बीजाणु अधिशोषण एंजाइम और एंटीजन के लिए एक Nonrecombinant प्रदर्शन प्रणाली के रूप में

Immunology and Infection

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Summary

इस प्रोटोकॉल को विभिन्न जैविक गतिविधियों के साथ विषमजीवी अणुओं adsorb करने के लिए एक "लाइव" nanobiotechnological उपकरण के रूप में बैक्टीरियल बीजाणु के उपयोग पर केंद्रित है । अधिशोषण की कुशलता को मापने की विधियाँ भी दिखाई जाती हैं.

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Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens. J. Vis. Exp. (145), e59102, doi:10.3791/59102 (2019).

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Abstract

बैक्टीरियल बीजाणु एक metabolically शांत सेल, सुरक्षात्मक एक निर्जला कोशिका द्रव्य आसपास के परतों की एक श्रृंखला के द्वारा गठित है । इस अजीब संरचना बीजाणु अत्यंत स्थिर और प्रतिरोधी बनाता है और एक मंच के रूप में बीजाणु का उपयोग करने के लिए विषम अणुओं को प्रदर्शित करने का सुझाव दिया है । अब तक, एंटीजन और एंजाइमों की एक किस्म बेसिलस सबटिलिस और कुछ अंय प्रजातियों के बीजाणुओं पर प्रदर्शित किया गया है, शुरू में एक पुनः संयोजक दृष्टिकोण द्वारा और फिर, एक सरल और कुशल nonrecombinant विधि द्वारा । nonrecombinant प्रदर्शन प्रणाली बीजाणु सतह पर विषमजातीय अणुओं के प्रत्यक्ष सोखना पर आधारित है, पुनः संयोजक उपभेदों के निर्माण से परहेज और पर्यावरण में आनुवंशिक रूप से संशोधित बैक्टीरिया की रिहाई. अधिशोषित अणुओं को बीजाणुओं के साथ अंतःक्रिया द्वारा स्थिर और संरक्षित किया जाता है, जो प्रतिजनों के तेजी से क्षरण और प्रतिकूल परिस्थितियों में एंजाइम गतिविधि की हानि को सीमित करता है । एक बार उपयोग किया, बीजाणु-अधिशोषित एंजाइमों गतिविधि की एक ंयूनतम कमी के साथ आसानी से एकत्र की जा सकती है और अतिरिक्त प्रतिक्रिया दौर के लिए पुन: उपयोग । इस पत्र में दर्शाया गया है कि किस प्रकार मॉडल अणुओं को बी-सबटिल्सके शुद्ध बीजाणु के रूप में देखा जाता है, सोखना की दक्षता का मूल्यांकन कैसे किया जाता है, और उपयोग किए गए बीजाणु को नई प्रतिक्रियाओं के लिए रीसायकल करने के लिए कैसे एकत्र करना चाहिए ।

Introduction

डिस्प्ले सिस्टम का उद्देश्य सूक्ष्मजीवों की सतह पर जैविक रूप से सक्रिय अणुओं को प्रस्तुत करना और विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों को खोजना है, औद्योगिक से चिकित्सा और पर्यावरणीय जैव प्रौद्योगिकियों के लिए । phages के अलावा1,2 और विभिन्न ग्राम की कोशिकाओं-नकारात्मक और सकारात्मक प्रजातियों3,4,5,6,7, बैक्टीरियल बीजाणु भी किया गया है दो दृष्टिकोण8,9द्वारा प्रदर्शन प्रणाली के रूप में प्रस्तावित ।

अपनी विशिष्ट संरचना की वजह से, अर्थात् एक निर्जला कोशिका द्रव्य सुरक्षात्मक परतों की एक श्रृंखला से घिरा हुआ10, बीजाणु फैगे पर कई फायदे प्रदान करता है-और सेल आधारित प्रदर्शन प्रणालियों8,9। एक पहला लाभ है कि शर्तों पर बीजाणु की चरम मजबूती और स्थिरता से आता है कि अंय सभी10,11कोशिकाओं को हानिकारक होगा । बीजाणु प्रदर्शित एंटीजन और एंजाइम कमरे के तापमान12 पर लंबे समय तक भंडारण और कम पीएच और उच्च तापमान13पर गिरावट से संरक्षित करने के बाद स्थिर हैं । बीजाणु का दूसरा लाभ कई बीजाणु बनाने वाली प्रजातियों की सुरक्षा है । बी, बी clausii, बी coagulans, और कई अंय प्रजातियों प्रोबायोटिक्स के रूप में दुनिया भर में इस्तेमाल कर रहे है और मानव या पशु उपयोग के लिए बाजार पर दशकों के लिए किया गया है14,15। इस असाधारण सुरक्षा रिकॉर्ड एक सतह प्रदर्शन प्रणाली के लिए एक स्पष्ट सामांय आवश्यकता है और विशेष रूप से प्रासंगिकता की है जब प्रणाली मानव या पशु उपयोग16के लिए करना है । एक बीजाणु आधारित प्रदर्शन प्रणाली का एक तीसरा, महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह अणु है कि उजागर किया जाना है के आकार के लिए सीमाएं नहीं है । फैगे-आधारित सिस्टम में, एक बड़े विषम प्रोटीन कैप्सिड की संरचना को प्रभावित कर सकता है, जबकि सेल आधारित प्रणालियों में, यह झिल्ली की संरचना को प्रभावित कर सकता है या झिल्ली स्थानांतरण चरण17को ख़राब कर सकता है । बीजाणु आसपास सुरक्षात्मक परतों से अधिक ७० विभिन्न प्रोटीन से बना रहे हैं10 और काफी लचीला किसी भी स्पष्ट संरचनात्मक दोष या कार्यात्मक हानि के बिना बड़े विदेशी प्रोटीन स्वीकार करने के लिए कर रहे हैं8. इसके अलावा, दोनों बीजाणु आधारित प्रदर्शन प्रणालियों के साथ, विषमजातीय प्रोटीन की झिल्ली स्थानांतरण8,9की आवश्यकता नहीं है । दरअसल, विषमजातीय प्रोटीन या तो मदर सेल कोशिका द्रव्य में उत्पादित कर रहे हैं और बीजाणु कि एक ही कोशिका द्रव्य में बनाने या परिपक्व बीजाणु8,9पर अधिशोषित पर इकट्ठे हुए ।

बीजाणु प्रदर्शन शुरू में एक आनुवंशिक प्रणाली विकसित करने के लिए बीजाणु सतह18इंजीनियर द्वारा प्राप्त किया गया था । इस आनुवंशिक प्रणाली मैं पर आधारित था) जीन कोडन के बीच एक बीजाणु कोट प्रोटीन के लिए एक जीन संलयन के निर्माण (एक वाहक के रूप में इस्तेमाल किया) और प्रोटीन के लिए जीन कोडिंग प्रदर्शित किया जा करने के लिए-अंतर्जात के transcriptional और transcriptional संकेतों की उपस्थिति जीन फ्यूजन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करेगा, और ii) आनुवंशिक स्थिरता प्रदान करने के लिए बी. सबटिल्ज क्रोमोजोम पर चिमेरिक जीन का एकीकरण । एंटीजन और एंजाइमों की एक किस्म इस पुनः संयोजक दृष्टिकोण द्वारा प्रदर्शित किया गया है, वाहक के रूप में विभिंन बीजाणु सतह प्रोटीन का उपयोग कर और विभिंन संभावित अनुप्रयोगों पर लक्ष्य, म्यूकोसा वैक्सीन से biocatalyst के लिए लेकर, बायोसेंसर, biocatalyst, या bioanalytical उपकरण8,13

हाल ही में, बीजाणु प्रदर्शन का एक अलग दृष्टिकोण विकसित किया गया है19। यह दूसरी प्रणाली nonrecombinant है और बीजाणु सतह9पर अणुओं की सहज और अत्यंत तंग सोखना पर निर्भर करता है । 19 एंटीजन,20 और एंजाइमों13,21 है कुशलता से प्रदर्शित किया गया है और पता चला है कि इस पद्धति को पुनः संयोजक एक से काफी अधिक कुशल है । यह nonrecombinant दृष्टिकोण20 देशी फार्म में प्रोटीन के प्रदर्शन की अनुमति देता है और भी autoclaved के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, मौत बीजाणु19. अधिशोषण का आण्विक तंत्र अभी तक पूर्ण रूप से स्पष्ट नहीं किया गया है । 13,19,22अधिशोषण के लिए प्रासंगिक गुणों के रूप में बीजाणु की ऋणात्मक आवेश और जलविरायता का प्रस्ताव किया गया है । हाल ही में, यह दिखाया गया है कि एक मॉडल प्रोटीन, लाल autoफ्लोरोसेंट प्रोटीन कोरल डिस्कोमा के (mrfp), जब बीजाणु को अधिशोषित, सतह भीतरी कोट में स्थानीयकृत परतों के माध्यम से घुसपैठ करने में सक्षम था23। यदि अंय प्रोटीन के लिए सच साबित कर दिया, विषमजातीय प्रोटीन के आंतरिक स्थानीयकरण उनकी वृद्धि की स्थिरता की व्याख्या जब23बीजाणु को अधिशोषित सकता है ।

हाल ही के एक अध्ययन में, दो एंजाइम xylan क्षरण मार्ग के दो क्रमिक कदम उत्प्रेरक स्वतंत्र रूप से बी सबटिलिस के बीजाणु पर प्रदर्शित किए गए थे और, जब एक साथ, दोनों क्षरण कदम21प्रदर्शन करने में सक्षम थे । प्रतिक्रिया के बाद एकत्र Spores अभी भी सक्रिय थे और ताजा सब्सट्रेट21के अलावा पर xylan गिरावट जारी रखने में सक्षम. यहां तक कि अगर अंतिम उत्पाद के बारे में 15% की हानि दूसरी प्रतिक्रिया21में मनाया गया था, एकल, साथ ही बहु कदम के लिए अधिशोषित एंजाइम के reusability, प्रतिक्रियाओं बीजाणु प्रदर्शन प्रणाली का एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण लाभ है ।

पैन एट अल.24 बीजाणु की सतह पर विषम प्रोटीन प्रदर्शित करने के लिए एक अतिरिक्त दृष्टिकोण की सूचना: विषमकोण प्रोटीन (एक endoglucanase प्रोटीन और एक बीटा-गैलक्टोसिडेस एक) बीजाणु के दौरान मदर सेल में उत्पादित सहज थे वाहक की आवश्यकता के बिना, बनाने बीजाणु कोट में फेब्रिक । इस अतिरिक्त बीजाणु प्रदर्शन प्रणाली दो अब तक वर्णित दृष्टिकोण का एक संयोजन है । वास्तव में, यह पुनः संयोजक के बाद से विषमजातीय प्रोटीन को स्पोर्युलेशन के दौरान मदर सेल में व्यक्त किया जा इंजीनियर थे, जबकि कोट के भीतर उनकी विधानसभा सहज था और इसलिए, nonrecombinant24। हालांकि, इस अतिरिक्त दृष्टिकोण के प्रदर्शन की दक्षता का परीक्षण किया है और एक ही विषम प्रोटीन का उपयोग करके अंय दो दृष्टिकोण के साथ तुलना में रहता है ।

वर्तमान प्रोटोकॉल में बीजाणु उत्पादन और शुद्धिकरण की प्रक्रियाएं शामिल नहीं हैं, जिन्हें24स्थानों पर व्यापक रूप से वर्णित किया गया है । यह अधिशोषण प्रतिक्रिया, डॉट द्वारा अधिशोषण की दक्षता का मूल्यांकन-सोख्ता और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और अतिरिक्त प्रतिक्रिया दौर के लिए अधिशोषित एंजाइम की रीसाइक्लिंग शामिल हैं ।

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Protocol

1. अधिशोषण अभिक्रिया

  1. इनसेबेट 2, 5, और mrfp के 10 μg 2 x 109 बी के साथ सबटिलिस जंगली प्रकार शुद्ध बीजाणु बाध्यकारी बफर के २०० μl में, ५० मिमी सोडियम साइट्रेट, पीएच ४.० (१६.७ मिमी सोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट; ३३.३ मिमी साइट्रिक एसिड) 1 ज के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक रॉकिंग शेखर पर (चित्रा 1) .
  2. बाध्यकारी मिश्रण (10 मिनट के लिए १३,००० x g ) fractionate छर्रों (P2, P5, और P10) और supernatants (S2, S5, और S10) सेंट्रीफ्यूज । कदम ३.२ में वर्णित अधिशोषण की दक्षता के अप्रत्यक्ष मूल्यांकन के लिए supernatants स्टोर ।
  3. बंधन बफर के २०० μL के साथ छर्रों 2x धोने और उन्हें बाइंडिंग बफर के १०० μL में resuspend और अगले विश्लेषण के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं ।
    ध्यान दें: बाध्यकारी प्रतिक्रिया बेहतर प्रोटीन के समविभव बिंदु से कम पीएच मूल्य पर होता है; आमतौर पर, १.५ मीटर फॉस्फेट-buffered खारा (PBS), पीएच ४.०, या ५० मिमी सोडियम साइट्रेट, पीएच ४.०, उपयोग किया जाता है ।

2. अधिशोषण की दक्षता का प्रत्यक्ष मूल्यांकन

  1. सतह प्रोटीन और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण का निष्कर्षण
    1. mrfp-अधिशोषित बीजाणु के ५० μl ले resuspension (P2, P5, और चरण १.३ के P10) और 2x सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के ५० μl जोड़ें-dithiothreitol (डीटीटी) (०.१ मीटर Tris-एचसीएल, पीएच ६.८; 2% एसडीएस; ०.१ एम डीटीटी) सोपानी सतह बीजाणु प्रोटीन ।
    2. का प्रयोग करें मुक्त, शुद्ध mrfp और बीजाणु कि सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रोटीन के लिए अधिशोषित नहीं कर रहे है की एक ही मात्रा के अर्क, क्रमशः ।
    3. ६५ डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के ४५ मिनट के बाद, सेंट्रीफ्यूज (१३,००० 10 मिनट के लिए एक्स जी ) मिश्रण और निकाले प्रोटीन के 10 μl का विश्लेषण (supernatant) मोनोक्लोनल विरोधी उसके एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी ब्लॉट द्वारा Mrfp के N-टर्मिनल पर मौजूद अपने टैग को पहचानने ( चित्र 2) ।
  2. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्रेक्षण
    नोट: फ्लोरोसेंट विषमजातीय प्रोटीन का उपयोग कर या एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण प्रदर्शन करके, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिशोषित अणुओं का स्थानीयकरण और मात्रा निर्धारित करना संभव है ।
    1. कदम १.३ से अधिशोषित बीजाणु resuspension के 5 μL ले लो और 1x PBS, पीएच ४.० के ९५ μL जोड़ने के लिए, प्राप्त करने के लिए ~ 1 x 106 बीजाणु/
    2. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर निलंबन के 5 μL प्लेस, एक coverslip पहले 30 एस के लिए पाली-एल-lysine के साथ इलाज के साथ कवर, और यह एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण ।
    3. प्रत्येक क्षेत्र के लिए, चरण-कन्ट्रास्ट माइक्रोस्कोपी छवि और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि को बचाने (चित्रा 2बी).
      नोट: वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंट बीजाणु cytofluorimetry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । 1x PBS, pH ४.० के 1 मिलीलीटर में विषमय प्रोटीन के साथ अधिशोषित या न-अधिशोषित कुल 106 बीजाणु, और एक प्रवाह cytometer (चित्र 2) का उपयोग करके निलंबन का विश्लेषण करें ।
  3. डेटा विश्लेषण का उपयोग ImageJ
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर (http://rsbweb.nih.gov/ij/) के साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों को खोलने और सुनिश्चित करें कि सभी छवियों 8-bit प्रारूप में है बनाने के लिए जांच (छवि । प्रकार । 8 बिट) ।
    2. यदि आवश्यक हो तो इसके विपरीत समायोजित करें (Image | समायोजित करें । चमक इसके विपरीत) और सत्यापित करें कि छवि के पैमाने पिक्सेल है (छवि । स्केल सेट करें) ।
    3. विश्लेषण मेनू से, माप सेटकरेंका चयन करें । सुनिश्चित करें कि क्षेत्र, एकीकृत घनत्वहै, और ग्रे मूल्य चयनित मतलब है ।
    4. किसी भी आरेखण/चयन उपकरण (अर्थात, वृत्त, बहुभुज, या मुक्ताकार) का उपयोग करके ब्याज के बीजाणु के चारों ओर एक रेखा आरेखित करें (चित्र 3) ।
    5. विश्लेषण मेनू से माप का चयन करें (या सीएमडी + एममारा) । इस पहले बीजाणु के लिए मानों का एक ढेर के साथ एक पॉपअप बॉक्स प्रकट होता है (चित्रा 3) ।
    6. इन दो चरणों को दोहराने के लिए चुने गए दृश्य के क्षेत्र में कम से ५० अन्य बीजाणु को मापा जाना चाहिए.
    7. किसी भी बीजाणु (जिसमें कोई प्रतिदीप्ति नहीं है) के बिना कई क्षेत्रों का चयन करें और माप दोहराएं; यह पृष्ठभूमि होगी ।
      नोट: आकार महत्वपूर्ण नहीं है । ये इसी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मूल्यों के लिए मैंयुअल रूप से पृष्ठभूमि घटाना इस्तेमाल किया जाएगा ।
    8. परिणाम विंडो में सभी डेटा का चयन करें और एक स्प्रेडशीट में परिणामों की प्रतिलिपि बनाएँ ।
    9. चयनित बीजाणु के एकीकृत घनत्व और क्षेत्रफल और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मानों के माध्य की गणना करें और सूत्र का उपयोग करके सही कुल-प्रति-कक्ष प्रतिदीप्ति (ctcf) प्राप्त करने के लिए उनका उपयोग करे: Ctcf = माध्य एकीकृत घनत्व-(माध्य क्षेत्र x अर्थ पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति) ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, अगर सभी बीजाणु अच्छी तरह से अलग दिखाई देते हैं, यह संभव है छवि क्षेत्र के सभी बीजाणु का विश्लेषण समारोह का उपयोग कणों का विश्लेषण, imagej के निर्देश के बाद । इससे बचने के लिए कि सॉफ्टवेयर एक विशिष्ट प्रतिदीप्ति या बीजाणु समुच्चय पढ़ता है, कणों के आयाम को पिक्सेल ˆ 2 = 50-200 (चित्रा 4) पर सेट किया जाना है ।

3. अधिशोषण की दक्षता का अप्रत्यक्ष मूल्यांकन

  1. शुद्ध प्रोटीन के लिए धारावाहिक dilutions तैयार ।
    1. बाध्यकारी बफर का उपयोग करते हुए, ०.५ एनजी/μL की एक अंतिम एकाग्रता पर शुद्ध mRFP के २५० μL युक्त पहली १.५ मिलीलीटर ट्यूब तैयार करें । यह मात्रा दो लेन लोड करने के लिए पर्याप्त है ।
    2. २५० μl (अंतिम मात्रा) प्रत्येक के छह दोहरा धारावाहिक dilutions प्रदर्शन, बाध्यकारी बफर का उपयोग कर ।
  2. अधिशोषण प्रतिक्रिया (S2, S5, और S10 चरण १.२ से) के अनबाउंड mrfp अंश वाले supernatant नमूनों के लिए दोहरा धारावाहिक dilutions तैयार करते हैं ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक supernatant के १०० μL रखो और बाध्यकारी बफर के १०० μL जोड़ें । २०० μl (अंतिम मात्रा) प्रत्येक के छह दोहरा धारावाहिक dilutions प्रदर्शन, बाध्यकारी बफर का उपयोग कर ।
  3. 5 (नमूनों की संख्या) x 6 (dilutions की संख्या) डॉट्स के क्षेत्र को कवर करने के लिए, आकार में 9 सेमी x 10 सेमी, एक नाइट्रो-सेलुलोज झिल्ली (०.४५ μm कटऑफ) में कटौती । झिल्ली डॉट ब्लाटर उपकरण के गैस्केट के किनारे से आगे नहीं बढ़ाना चाहिए ।
  4. डॉट ब्लॉट उपकरण में prewet झिल्ली रखें । झिल्ली और गैसकेट के बीच फंसे किसी भी हवाई बुलबुले को हटा दें । टेप या पैराफिन फिल्म के साथ उपकरण के अप्रयुक्त भाग को कवर करने के लिए उन कुओं के माध्यम से जाने से रोकने के लिए हवा ।
  5. निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में डॉट ब्लॉट तंत्र को इकट्ठा ।
  6. यदि एक निर्वात कोडांतरण के दौरान प्रयोग किया जाता है, प्रति अच्छी तरह से प्रतिजन की वर्दी बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए 1x pbs के १०० μl के साथ झिल्ली rehydrate और कुण् डली या एक कमजोर का पता लगाने के संकेत को रोकने के ।
  7. धीरे से वैक्यूम से कुओं से बफर निकालें. बफर समाधान के रूप में ही सभी कुओं से नालियों, वैक्यूम पंप बंद करो और इसे डिस्कनेक्ट ।
  8. दो सबसे बाहरी गलियों और बीच में नमूनों में मानक लोड (चित्रा 5) । प्रत्येक कमजोर पड़ने के १०० μL के साथ उपयुक्त कुओं भरें । एक ही मात्रा में एक अच्छी तरह से सभी नमूना कुओं की एक सजातीय छानने का काम सुनिश्चित करना चाहिए के लिए इस्तेमाल किया ।
  9. 2 मिनट के लिए वैक्यूम पंप पर बारी, इसे बंद करो, और फिर, गुरुत्वाकर्षण प्रवाह से झिल्ली के माध्यम से फिल्टर करने के लिए नमूना अनुमति देते हैं ।
  10. 1x PBS के १०० μL के साथ सभी कुओं धोने और वैक्यूम पंप एक और 5 मिनट के लिए चलाने के बाद धोने बफर पूरी तरह से उपकरण से सूखा गया है ।
  11. पर वैक्यूम के साथ, शिकंजा ढीला, और ध्यान से डॉट ब्लॉट तंत्र को खोलने ।
  12. निर्वात बंद करें, झिल्ली ले, और यह प्रक्रिया एक पश्चिमी ब्लॉट प्रोटोकॉल के बाद ।
  13. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर, जैसे ImageJ का उपयोग करते हुए, फ़िल्टर का कोई डेंसिमेट्रिक विश्लेषण निष्पादित करें ।
    1. एक ही क्षेत्र के एक सर्कल के साथ उन्हें रूपरेखा और विश्लेषण/माप आदेश का उपयोग करके प्रत्येक डॉट के एकीकृत घनत्व को मापने ।
    2. छवि का एक पृष्ठभूमि सुधार बनाओ, एक खाली क्षेत्र में एक चक्र ड्राइंग और उसके एकीकृत घनत्व को मापने या प्रक्रिया का उपयोग /
    3. लोड प्रोटीन की मात्रा के साथ मानक डॉट्स के एकीकृत घनत्व सहसंबंधी और एक अंशांकन लाइन प्राप्त (अंशांकन curves के लिए आर2 मान ०.९५ से अधिक होना चाहिए) ।
    4. प्रत्येक नमूना डॉट के mRFP की एकाग्रता बहिर्वेशन करने के लिए अंशांकन वक्र का उपयोग करें ।
    5. अनबाउंड अंशों में शेष mRFP की सांद्रता परिकलित करें ।
      नोट: डॉट ब्लाटर तंत्र के सही समापन सुनिश्चित करने के लिए और, इसलिए, एक समान दबाव के लिए झिल्ली विषय के लिए, एक तिरछे पार योजना का पालन करके शिकंजा कस और, फिर, शिकंजा और अधिक दृढ़ता से कसने के लिए वैक्यूम पंप खुला.

4. बीजाणु संग्रह और पुनः प्रयोग

  1. अधिशोषित बीजाणु के पुनर्चक्रण के लिए, 10 μg शुद्ध GH10-XA xylanase या 10 μg शुद्ध GH3-XT β-xylosidase के साथ २.० x 109 शुद्ध बीजाणु की दो सोखना प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन, के रूप में कदम 1.1-1.3 (चित्रा 6) में वर्णित है ।
  2. एंजाइम-अधिशोषित बीजाणु युक्त छर्रों को एकत्र करें, उन्हें एंजाइमैटिक रिएक्शन परख के लिए इष्टतम बफर के ५० μL में पुनर्सपेंड (५० मिमी सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच ६.५ पर; २.४८६८९ g/L ना2hpo4, ४.८८९९१ g/l णः2PO4), और उंहें एक साथ मिश्रण के लिए बीजाणु adsorbing GH10-XA या GH3-XT के एक १०० μl मिश्रण प्राप्त करते हैं ।
  3. सब्सट्रेट (5 मिलीग्राम/एमएल 4-ओ-मिथाइल-डी-ग्लूकुरोनोड-जाइलन [MGX]) जोड़ें और एंजाइम प्रतिक्रियाओं को ६५ डिग्री सेल्सियस पर 16 ज के लिए जगह ले ।
  4. सेंट्रीफ्यूज प्रतिक्रिया मिश्रण (के लिए १३,००० x जीपर 15 मिनट) और एंजाइम रिएक्शन उत्पाद युक्त supernatant की दुकान.
  5. एक नया सब्सट्रेट (MGX) (चित्रा 6बी) की उपस्थिति में पीएच ६.५ पर ताजा ५० mM सोडियम फॉस्फेट बफर के १०० Μl में गोली resuspend ।
    नोट: एक से अधिक एंजाइम adsorb करने के लिए, यह दोनों एक साथ या एक स्वतंत्र रूप से एक साथ adsorb करने के लिए संभव है. उत्तरार्द्ध संभावना अधिशोषण दक्षता के मात्रात्मक विश्लेषण और प्रत्येक एंजाइम की गतिविधि की सुविधा, प्रतिक्रियाओं के लिए आवश्यक प्रत्येक एंजाइम की एक रससमीकरणमितीय संतुलन की अनुमति.

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Representative Results

सफल अधिशोषण पश्चिमी blotting द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । प्रतिक्रिया पर, मिश्रण केंद्रापसारक और धोया द्वारा fractionated है, और गोली अंश (चित्रा 1) के लिए सतह प्रोटीन निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है । निकालने एसडीएस polyacrylamide जेल ट्रो (पृष्ठ) द्वारा fractionated है, एक पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (pvdf) झिल्ली को हस्तांतरित, और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के खिलाफ प्रतिक्रिया व्यक्त की । अपेक्षित आकार के प्रोटीन की उपस्थिति, केवल अधिशोषित बीजाणु के एक उद्धरण से भरी लेन में, एक सफल अधिशोषण प्रतिक्रिया का संकेत है (चित्र 2) ।

अधिशोषण अभिक्रिया की दक्षता का मूल्यांकन प्रत्यक्ष एवं अप्रत्यक्ष विधियों द्वारा किया जा सकता है । अधिशोषण दक्षता का सीधा मूल्यांकन विषमजातीय प्रोटीन पर निर्भर करता है जिसका उपयोग किया गया है और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2B) और cytofluorimetry (चित्रा 2सी) पर गोली के अंश से किया जा सकता है अधिशोषण अभिक्रिया के प्रभावन के बाद । बीजाणु पर मौजूद फ्लोरोसेंट संकेतों का एक परिमाणन imagej सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया जा सकता है (चित्रा 3 और चित्रा 4). अधिशोषण दक्षता का अप्रत्यक्ष विश्लेषण एक डॉट सोख्ता विश्लेषण (चित्र 5) के द्वारा किया जा सकता है जिसमें अपरिबद्ध प्रोटीन (चित्रा 1) युक्त अधिनतांत अंश होता है । अनबाउंड प्रोटीन का एक डेन्सिमेट्रिक विश्लेषण (चित्र 5) इसके बाद वैज्ञानिकों को अप्रत्यक्ष रूप से बीजाणु पर अधिशोषित प्रोटीन की मात्रा की गणना करने की अनुमति होगी ।

दो आनुक्रमिक प्रतिक्रियाओं को बीजाणु के मिश्रण द्वारा उत्प्रेरित किया जा सकता है जो या तो दो विशिष्ट एंजाइमों में से एक को प्रदर्शित करता है (चित्र 6) । अधिशोषित एंजाइम (ओं) को एक सरल अपकेंद्रण चरण के साथ एकत्र किया जा सकता है, धोया जाता है, और नई अभिक्रिया चक्र (चित्र 6) के लिए नए सिरे से सब्सट्रेट के साथ इनसेट कर दिया जाता है ।

Figure 1
चित्र 1:अधिशोषण प्रयोग की सामान्य योजना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : mRFP प्रदर्शन की दक्षता का प्रत्यक्ष विश्लेषण । () एमएफपी-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ वेस्टर्न ब्लॉट । C + = मुक्त शुद्ध mRFP; C-= बीजाणु से प्रोटीन निकालने के लिए प्रोटीन को अधिशोषित नहीं करते; P2/P5/P10 = बी से निकाले गए प्रोटीन क्रमशः 2, 5 और 10 मिलीग्राम mrfp के साथ अधिशोषित बीजाणु । () अधिशोषित बीजाणु की इम्योनोफ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी । Immunoreactions एक प्राथमिक एंटीबॉडी को पहचानने के साथ प्रदर्शन किया गया था और एक प्रतिदीप्त द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ एक फ्लोरेसेइन आइसोथायोसिनेट (FITC) के साथ संयुग्मित । बाएँ पैनल लाल आंतरिक mRFP प्रतिदीप्ति से पता चलता है, सही पैनल FITC-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के हरे रंग प्रतिदीप्ति से पता चलता है. () अधिशोषित बीजाणु का प्रवाह साइटोमितीय विश्लेषण । बीजाणु mRFP विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की और FITC-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ, और फिर, cytofluorimetry द्वारा विश्लेषण किया गया । विश्लेषण पूरे बीजाणु जनसंख्या (१०,००० घटनाओं, ungated) पर प्रदर्शन किया गया था । बाएँ फलक में, न-अधिशोषित बीजाणु लाल रंग में काले, एमएफपी-अधिशोषित बीजाणु में दर्शाए जाते हैं । सही पैनल आगे और साइड स्कैटर (FSC-SSC) डॉट प्लॉट दिखाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: imagej द्वारा फ्लोरोसेंट संकेत के मैनुअल मात्रा । बीजाणु की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवि, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन mRFP के साथ अधिशोषित, ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया । एक पीले वृत्त एक बीजाणु के आसपास तैयार किया गया है डेंसिमेट्रिक डेटा (बढ़े हुए छवि) प्राप्त करने के लिए । पॉपअप बॉक्स चयनित बीजाणु के डेन्सीमेट्रिक विश्लेषण के परिणामों को दर्शाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: imagej द्वारा फ्लोरोसेंट संकेत का एक साथ परिमाणन । () पॉपअप बॉक्स का चयन जब कण का विश्लेषणप्राप्त किया । 50-200 पिक्सेल ^ 2 का अंतराल मान बीजाणु23के लिए सेट किया जाना है । () विश्लेषण कणों (बाएँ) का उपयोग करने के बाद चित्रा 3A की छवि का विभाजन, और सापेक्ष डेन्सीमेट्रिक विश्लेषण परिणाम (दाएँ). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: डॉट सोख्ता और डेन्सिमेट्रिक विश्लेषण । () बिंदी (std1 और std2) और अधिशोषण अभिक्रिया के सुपरनेटंट (S10, S5 और S2) में प्यूरिफाइड एमएफपी की क्रमिक कमजोरियां, जिनमें एमएफपी के 10, 5 और 2 μg के साथ प्रदर्शन किया गया था, के साथ डॉट सोख्ता क्रमशः23. () पैनल के डॉट सोख्ता का उपयोग डेन्सिमेट्रिक विश्लेषण के लिए किया जाता है । वृत्त संकेतों के घनत्व का परिमाण निर्धारित करने के लिए प्रयुक्त क्षेत्र दर्शाते हैं । सही पर पैनल डेन्सिमेट्रिक विश्लेषण के साथ प्राप्त परिणामों का एक उदाहरण रिपोर्ट करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: पुनः प्रयोज्य बीजाणु द्वारा जाइलन का रूपांतरण । () जाइलन निम्नीकरण की सामान्य योजना । () जाइलान या β जाइलोसिडेस एंजाइम को प्रदर्शित करने वाले बीजाणु, जब एक साथ मिश्रित होते हैं, जाइलन के द्वि-चरणीय निम्नीकरण को उत्प्रेरित करते हैं । प्रतिक्रिया के बाद, नमूना केंद्रापसारक द्वारा fractionated है । supernatant प्रतिक्रिया उत्पाद शामिल हैं, जबकि गोली बीजाणु-बाध्य एंजाइमों कि ताजा सब्सट्रेट जोड़कर पुन: उपयोग किया जा सकता है शामिल हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यह बीजाणु अधिशोषण प्रोटोकॉल बहुत सरल और सीधा है । प्रतिक्रिया कड़ाई से प्रतिक्रिया बफर के पीएच पर निर्भर है और अधिशोषण की क्षमता अम्लीय पीएच मूल्यों (पीएच ५.० या कम) पर इष्टतम है । तटस्थ पीएच शर्तों पर, अधिशोषण की दक्षता कम है, और alkaline पीएच मूल्यों पर, अधिशोषण नहीं हो सकता है । इष्टतम अधिशोषण एक रॉकिंग शेखर पर १.५ मिलीलीटर ट्यूबों (या एक समान अनुपात रखने) में २०० μL की मात्रा का उपयोग कर प्राप्त की है ।

अधिशोषण बहुत तंग है, और प्रतिक्रिया बफर के एक ही पीएच पर एक बफर के साथ washes अधिशोषित प्रोटीन की किसी भी रिहाई का कारण नहीं है । क्षारीय बफ़र्स के साथ Washes एक ंयूनतम में परिणाम हो सकता है (आम तौर पर 15% से कम26) अधिशोषित प्रोटीन की रिहाई ।

डॉट सोख्ता द्वारा अधिशोषण की दक्षता का अप्रत्यक्ष मूल्यांकन विश्वसनीय है यदि शुद्ध और अनबाउंड प्रोटीन की कई कमजोरियां विश्लेषित की जाती हैं और डेन्सीमेट्रिक विश्लेषण ठीक ढंग से किया जाता है । विषमजातीय प्रोटीन की गिरावट का कोई सबूत नहीं है25बताया गया है । अधिशोषण की दक्षता का सीधा मूल्यांकन बहुत अधिक प्रोटीन पर निर्भर करता है जो अधिशोषित है । यदि प्रोटीन ऑटोफ्लोरोसेंट या प्रतिदीप्ति लेबल है, एक ImageJ-सहायता विश्लेषण प्रतिदीप्ति और बीजाणु पर मौजूद फ्लोरोसेंट अणुओं की मात्रा का एक मात्रात्मक निर्धारण प्रदान करता है । यदि प्रोटीन एक एंजाइमी गतिविधि है, एक विशिष्ट एंजाइमी परख बीजाणु पर मौजूद प्रोटीन की मात्रा का एक संकेत प्रदान कर सकता है । हालांकि, यह ज्ञात है कि बीजाणु के साथ जुड़े एंजाइमी गतिविधि बीजाणु13के साथ बातचीत के कारण एक स्थिरीकरण प्रभाव द्वारा बढ़ाया जा सकता है । यदि अधिशोषित प्रोटीन फ्लोरोसेंट नहीं है और एंजाइमी गतिविधि नहीं है, तो अधिशोषण की दक्षता को कठोर परिस्थितियों में निकाले गए बीजाणु पर डॉट सोख्ता द्वारा मूल्यांकित किया जा सकता है ।

प्रयुक्त बीजाणु का संग्रह एक बहुत ही सरल प्रक्रिया द्वारा किया जा सकता है । प्रतिक्रिया बफर के साथ एक धुलाई कदम से प्रतिक्रिया को दूर करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है-उत्पादों, जबकि ताजा सब्सट्रेट के अलावा एक नई प्रतिक्रिया21शुरू करने के लिए आवश्यक है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम "finanziamento डि ricerca di ateneo" के लिए एल baccigalupi, परियोजना शीर्षक "सपा-LAY: बैक्टीरियल बीजाणु के रूप में प्रोटीन प्रदर्शन के लिए जीना मंच" द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% Poly-L-lysine solution Sigma P8920
0.45 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Sartorius M_Blotting_Membranes
100× objective UPlanF1  Olympus microscope equipment
Bacillus subtilis strain NCIB3610 Bacillus Genetic Stock Center 3A1
BD ACCURI C6 PLUS BD flow cytometer
BX51 Olympus Fluorescent microscope
Clarity Biorad 1705060
DP70 digital camera a Olympus microscope equipment
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC Thermo fisher F-2754
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)  Abcam ab6721
Monoclonal Anti-polyHistidine−Peroxidase antibody Sigma A7058-1VL used to detect adsorbed proteins presenting a 6xhistidine-tag at C- or N- terminal 
SecureSlip glass coverslip Sigma S1815-1PAK
Superwhite Uncharged Microscope Slides VWR 75836-190
U-CA Magnification Changer  Olympus microscope equipment

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References

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