Efecto de anticuerpos Anti-c-fms en la formación de osteoclastos y la proliferación de precursores de osteoclastos In Vitro

Immunology and Infection

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Summary

Este protocolo incluye la disección de huesos largos murinos y aislamiento de médula ósea, macrófagos de médula ósea y producir osteoclastos con estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL) de colonias de macrófagos o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y su detención por el anticuerpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

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Marahleh, A., Kitaura, H., Ishida, M., Shima, K., Kishikawa, A., Ogawa, S., Shen, W. R., Qi, J., Ohori, F., Noguchi, T., Nara, Y., Mizoguchi, I. Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro. J. Vis. Exp. (145), e59089, doi:10.3791/59089 (2019).

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Abstract

Remodelamiento óseo es un proceso complejo e implica períodos de deposición y reabsorción. La resorción ósea es un proceso por el cual hueso se descompone por osteoclastos en respuesta a diversos estímulos. Precursores de osteoclastos se diferencian en osteoclastos multinuclear en respuesta a la colonia de macrófagos estimulando la factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando del factor nuclear Kappa B (RANKL). En condiciones patológicas, el perfil de citoquinas es diferente y consiste en una mezcla de citoquinas inflamatorias. Factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) es una de las citoquinas más importantes ya que se encuentra en grandes cantidades en áreas involucradas con el osteolysis inflamatorio. El propósito de este protocolo es proporcionar un método por el cual médula ósea murina es aislada para generar osteoclastos a través de la inducción con el M-CSF y RANKL o TNF-α que se inhibirá posteriormente al aumentar la dosis de anticuerpo anti-c-fms, el receptor por M-CSF. Este experimento pone de relieve el valor terapéutico de los anticuerpos anti-c-fms en enfermedades de la resorción ósea inflamatoria.

Introduction

Los osteoclastos son células altamente especializadas, y se diferencian de las células madre hematopoyéticas a través de la fusión de varios precursores de osteoclastos. Son esenciales para la remodelación de hueso sano y contribuyen a la resorción del hueso patológico asociada con enfermedades osteolíticas inflamatorias como la artritis reumatoide y la enfermedad periodontal1.

Osteoclastogénesis y osteoclastos función es mediada por dos factores clave; macrófago colonia estimulante factor (M-CSF) y el receptor activador del ligando de factor nuclear kappa B (RANKL). M-CSF y RANKL son importantes para la diferenciación de los osteoclastos2. Otro factor que se ha demostrado para inducir la formación de osteoclastos de macrófagos de médula ósea in vitro es el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α)3,4,5. TNF-α mediada por osteoclastos formación ha demostrado ser crítica para osteólisis en enfermedades óseas destructivas como artritis reumatoide6,7de la enfermedad periodontal y osteoporosis postmenopáusica8.

C-fms es el receptor de membrana de M-CSF y media su acción. El papel de c-fms está bien documentado en la literatura como se ha demostrado que la administración de un anticuerpo contra c-fms (anticuerpo anti-c-fms) totalmente detenido osteoclastogénesis en un modelo de artritis así como en TNF-α inducida por erosiones del hueso mientras que osteoclastogénesis distante de la articulación inflamada estaba aún robusto9. Administración de anticuerpos anti-c-fms inhibe los osteoclastos formación y hueso la resorción inducida por lipopolisacárido (LPS) en ratón calvariae10 así como en la periodontitis inducida por LPS modelo11. Además, anticuerpos anti-c-fms inhiben resorción de la raíz provocada por el estrés mecánico durante de movimiento dental ortodóncico12, así como el movimiento dental ortodóncico y la resorción ósea asociada de movimiento ortodóntico del diente13.

M-CSF se ha divulgado para tener otras funciones que son esenciales para la respuesta inmune del huésped. La ausencia de M-CSF en ratones op/op con neumonía bacteriana conduce al aumento de la carga bacteriana y diseminación bacteriana al hígado con necrosis hepática14. Por lo tanto, M-CSF es importante para la respuesta inmunológica en la protección contra la infección.

Este estudio demuestra el efecto de anticuerpos anti-c-fms en el M-CSF y RANKL o TNF-α inducida por la formación de osteoclastos in vitro y M-CSF indujo proliferación de precursores de osteoclastos. Este protocolo demuestra el aislamiento de células de médula ósea murina de los huesos largos y los pasos para generar los macrófagos de la médula (BMM) que son considerados como precursores de los osteoclastos para inducir la diferenciación de BMM en osteoclastos multinuclear por dos métodos; RANKL o TNF-α. El protocolo también compara la detención de osteoclastogénesis en ambos métodos usando el anticuerpo anti-c-fms.

El proceso por el cual médula es extraída y utiliza posteriormente para generar precursores de osteoclastos es confiable en la producción de grandes cantidades de cultivos de osteoclastos pura que pueden ser utilizados en múltiples aplicaciones posteriores como las pruebas de drogas. El uso de RANKL o TNF-α para inducir osteoclastogénesis en este protocolo distingue osteoclastogénesis como un proceso fisiológico (RANKL) de osteoclastogénesis como un proceso patológico (TNF-α), que a su vez proporciona dos procedimientos alternativos para guiar la decisión de que uno es superior en cuanto a los reactivos a utilizar en aplicaciones posteriores. Este protocolo también proporciona un método por el cual podemos determinar una concentración adecuada de anticuerpos anti-c-fms que pueden utilizar con seguridad para estudios posteriores en la resorción ósea y enfermedades osteolíticas.

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Protocol

Se realizaron todos los procedimientos animales y cuidado de los animales según el estatuto y el Reglamento de la Universidad de Tohoku.

1. manejo y disección de miembro posterior murino

  1. Antes de la disección, llene un plato con unos 50 mL de α-MEM dependiendo del tamaño del recipiente y coloque en hielo. Esto servirá como un recipiente hasta que se completa la disección de todos los huesos. Para este y posteriores experimentos, usar α-MEM con 10% suero bovino fetal (FBS), 100 UI/mL de penicilina G y estreptomicina 100 de μg/mL.
  2. Eutanasia el ratón C57Bl/6J por la inhalación de una sobredosis de 5% de isoflurano.
  3. Fijar el ratón en una posición supina con pernos perforados a través de las palmas y pies y rocíe completamente con etanol al 70%.
  4. Hacer una incisión en la piel con tijeras quirúrgicas estériles y pinzas a la altura de la cadera y extienda hasta los pies, exponiendo los músculos.
  5. Cortar el tendón adjuntando el músculo cuádriceps y el tendón adjuntando el músculo del tendón de la corva al hueso. Retire los músculos exponiendo las articulaciones cadera y rodilla. Localizar estos tendones facilitará la liberación de ambos músculos de sus accesorios sin dejar etiquetas blandas. No corte en el hueso.
  6. Colocar la tijera entre la cabeza del fémur y el espacio común y corte en liberar el fémur pero manteniendo intacto el hueso. Esto permitirá la separación de los huesos sin el riesgo de exposición de la médula ósea.
  7. Del mismo modo corte los músculos a la tibia. Cortar la tibia de su fijación en la articulación del tobillo manteniendo el hueso intacto para evitar la contaminación.
  8. Raspe cualquier tejido blando restante de fémur y la tibia utilizando las tijeras cuchillas y kimwipe y colocar en una placa con α-MEM colocado en hielo.

2. aislamiento de médula trasera murino

  1. Llene una jeringa de aguja de 30 G con α-MEM.
  2. Desconecte la tibia y el fémur de la articulación de la rodilla.
  3. Corte los extremos de los huesos largos de ambos lados con unas tijeras.
  4. Mantener el hueso del eje con unas pinzas, inserte la aguja en el espacio de la médula del hueso y enjuague lentamente el contenido de la médula en una placa de cultivo de 6 cm. El hueso aparece blanco, indicando que la extracción de todo el contenido de médula ósea. Repita para todos los huesos.
  5. Tensión de la médula ósea extraer usando un colador de célula 40 μm nylon en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
  6. Desechar el sobrenadante y lavar con 5 mL de α-MEM, centrifugar a 300 x g durante 5 min lavado de repetición para un total de 2 veces.
  7. Resuspender el precipitado en 10 mL de α-MEM y realizar un conteo usando un hemocitómetro como sigue:
    1. Hacer una dilución de 1:1 de la suspensión celular añadiendo 10 μL de la suspensión celular a 10 μL de tripano 0.4% azul en un tubo de 1,5 mL y pipetear una vez.
    2. Cubra la cámara del hemocitómetro con un tobogán y transferir la suspensión de tinte para el hemocitómetro. Es importante no sobrellene o llene la cámara y permite la suspensión llenar la cámara por capilaridad.
    3. Lugar el hemocitómetro sobre una platina del microscopio. Con el objetivo de 10 x, se centran en la Plaza del centro. Contar todas las células por 3 líneas. Para asegurarse de que las células no son contadas dos veces, contar las esquinas superiores y derecha de cada plaza. Las células muertas aparecerá azul oscuro, éstos quedan excluidos de la cuenta.
  8. Dependiendo de la aplicación aguas abajo de la semilla las células en un recipiente apropiado de la cultura. Para este experimento particular, siga en la sección 3.

3. generación de BMM

  1. Semilla 1 x 107 células/10 mL en 10 cm plato de la cultura y añadir M-CSF 100 ng/mL. La concentración final de M-CSF es 100 ng/mL de medio de cultivo. Incubar el cultivo a 37 ° C, 5% CO2 durante 3 días.
  2. Después de 3 días, eliminar el medio de cultivo, lavar las células vigorosamente con 10 mL de tampón fosfato salino (PBS) dos veces para eliminar las células no adherentes, añadir 5 mL de temperatura ambiente 0.02% tripsina-EDTA en PBS e incubar a 37 ° C, 5% CO2 durante 5 minutos.
  3. Separar las células mediante pipeteo cuidadoso. Asegúrese de que las células han sido separadas mediante la observación de la cultura bajo un microscopio (las células deben aparecer redondeadas y flotantes en los medios de comunicación). Si las células permanecen adjuntas, repita Pipetear cuidadosamente para separarlos. Cuando las células han sido separadas, añadir 5 mL de α-MEM para inactivar la reacción.
  4. Recoger las células en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar a 300 x g por 5 min, descartar el sobrenadante y lavar con 5 mL de α-MEM.
  5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y resuspender el precipitado en 10 mL de α-MEM.
  6. Realizar un conteo como se describió anteriormente en el paso 2.7.1.
  7. Semilla 1 x 106 células/10 mL en 10 cm plato de la cultura y añadir M-CSF 100 ng/mL. La concentración final de M-CSF es 100 ng/mL de medio de cultivo. Incubar el cultivo a 37 ° C, 5% CO2 durante 3 días.

4. generación de osteoclastos de BMM como precursores de los osteoclastos

  1. Después de 3 días, la cosecha las células adjuntas que representan BMM como precursores de los osteoclastos, siguiendo pasos 3.2-3.7.
  2. BMM semilla en 5 x 104 células/200 μL de α-MEM en una placa bien 96. Añadir RANKL para una concentración final de 50 ng/mL o TNF-α a una concentración final de 100 ng/mL. Añadir M-CSF para una concentración final de 100 ng/mL a cada pozo.
  3. Añadir el anticuerpo anti-c-fms (concentraciones finales de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) a cada pocillo.
  4. Incubar a 37 ° C, 5% CO2 4 días. Cambiar los medios de comunicación diariamente durante 4 días.

5. tinción de fosfatasa ácida tartrato-resistente (TRAP)

  1. Después de 4 días de incubación, aspirar suavemente el medio de cultivo de cada pozo. Lavar bien una vez con 200 μL de PBS 1 x de temperatura ambiente.
  2. Añadir 200 μL de formalina al 10% a cada pocillo para la fijación e incubar 1 h a temperatura ambiente. Aspire el formol y lavar cada pozo 3 veces con agua desionizada.
  3. Añada 200 μL de 0,2% Tritón X-100 en PBS a cada bien de permeabilización e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Aspire el Triton X-100 y lavar cada pozo 3 veces con agua desionizada.
  4. Añadir 200 μL de solución de tinción de trampa a cada pocillo. Visualizar la mancha bajo el microscopio. Tardará de 10 a 30 min de la mancha desarrollar correctamente.
  5. Aspirar la mancha y lavar cada pozo con agua desionizada 3 veces y seque al aire. Mantener a temperatura ambiente para utilizar en más de observación.

6. proliferación ensayo

  1. BMM semilla como precursores de osteoclastos en 5 x 103 células/200 μL de α-MEM en una placa bien 96. Añadir M-CSF para una concentración final de 100 ng/mL a cada pozo.
  2. Añadir el anticuerpo anti-c-fms (concentraciones finales de 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) e incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 3 días sin cambio de medio.
  3. Después de 3 días, se lavan las células con PBS 1 x. Añada 100 μL de α-MEM en cada pocillo.
  4. Añadir 10 μL de solución kit de conteo celular, incubar a 37 ° C, 5% CO2 h 2 y determinar la absorbancia de cada pocillo a 450 nm utilizando un lector de microplacas.

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Representative Results

El propósito de este protocolo es evaluar el efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos en presencia de RANKL o TNF-α y determinar el efecto de M-CSF sobre la proliferación de precursores de osteoclastos. En este protocolo, hemos proporcionado un proceso confiable por el cual se generan grandes cantidades de cultivos puros de los osteoclastos. También hemos proporcionado una manera para probar la concentración adecuada de anticuerpos anti-c-fms para inhibir la formación de osteoclastos bajo condiciones de cultivo diferentes.

La formación de osteoclastos en M-cultura del CSF + RANKL con anticuerpo anti-c-fms se muestra en la figura 1. En 1, 10 ng/mL de anticuerpo anti-c-fms, ninguna disminución significativa en el número de osteoclastos en comparación con el control (0 ng/mL). Mientras que a 100, 1.000 anticuerpo anti-c-fms de ng, hubo una disminución significativa en el número de osteoclastos en comparación con el control. La formación de osteoclastos en la cultura de M-CSF + TNF-α con anticuerpo anti-c-fms se muestra en la figura 2. A 1 ng/mL de anticuerpo anti-c-fms, no hubo ninguna disminución significativa en el número de osteoclastos en comparación con el control (0 ng/mL). Mientras que en 10, 100, 1.000 ng/mL de anticuerpo anti-c-fms, hubo una disminución significativa en el número de osteoclastos en comparación con el control.

Cultura de precursores de osteoclastos con anticuerpo M-CSF + anti-c-fms se muestra en la figura 3. En 1, 10, 100 ng/mL, no hay disminución significativa en el número de precursores de osteoclastos en comparación con el control (0 ng/mL), mientras que a 1.000 ng/mL, hubo una disminución significativa en el número de precursores de osteoclastos en comparación con el control. Esto indica que es necesaria una concentración tan alta como 1.000 ng/mL para inhibir significativamente la proliferación de precursores de osteoclastos.

Estos resultados proporcionan información acerca de la naturaleza robusta de RANKL en la producción de osteoclastos y se utilizó una concentración de 50 ng/mL de RANKL, una concentración de 100 ng/mL de TNF-α fue necesario para obtener el mismo número de osteoclastos. Ambos de estos métodos son convenientes para la generación de osteoclastos, pero la decisión de que es superior depende de la aplicación aguas abajo en el contexto de los reactivos a utilizar más adelante. Como indican los resultados, utilizando RANKL no es el equivalente del uso de TNF-α para generar osteoclastos.

En este protocolo, utiliza anticuerpos anti-c-fms para inhibir la osteoclastogénesis y observando los resultados, encontramos que una concentración de 100 ng/mL de anticuerpo anti-c-fms fue necesaria para producir una disminución significativa en el número de osteoclastos en los pozos de RANKL. Se necesitaba una concentración de 1.000 ng/mL de anticuerpo anti-c-fms para inhibir la proliferación de precursores de osteoclastos en ensayo de proliferación de MCSF, mientras que una concentración de sólo 10 ng/mL de anticuerpo anti-c-fms fue necesaria para producir una disminución significativa en los osteoclastos número de pozos de TNF-α.

Figure 1
Figura 1: efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos inducida por RANKL. Observación microscópica de los precursores de los osteoclastos que fueron tratados con M-CSF, RANKL y varias dosis de anticuerpos anti-c-fms (0, 1, 10, 100 y 1.000 ng/mL) durante 4 días. Células eran fijos y teñidas con la coloración de la trampa. Número de células de la trampa-positivas con el M-CSF, RANKL y varias concentraciones de anticuerpos anti-c-fms (0, 1, 10, 100 y 1.000 ng/mL) durante 4 días. Células eran fijos y teñidas con la coloración de la trampa. Se evaluó el número de células positivas de la trampa. Los resultados se expresaron como media ± D.S. de cuatro culturas. Se detectaron diferencias estadísticas mediante el uso de pruebas de Scheffe (n = 4; * p < 0.01). Barras de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos inducidos por el TNF-α. Observación microscópica de los precursores de los osteoclastos que fueron tratados con M-CSF, TNF-α y varias dosis de anticuerpos anti-c-fms (0, 1, 10, 100 y 1.000 ng/mL) durante 4 días. Células eran fijos y teñidas con la coloración de la trampa. Número de células de la trampa-positivas con el M-CSF, TNF-α y varias concentraciones de anticuerpos anti-c-fms (0, 1, 10, 100 y 1.000 ng/mL) durante 4 días. Células eran fijos y teñidas con la coloración de la trampa. Se evaluó el número de células positivas de la trampa. Los resultados se expresaron como meanv ± S.D. de cuatro culturas. Se detectaron diferencias estadísticas mediante el uso de pruebas de Scheffe (n = 4; * p < 0.01). Barras de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: efecto de anticuerpos anti-c-fms sobre la proliferación de precursores de osteoclastos. Viabilidad de precursores de osteoclastos que fueron tratados con M-CSF y varias dosis de anticuerpos anti-c-fms de la célula (0, 1, 10, 100 y 1.000 ng/mL) durante 3 días. Celda contar kit-8 fue utilizado para medir la viabilidad. Los datos se presentan como un porcentaje para comparar la actividad relativa de los pozos que contienen M-CSF + anti-c-fms versus los pozos que contienen M-CSF solos y expresados como promedio ± S.D. de cuatro culturas. Se detectaron diferencias estadísticas mediante el uso de pruebas de Scheffe (n = 4; * p < 0.01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En este estudio, investigamos el efecto de anticuerpos anti-c-fms en la formación de osteoclastos inducida por RANKL, formación de osteoclastos inducida por el TNF-α y proliferación de precursores de osteoclastos inducida por el M-CSF. Se encontró que la cantidad efectiva de anticuerpos anti-c-fms para la inhibición de la osteoclastogénesis entre formación de osteoclastos inducida por RANKL, TNF-α inducida por osteoclastos formación y M-CSF indujo proliferación de precursores de osteoclastos es diferente.

RANKL media osteoclastogénesis en presencia de M-CSF in vitro, y ratones fila nula experimentan osteopetrosis severa debido a la falta de los osteoclastos a desarrollar15, así el RANKL es una citoquina obligatorio para la osteoclastogénesis y tiene un importante función reguladora en la homeostasis del hueso. Por lo tanto, si puede controlar la formación de osteoclastos inducida por RANKL, la disminución del hueso masa puede controlarse. Sin embargo, si se produce excesiva represión, homeostasis del hueso no se mantendrá. En este experimento, se muestra que el anticuerpo anti-c-fms debe estar en alta concentración de 100 ng/mL y ser capaces de disminuir la formación de osteoclastos inducida por RANKL.

TNF-α mediada por osteoclastos formación ha demostrado para ser crítico para osteólisis en destructiva ósea enfermedades como artritis reumatoide6, enfermedad periodontal7y8 de la osteoporosis postmenopáusica y aquí mostramos eso anti-c-fms anticuerpos fácilmente pueden inhibir la formación de osteoclastos mediada por TNF-α en una baja concentración de 10 ng/mL. El resultado sugiere que una baja concentración de anticuerpos anti-c-fms podría ser de valor terapéutico para disminuir el proceso de la osteoclastogénesis en condiciones patológicas, pero tendría un efecto mínimo en la osteoclastogénesis en condiciones normales.

M-CSF es un factor clave para la formación de los osteoclastos como los ratones op/op que falta Csf1 el gen que codifica para la demostración de M-CSF un fenotipo osteopetrotic debido a la falta completa de osteoclastos16. M-CSF también promueve la supervivencia de los precursores de los osteoclastos2. M-CSF niveles se aumentan en el suero de pacientes con artritis reumatoide de la espondilitis anquilosante severa17 y en el líquido sinovial alrededor de prótesis articulares sueltos18. TNF-α aumenta el número de osteoclastos precursores en vivo como resultado de la inducción de expresión de gene de M-CSF en células stromal9. A la luz de estos datos podemos concluir que el M-CSF es un importante mediador de la inflamación debido al impacto del TNF-α en células stromal que causa un aumento en la producción de M-CSF de las células.

Se ha informado de que M-CSF juega un papel importante en inmunorespuesta del anfitrión como funciones antimicrobianas de los fagocitos mononucleares del pulmón y el hígado durante la neumonía14. Por lo tanto, si se produce excesiva supresión de M-CSF, es la posibilidad de que la respuesta inmune disminuirá. En este experimento, demostró que era necesario una muy alta concentración de anticuerpos anti-c-fms (1.000 ng/mL) para inhibir la proliferación mediada por M-CSF y supervivencia de precursores de osteoclastos. Estos resultados al lado del otro sugieren que el anticuerpo anti-c-fms puede funcionar como una terapéutica para detener la osteoclastogénesis en TNF-α inducida por enfermedades osteolíticas en baja concentración, a la vez, por que esta concentración será repuesto formación de osteoclastos inducida RANKL y M-CSF que permitirá hueso remodelado para ocurrir.

Pasos críticos en el protocolo deben realizarse cuidadosamente para asegurar el éxito del experimento. Al principio del protocolo y de disección, es importante evitar el corte en el hueso para evitar la contaminación de la médula ósea. En el proceso de extracción de la médula ósea, para asegurar que se han extraído toda la médula ósea, el procedimiento de lavado debe repetirse por sea necesario hasta que se han extraído toda la médula ósea, lo que proporciona un alto rendimiento de las células. Este protocolo puede ser utilizado en múltiples aplicaciones posteriores, tales como reactivos de prueba, y también es una manera por la cual la concentración de anticuerpos anti-c-fms puede comprobarse evitar la falsa interpretación de los resultados. Como hemos mostrado, no es igual entre los métodos de la concentración de anticuerpos anti-c-fms que se necesitan para inhibir la formación de osteoclastos por que los osteoclastos se obtuvieron (RANKL o TNF-α), por lo tanto cualquier resultados obtenidos con respecto a la concentración de anti-c-fms han para ser cuidadosamente examinado en el futuro los experimentos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por un KAKENHI JSPS becado por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (no. 16K 11776 H. K., no. 17K 17306 a K. S., no. 16K 20637 a k. k K., no. 16K 20636 a M. S., no. 18K 09862 I. m.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-c-Fms antibody AFS98, a rat monoclonal, antimurine, c-Fms antibody (IgG2a)
TNF-α Recombinant murine TNF-α prepared in our laboratory. TNF-α cDNA fragment cloned by RT-PCR and cloned into a pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) to generate a GST-fusion protein. GST-TNF-α was expressed in Escherichia coli BL21 cells cells (Stratagene, La Jolla, CA). The cells were lysed under nondenaturing conditions and GST-TNF-α was purified over a glutathione-Sepharose column. GST was cleaved off by PreScission Protease (Amersham Biosciences) by manufacturer’s directions and was removed by a glutathione-Sepharose column.
RANKL PEPROTECH 315-11 Recombinant Murine sRANK Ligand, Source: E. coli
M-CSF Recombinant human M-CSF. 1/10 vol of CMG14–12 cell line culture supernatant at 5x106 cells in a 10 cm suspension culture dish.
α-MEM Wako with L-Glutamine and phenol red
Fetal Bovine Serum Biowest s1820-500 Fetal Bovine Serum French Origin
Culture dish Corning 100 mm x 20 mm style dish
96-well plate Thermofischer Scientific Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8 Dojindo, Kumamoto, Japan
Microplate reader Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japan
Cell strainer Corning 40 μm Nylon
Centrifuge tube Corning 50 mL CentriStar cap
Triton X-100 Wako Polyoxyethylene (10) Octyphenyl ether

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References

  1. Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss. Journal of Immunology Research. 2015, 281287 (2015).
  2. Teitelbaum, S. L. Bone resorption by osteoclasts. Science. 289, (5484), 1504-1508 (2000).
  3. Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts. Journal of Biological Chemistry. 275, (7), 4858-4864 (2000).
  4. Kobayashi, K., et al. Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction. Journal of Experimental Medicine. 191, (2), 275-286 (2000).
  5. Kim, N., et al. Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis. Journal of Experimental Medicine. 202, (5), 589-595 (2005).
  6. Redlich, K., et al. Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction. Journal of Clinical Investestigation. 110, (10), 1419-1427 (2002).
  7. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. Journal of Clinical Investestigation. 100, (6), 1557-1565 (1997).
  8. Zha, L., et al. TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).
  9. Kitaura, H., et al. M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis. Journal of Clinical Investigation. 115, (12), 3418-3427 (2005).
  10. Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64, (2), 219-227 (2012).
  11. Kimura, K., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model. Oral Diseases. 20, (3), 319-324 (2014).
  12. Kitaura, H., et al. An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice. Angle Orthodontist. 79, (5), 835-841 (2009).
  13. Kitaura, H., et al. An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement. Journal of Dental Research. 87, (4), 396-400 (2008).
  14. Bettina, A., et al. M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes. Journal of Immunology. 196, (12), 5047-5055 (2016).
  15. Dougall, W. C., et al. RANK is essential for osteoclast and lymph node development. Genes & Develpoment. 13, (18), 2412-2424 (1999).
  16. Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, (12), 4828-4832 (1990).
  17. Yang, P. T., et al. Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 65, (12), 1671-1672 (2006).
  18. Takei, I., et al. High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints. The Journal of Rheumatology. 27, (4), 894-899 (2000).

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