Un test haut débit pour la prévision de la toxicité chimique de profilage phénotypique automatisé de Caenorhabditis elegans

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Summary

Une méthode quantitative a été développée pour identifier et prédire la toxicité aiguë de substances chimiques en analysant automatiquement la détermination des caractéristiques phénotypiques de Caenorhabditis elegans. Ce protocole décrit comment traiter les vers avec des produits chimiques dans une plaque 384 puits, capturer des vidéos et quantifier les phénotypes associés toxicologiques.

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Gao, S., Chen, W., Zhang, N., Xu, C., Jing, H., Zhang, W., Han, G., Flavel, M., Jois, M., Zeng, Y., Han, J. D., Xian, B., Li, G. A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (145), e59082, doi:10.3791/59082 (2019).

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Abstract

Essais de toxicité des produits chimiques chez les organismes supérieurs de commande, tels que les souris ou les rats, l’application, c’est long et coûteux, en raison de leur longue durée de vie et les problèmes d’entretien. Au contraire, le nématode Caenorhabditis elegans (c. elegans) a des avantages à en font un choix idéal pour les essais de toxicité : une courte durée de vie, une culture facile et de reproduction efficace. Nous décrivons ici un protocole pour le profilage phénotypique automatique de c. elegans dans une plaque 384 puits. Les vers nématodes sont cultivées dans une plaque 384 puits avec traitement moyen et chimique liquides et vidéos sont prises de chaque puits de quantifier l’influence chimique sur 33 caractéristiques de ver. Les résultats expérimentaux montrent que les caractéristiques de phénotype chiffrés peuvent classer et prédire la toxicité aiguë pour les différents composés chimiques et établir une liste de priorités pour les tests d’évaluation plus traditionnelle de la toxicité chimique dans un modèle de rongeur.

Introduction

Avec le développement rapid des composés chimiques appliqués à la production industrielle et de la vie quotidienne du peuple, il est important d’étudier la toxicité à l’essai des modèles pour les produits chimiques. Dans de nombreux cas, le modèle animal rongeur est employé pour évaluer la toxicité potentielle des différents produits chimiques sur la santé. En règle générale, la détermination des concentrations létales (c.-à-d. la dosé 50 % dose létale [DL50] de différents produits chimiques) est utilisée comme paramètre dans un modèle de rongeur (rat/souris) in vivo, traditionnel qui est long et très coûteux. En outre, en raison de la réduire, affiner ou remplacer (3R) principe qui est au cœur de l’éthique et du bien-être animal, de nouvelles méthodes qui permettent le remplacement des animaux supérieurs sont précieux pour la recherche scientifique1,2,3 . C. elegans est un nématode libre qui a été isolé du sol. Il a été largement utilisé comme un organisme de recherche en laboratoire en raison de ses caractéristiques bénéfiques, notamment une courte durée de vie, une culture facile et de reproduction efficace. En outre, plusieurs voies biologiques fondamentaux, y compris les processus physiologiques de base et les réactions de stress chez c. elegans, sont conservées dans les mammifères supérieurs4,5,6,7 , 8. dans quelques comparaisons nous et autres avons fait, il y a une bonne concordance entre le c. elegans ou toxique observé chez les rongeurs,9. Tout cela fait c. elegans , un bon modèle pour tester les effets de la toxicité chimique in vivo.

Récemment, certaines études quantifié les caractéristiques phénotypiques de c. elegans. Les caractéristiques peuvent être utilisés pour analyser la toxicité des produits chimiques2,3,10 et le vieillissement vers11. Nous avons également développé une méthode qui combine un ver liquid culture système et un système d’analyse image, où les vers sont cultivées dans une plaque 384 puits sous différents traitements chimiques12. Cette technique quantitative a été développée pour analyser automatiquement les 33 paramètres de c. elegans après 12 à 24 heures de traitement chimique dans une plaque 384 puits avec un milieu liquide. Une platine du microscope automatisé est utilisé pour l’acquisition vidéo expérimentale. Les vidéos sont traitées par un programme sur-mesure, et 33 caractéristiques liées au comportement de déplacement du ver sont quantifiées. La méthode est utilisée pour quantifier les phénotypes de ver dans le traitement des 10 composés. Les résultats montrent que les différentes toxicités peuvent altérer les phénotypes de c. elegans. Ces phénotypes quantifiées peuvent être utilisés pour identifier et prédire la toxicité aiguë de différents composés chimiques. L’objectif général de cette méthode est de faciliter l’observation et la quantification phénotypique des expériences avec le c. elegans en milieu liquide. Cette méthode est utile pour l’application de c. elegans dans les évaluations de la toxicité chimique et analyses quantitatives phénotype, ce qui aident à prédire la toxicité aiguë de différents composés chimiques et établir une liste de priorités pour les plus traditionnels tests d’évaluation de la toxicité chimique dans un modèle de rongeur. En outre, cette méthode peut être appliquée à la toxicité de dépistage et de tester de nouveaux produits chimiques ou le composé comme la pollution agent additif alimentaire, composés de pharmacautical, environnement composé exogène et ainsi de suite.

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Protocol

Le protocole suit les directives de protection des animaux du comité d’éthique animale du centre de Pékin pour la prévention et de contrôle en Chine.

1. préparation chimique

  1. Obtenir des produits chimiques (tableau 1 et Table des matières).
  2. Déterminer la dose maximale et minimale des produits chimiques individuelle pour une concentration minimale de 100 % de létalité (LC100, 24 h) et une concentration maximale de 100 % nonlethality (CL0, 24h) à worms. Utiliser au moins six dilutions de la plus forte concentration (tableau 1).
    Remarque : Effectuer un ver préliminaire létalité test9 pour explorer LC100 et CL0 pour un nouveau produit chimique, afin de déterminer la posologie.
  3. Diluer chaque produit chimique avec K-médium (Table des matières) à 2 x la concentration requise. Utilisez K-médium comme témoin pour comparer les altérations de phénotype causées par les produits chimiques.
    1. Par exemple, préparer 7 concentrations gradients de chlorure de cadmium (CdCl2) (tableau 1). Pour préparer 2 x la plus haute solution aqueuse concentrée (4,64 mg/mL), dissoudre 92,8 mg de CdCl poudre pleine de2 à 8 mL de K-médium et compléter jusqu'à 10 mL lorsque la poudre est complètement dissout. Préparer les autres niveaux de concentration par dilution avec K-moyennes.
  4. Préparer huit puits parallèles pour chaque concentration du gradient chimique. Eh bien, chacun contient 50 µL de la 2 x solution chimique. Préparer au moins trois groupes de huit puits parallèles de K-médium comme témoins (tableau 2).
    Remarque : en bref, un volume de 500 µL de 2 x solution de travail est nécessaire pour une dose unique de chaque produit chimique.

2. préparation de la vis sans fin

  1. Obtenir sauvage N2 vers et des souches de Escherichia coli OP50 de la centre de génétique de Caenorhabditis (CCG).
  2. Obtenir synchronisée vers L4.
    1. Prélever une colonie unique d’e. coli OP50 de la plaque de la strie. Ensemencer la colonie dans 100 mL de bouillon LB de façon aseptique et cultiver une nuit à 37 ° C.
      Remarque : La solution OP50 d’e. coli est maintenant prête pour l’ensemencement aux plaques de nématode croissance moyenne (NGM, Table des matières).
    2. Versez NGM dans un plastique de 90 mm de pétri. Graines de chaque plaque avec 300 µL de solution d’e. coli OP50 au lendemain de la coulée. Incuber N2 vers sur les plaques NGM avec OP50 à 20 ° C pendant environ 2-3 jours jusqu'à ce que la plupart vers ont atteint le stade adulte.
    3. Récolte vers gravides dans un tube à centrifuger conique stérile 15 mL stérile H2O. Laissez les vers s’installent pendant au moins 2 min, aspirer l’H2O et ajouter 5 mL de tampon d’eau de Javel (Table des matières).
    4. Vortex le tube pendant 5 minutes, tourner le tube pendant 30 s (à 1 300 x g) pour les oeufs de granule et éliminer le surnageant.
    5. Laver les oeufs avec 5 mL stérile H2O et vortex le tube pendant 5 s. centrifuger le tube 30 s (à 1 300 g), enlever le surnageant et lavage à nouveau.
    6. Déposer les oeufs sur une nouvelle plaque de NGM avec OP50. Les incuber à 20 ° C. Surveiller les vers L1 éclos le lendemain matin ; les vers atteindront le stade L4 dans environ 40 h.
  3. Laver les vers L4 hors les plats de pétri de 90 mm avec K-médium dans un tube conique stérile de 50 mL. Ajuster la concentration de worms à ~ 40 animaux par 100 µL de K-médium sous un stéréomicroscope. Ajouter 50 µL (~ 20 vers) dans chaque puits de la plaque 384 puits. Ces vers synchronisé (stade L4) sont prêts pour le traitement suivant par des produits chimiques.

3. traitement chimique et capture vidéo

Remarque : Dans une plaque 384 puits, worms (50 µL à chaque puits) sont traités à six à sept doses d’un substance chimique individuel (tableau 1). Préparer huit puits parallèles, chacune contenant 50 µL de la 2 x solution chimique pour chaque dosage (huit puits sont remplis avec le même produit chimique et la même concentration, tableau 2). Toutes les vidéos sont recueillies à l’aide d’un appareil photo numérique attaché à un microscope inversé (Table des matières). L’expérience de traitement chimique dure pendant 24 h. N’ajoutez pas de nourriture bactérienne dans chaque puits pendant l’expérience de traitement chimique de 24h.

  1. Avant d’ajouter les produits chimiques, mettre la plaque de 384 puits avec les vers synchronisé sur la scène automatique et de prendre des vidéos de chaque puits avec la procédure d’acquisition programmée (7 images par seconde pour 2 s ; il faut environ 25 min pour analyser chaque plaque).
  2. Ajouter 50 µL de la 2 x stock chimique préparé conformément à l’article 1 pour chaque puits (tableau 2). Réglez l’heure comme le point h 0.
  3. Incuber les plaques 384 puits à 20 ° C et l’agiter à 80 tr/min dans un shaker incubateur.
  4. Retirez la plaque de l’incubateur et transférez-le vers un stade automatique. Prendre des vidéos de chaque puits de la plaque entière, à 12 h et 24h, pour vérifier les phénotypes vers pour chaque traitement chimique spécifique au K-médium. Environ 25 min sont nécessaires pour l’écran d’une seule plaque.

4. traitement vidéo expérience

Remarque : Un programme pour la vidéo expérimentale et traitement des images a été écrit et emballé. Il peut être librement téléchargé (voir Table des matières). La vidéo expérimentale est stockée sous la forme d’une séquence d’image image, et la séquence d’images de chaque vidéo est stockée dans un répertoire spécifique. Le programme peut reconnaître les vers et quantifier les phénotypes automatiquement.

  1. Dans l’interface utilisateur graphique (GUI, Figure 1), ajoutez des paramètres, tels que le répertoire de séquence de trame, le répertoire de sortie, le paramètre de taille de vis sans fin et le paramètre de seuil de mouvement. Cliquez sur le bouton Analyze pour traiter les images expérimentales.
    1. Cliquez sur le bouton sélectionner pour choisir le répertoire d’images source.
    2. Ajoutez le répertoire résultat intermédiaire dans l’interface.
      Remarque : Les résultats moyens incluent les images segmentées. Ces résultats moyens sont utiles pour l’observation visuelle des images traitées.
    3. Ajoutez le répertoire résultat final dans l’interface.
    4. Ajoutez le paramètre de taille moyenne ver dans la zone de texte Taille de ver dans l’interface.
      Remarque : Le paramètre de taille utilisé dans les expériences est de 2 000.
    5. Ajouter le seuil du ratio déplacé dans l’interface.
      NOTE : Le ratio utilisé dans les expériences est de 0,93.
    6. Cliquez sur le bouton Analyze pour commencer le traitement de l’image. Cliquez sur le bouton Reset pour effacer les paramètres ajoutés.
      Remarque : Il y a 33 éléments définis et quantifiés pour les vers. Tous les phénotypes définis sont triés par catégories (énumérées dans le tableau 3). Ces fonctionnalités peuvent être quantifiées d’images expérimentales. Une comparaison quantitative entre les différents produits chimiques, qui ont des toxicités différentes, peut être faite en comparant ces fonctionnalités.

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Representative Results

Nous avons testé les phénotypes vers exposés à différentes concentrations de plus de 10 produits chimiques12. Dans le test, 33 caractéristiques distinctes ont été quantifiées pour chaque produit chimique composé à trois points dans le temps (0 h, 12 h et 24h). Une comparaison entre un manuel et une analyse automatique d’un test de durée de vie a été faite auparavant,11,12. Dans ce test, nous avons constaté que les concentrations et les produits chimiques peuvent influencer les phénotypes de ver. Un aperçu de cette méthode est illustré à la Figure 2.

Les résultats (Figure 3 et Figure 4c, d) ont montré que les vers sont morts rapidement comme la concentration chimique a augmenté. Des concentrations plus élevées, les vers sont devenus plus droits et moins courbé qu’à des concentrations inférieures ou dans les groupes témoins (Figure 3 et Figure 4b). Au début (à 0 h), il n’y avait aucun différence significative entre le contrôle (K-moyennes) et les traitements chimiques pour tous les phénotypes. Après 12 h de traitement avec un dosage chimique donné, les phénotypes vers ont montré des degrés différents de différences entre les groupes de concentration différente. Par exemple, la longueur de l’axe principal augmenté comme du temps passé. Il y a également une tendance dégradée du bas, à des concentrations plus élevées de produits chimiques. La tendance dégradée de différentes concentrations de produits chimiques a également été significative dans la longueur du petit axe (Figure 4a, b).

Dans cet essai, la motilité du ver a été calculée de deux manières, basés sur la zone, le ver s’installe en et le ratio de la motilité (Figure 4c, d). Résultats de motilité des deux côtés ont montré des profils similaires. Il n’y a aucune différence significative de la motilité ver les différentes concentrations et les groupes de contrôle au début (au point de temps 0 h). Avec le temps, les vers dans les groupes témoins ont montré une écurie diminuent de la motilité. A 12 h, les vers qui ont subi des traitements chimiques à des concentrations différentes ont montré des différences significatives par rapport aux groupes témoins de la motilité. En outre, les vers dans les traitements de concentration plus élevés ont montré faible motilité contre les vers dans les traitements de concentration plus faibles. Cela indique que les vers dans les traitements de concentration plus élevés est devenu moins motiles et est mort plus rapide (Figure 4c, d). Ces résultats suggèrent que la méthode conçue est utile pour l’évaluation de la toxicité chimique et les phénotypes quantifiés de c. elegans sont des marqueurs utiles pour l’identification de la toxicité chimique.

Figure 1
Figure 1 : L’interface du logiciel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Le pipeline d’un test haut débit pour la prévision de la toxicité chimique de profilage phénotypique automatisé de Caenorhabditis elegans. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Images expérimentales de worms 4,64 mg/mL CdCl2 (du haut), 0,464 mg/mL CdCl2 (panneau central), et K-médium (panneau inférieur), à différents moments. Les images montrent les changements de statut vers sous traitement chimique ou d’un groupe témoin dans un puits représentatif de la plaque 384 puits au fil du temps. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Les caractéristiques quantifiées de worms sous différentes concentrations de CdCl2. (a) la longueur de l’axe quantifiés. (b) la longueur de l’axe mineur quantifiés. zone (c) la motilité quantifiée par les déplacés. taille de zone/ver (d) la motilité quantifiée par les déplacés. La barre de diagrammes montrent la quantification moyenne pour chaque fonctionnalité sur worms unique. Les barres d’erreur indiquent ± écart-type (SD). L’unité de concentration = mg/mL. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table 1
Tableau 1 : concentration d’exposition de 10 produits chimiques pour la plaque 384-puits- C. elegans , test de toxicité aiguë.

Table 2
Tableau 2 : Une représentation schématique de la disposition de la plaque 384 puits.

Table 3
Tableau 3 : Phénotypes définis de worms.

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Discussion

Les avantages de c. elegans ont conduit à son utilisation croissante en toxicologie9, tant pour les études mécanistiques et approches de criblage à haut débit. Un rôle accru pour le c. elegans en complément des autres systèmes de modèle dans la recherche toxicologique a été remarquable ces dernières années, en particulier pour l’évaluation de la toxicité rapide de nouveaux produits chimiques. Cet article fournit une nouvelle méthode de dosage de criblage haut débit, quantitative du ver des phénotypes dans une plaque 384 puits d’identification automatique et d’évaluation de la toxicité chimique. Ce test est idéal pour les essais de toxicité aiguë de substances chimiques dans les 24h, et elle pourrait être appliquée aux essais ainsi lorsque plusieurs points dans le temps des données sont collectées et source de nourriture (OP50) est fournie pour les vers de la toxicité subaiguë.

Le support utilisé pour diluer les produits chimiques peut varier ; Nous avons choisi K-médium dans l’essai en se référant à Sofieet al. 13. worms ont été cultivés dans le K-médium dans le contrôle et chimique des groupes de traitement. Une solution d’eau douce artificielle ou une solution de sol à faible force ionique pourrait être alternatives à K-moyennes.

Produits chimiques avec des toxicités différentes peuvent altérer les phénotypes de c. elegans dans différents modèles. Produits chimiques utilisés dans cet essai ont été choisis parmi les catégories de la troisième à la sixième du système général harmonisé de Classification et d’étiquetage des produits chimiques (SGH). C. elegans ont été exposés à des produits chimiques à six ou plus des doses, qui couvrait la gamme posologique de 0 % à 100 % la mortalité. Pour les substances chimiques à faible hydrosolubilité, DMSO est recommandé pour favoriser la dissolution chimique dans l’eau. Comme une forte concentration de DMSO peut affecter le développement de ver et la durée de vie14, ne dépassant pas 0,2 % DMSO doit être utilisé pour les tests aquatiques.

Les fonctions automatiquement chiffrées montrent une différence significative entre les différentes toxicités, qui démontrent que ces phénotypes quantifiés vers sont très utiles dans l’identification de la toxicité des produits chimiques. Il a indiqué que profilage phénotypique a révélé des fonctions conservées à classer et à prévoir la toxicité des produits chimiques différents, en utilisant le nématode c. elegans comme un organisme modèle in vivo.

Le National Toxicology Program (NTP) des États-Unis a établi la communauté Tox21 grâce à un protocole d’entente avec l’US Environmental Protection Agency (EPA) et le centre de génomique de la substance chimique National Institutes of Health (NIH), maintenant le National Center for Progression Sciences translationnelles (NCATS). Tox21 utilise le criblage à haut débit in vitro et in vivo modèle animal autre tests pour identifier les mécanismes de la toxicité, à prioriser les produits chimiques pour les essais de toxicité in vivo supplémentaire et à développer des modèles prédictifs de la réponse humaine toxicologique. Dans le cadre de cet effort, c. elegans a été utilisé pour dépister l’EPA ToxCast Phase I et Phase II bibliothèques, qui contiennent des produits chimiques 292 et 676, respectivement, pour les produits chimiques menant à a diminué de croissance et le développement larvaire15. La plate-forme COPAS (complexe objet analyseur paramétrique et trieur) a également été utilisée pour le dépistage toxicologique ver studies2. Toutefois, la plate-forme COPAS quantifie seulement peu de fonctionnalités, comme la largeur de ver, ver longueur et l’intensité de la fluorescence. Cette méthode est d’améliorer les méthodes actuelles utilisant les vers à présélectionner rapidement la toxicité des substances chimiques nouvelles.

Il y a plusieurs étapes cruciales au sein du protocole : la culture du ver dans une plaque 384 puits, traitement chimique, la capture d’image expérimentale et la quantification du phénotype. Par rapport aux méthodes d’évaluation de toxicité classiques, ce protocole permet de quantifier certains phénotypes des vers qui sont difficiles à calculer manuellement et utile pour tenir compte de la toxicité de chaque produit chimique, tels que la motilité de ver, ver largeur, taille de ver et gris intensité. Clairement, ce test haut débit pour la prévision de la toxicité chimique sera une approche de type de toxicité précieuses et pourrait être utilisé pour la présélection de produits chimiques avant d’expériences sur des animaux rongeurs.

En résumé, cette technique ouvre une voie sur l’évaluation de la toxicité rapide dans de multiples domaines. Les chercheurs pourraient appliquer la méthode à l’analyse d’urgence de toxicité chez les intoxications d’origine alimentaire, l’évaluation de l’innocuité des composés pharmaceutiques, ainsi que le dépistage de la toxicité aiguë et la détection de nouvelles substances chimiques et composés exogènes environnementales.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le CCG pour bien vouloir envoyer c. elegans. Ce travail a été soutenu par la National Key Research and Development Programme of China (#2018YFC1603102, #2018YFC1602705) ; Fondation nationale des sciences naturelles de Chine Grant (#31401025, #81273108, #81641184), Capital Health recherche et développement d’un projet spécial à Pékin (#2011-1013-03), le fonds de l’ouverture du laboratoire de toxicologie de l’environnement (# clé Beijing 2015HJDL03) et la Fondation des sciences naturelles de la Province de Shandong, Chine (ZR2017BF041).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Propanol Sigma-Aldrich 59300
384-well plates Throme 142761
Agar Bacto 214010
Atropine sulfate Sigma-Aldrich PHL80892
Bleach buffer 0.5 mL of 10 M NaOH, 0.5 mL of5% NaClO, 9 mL ofultrapure water
Cadmium chloride Sigma-Aldrich 202908
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074
CCD camera Zeiss AxioCam HRm Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
Copper(II) sulfate Sigma-Aldrich 451657
Ethanol Sigma-Aldrich 24105
Ethylene glycol Sigma-Aldrich 324558
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
K-Medium 3.04 g of NaCl and 2.39 g of KCl in 1 L ultrapure water
LB Broth  10 g/L Tryptone, 5 g/L Yeast Extract, 5 g/L NaCl 
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 63140
NGM Plate 3 g ofNaCl, 17 g ofagar, 2.5 g ofpeptone in 1 L of ultrapure water, after autoclave add 1 mL of cholesterol (5 mg/mL in ethanol), 1 mL of MgSO4 (1 M), 1 mL of CaCl2 (1 M), 25 mL of PPB buffer
Peptone Bacto 211677
Potassium chloride Sigma-Aldrich 60130
Potassium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 795496
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 795488
PPB buffer 35.6 g of K2HPO4, 108.3 g of KH2PO4 in 1 L ultrapure water
shaker ZHICHENG ZWY-200D
Sodium chloride Sigma-Aldrich 71382
Sodium fluoride Sigma-Aldrich s7920
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium hypochlorite solution Sigma-Aldrich 239305
The link of program https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast extract Sigma-Aldrich Y1625
Zeiss automatic microscope  Zeiss AXIO Observer.Z1 Zeiss automatic microsco with peproprietary software Zen2012 and charge coupled device(CCD) camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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