Produktion av Pseudotyped partiklar att studera högpatogen coronavirus i biosäkerhet nivå 2 miljö

Immunology and Infection
 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att generera pseudotyped partiklar i en BSL-2 inställning innehåller proteinet spike högpatogena virus Mellanöstern respiratorisk sjukdom och svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus. Dessa pseudotyped partiklar innehåller ett luciferas reporter gen så att kvantifiering av virus trätt i värd målceller.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Millet, J. K., Tang, T., Nathan, L., Jaimes, J. A., Hsu, H. L., Daniel, S., Whittaker, G. R. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. J. Vis. Exp. (145), e59010, doi:10.3791/59010 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protokollet syftar till att generera coronavirus (CoV) spike (S) fusionsprotein pseudotyped partiklar med en murin leukemi virus (MLV) core och luciferas reporter, använder en enkel transfection tillvägagångssättet av den allmänt tillgängliga HEK-293T cellinje. När bildas och avges från producenten celler, införliva dessa pseudovirions ett luciferas reporter gen. Eftersom de endast innehåller heterologa coronavirusen spike protein på sin yta, partiklarna beter sig som deras infödda coronavirus motsvarigheter för posten steg. Som sådan, är de de utmärkta ersättningar av infödda virioner för att studera viral trätt i värdceller. Vid lyckad post och infektion i målceller, luciferas reportern blir integrerade i den mottagande cell arvsmassan och uttrycks. Med en enkel luciferas-analys, kan sensorik celler vara enkelt kvantifieras. En viktig fördel med förfarandet är att det kan utföras i biosäkerhet nivå 2 (BSL-2) faciliteter istället för BSL-3 faciliteter krävs för arbete med högpatogen coronavirus som Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) och svår akut respiratorisk sjukdom coronavirus (SARS-CoV). En annan fördel kommer från dess mångsidighet som det kan tillämpas på kuvert proteiner tillhör alla tre klasser av viral fusionsproteinerna, till exempel klassen I influensa hemagglutinin (HA) och Ebola virus glykoprotein (GP), klass II Semliki forest viruset E1 protein, eller klass III vesikulär stomatit virus G glykoprotein. En begränsning i metoden är att det endast kan sammanfatta virus posten steg medieras av kuvertet protein utreds. För att studera andra virala livscykel steg, krävs andra metoder. Exempel på de många program som dessa pseudotype partiklar kan användas i utredningen av mottagande cellernas mottaglighet och tropism och testa effekterna av viruset inträde hämmare att dissekera viral posten vägar används.

Introduction

Cell värdpost utgör de första stegen av viral infektionssjukdomar livscykel. För höljeförsedda virus innebär bindning till en enda värd cell receptor eller flera receptorer, följt av smältning av viral och cellulära membran. Dessa väsentliga funktioner utförs av virala kuvertet glykoproteiner1,2. Den coronavirus kuvert glykoprotein kallas proteinet spike (S) och är medlem i klassen jag viral fusion proteiner2,3,4,5,6. Studera virala kuvertet glykoproteiner är avgörande för att förstå många viktiga egenskaper hos ett visst virus, såsom: lifecycle inledande, dess värden och cellulära tropism, mellan arterna överföring, viral patogenes, samt värd cell inträde vägar. Viral pseudotyped partiklar, även kallad pseudovirions, är kraftfulla verktyg som möjligt för oss att enkelt studera funktionen av viral fusionsproteinerna. Pseudotyped partiklar eller pseudovirions är chimära virioner som består av en surrogat viral kärna med ett heterologt virala kuvertet protein på sin yta. Protokollets huvudsakliga syfte är att visa hur man skaffar coronavirus spike pseudotyped partiklar som är baserade på en murin leukemi virus (MLV) kärna och innehåller ett luciferas reporter gen. Som exempel presenteras metoden för att producera pseudotyped partiklar med spike proteinerna av högpatogen svår akut respiratorisk sjukdom (SARS) och Middle East respiratory syndrome (MERS) coronavirus. Protokollet beskrivs förfarandet transfection inblandade, hur att smitta mottagliga target cells, och smittsamhet kvantifiering av luciferas assay.

Eftersom posten stegen i pseudovirions regleras av coronavirusen S på deras yta, ange de celler på ett liknande sätt till inhemska motsvarigheter. Som sådan, är de utmärkta surrogat av funktionella smittsamhet analyser. Pseudotyped partiklar är vanligtvis härrör från föräldrarnas modell virus såsom retrovirus (MLV,7,8,9,10,11,12,13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 och lentivirus humant immunbristvirus — HIV23,24,25,26,27,28,29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35) eller rhabdoviruses (vesikulär stomatit virus — VSV36,39,40,41,42,43,44 , 45 , 46 , 47). när den används i pseudotyping, föräldrarnas virus genomen modifieras för att ta bort viktiga gener, vilket gör dem defekt för att åstadkomma en fullständig replikeringscykel. Denna funktion tillåter dem att användas i mellanliggande biosäkerhet nivå faciliteter (BSL-2) och är en viktig fördel jämfört med infödda högpatogena virus som kräver högre biosäkerhet faciliteter (BSL-3, BSL-4 som inte är så lätt tillgängliga) när bedriver virus post studier. Här, S proteinerna av risk grupp 3 patogener SARS-CoV och MERS-CoV används som exempel på virala kuvert proteiner införlivas MLV pseudotyped partiklar, generera SARS-CoV S och MERS-CoV S pseudovirions (SARS-Spp och MERS-Spp, respektive). Dessa pseudovirions har använts framgångsrikt i studier med fokus på posten händelser av dessa virus48,49,50,51. En annan fördel är att den teknik som beskrivs här inte är begränsad till pseudotyping coronavirus S proteiner: det är mycket flexibel och kan användas för att införliva representanter från alla tre klasser av viral fusionsproteinerna. Exempel inkluderar influensa hemagglutinin (HA, klass I)52, Ebola virus glykoprotein (GP klass I), E1 protein alphavirus Semliki Forest virus (SFV, klass II) och VSV glykoprotein (G, klass III)53. Dessutom mer än en typ av viral glykoprotein kan vara co införlivad med en pseudotyped partikel, som i fallet med influensa HA- och NA - pseudotyped partiklar51.

Baserat på arbete som utförs av Bartosch et al.20, det här protokollet beskriver generationen av MLV pseudotyped partiklar med en tre-plasmid samtidig transfection strategi med hjälp av den allmänt tillgängliga och transfection-kompetenta HEK-293T cellinje 54. första plasmiden kodar den MLV core generna gag och pol men saknar genen MLV kuvert env . Andra plasmiden är en överföring vektor som kodar en firefly luciferas reporter gen, en MLV Ψ-RNA förpackning signal, tillsammans med 5'- och 3'-flankerande MLV länge terminal upprepa (LTR) regioner. Den tredje plasmiden kodar proteinet fusion av intresse, i det här fallet antingen proteinet SARS-CoV S eller S för MERS-CoV. Vid samtidig transfection av tre plasmidsna använder transfection reagens, få viral RNA och proteiner uttrycks inom transfekterade celler möjliggör generering av pseudotyped partiklar. Eftersom MLV används som neutralisationsanalysen ryggrad, detta inträffar vid plasmamembranet: RNASEN som innehåller luciferas gen reporter och förpackning signal få inkapslade i begynnande partiklar som också införlivar plasmamembran-uttryckta coronavirus spike proteiner. De partiklar som bud ut från cellerna innehåller coronavirus S protein på sin yta och skördas för användning i smittsamhet analyser. Eftersom pseudotyped partiklar hamnområde coronavirus S proteinet och inte MLV kuvertet protein, när den används för att infektera celler, de beter sig som deras infödda coronavirus motsvarigheter för posten steg. Viral RNA som innehåller luciferas reportern och flankerande l släpps sedan inom cellen och retrovirala polymeras verksamheten möjliggöra dess omvänd transkription i DNA och integrering i den mottagande cell arvsmassan. Kvantifiering av smittsamhet viral pseudotyped partiklar i infekterade celler utförs sedan med en enkel luciferas aktivitet assay. Eftersom DNA-sekvensen som blir integrerade i den mottagande cell arvsmassan endast innehåller luciferas genen och ingen av de MLV eller coronavirus protein-encoding generna, är de till sin natur säkrare att använda än replikering-behöriga infödda virus.

Förutom att vara säkrare surrogat och mycket anpassningsbara att tillåta införlivandet av olika typer av kuvertet glykoproteiner, de pseudotyped partiklar som beskrivs här är också mycket mångsidig och kan användas för att studera många aspekter av viruset inträde. Detta inkluderar men är inte begränsat till: testa värd cellernas mottaglighet för virusinfektion, analysera de cellulära post vägar ett höljebärande virus använder, studera effekter av farmakologiska hämmare och drog filmvisningar, bedriva neutralisering antikropp analyser, karaktärisera värd cellinmatning höljeförsedda virus som inte kan vara odlade, och generera virala vektorer för gen leverans, stabil cellulära uttrycket av gener av intresse, eller nedtystning.

Protocol

1. cell seedning för Pseudotyped partikel produktion

Obs: Utför det här steget i biosäkerhet skåp.

  1. Genom standard cell kultur tekniker, få en 80 – 90% konfluenta 75 cm2 kolv HEK-293T/17 celler överförda i komplett Dulbecco är modifierade örnens Medium (DMEM-C) innehållande 10% (vol/vol) fetalt bovint serum (FBS), 10 mM 4-(2-hydroxietyl) -1- piperazineethanesulfonic syra (HEPES), 100 IE/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin. Förbereda DMEM-T medium för transfections (dess sammansättning är densamma som DMEM-C utan antibiotika).
  2. Tvätta cellerna med 10 mL av pre värmde (37 ° C) Dulbeccos fosfat buffrad koksaltlösning (DPBS) två gånger.
    Obs: Hantera HEK293T/17 celler med omsorg eftersom de enkelt lossa.
  3. Aspirera supernatanten och ta bort celler med 1 mL 0,25% trypsin lösning före värmas vid 37 ° C. Placera kolven av celler vid 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 3−5 min eller tills celler börjar lossa.
    Obs: Undvika ruvning celler med trypsin för mer än 5 min som detta leder vanligtvis till cell klumpar.
  4. Inaktivera trypsin genom att lägga till 4 mL DMEM-C medium och räkna celler som använder en cell räknar bild- och ljusmikroskop.
    Obs: För att slippa räkna för många celler, kan en extra utspädningssteg krävas i förväg. Kom ihåg att faktor i denna utspädning vid beräkning av faktiska cell densiteten av trypsinized celler.
  5. Späd cellerna till 5 x 105 celler/mL med DMEM-C.
  6. Utsäde 6-väl vävnadsodling tallrik med 2 mL cell lösning per brunn och försiktigt flytta plattan fram och tillbaka och sida till sida att jämnt fördela celler, undvika cirkelrörelse.
    Obs: Detta är ett viktigt steg. Jämnt fördelade celler kommer att se till att cellerna inte klumpar i mitten av brunnar. I sin tur, detta kommer att säkerställa bra transfection effektivitetsvinster och pseudotyped partikel produktion.
  7. Inkubera plattan över natten (16 – 18 h) i en 37 ° C, 5% CO2 cell kultur inkubator.

2. tre-plasmid samtidig transfection

Obs: Utför det här steget i biosäkerhet skåp.

  1. Iaktta celler under ett inverterat ljusmikroskop att kontrollera för Cellmorfologi och densitet.
    Obs: Cell densiteten bör helst vara i intervallet 40 – 60% confluency. Det är viktigt att cellerna är varken alltför konfluenta (80−90% konfluenta) inte heller alltför glest fördelade (20−30 procent konfluenta) i varje brunn. En cell densiteten av 40−60% konfluens säkerställer bra pseudotyped partiklar produktion.
  2. Plasmider mix
    1. Beräkna den plasmid mix för varje kuvert glykoprotein efter kvantiteterna för en väl 6-well platta som visas i tabell 1. Multiplicera kvantiteter om transfecting flera brunnar och inkluderar en extra brunn för att undvika att köra av mix.
      Obs: Tillsammans med SARS-CoV S och MERS-CoV S kodning plasmider, inkluderar Tom vector kontroll för generering av negativ kontroll partiklar som saknar virala kuvertet glykoproteiner (Δenv partiklar) tillsammans med en positiv kontroll glykoprotein som vesikulär stomatit virus (VSV) G glykoprotein som är kända för att kraftfullt infektera ett stort antal celler (VSV-Gpp). Plasmider finns tillgängliga på begäran.
    2. Blanda beräknade volymer av plasmider och minskade serum cellodlingsmedium (se Tabell för material) i en mikrocentrifug rör.
  3. Lipid-baserade transfection reagens blanda (se Tabell för material)
    1. Beräkna volymer för transfection reagens mixen från de kvantiteter som anges i tabell 2 för en brunn (1:3 transfection baserat, multiplicera de kvantiteter som behövs). Inkludera extra brunnar för att undvika att köra transfection reagens mix.
    2. Blanda beräknade volymer av lipid-baserade transfection reagens (3 µL per brunn) och minskade serum cellodlingsmedium (47 µL per brunn) i en mikrocentrifug rör, se till att lägga transfection reagenset i den minskade serum cellodlingsmedium och inte tvärtom runt.
  4. Inkubera båda mixar (för ett väl: 50 µL av plasmider blanda och 50 µL av lipid-baserade transfection reagens blanda) separat för 5 min i rumstemperatur.
  5. Tillsätt innehållet i transfection reagens mixen till plasmider mixen i förhållandet 1:1 (för 1 väl: 50 µL av varje blandning)
  6. Utföra grundlig upp-ned pipettering av den resulterande blandningen.
  7. Inkubera mixen i minst 20 min i rumstemperatur.
  8. Aspirera använt medlet av celler.
  9. Tillsätt försiktigt 1 mL cellodlingsmedium i förväg värmde (37 ° C) minskade serum per brunn.
  10. Tillsätt droppvis 100 µL av transfection mix till varje brunn.
    Obs: Var försiktig när du lägger till transfection mixen till brunnar i HEK-293T som de lossa lätt.
  11. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 cell kultur inkubator för 4 – 6 h.
  12. Tillsätt 1 mL per brunn av pre värmde (37 ° C) DMEM-T medium, som inte innehåller antibiotika
    Obs: Detta är ett viktigt steg. Transfection reagenser öka cellen permeabilitet och öka känslighet för antibiotika. För att säkerställa bra transfection effektivitet och pseudotyped partikel produktion, är det viktigt att undvika att använda cellodlingsmedium innehållande antibiotika
  13. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 cell kultur inkubator för 48 h.

3. pseudotyped partiklar samling

Obs: Utför det här steget i biosäkerhet skåp.

  1. Iaktta celler under inverterat ljusmikroskop att kontrollera Cellmorfologi och allmäntillstånd. Också kontrollera färgen på det medium som bör vara ljus rosa/svagt orange.
    Obs: Detta är ett viktigt steg. Om det finns för mycket celldöd som är associerad med transfection eller medellång färg vände orange/gula (surt pH), associeras detta vanligtvis med lägre avkastning i smittsamma pseudotyped partiklar
  2. Överföra supernatanterna transfekterade celler till 50 mL koniskt centrifugrör.
  3. Centrifugera rören på 290 x g för 7 min att ta bort cellfragment.
  4. Filtrera skirat supernatanterna genom ett sterilt 0,45 µm porstorlek och medelstora filter.
  5. Gör liten volym alikvoter (e.g., 500 µL eller 1 mL) av pseudotyped virus lösning i cryovials.
  6. Förvaras vid-80 ° C.
    Obs: Protokollet kan pausas här. Pseudotyped partiklar är stabila vid-80 ° C för många månader men när Tinas, undvika åter fryser dem eftersom de kommer att förlora smittsamhet

4. pseudotyped partikel infektion av mottagliga celler

Obs: Utför det här steget i biosäkerhet skåp.

  1. Cell sådd av mottagliga celler i plattan 24-brunnar
    1. Få genom standard cell kultur tekniker 80−90% konfluenta 75 cm2 kolv av mottagliga celler: Vero-E6 celler för SARS-CoV pseudotyped partiklar (SARS-Spp) och va-7 celler för MERS-CoV S pseudotyped partiklar (MERS-Spp).
      Obs: För att bekräfta huruvida pseudotyped partiklarna som har producerats är smittsam, är det viktigt att noga välja en lämplig mottagliga cellinje för neutralisationsanalysen smittsamhet analyser. Med dåligt tillåtande celler kommer att leda till låg smittsamhet.
    2. Tvätta cellerna två gånger med 10 mL före värmde (37 ° C) DPBS.
    3. Aspirera supernatanten och ta bort celler med 1 mL 0,25% trypsin lösning före värmas vid 37 ° C. Placera kolven av celler vid 37 ° C, 5% CO2 inkubator för 3−5 min eller tills celler börjar lossa.
      Obs: Undvika ruvning celler med trypsin för mer än 5 minuter som detta leder vanligtvis till cell klumpar. VA-7 celler är särskilt känsliga för denna effekt.
    4. Inaktivera trypsin genom att lägga till DMEM-C medium och räkna celler som använder en cell räknar bild- och ljusmikroskop.
    5. Späd cellerna till 5 x 105 celler/mL med DMEM-C.
    6. Utsäde brunnar i en 24-väl platta med 0,5 mL cell lösning per brunn och försiktigt flytta plattan fram och tillbaka och sida till sida att jämnt fördela celler, undvika cirkelrörelse
      Obs: Detta är ett viktigt steg. Jämnt fördelade celler kommer att se till att cellerna inte klumpar i mitten av brunnar. Detta i sin tur kommer att säkerställa bra smittsamhet analyser. För varje pseudotyped partikel (SARS-Spp, MERS-Spp) och skick, förbereda tre brunnar för tre experimentella replikat. Inkludera brunnar för icke-infekterade (ni), Tom vektor Δenv partiklar och partiklar, positiv kontroll som VSV-Gpp
    7. Inkubera plattan över natten (16−18 h) i en 37 ° C, 5% CO2 cell kultur inkubator
  2. Pseudotyped partikel infektion
    1. Observera celler under ljusmikroskop och visuellt bekräfta att det finns en konfluenta matta av celler.
    2. Ta cryovials pseudotyped virus Tina på is.
    3. Wash-celler tre gånger med 0,5 mL före värmde (37 ° C) DPBS
      Obs: Detta är ett viktigt steg. Celler som inte sköljs ordentligt före infektion vanligtvis leder till dålig smittsamhet utläsningar
    4. Aspirera supernatanterna av celler.
    5. Inokulera cellerna med 200 µL upptinade pseudotyped partikel lösning.
    6. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 cell kultur inkubator för 1−2 h.
    7. Tillsätt 300 µL av pre värmde (37 ° C) DMEM-C medium.
    8. Inkubera cellerna i en 37 ° C, 5% CO2 cell kultur inkubator för 72 h.

5. smittsamhet kvantifiering av luciferas Assay avläsning

Obs: Utför inledande steg i biosäkerhet skåp.

  1. Blidvädret luciferin substrat (lagras vid-80 ° C) och 5 x luciferas assay lyseringsbuffert (lagras vid-20 ° C) tills de når rumstemperatur.
  2. Späd luciferas assay lyseringsbuffert till 1 x med sterilt vatten.
  3. Aspirera supernatanterna av celler som smittats med pseudotyped partiklar.
  4. Tillsätt 100 µL av 1 x luciferas assay lyseringsbuffert till varje brunn.
  5. Placera plattan på en rocker och inkubera i 15 min med gunga vid rumstemperatur (från denna punkt och framåt plattan kan hanteras utanför en biosäkerhet skåp).
  6. Förbereda mikrocentrifugrör för varje brunn genom att lägga till 20 µL av luciferin substrat i varje rör.
  7. Slå på luminometern.
  8. Utföra luciferas aktivitet mätning en väl i taget genom att överföra 10 µL lysate till en tub som innehåller 20 µL av luciferin substrat.
  9. Snärta röret försiktigt för att blanda innehållet, men Undvik undantränger vätskan på väggarna i röret.
  10. Placera röret i enheten och stäng locket.
  11. Mäta luminiscens värdet av röret med hjälp av luminometern.
  12. Spela in relativa ljus enhetens mätning.
  13. Upprepa steg 5,8 – 5.12 tills alla brunnar analyseras.
    Obs: Med lämplig utrustning såsom en tallrik läsning luminometer, kan denna process utföras automatiskt. Analysen kommer att behöva skalas till plattan format (t.ex., plattan med 96 brunnar-format).

6. dataanalys

  1. Beräkning och plottning av relativa luciferas enheternas medelvärden och standardavvikelser
    1. Använda en graf plottning programvara för att beräkna luciferas analys mätning medelvärden och standardavvikelser replikat för experimentella och biologiska.
    2. Plotta data som stapeldiagram med standardavvikelser.
      Obs: När du gör statistiska analyser av data, se till att inkludera minst tre biologiska replikat i datamängder.

Representative Results

Representativa resultat av smittsamhet analyser av SARS-CoV S och MERS-CoV S pseudotyped partiklar visas i figur 1. Som förväntat, för båda figur 1A och 1B, VSV G pseudotyped positiv kontroll partiklar (VSV-Gpp) gav mycket höga genomsnittliga smittsamhet i 106 107 relativa luciferas enheter (RLU) intervall respektive. För SARS-CoV S pseudotyped partiklar (figur 1A) infektion av mottagliga Vero-E6 celler, en stark genomsnittliga smittsamhet uppmättes till cirka 9,8 x 104 RLU. Detta värde är nästan 3 tiopotenser högre än de värden som uppmätts för icke-infekterade kontroll (1.1 x 102 RLU), eller Δenv partiklarna (1,5 x 102 RLU), vilket inte hysa någon virala kuvertet glykoproteiner på deras yta. Likaså för MERS-CoV S pseudotyped partiklar (figur 1B) infektion av Huh-7 celler, en hög genomsnittlig smittsamhet uppmättes till cirka 1,0 x 106 RLU. Detta är nästan 4 tiopotenser högre än de värden som uppmätts för icke-infekterade kontroll (0,8 x 102 RLU), eller Δenv partiklarna (2.0 x 102 RLU). Ett ytterligare smittsamhet test utfördes där de SARS-Spp och MERS-Spp var seriellt spädas och används att infektera Vero-E6 celler (figur 2A). Denna analys bekräftar att aktiviteten luciferas mätt är beroende av koncentrationen av partiklar används att infektera celler. För att bekräfta roll av angiotensin konvertera enzym 2 (ACE2) och Dipeptidylpeptidas-4 (DPP4), receptorsna av SARS-CoV och MERS-CoV, respektive i medla fastsättning och inträde av pseudotyped partiklarna, vi använde dåligt-tillåtande HEK-293T celler och transfekterade dem uttrycka antingen ACE2 eller DPP4 (figur 2B). De transfekterade cellerna användes sedan för ett smittsamhet test. Denna analys visar att vid överuttryck av ACE2 och DPP4, det finns en ~ 4-loggar och ~ 2-ökning av SARS-Spp och MERS-Spp smittsamhet, respektive, bekräftar att receptorn användning av pseudovirions är liknande till det av infödda virus.

Exemplen visas här visar vikten av att inkludera negativa (icke-infekterade, Δenv partiklar) samt positiv kontroll (VSV-Gpp) villkor när producerar pseudotyped partiklar. Faktiskt, de positiva kontrollen VSV-Gpp partiklarna tillåter oss att bedöma om ett visst parti av pseudotyped partiklar var framgångsrik i framställning av funktionella och smittsam pseudovirions. Förväntade resultat av typisk infektion av VSV-Gpp partiklar i mest däggdjursceller linjer är i intervallet RLU 106−107 . Problem med HEK-293T/17 producent celler (hög passage nummer, problem med cell tätheter) eller dålig transfection effektivitetsvinster kan påverka övergripande pseudotyped partikel produktion och smittsamhet. Dessutom är negativ kontroll villkoren också viktiga eftersom de tillåter oss att bedöma baslinjer RLU mätningar i en viss cell linje (icke-infekterade tillstånd) och icke-specifik internalisering av partiklar (Δenv infektion) som inte medieras av en viral kuvertet protein. Idealiskt, för en viss typ av partikel pseudotyped med en virala kuvertet protein av intresse, det rekommenderas att erhålla värden som är ett par tiopotenser högre än värden som negativ kontroll, som visas här i figur 1A, B. Dock om för en viss celltyp en pseudotyped virusinfektion ger mycket lite smittsamhet (dvs., nära till negativa kontroller såsom i figur 2B i icke-transfekterade N.T. villkor) det betyder inte nödvändigtvis att den pseudotyped partikel produktion var defekt. Det kan väl vara som en viss cell linje används är inte eller dåligt tillåtande till infektion. Det är rekommenderat att kontrollera om en viss celltyp väntas vara mottagliga för infektion av viruset som utreds. Transfecting dåligt tillåtande celler med plasmid(s) uttrycker den virala receptor(s) kan tillåta effektivare viral intrade och infektion förekommer, som visas i figur 2B, där vid transfection av ACE2 och DPP4-receptorer i rikta HEK-293T celler, finns det en ~ 4- och ~ 2-logg ökning av smittsamhet, respektive.

Plasmid/reagens Kvantitet
pCMV-MLVgagpol MLV gag och pol kodning plasmid 300 ng
pTG-Luc överföring vektor med luciferas reporter 400 ng
pcDNA-SARS-S, pcDNA-MERS-S eller tom vektor 300 ng
Minskad serum cellodlingsmedium Till 50 µL

Tabell 1: mängder av plasmider och minskade serum cell odlingsmedium som krävs för att transfect en väl 6-well platta HEK-293T/17 celler för pseudotyped partikel produktion. Koncentrationen av Plasmiden preparat, beräkna volymen som krävs för att nå den erforderliga mängden av plasmid DNA. Om mer än en väl är transfekterade med samma plasmidsna, multiplicera volymer av erforderligt antal brunnar till transfect, och inkluderar en extra brunn i beräkningar för att undvika att köra för mix i senare steg. Den totala mängden DNA att transfekterade är 1 µg per brunn. Plasmider finns tillgängliga på begäran till författarna.

Reagens Kvantitet
Transfection reagens 3 ΜL
Minskad serum cellodlingsmedium 47 ΜL

Tabell 2: mängder transfection reagens och minskade serum cell odlingsmedium som krävs för att transfect en väl 6-well platta HEK-293T/17 celler för pseudotyped partikel produktion. Multiplicera volymer av erforderligt antal brunnar transfect och inkludera extra brunnar i beräkningar för att undvika att köra för mix i senare steg. Transfection reagens: plasmid DNA förhållandet används är 3:1.

Figure 1
Figur 1 : Coronavirus S-pseudotyped partikel smittsamhet analyser i mottagliga värdceller använder en murin leukemi virus (MLV) ryggraden och luciferas reporter gen. (A) SARS-CoV S pseudotyped partikel smittsamhet assay i Vero-E6 celler. (B) MERS-CoV S pseudotyped partikel smittsamhet assay i Huh-7 celler. För både (A) och (B), plottade data motsvarar genomsnittliga relativa luciferas enheter från tre oberoende experiment, med felstaplar motsvarande standardavvikelsen (SD). Data plottas log10 skala på y-axeln. Ni: icke-infekterade kontroll; Δenv: infektion med pseudotyped partiklar saknar virala kuvertet glykoproteiner och VSV-Gpp: infektion med pseudotyped partiklar bär positiv kontroll VSV G kuvert glykoprotein. Andra förkortning som används, SARS-Spp: infektion med SARS-CoV S pseudotyped partiklar, MERS-Spp: infektion med MERS-CoV S pseudotyped partiklar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Koncentration-beroende av CoV S-neutralisationsanalysen smittsamhet och roll ACE2 och DPP4-receptorer i SARS-Spp och MERS-Spp post. (A) koncentration-beroendet av SARS-Spp och MERS-Spp smittsamhet mätt luciferas aktivitet assay. Pseudovirions var seriellt spädas och används att infektera Vero-E6 celler. (B) smittsamhet haltbestämning av SARS-Spp och MERS-Spp i dåligt tillåtande HEK-293T målceller transfekterade till express ACE2, och DPP4-receptorer, respektive. Data ritas i log10 -skala på y-axeln enligt figur 1 från dubbla experiment, med felstaplar motsvarande standardavvikelsen (SD). N.T.: icke-transfekterade kontroll HEK-293T celler; ACE2: ACE-hämmare 2 (SARS-CoV receptor) och DPP4: Dipeptidylpeptidas 4 (MERS-CoV-receptorn). Andra förkortningar som används är samma som i figur 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det här protokollet beskriver en metod för att effektivt producera pseudotyped partiklar bär S proteinet av risk grupp 3 coronavirus, SARS-CoV och MERS-CoV i BSL-2 miljö. Dessa partiklar, som inkorporerar ett luciferas reporter gen, göra det möjligt för oss att enkelt kvantifiera coronavirus S-medierad inträde händelser av en relativt enkel luciferas assay48,49,50,51. Smittsamhet analyser med tillåtande celler, bekräftar vi att aktiviteten luciferas mätt är beroende av koncentrationen av partiklar. Dessutom möjliggör ACE2 och DPP4 receptor transfection effektivare post i dåligt tillåtande celler rader, till exempel HEK-293T celler. Metoden är mycket anpassningsbar till andra virala kuvertet glykoproteiner och har använts i stor utsträckning48,49,50,51,52,53, 55,56,57,58,59, ofta att komplettera andra analyser som biokemiska analyser eller infödda virusinfektioner.

Det protokoll som vi beskriver här är baserad på retrovirus MLV som innehåller luciferas reporter. Det är dock viktigt att betona att det finns ett mycket brett utbud av andra pseudotyping-system som har utvecklats framgångsrikt för förpackning coronavirus S12,13,25,26, 30 , 31 , 32 och andra virala kuvertet glykoproteiner10,11,14,16,17,23,24, 29 , 33 , 38 , 40 , 42 , 44 , 46. några av dessa andra system är baserade på vanliga MLV retrovirala core7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20, eller baserat på den utbredda lentiviral HIV-1 pseudotyping system med hjälp av olika strategier23,24,25,26,27,28,29,30 ,31,32,33,34,35, eller med rhabdovirus vesikulär stomatit virus (VSV) som kärna, som gör det möjligt för att införliva en mängd av kuvertet glykoproteiner, och igen med olika anställd strategier37,38,39,40,41,42,43 ,44,45,46,47. Dessutom andra reportrar till exempel fluorescerande proteiner såsom GFP11,13 och RFP36eller enzymer än luciferas som β-galaktosidas16,17 och utsöndras alkaliskt fosfatas (SEAP)42 har lyckat använts för mätningar. Dessutom i den analys som presenteras i detta protokoll, användes en övergående transfection för att uttrycka MLV och CoV S gener och proteiner. Dock finns det andra strategier för uttryck, såsom generering av stabil cell linjer för produktion av pseudotyped virus7,14. Som varje system har sina fördelar och nackdelar, är det viktigt att beakta följande viktiga parametrar när man beslutar vilken pseudotyping system bästa passar en prövarens behov: neutralisationsanalysen kärna (MLV, HIV-1, VSV eller andra), hur selektiv en viss pseudotyping kärna är införliva en specifik viral kuvert glykoprotein, reporter för assay avläsning (GFP, luciferas, SEAP eller annat) och transfection strategin (antal plasmider inblandade i samtidig transfection, övergående transfection eller generering av stabil cellinjer).

Det finns ett antal kritiska steg i metoden som är viktiga att betona. Cell densiteten, särskilt av raden HEK-293T/17 producent cell är en kritisk faktor för att säkerställa framgångsrika transfection. En cell densiteten i intervallet 40 – 60% konfluens befanns vara optimal. Högre densiteter leda vanligtvis låg transfection effektivitet och låga partikel produktion. Dessutom är det viktigt att komma ihåg att HEK-293T/17 celler är mindre vidhäftande än andra cellinjer. Försiktighet bör iakttas vid hantering av dem. Undvik lossa dem onödigt. Ett alternativ är att behandla cell kultur plastytor med poly-D-lysin att förbättra följsamhet. Dessutom resulterar högre cell passage ofta i fattiga transfection priser. Efter att lägga transfection reagensen HEK-293T/17 celler, är det också viktigt att komma ihåg att cellen permeabilitet ökar. Det är därför i nuläget är det bäst att undvika att använda medium innehållande antibiotika eftersom de kan öka Cytotoxiciteten. Innan samlande pseudotyped partiklar, kontrollera färgen på transfekterade HEK-293T/17 cell supernatanterna. Vanligtvis efter 48 h av transfection tar cell odlingsmedium färgen en orange-rosa nyans. Gul-färgade medium vanligtvis översätts till fattiga pseudotyped partiklar avkastning och är ofta ett resultat av problem med cell sådd densitet eller hög passage nummer.

I detta protokoll utförs pseudotyped partikel produktionen i ett 6-well platta format. För att öka volymen av producerade partiklar, flera brunnar i en 6-väl plattan kan vara transfekterade med samma plasmider mix och supernatanterna kan poolas tillsammans. Poolen kan klargöras, filtrerade och aliquoted. Alternativt för att skala produktion upp, andra typer av fartyg (t.ex. 25 eller 75 cm2 kolvar) kan användas. I det här fallet bör transfection villkor skalas upp med detta. I detta protokoll utförs smittsamhet analysen med ett 24-well platta format och en luminometer som bara tillåter mätningar ett rör i taget. För hög genomströmning filmvisningar är andra format också möjligt, såsom plattan med 96 brunnar format och en tallrik läsaren luminometern. Volymer och reagenser för luciferas analysen måste anpassas därefter. Lagring av pseudotyped partiklar i cryovials vid-80 ° C behåller sin stabilitet i flera månader utan märkbar minskning av smittsamhet. Det rekommenderas inte att utsätta dem för att frysning-tining cykler som detta kommer att minska sin smittsamhet över tid. Därför är det bäst att förvara dem i små delprover som 0,5 – 1 mL och Tina dem innan en infektion.

Metoden presenteras här har flera begränsningar. En viktig är det faktum att pseudotyped partiklar recapitulate endast viral post händelser. För att analysera andra steg i livscykeln för infektiös, krävs andra analyser. Dessutom som MLV partiklar knopp på plasmamembranet, det är viktigt att komma ihåg att de kuvert glykoprotein som studeras behov att även trafik till plasmamembranet för iblandning i pseudovirions under produktionen. Som sådan, är det viktigt att veta var i cellen en särskilda virala kuvert glykoprotein uttrycks i transfection villkor, såsom genom att visualisera subcellulär lokalisering med en immunofluorescens analys, eller genom att kontrollera lagring signaler inom proteinet. Också, medan protokollet beskriver stegen för att producera och testa smittsamhet, det inte i detalj hur man mäter införlivande av virala kuvertet glykoproteiner i pseudotyped partiklar. En metod är att utföra western blot analyser på koncentrerade lösningar av partiklar, som tidigare beskrivits50,51 för MERS-CoV S iblandning. I dessa analyser, är den S kuvert glykoprotein i MERS-CoV utforskad tillsammans med proteinet kapsid (p30) av MLV, som gör det möjligt för oss att normalisera införlivande av proteinet S partiklar. Andra exempel på sådana analyser analysera virala kuvert glykoprotein införlivande i pseudovirions har utförts för SARS-CoV S iblandning i en HIV-1 lentiviral neutralisationsanalysen system32 , Ebola glykoprotein (GP) i en annan MLV pseudotyped partikel system17, och influensa hemagglutinin (HA) och neuraminidas (NA) i VSV pseudovirions38. En ny utveckling i karaktärisera pseudotyped partikel produktion är användningen av innovativa imaging-enheter såsom Nanosight: det gör det möjligt för oss att direkt visualisera, kvantifiera och storlek viruspartiklar50. Enheten innehåller detaljerad information om totala partikel produktionen; Det är dock viktigt att komma ihåg att den inte ger information om kuvert glykoprotein inkorporering. En framtida riktning för tillämpningen av dessa mångsidiga neutralisationsanalysen partiklar är att analysera enskilda virala fusion händelser med enda partikel spårning, mikrofluidik och Totalreflexion fluorescence mikroskopi60,61 ,62. Sådana tillvägagångssätt tillämpades till influensavirus och felint coronavirus partiklar samt influensa HA - och NA-pseudotyped VSV-baserade pseudovirions63. Distribution av sådan teknik som tillämpas på coronavirus S-pseudotyped MLV-baserade partiklar som för närvarande utvecklas.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka alla medlemmar i de Whittaker och Daniel labs för hjälpsamma kommentarer. Finansiering av forskning lämnades av NIH grants R21 AI111085 och R01 AI135270. T.T. erkänner stöd från presidentvalet Life Science gemenskap i Cornell University och National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant nr DGE-1650441. Lauridsen erkänner stöd från en Samuel C. Fleming familj Graduate Fellowship och National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program under Grant nr DGE-1650441. Detta arbete stöds också av National Science Foundation 1504846 (att S.D. och G.R.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells  ATCC CRL-11268 Clone 17 cells are highly competent for transfection.
African green monkey kidney epithelial Vero-E6 cells ATCC CRL-1586
Human hepatic Huh-7 cells  Japan National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB0403
Inverted light microscope with 10 × objective  Nikon TS100
Dulbecco’s modification of Eagle's medium (DMEM) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine without sodium pyruvate Corning Mediatech 10-017-CV
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) Thermo Fisher Scientific, Gibco 1614071
1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulphonic acid (HEPES)  Corning Mediatech 25-060-Cl
100 × penicillin-streptomycin (PS) solution Corning Mediatech 30-002-Cl
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+  Corning Mediatech 21-030-CV
0.25% trypsin, 2.21 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 1 × solution  Corning Mediatech 25-053-Cl
Cell counting slides with grids  Kova 87144
Opti-minimal essential medium (Opti-MEM) Thermo Fisher Scientific, Gibco 31985-070
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific, Invitrogen 11668-027
0.45 µm pore-size sterile filter  Pall 4184
10 mL syringes  BD 309604
5 × luciferase assay lysis buffer  Promega E1531
Luciferin, substrate for luciferase assay Promega E1501
Sterile water  VWR E476-1L
GloMax 20/20 luminometer  Promega 2030-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dimitrov, D. S. Virus entry: molecular mechanisms and biomedical applications. Nature Reviews Microbiology. 2, (2), 109-122 (2004).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and Mechanisms of Viral Membrane Fusion Proteins: Multiple Variations on a Common Theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43, (3), 189-219 (2008).
  3. Bosch, B. J., van der Zee, R., de Haan, C. A. M., Rottier, P. J. M. The Coronavirus Spike Protein Is a Class I Virus Fusion Protein: Structural and Functional Characterization of the Fusion Core Complex. Journal of Virology. 77, (16), 8801-8811 (2003).
  4. Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. Mechanisms of Coronavirus Cell Entry Mediated by the Viral Spike Protein. Viruses. 4, (6), 1011-1033 (2012).
  5. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Physiological and molecular triggers for SARS-CoV membrane fusion and entry into host cells. Virology. 517, 3-8 (2018).
  6. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. 202, (0), 120-134 (2015).
  7. Steidl, S., et al. Coreceptor Switch of [MLV(SIVagm)] Pseudotype Vectors by V3-Loop Exchange. Virology. 300, (2), 205-216 (2002).
  8. Höhne, M., Thaler, S., Dudda, J. C., Groner, B., Schnierle, B. S. Truncation of the Human Immunodeficiency Virus-Type-2 Envelope Glycoprotein Allows Efficient Pseudotyping of Murine Leukemia Virus Retroviral Vector Particles. Virology. 261, (1), 70-78 (1999).
  9. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. Journal of Virological Methods. 153, (2), 111-119 (2008).
  10. Wallerstrom, S., et al. Detection of antibodies against H5 and H7 strains in birds: evaluation of influenza pseudovirus particle neutralization tests. Infection Ecology, Epidemiology. 4, (2014).
  11. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, (7131), 92-96 (2007).
  12. Han, D. P., Kim, H. G., Kim, Y. B., Poon, L. L., Cho, M. W. Development of a safe neutralization assay for SARS-CoV and characterization of S-glycoprotein. Virology. 326, (1), 140-149 (2004).
  13. Moore, M. J., et al. Retroviruses pseudotyped with the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein efficiently infect cells expressing angiotensin-converting enzyme 2. Journal of Virology. 78, (19), 10628-10635 (2004).
  14. Sharkey, C. M., North, C. L., Kuhn, R. J., Sanders, D. A. Ross River virus glycoprotein-pseudotyped retroviruses and stable cell lines for their production. Journal of Virology. 75, (6), 2653-2659 (2001).
  15. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. Journal of Virology. 75, (23), 11464-11473 (2001).
  16. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64, (1), 23-32 (1999).
  17. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72, (4), 3155-3160 (1998).
  18. Op De Beeck, A., et al. Characterization of Functional Hepatitis C Virus Envelope Glycoproteins. Journal of Virology. 78, (6), 2994-3002 (2004).
  19. Calland, N., et al. (-)-Epigallocatechin-3-gallate is a new inhibitor of hepatitis C virus entry. Hepatology. 55, (3), 720-729 (2012).
  20. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197, (5), 633-642 (2003).
  21. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. Journal of Virology. 78, (17), 9007-9015 (2004).
  22. Dye, C., Temperton, N., Siddell, S. G. Type I feline coronavirus spike glycoprotein fails to recognize aminopeptidase N as a functional receptor on feline cell lines. Journal of General Virology. 88, (6), 1753-1760 (2007).
  23. Kobinger, G. P., Weiner, D. J., Yu, Q. -C., Wilson, J. M. Filovirus-pseudotyped lentiviral vector can efficiently and stably transduce airway epithelia in vivo. Nature Biotechnology. 19, 225 (2001).
  24. Salvador, B., Zhou, Y., Michault, A., Muench, M. O., Simmons, G. Characterization of Chikungunya pseudotyped viruses: Identification of refractory cell lines and demonstration of cellular tropism differences mediated by mutations in E1 glycoprotein. Virology. 393, (1), 33-41 (2009).
  25. Nie, Y., et al. Highly infectious SARS-CoV pseudotyped virus reveals the cell tropism and its correlation with receptor expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 321, (4), 994-1000 (2004).
  26. Grehan, K., Ferrara, F., Temperton, N. An optimised method for the production of MERS-CoV spike expressing viral pseudotypes. MethodsX. 2, 379-384 (2015).
  27. Bakri, Y., et al. The Maturation of Dendritic Cells Results in Postintegration Inhibition of HIV-1 Replication. The Journal of Immunology. 166, (6), 3780-3788 (2001).
  28. Hsu, M., et al. Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, (12), 7271-7276 (2003).
  29. Simmons, G., et al. DC-SIGN and DC-SIGNR Bind Ebola Glycoproteins and Enhance Infection of Macrophages and Endothelial Cells. Virology. 305, (1), 115-123 (2003).
  30. Simmons, G., et al. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, (33), 11876-11881 (2005).
  31. Gierer, S., et al. The spike-protein of the emerging betacoronavirus EMC uses a novel coronavirus receptor for entry, can be activated by TMPRSS2 and is targeted by neutralizing antibodies. Journal of Virology. 87, (10), 5502-5511 (2013).
  32. Bertram, S., et al. Cleavage and activation of the SARS-coronavirus spike-protein by human airway trypsin-like protease. Journal of Virology. 85, (24), 13363-13372 (2011).
  33. Bertram, S., et al. TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, (19), 10016-10025 (2010).
  34. Connor, R. I., Chen, B. K., Choe, S., Landau, N. R. Vpr Is Required for Efficient Replication of Human Immunodeficiency Virus Type-1 in Mononuclear Phagocytes. Virology. 206, (2), 935-944 (1995).
  35. Evans, M. J., et al. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry. Nature. 446, (7137), 801-805 (2007).
  36. Negrete, O. A., et al. EphrinB2 is the entry receptor for Nipah virus, an emergent deadly paramyxovirus. Nature. 436, (7049), 401-405 (2005).
  37. Suda, Y., et al. Analysis of the entry mechanism of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, using a vesicular stomatitis virus pseudotyping system. Archives of Virology. 161, (6), 1447-1454 (2016).
  38. Zimmer, G., Locher, S., Berger Rentsch, M., Halbherr, S. J. Pseudotyping of vesicular stomatitis virus with the envelope glycoproteins of highly pathogenic avian influenza viruses. Journal of General Virology. 95, Pt 8 1634-1639 (2014).
  39. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8, (9), (2016).
  40. Tong, W., Yin, X. X., Lee, B. J., Li, Y. G. Preparation of vesicular stomatitis virus pseudotype with Chikungunya virus envelope protein. Acta Virologica. 59, (02), 189-193 (2015).
  41. Tani, H., et al. Involvement of ceramide in the propagation of Japanese encephalitis virus. Journal of Virology. 84, (6), 2798-2807 (2010).
  42. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179, (1), 226-232 (2012).
  43. Tani, H., et al. Analysis of Lujo virus cell entry using pseudotype vesicular stomatitis virus. Journal of Virology. 88, (13), 7317-7330 (2014).
  44. Ogino, M., et al. Use of Vesicular Stomatitis Virus Pseudotypes Bearing Hantaan or Seoul Virus Envelope Proteins in a Rapid and Safe Neutralization Test. Clinical and Vaccine Immunology. 10, (1), 154-160 (2003).
  45. Logan, N., et al. Efficient generation of vesicular stomatitis virus (VSV)-pseudotypes bearing morbilliviral glycoproteins and their use in quantifying virus neutralising antibodies. Vaccine. 34, (6), 814-822 (2016).
  46. Takada, A., et al. A system for functional analysis of Ebola virus glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, (26), 14764-14769 (1997).
  47. Whitt, M. A. Generation of VSV pseudotypes using recombinant DeltaG-VSV for studies on virus entry, identification of entry inhibitors, and immune responses to vaccines. Journal of Virological Methods. 169, (2), 365-374 (2010).
  48. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429, (24), 3875-3892 (2017).
  49. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  50. Millet, J. K., et al. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging Microbes, Infections. 5, (12), 126 (2016).
  51. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, (42), 15214-15219 (2014).
  52. Tse, L. V., Hamilton, A. M., Friling, T., Whittaker, G. R. A Novel Activation Mechanism of Avian Influenza Virus H9N2 by Furin. Journal of Virology. 88, (3), 1673-1683 (2014).
  53. Sun, X., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Molecular architecture of the bipartite fusion loops of vesicular stomatitis virus glycoprotein G, a class III viral fusion protein. Journal of Biological Chemistry. 283, (10), 6418-6427 (2008).
  54. Millet, J., Whittaker, G. Murine Leukemia Virus (MLV)-based Coronavirus Spike-pseudotyped Particle Production and Infection. Bio-Protocol. 6, (23), 2035 (2016).
  55. Bonnin, A., Danneels, A., Dubuisson, J., Goffard, A., Belouzard, S. HCoV-229E spike protein fusion activation by trypsin-like serine proteases is mediated by proteolytic processing in the S2' region. Journal of General Virology. (2018).
  56. Belouzard, S., Madu, I., Whittaker, G. R. Elastase-mediated activation of the SARS coronavirus spike protein at discrete sites within the S2 domain. Journal of Biological Chemistry. 285, (30), 22758-22763 (2010).
  57. Madu, I. G., Roth, S. L., Belouzard, S., Whittaker, G. R. Characterization of a Highly Conserved Domain within the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Spike Protein S2 Domain with Characteristics of a Viral Fusion Peptide. Journal of Virology. 83, (15), 7411-7421 (2009).
  58. Madu, I. G., Belouzard, S., Whittaker, G. R. SARS-coronavirus spike S2 domain flanked by cysteine residues C822 and C833 is important for activation of membrane fusion. Virology. 393, (2), 265-271 (2009).
  59. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, (14), 5871-5876 (2009).
  60. Costello, D. A., Millet, J. K., Hsia, C. -Y., Whittaker, G. R., Daniel, S. Single particle assay of coronavirus membrane fusion with proteinaceous receptor-embedded supported bilayers. Biomaterials. 34, (32), 7895-7904 (2013).
  61. Costello, D. A., Hsia, C. -Y., Millet, J. K., Porri, T., Daniel, S. Membrane Fusion-Competent Virus-Like Proteoliposomes and Proteinaceous Supported Bilayers Made Directly from Cell Plasma Membranes. Langmuir. 29, (21), 6409-6419 (2013).
  62. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, (40), 15382-15387 (2008).
  63. Hsu, H. -L., Millet, J. K., Costello, D. A., Whittaker, G. R., Daniel, S. Viral fusion efficacy of specific H3N2 influenza virus reassortant combinations at single-particle level. Scientific reports. 6, 35537 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics