은 세포 죽음 또는 중간 색깔 주황색/노란색 (산 성 pH) 설정 되어 있는 경우에,이 일반적으로 낮은 수익률을 감염 pseudotyped 입자에 연결 됩니다.
  2. 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 supernatants transfected 세포의 전송.
  3. 290 x g 세포 파편을 제거 하는 7 분에 튜브 원심
  4. 명확히 supernatants 살 균 0.45 μ m 기 공 크기의 필터를 통해 필터링.
  5. 작은 볼륨 aliquots를 확인 (예:., 500 µ L 또는 1 mL)의 cryovials pseudotyped 바이러스 솔루션.
  6. -80 ° c.에 게
    참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. Pseudotyped 입자는 몇 달 동안-80 ° C에 안정 하지만 일단 해 동, infectivity 잃게됩니다 그들은 다시 그들을 동결 하지 않도록

4. pseudotyped 입자 감염 감염 되기 쉬운 세포의

참고: Biosafety 내각에서이 단계를 수행 합니다.

  1. 셀 24-잘 접시의 감염 세포의 시드
    1. 표준 셀 문화 기술 80−90% confluent 75 c m2 플라스 크 취약 셀 여: SARS CoV Vero-E6 셀 pseudotyped 입자 (SARS-Spp)와 허 7 셀 메 CoV S pseudotyped 입자 (메 종).
      참고: 확인 하려면 생산 된 pseudotyped 입자는 전염 성, 신중 하 게 pseudovirion infectivity 분석 실험에 대 한 적절 한 취약 셀 라인을 선택 하는 것이 중요 하다. 가난 하 게 관대 한 셀을 사용 하 여 낮은 infectivity 이어질 것입니다.
    2. 미리 데워 진된 (37 ° C) DPBS의 10 mL로 두 번 셀을 씻어.
    3. 상쾌한 발음 하 고 37 ° c.에 미리 예 열 하는 0.25 %trypsin 솔루션의 1 mL로 세포 분리 37 ° C, 5% CO2 배양 기 3−5 분 또는 때까지 분리를 시작 하는 셀에 셀의 플라스 크를 배치 합니다.
      참고: 이 일반적으로 세포 응집을 리드 5 분 이상 trypsin 셀 잠복기 하지 마십시오. 허-7 셀이이 효과에 특히 민감합니다.
    4. DMEM C 매체 및 count 셀 셀 슬라이드 및 가벼운 현미경을 사용 하 여 추가 하 여 트립 신을 비활성화 합니다.
    5. DMEM c5 셀/mL 5 x 10을 셀 희석
    6. 시드 웰 스 24 잘 잘 당 셀 솔루션의 0.5 mL 접시 부드럽게 접시를 앞뒤로 이동 및 균일 하 게 배포 셀, 원형 모션을 피하고 측면에 측면
      참고: 이것은 중요 한 단계 이다. 균등 하 게 분산된 셀 셀 우물의 센터에서 덩어리 하지 않습니다 보장 됩니다. 차례 차례로, 이렇게 하면 좋은 infectivity 분석 실험. 각 pseudotyped 입자 (SARS-Spp, 메 종) 및 상태에 대 한 3 개의 실험적인 복제에 대 한 3 개의 우물을 준비 합니다. 감염 되지 않은 (N.I.), 빈 벡터 Δenv 입자와 VSV Gpp 같은 긍정적인 제어 입자에 대 한 웰 스를 포함
    7. 접시 하룻밤 (h 16−18) 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서에서 품 어
  2. Pseudotyped 입자 감염
    1. 가벼운 현미경에서 세포를 관찰 하 고 시각적으로 셀 confluent 카펫 인지 확인.
    2. 얼음 해 동 pseudotyped 바이러스의 cryovials를가지고.
    3. 미리 예 열 (37 ° C) DPBS 0.5 mL로 세 번 세척 세포
      참고: 이것은 중요 한 단계 이다. 있지 않은 셀 제대로 감염 일반적으로 가난한 infectivity 판독을 리드 하기 전에 씻어 서
    4. 셀의 supernatants 발음
    5. 해 동된 pseudotyped 입자 솔루션의 200 µ L로 세포 접종
    6. 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 1−2 h에 대 한 셀을 품 어.
    7. 미리 데워 진된 (37 ° C) DMEM C 매체의 300 µ L를 추가 합니다.
    8. 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터 72 h에 대 한 셀을 품 어.

5. infectivity Luciferase 분석 결과 판독 하 여 정량화

참고: Biosafety 내각에서 초기 단계를 수행 합니다.

  1. 해 동 소 기판 (-80 ℃에서 저장) 및 5 배 luciferase 분석 결과 세포의 용 해 버퍼 (-20 ° C에서 저장 된)까지 실내 온도 도달.
  2. 멸 균 물 1 x luciferase 분석 결과 세포의 용 해 버퍼를 희석.
  3. 셀 pseudotyped 입자와 감염의 supernatants 발음
  4. 각 잘을 100 µ L 1 x luciferase 분석 결과 세포의 용 해 버퍼를 추가 합니다.
  5. 로커에 접시를 놓고와 락을 (이 시점에서 앞으로 접시 biosafety 캐비닛 외부 처리 될 수 있습니다) 실 온에서 15 분 동안 품 어.
  6. 각 관에서 소 기판의 20 µ L을 추가 하 여 각 잘 microcentrifuge 튜브를 준비 합니다.
  7. 루미 노 켭니다.
  8. 루시페린 기판의 20 µ L을 포함 하는 1 개의 관에 lysate의 10 µ L를 전송 하 여 한 번에 잘 하나 luciferase 활동 측정을 수행 합니다.
  9. 부드럽게 혼합 내용, 하지만 튜브의 벽에 액체를 전치 하지 않도록 튜브를 터치 합니다.
  10. 장치에서 튜브를 놓고 뚜껑을 닫습니다.
  11. 루미 노를 사용 하 여 튜브의 발광 값을 측정 합니다.
  12. 상대 빛 단위 측정 기록.
  13. 단계 5.8-5.12를 반복 하 여 모든 웰 스는 분석 했다.
    참고: 루미 노 읽고 접시 같은 적절 한 장비와 함께이 프로세스를 자동으로 수행할 수 있습니다. 분석 결과 플레이트 형식 (예:, 96 잘 플레이트 형식) 조절 해야 합니다.

6. 데이터 분석

  1. 계산 및 상대 luciferase 단위의 평균 및 표준 편차의 표시
    1. 소프트웨어를 플롯 그래프를 사용 하 여 계산 luciferase 분석 결과 측정 평균 및 표준 편차 실험 및 생물의 복제.
    2. 막대형 차트 표준 편차로 데이터를 플롯 합니다.
      참고: 데이터에서 통계 분석을 수행할 때 데이터 집합에 적어도 3 개의 생물 복제를 포함 해야 합니다.

Representative Results

대표 결과 사스 CoV S과 메 CoV S infectivity 분석 실험의 pseudotyped 입자는 그림 1에 나와 있습니다. 예상 했던 대로, 두 그림 1A, 1B, VSV G pseudotyped 제어 입자 (VSV Gpp) 10에 매우 높은 평균 infectivity 준 긍정적인6 107 상대 luciferase 단위 (RLU)에 각각 범위. 사스 CoV s 취약 Vero-E6 셀의 pseudotyped 입자 (그림 1A) 감염, 강한 평균 infectivity 9.8 x 10에 측정 되었다4 RLU. 이 값은 거의 3 배나 감염 되지 않은 컨트롤에 대 한 측정 값 보다 더 높은 (1.1 x 102 RLU), 또는 Δenv 입자 (1.5 x 102 RLU)는 그들의 표면에 어떤 바이러스 성 봉투 glycoproteins 항구 하지 않습니다. 마찬가지로, 메 CoV S에 대 한 허-7 세포의 pseudotyped 입자 (그림 1B) 감염, 높은 평균 infectivity 약 1.0 x 10에 측정 되었다6 RLU. 이것은 거의 4 배나 감염 되지 않은 컨트롤에 대 한 측정 값 보다 더 높은 (0.8 x 102 RLU), 또는 Δenv 입자 (2.0 x 102 RLU). 추가 infectivity 분석 결과는 SARS Spp와 메 Spp 순차적으로 희석 되었고 Vero-E6 셀 (그림 2A)를 감염 하는 데 사용 수행 되었다. 이 분석 결과 측정 luciferase 활동은 세포를 감염 하는 데 사용 하는 입자의 농도에 따라 확인 합니다. 우리가 제대로 허용 HEK 293T 세포를 사용 하는 첨부 파일 및 항목 pseudotyped 입자의 중재에 각각 안 변환 효소 2의 역할 (ACE2) 및 dipeptidyl peptidase 4 (DPP4), 사스 CoV와 메 CoV의 수용 체를 확인 하 고 ACE2 또는 DPP4 표현할 수 페 (그림 2B). Transfected 세포 infectivity 분석 결과 대 한 다음 사용 되었습니다. 이 분석 ACE2 DPP4의 overexpression, 시는 사스 Spp와 메 Spp infectivity ~ 4 로그와 ~ 2-로그 증가 각각 보여 줍니다 pseudovirions의 그 수용 체 사용을 확인 하는 것은 네이티브 바이러스 비슷합니다.

여기에 표시 된 예는 긍정적인 제어 (VSV Gpp) 조건에 뿐만 아니라 pseudotyped 입자를 생산 하는 경우의 중요성 등 부정적인 (감염 되지 않은 Δenv 입자)를 보여 줍니다. 실제로, 긍정적인 제어 VSV Gpp 입자 수 pseudotyped 입자의 특정 배치 기능과 infective pseudovirions 항복에 성공 여부를 평가. VSV Gpp 입자 선은 106−107 RLU 범위에 대부분 포유류 세포에 의해 일반적인 감염의 결과 예상. HEK-293T/17 프로듀서 셀 (높은 통행 수, 세포 밀도와 문제) 문제 또는 가난한 transfection 효율 전체 pseudotyped 입자 생산과 infectivity 영향을 줄 수. 또한, 부정적인 제어 조건에 또한 중요 한 그들은 우리는 특정 셀 라인 (감염 되지 않은 상태)에서 RLU 측정의 베이스 라인 및 중재 하지 입자 (Δenv 감염)의 일반적인 국제화 평가를 수 의해 바이러스 성 봉투 단백질. 이상적으로, 관심의 바이러스 성 봉투 단백질 입자 pseudotyped의 특정된 유형, 그것 것이 좋습니다 값을 몇 배나 부정적인 컨트롤 값 보다 더 높은 그림 1A, B에서그림과 같이. 그러나, 지정 된 셀 형식에 대 한 pseudotyped 바이러스 감염 매우 작은 infectivity 제공 하는 경우 (즉,, 가까이 부정적인 컨트롤 같은 그림 2B 비 페 N.T. 조건에서) 그것은 반드시 의미 하지 않는다 그는 pseudotyped 입자 생산은 잘못 이었다. 잘 될 수 있는 특정 셀 라인 사용 또는 저조한 아니다 감염을 허용. 여부는 지정 된 셀 형식을 것으로 예상 된다 감염에 감염 될 조사 되 고 바이러스에 의해 확인 하는 것이 좋습니다. 더 효율적인 바이러스 항목 및 ACE2 및 DPP4 수용 체에서의 transfection 시 어디에 표시 된 그림 2B로 발생 하는 감염 바이러스 성 receptor(s) 수를 표현 하는 plasmid(s)와 transfecting 제대로 허용 셀 HEK 293T 대상 셀, ~ 4-와 ~ 2-로그 infectivity, 각각 증가.

플라스 미드/시 약 수량
pCMV-MLVgagpol MLV 개 그와 플라스 미드를 인코딩 폴 300 ng
pTG-뤽 전송 벡터 luciferase 기자 400 ng
pcDNA-SARS-S, pcDNA-메-S 또는 빈 벡터 300 ng
감소 된 혈 청 세포 배양 매체 50 µ L를

표 1: 플라스 미드 및 감소 된 혈 청의 문화 매체 transfect pseudotyped 입자 생산을 위한 HEK-293T/17 셀의 6 잘 플레이트의 하나 잘 하는 데 필요한 셀. 플라스 미드 준비의 농도에서 플라스 미드 DNA의 필요한 금액을 도달 필요한 볼륨을 계산 합니다. 하나 이상의 잘 동일한 플라스 미드와 페는, 볼륨에 transfect, 우물의 필요한 수를 곱하면 고 추가 잘 혼합 나중 단계에 부족 하지 않도록 하는 계산에 포함. 페 되 고 DNA의 총 금액은 1 µ g/잘. 플라스 미드로 요청 시 사용할 수 있습니다.

시 약 수량
Transfection 시 약 3 Μ L
감소 된 혈 청 세포 배양 매체 47 Μ L

표 2: transfection 시 약 및 감소 된 혈 청의 문화 매체 transfect pseudotyped 입자 생산을 위한 HEK-293T/17 셀의 6 잘 플레이트의 하나 잘 하는 데 필요한 셀. 볼륨 transfect 나중 단계에서 혼합의 밖으로 실행 되지 않도록 계산에 추가 웰 스를 포함 하는 우물의 필요한 수를 곱하면 됩니다. Transfection 시 약: 플라스 미드 DNA 사용 비율은 3:1.

Figure 1
그림 1 : 코로나 S-pseudotyped 입자 infectivity 분석 murine 백혈병 바이러스 (MLV) 백본 및 luciferase 리포터 유전자를 사용 하 여 취약 호스트 셀에. (A) SARS CoV S pseudotyped 입자 infectivity 분석 결과 Vero-E6 셀에. (B) 메 CoV S pseudotyped 입자 infectivity 분석 결과 허 7 셀에. 모두 (A) (B), 그려진된 데이터에 해당 평균 상대 luciferase 단위, 3 개의 독립적인 실험에서 표준 편차 (사 우 스 다코타)에 해당 하는 오차 막대와 함께. Y 축에 로그10 규모에서 데이터 플롯. N.I.: 비 감염 제어; Δenv: pseudotyped 입자 바이러스 성 봉투 glycoproteins와 VSV Gpp 감염: 감염 베어링 긍정적인 제어 VSV G 봉투 당단백질 pseudotyped 입자. 다른 약어 사용, SARS Spp: SARS CoV s 감염 pseudotyped 입자, 메 종: 메 CoV s 감염 pseudotyped 입자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : CoV S-pseudovirion infectivity와 SARS Spp와 메 종 항목에서 ACE2 및 DPP4 수용 체의 역할의 농도 의존. (A) 농도-의존성 SARS Spp와 메 Spp infectivity luciferase 활동 분석 결과 의해 측정의 Pseudovirions 직렬 희석 되었고 Vero-E6 셀을 감염 하는 데 사용. (B) Infectivity SARS Spp와 제대로 허용 HEK 293T 대상 셀에 메-Spp의 분석 결과 표현 ACE2 하 페 및 DPP4 수용 체, 각각. 데이터 표준 편차 (사 우 스 다코타)에 해당 하는 오차 막대와 중복 실험에서 그림 1 과 같이 y 축에 로그10 규모에서 플롯. N.T.: 비 페 제어 HEK 293T 세포; ACE2: 안 변환 효소 2 (SARS CoV 수용 체)와 DPP4: dipeptidyl peptidase 4 (메 CoV 수용 체). 다른 약어 사용은 그림 1과 같이 동일 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 프로토콜에는 베어링의 위험 그룹 3 coronaviruses, SARS CoV와 메 CoV BSL-2 설정에서 S 단백질 pseudotyped 입자를 효율적으로 생산 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 입자 luciferase 취재 원 유전자를 통합 하는 비교적 간단한 luciferase 분석 결과48,49,,5051에 의해 코로나 S 중재 항목 이벤트를 쉽게 계량 하 가능 Infectivity 분석 허용 셀을 사용 하 여, 우리는 측정 luciferase 활동 입자의 농도에 따라 달라 집니다 확인 합니다. 또한, ACE2 및 DPP4 수용 체 transfection HEK 293T 세포 등 제대로 허용 셀 라인에서 더 효율적인 항목에 대 한 수 있습니다. 방법과 매우 다른 바이러스 성 봉투 glycoproteins에 적응할 수 있는 광범위 하 게 사용 되었습니다48,49,50,,5152,53, 55,56,,5758,59, 생 화 확 적인 분석 또는 기본 바이러스 감염과 같은 다른 분석을 보완 하기 위해 자주.

우리는 여기에 설명 하는 프로토콜 레트로 바이러스 MLV luciferase 기자 통합을 기반으로 합니다. 그러나, 그것은 매우 다양 한 다른 pseudotyping 시스템을 성공적으로 개발 된 포장 코로나 바이러스에 대 한 S12,13,,2526, 는 강조 하는 것이 중요 30 , 31 , 32 와 다른 바이러스 성 봉투 glycoproteins10,11,14,,1617,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. 이러한 다른 시스템의 일부를 기반으로하는 일반적으로 사용 되 MLV retroviral 코어7,8,,910,11,12,13 ,14,15,,1617,18,19,20, 또는 널리 lentiviral V-1에 따라 다른 전략23,,2425,26,27,28,29,30 사용 하 여 pseudotyping 시스템 ,31,32,33,,3435, 광범위 한 통합을 허용 하는 rhabdovirus vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) 코어로, 또는 봉투 glycoproteins, 그리고 다시 다양 한 전략 고용37,38,39,40,,4142,43 ,,4445,,4647. 또한, 형광 단백질 등 다른 기자와 같은 GFP11,13 및 RFP36또는 이외에 β-galactosidase16,17 같은 luciferase 효소 분 비 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (SEAP)42 측정을 위한 성공적으로 고용 되어 있다. 또한,이 프로토콜에서 제공 하는 분석 결과에 과도 transfection MLV 및 CoV S 유전자와 단백질을 표현 하기 위해 사용 되었다. 그러나, 식, pseudotyped 바이러스7,14의 생산에 대 한 안정 된 세포의 생성 등을 위한 다른 전략이 있다. 이러한 시스템의 각 그들의 장점과 단점이 있다, 그것은 어떤 pseudotyping 시스템 최고의 탐정의 요구에 적합 한 결정할 때 다음과 같은 중요 한 매개 변수를 고려 하는 것이 중요: pseudovirion 코어 (MLV, 에이즈-1, VSV 또는 다른 사람), 어떻게 선택적 특정 pseudotyping 코어는 특정 바이러스 성 봉투 당단백질, 분석 결과 판독 (GFP, luciferase, SEAP 또는 다른), 기자와 transfection 전략 (공동 transfection, 과도에 관련 된 플라스 미드의 수 고에 transfection 또는 안정 된 세포의 생성).

방법에 중요 한 단계를 강조 하는 것이 중요 수가 있다. 셀 밀도, HEK-293T/17 프로듀서 셀 라인의 특히 성공적인 transfection 확보에 중요 한 요소 이다. 40-60 %confluency 범위에서 셀 밀도 수 발견 됐다. 높은 밀도 낮은 transfection 효율 및 낮은 입자 생산에서 일반적으로 발생할. 또한, HEK-293T/17 셀은 다른 셀 라인 보다 덜 부착을 염두에 중요 하다. 불필요 하 게 그들을 분리 하는 피하기 위해 그들을 처리할 때 관리를 행사 한다. 하나의 옵션 준수를 향상 시키기 위해 폴 리-D-리 셀 문화 플라스틱 표면 치료 하는 것입니다. 또한, 더 높은 셀 통로 종종 가난한 transfection 비율에 있는 결과. Transfection 시 HEK-293T/17 셀을 추가한 후 그것은 또한 세포 침투성 증가 기억 하는 것이 중요입니다. 이 때문에 시점에서 그들은 세포 독성을 증가 시킬 수 있습니다으로 중간 포함 된 항생제를 사용 하지 않도록 최상 이다. Pseudotyped 입자를 수집 하기 전에 transfected HEK-293T/17 셀 supernatants의 색을 확인 합니다. 일반적으로, transfection의 48 h 후 세포 배양 매체 컬러는 오렌지 핑크 가미를 걸립니다. 노란색 색 매체 일반적으로 가난한 pseudotyped 입자 수율으로 변환 하 고 종종 문제와 셀 밀도 높은 통행 수를 뿌리기의 결과 이다.

이 프로토콜에 pseudotyped 입자 생산 6 잘 플레이트 형식으로 수행 됩니다. 생산된 입자의 볼륨을 증가, 6 잘 플레이트의 여러 우물 같은 플라스 미드 믹스와 함께 페 수 고는 supernatants 함께 풀링된 수 있습니다. 명확히 하 고, 필터링 및 aliquoted에 다음 풀 수 있습니다. 또는 혈관의 다른 종류를 생산 규모 (예를 들어, 25, 또는 75 c m2 플라스 크) 사용할 수 있습니다. 이 경우 transfection 조건 한다 수평 따라. 이 프로토콜에서 infectivity 분석 결과 24-잘 플레이트 형식 및 루미 노만 한 번에 측정 한 관 수를 사용 하 여 수행 됩니다. 높은 처리량 검사에 대 한 다른 포맷 가능, 96-잘 플레이트 형식 및 플레이트 리더 루미 노 등도 있습니다. 볼륨 및 시 약 luciferase 분석 결과 대 한 적절 하 게 적응 시킬 필요가 있다. -80 ° C에서 cryovials에 pseudotyped 입자의 저장 infectivity에서 눈에 띄는 감소 없이 몇 달 동안 그들의 안정성을 유지합니다. 그것은 동결-해 동 주기로이 시간이 지남에 자신의 infectivity 줄어에 그들을 권장 하지 않습니다. 따라서, 그것은 0.5-1 작은 aliquots에 그들을 저장할 좋은 mL 감염 하기 전에 그들을 재개 하 고.

여기에 제시 하는 메서드는 몇 가지 제한이 있습니다. 중요 한 pseudotyped 입자만 바이러스 항목 이벤트를 정리 하는 사실 이다. 전염 성 수명 주기의 다른 단계를 분석, 다른 분석 실험이 필요 합니다. 또한, 플라즈마 막에서 MLV 입자 버드, 그것은에서 중요 한 그 봉투 당단백질을 생산 하는 동안 pseudovirions에 설립에 대 한 원형질 막에도 트래픽을 필요로 공부 되 고 마음. 이와 같이, 그것은 아는 것이 중요 어디 셀에 특정 바이러스 성 봉투 당단백질은 표현 transfection 조건에서와 같은 면역 형광 분석 결과와 subcellular 지 방화를 시각화 및 보존 신호에 대 한 확인 하 여 단백질입니다. 또한, 프로토콜에서는 생산 infectivity 테스트 하는 단계에 설명 합니다, 하지만 pseudotyped 입자에 바이러스 성 봉투 glycoproteins의 결합을 측정 하는 방법을 선발 하지 않습니다. 한 방법은 앞에서 설명한50,51 메 CoV S 통합으로 입자의 집중된 솔루션에 서쪽 오 점 분석 실험을 수행 하는. 이 분석 실험에서 메 CoV의 S 봉투 당단백질 정상화 입자로 S 단백질의 설립을 허용 하는 MLV, capsid (p30) 단백질 함께 조사 이다. Pseudovirions로 바이러스 성 봉투 당단백질 설립 분석 등 분석 실험의 다른 예제는 HIV 1 lentiviral pseudovirion 시스템32 , 다른 MLV pseudotyped에서 에볼라 당단백질 (GP)에서 사스 CoV S 통합 수행 되었습니다. 입자 시스템17, 인플루엔자 조류 (HA) 및 응집 VSV pseudovirions38(없음). Pseudotyped 입자 생산을 특성화에 최근 개발은 Nanosight 같은 혁신적인 이미징 장치 사용: 직접 시각화, 계량, 및 바이러스 성 입자50크기를 수 있습니다. 전반적인 입자 생산;에 자세한 정보를 제공 하는 장치 그러나, 그것은 그것은 봉투 당단백질 설립에 정보를 제공 하지 않습니다 명심 하는 것이 중요입니다. 이 다재 다능 한 pseudovirion 입자의 응용 프로그램에 대 한 미래 방향을 추적 하는 단일 입자, 마이크로 및 총 내부 반사 형광 현미경60,61 사용 하 여 개별 바이러스 퓨전 이벤트를 분석 하는 ,62. 이러한 접근 방식은 성공적으로 인플루엔자 바이러스 및 고양이 코로나 입자 뿐만 아니라 인플루엔자 HA-와 NA-pseudotyped VSV 기반 pseudovirions63에 적용 했다. 코로나 S pseudotyped MLV 기반 입자에 적용 되는 이러한 기술 배포 현재 개발 되고있다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

유용한 코멘트에 대 한 휘 태 커와 다니엘 연구소의 모든 구성원에 게 감사 하 길. NIH에 의해 제공 된 연구 자금 보조금 R21 AI111085 및 R01 AI135270. 고작 인정 코넬 대학 및 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 프로그램 부여 번호 아래에서 대통령 생명 과학 원정대 지원 DGE-1650441입니다. L.N. 인정 사무엘 C. 플레밍 가족 대학원 친교 및 국립 과학 재단 대학원 연구 친교 프로그램 부여 번호 아래에서 지원 DGE-1650441입니다. 이 작품은 국립 과학 재단 1504846 (사 우 스 다코타 G.R.W.)를 하 여도 지원 됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100

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