Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

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Summary

Este manuscrito describe un protocolo experimental para evaluar las características morfológicas y el estado funcional de las sinapsis de cinta en ratones normales. El modelo actual también es adecuado para modelos de sinaptopatía coclear inducidas por ruido y relacionados con la edad. También se discuten los resultados correlativos de estudios anteriores del ratón.

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Yu, S. K., Du, Z. D., Song, Q. L., Qu, T. F., Qi, Y., Xiong, W., He, L., Wei, W., Gong, S. S., Liu, K. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (147), e59189, doi:10.3791/59189 (2019).

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Abstract

Las células del vello interno coclear (ICH) transmiten señales acústicas a las neuronas ganglionares espirales (SGN) a través de las sinapsis de cinta. Varios estudios experimentales han indicado que las sinapsis de células pilosas pueden ser los objetivos iniciales de la hipoacusia neurosensorial (SNHL). Tales estudios han propuesto el concepto de "sinaptoopatía" coclear, que se refiere a alteraciones en el número, estructura o función de la siinas de cinta que dan lugar a una transmisión sináptica anormal entre los IHC y los SCN. Si bien la sinaptoopatía coclear es irreversible, no afecta al umbral auditivo. En los modelos experimentales inducidos por ruido, se emplean daños restringidos a las sinapsis de IHC en regiones de frecuencia selectas para identificar los factores ambientales que causan específicamente la sinaptopatía, así como las consecuencias fisiológicas de perturbar este oído interno Circuito. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la morfología sináptica coclear y la función en una región de frecuencia específica en ratones adultos. En este protocolo, la localización coclear de regiones de frecuencia específicas se realiza utilizando mapas de frecuencia de lugar junto con datos de coclearografía, tras los cuales las características morfológicas de las sinapsis de cinta se evalúan a través de sinápticas Immunostaining. El estado funcional de las sinapsis de cinta se determina entonces en función de las amplitudes de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) onda I. El presente informe demuestra que este enfoque puede utilizarse para profundizar nuestra comprensión de la patogénesis y los mecanismos de la disfunción sináptica en la cócleara, lo que puede ayudar en el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.

Introduction

Las frecuencias en el rango de aproximadamente 20 u201220,000 Hz pueden ser percibidas como estímulos auditivos por los seres humanos. La audición humana es normalmente más sensible cerca de 1.000 Hz, donde el nivel medio de presión sonora es de 20 oP en adultos jóvenes (es decir, 0 decibelios de nivel de presión sonora [dB SPL]). En algunas condiciones patológicas, la pérdida auditiva está restringida a frecuencias específicas. Por ejemplo, en las primeras etapas de la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL), se puede observar una "notch" (es decir, elevación del umbral auditivo) en el audiograma a 4 kHz1. A lo largo de la partición coclear de mamíferos, sus gradaciones de rigidez y masa producen un mapa de frecuencia exponencial,con detección de sonido de alta frecuencia en la base de la cócleara y detección de baja frecuencia en el ápice 2. De hecho, hay un mapa de frecuencia de lugar coclear a lo largo de la membrana basilar, que conduce a lo que se conoce como organización tonotópica2,3. Cada lugar dado en la membrana basilar tiene la sensibilidad más alta a una sola frecuencia de sonido particular, que generalmente se denomina la frecuencia característica3,4, aunque también se pueden observar respuestas a otras frecuencias.

Hasta la fecha, se han empleado varios modelos de ratón para investigar la función normal, los procesos patológicos y la eficacia terapéutica en el sistema auditivo. El conocimiento preciso de los parámetros fisiológicos en la cócleara del ratón es un requisito previo para estos estudios de pérdida auditiva. La cócleara de ratón se divide anatómicamente en giros apicales, medios y basales, que corresponden a diferentes regiones de frecuencia. Mediante el etiquetado de los afferents de nervio auditivo en el núcleo coclear para analizar sus correspondientes sitios de inervación periférica en la cócleara, m'ller et al. lograron establecer el mapa de frecuencia de lugar coclear en el ratón normal in vivo5. En el intervalo de 7,2–61,8 kHz, que corresponde a posiciones entre el 90% y el 10% de la longitud total de la membrana basilar, el mapa de frecuencia de lugar coclear del ratón se puede describir mediante una simple función de regresión lineal, lo que sugiere una relación entre el distancia normalizada desde la base coclear y el ritmoritmo de la frecuencia característica5. En ratones de laboratorio, el mapa de frecuencia de lugar se puede utilizar para explorar la relación entre los umbrales auditivosdentro de rangos de frecuencia específicos y los cocleares que muestran el número de células pilosas que faltan en regiones relativas a lo largo de la membrana basilar 6. Es importante destacar que el mapa de frecuencia de lugar proporciona un sistema de posicionamiento para la investigación de daños estructurales mínimos, como daños en las sinapsis de la cinta de las células pilosas en lugares específicos de frecuencia coclear en ratones con trauma auditivo periférico7 ,8.

En la cóclea de mamíferos, las sinapsis de cinta se componen de una cinta presináptica, una proyección de electrones denso que ate un halo de vesículas sinápticas listas para liberación que contengan glutamato dentro del IHC, y una densidad postsináptica en el terminal nervioso de la SGN con receptores de glutamato9. Durante la transducción del sonido coclear, la desviación del haz de células pilosas resulta en la despolarización de IHC, que conduce a la liberación de glutamato de los IHC en los terminales aferentes postsinápticos, activando así la vía auditiva. La activación de esta vía conduce a la transformación de señales mecánicas inducidas por el sonido en un código de velocidad en el SGN10. De hecho, la sinapsis de cinta IHC está altamente especializada para la transmisión de sonido infatigable a velocidades de cientos de hercios con alta precisión temporal, y es de importancia crítica para los mecanismos presinápticos de codificación de sonido. Estudios anteriores han revelado que las sinapsis de cinta varían mucho en tamaño y número en diferentes regiones de frecuencia en la cócleara de ratón adulta11,12, probablemente reflejando la adaptación estructural a la codificación de sonido particular para necesidades de supervivencia. Recientemente, estudios experimentales en animales han demostrado que la sinaptopatía coclear contribuye a múltiples formas de deficiencias auditivas, incluyendo pérdida auditiva inducida por ruido, pérdida auditiva relacionada con la edad y pérdida auditiva hereditaria13, 14. Así, los métodos para identificar los cambios correlacionados en el número, la estructura y la función sinápticas en regiones de frecuencia específicas se han empleado cada vez más en estudios de desarrollo auditivo y enfermedad del oído interno, utilizando modelos generados a través de manipulación experimental de variables genéticas o ambientales15,16,17.

En el informe actual, presentamos un protocolo para analizar el número sináptico, la estructura y la función en una región de frecuencia específica de la membrana basilar en ratones adultos. La localización de frecuencia coclear se realiza utilizando un mapa de frecuencia de lugar determinado en combinación con un coclearografía. Las características morfológicas normales de las sinapsis de cinta coclear se evalúan mediante inmunomanchas presinápticas y postsinápticas. El estado funcional de las sinapsis de la cinta coclear se determina en función de las amplitudes supraumbral de la onda ABR I. Con alteraciones menores, este protocolo se puede utilizar para examinar condiciones fisiológicas o patológicas en otros modelos animales, incluyendo ratas, conejillos de indias y jerbos.

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Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía NRC/ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8a Edición). El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica Capital, Beijing, China.

1. Selección de animales

  1. Para todos los experimentos, utilice ratones macho c57BL/6J adultos (8 semanas de edad) como modelo animal.
    NOTA: Los ratones C57BL/6J que llevan una variante de empalme del Cdh23 presentan una senescencia acelerada en el sistema auditivo, reflejada como una pérdida del 40% de las sinapsis de cinta en el giro basal de la cócleara y una pérdida del 10% en el giro medio por 6 meses de edad, seguida de una rápida aumento de esta pérdida en toda la cócleara con18años,19. Por lo tanto, recomendamos precaución al usar ratones C57BL/6J mayores de 6 meses para la investigación auditiva. Otras cepas de ratones se pueden utilizar dependiendo de objetivos experimentales específicos.
  2. Inspeccione a los ratones utilizando un otoscopio de bolsillo de diagnóstico profesional para descartar patologías del oído externo o medio antes de las evaluaciones auditivas. Los signos potenciales pueden incluir líquido o pus en el canal auditivo externo, enrojecimiento e hinchazón en el tejido local, y perforación de membrana timpánica.
    NOTA: Aunque esto rara vez se encuentra, una vez identificado, se deben excluir los ratones con enfermedades del oído externo o medio.

2. Evaluación de la audición

  1. Anestetizar ratones utilizando una inyección intraperitoneal de una mezcla de clorhidrato de ketamina (100 mg/kg) e clorhidrato de xilazina (10 mg/kg). Juzgue la profundidad de la anestesia a través de estímulos dolorosos (p. ej., reflejo de pellizco de los dedos de los dedos).
    NOTA: Cuando el reflejo del dedo del pie está completamente ausente, el animal ha alcanzado una profundidad adecuada de la anestesia para las pruebas auditivas. Si se requiere más tiempo para las grabaciones bilaterales abr, administrar una dosis más baja (una quinta parte de la dosis original) de anestésicos para restaurar el plano anestésico original. Tenga cuidado de evitar la sobredosis anestésica, ya que esto puede llevar a la muerte en ratones.
  2. Mantener la temperatura corporal del animal anestesiado a 37,5 oC utilizando una almohadilla térmica. Coloque el animal anestesiado en una habitación eléctrica y acústicamente blindada para evitar interferencias durante toda la prueba auditiva.
    NOTA: Mantener la temperatura fisiológica durante todo el procedimiento hasta que el animal esté totalmente despierto, con el fin de prevenir la muerte causada por la hipotermia post-anestesia.
  3. Coloque los electrodos de aguja subdérmico (20 mm, 28 G) en el vértice del cráneo (electrodo de grabación), en la región parótida ipsilateral por debajo del pinna del oído medido (electrodo de referencia), y en la región parótida contralateral (electrodo de tierra), con una profundidad de 3 mm bajo la piel de la cabeza del ratón, respectivamente20.
  4. Utilice un altavoz de campo cerrado para realizar estimulación acústica a través de un tubo de plástico de 2 cm con una punta en forma de cono. Coloque la punta en el canal auditivo externo21.
    NOTA: Asegúrese de que la impedancia eléctrica en los electrodos de grabación y referencia es inferior a 3 kOhm (normalmente 1 kOhm). Si la impedancia es alta, cambie el sitio de inserción del electrodo, limpie el electrodo con alcohol o reemplace el electrodo para evitar alteraciones en la amplitud de onda ABR.
  5. Para la grabación ABR, genere pips de tono (3 ms de duración, tiempos de subida/caída de 1 ms, a una velocidad de 21,1/s, frecuencia: 4-48 kHz) y preséntelos en EsP de disminución de 90 a 10 dB en pasos de 5 a 201210 dB SPL20. Durante este paso, las respuestas se amplifican (10.000 veces), se filtran (0,1–3 kHz) y se promedian (1.024 muestras/nivel de estímulo).
    NOTA: Los AB se recogen para cada nivel de estímulo en pasos de 10 dB, con pasos adicionales de 5 dB cerca del umbral.
  6. En cada frecuencia, determine el umbral ABR, que se refiere al SPL mínimo que da como resultado una grabación ABR confiable con una o más ondas distinguibles que se pueden identificar claramente mediante la inspección visual (Figura1).
    NOTA: Por lo general, es necesario repetir el proceso para los SPÁ Bajos alrededor del umbral para asegurar la consistencia de las formas de onda. El umbral de respuesta es el nivel de estímulo más bajo en el que se puede observar la forma de onda, cuando una disminución de 5 dB llevaría a la desaparición de la forma de onda.

3. Procesamiento de tejido coclear

  1. Después de la grabación de ABR, eutanasia a los ratones anestesiados a través de la dislocación cervical, decapitarlos, exponer la bulla desde el lado ventral y abrir con tijeras afiladas para acceder a la cócleara.
  2. Usando un fórceps fino, retire los huesos temporales, corte la arteria de las estapas, retire las estapas de la ventana ovalada y rompa la membrana de la ventana redonda. Haga un pequeño agujero en el ápice de la cócleara girando suavemente la punta de una aguja (13 mm, 27 G).
  3. Fijar los huesos aislados con 4% (wt/vol) paraformaldehído en 0.1 M solución salina con fosfato (PBS, pH 7.4) durante la noche a 4 oC. Usando una pipeta de punta fina, enjuague suavemente el fijador a través de los espacios perilinfáticos a través de la aplicación a las ventanas ovaladas o redondas (como una entrada) y la abertura en el ápice (como salida).
    NOTA: Algunas proteínas requieren una corta duración de la fijación para evitar la destrucción de sus epítopos para el inmunoetiquetado. En tales casos, incubar huesos en 4% paraformaldehído a temperatura ambiente (RT) durante 2 h, dependiendo de las instrucciones del fabricante para la inmunohistoquímica. La fijación también se puede realizar a través de perfusión cardíaca para eliminar la sangre coclear, evitando el ruido de fondo debido a manchas no específicas en etapas posteriores, particularmente en modelos de ratón de sinaptopatía coclear.
  4. Enjuague los huesos tres veces durante 5 min con PBS frío de 0,1 M para eliminar el paraformaldehído residual. Descalcificar los huesos con ácido etilendiaminetetraacético al 10% (EDTA) ya sea a RT durante 4 h o a 4 oC durante 24 h mediante un suave temblor en un agitador horizontal a 20 rpm. EDTA se puede refrescar a mitad de camino.
    NOTA: Los tiempos de descalcificación están sujetos a la concentración de EDTA y a las preferencias de los usuarios. El tejido descalcificado debe mantener un cierto grado de dureza, lo que facilita la manipulación del aislar monturas cocleares enteras en pasos posteriores. Los huesos temporales se pueden descalcificar en 10% EDTA con rotación, lo que permite a los investigadores salir del laboratorio después de pruebas de ABR y experimentos de fijación. El tiempo de descalcificación es flexible dentro del rango de 20 a 30 h a 4 oC.
  5. Transfiera un hueso temporal descalcificado de EDTA a 0,1 M PBS. Utilice #3, #5 fórceps Dumont y la aguja de 27 G para diseccionar las regiones cocleares apicales, medias y basales a su vez y luego diseccionar la cócleara fuera del hueso bajo un microscopio de disección estéreo (como se describió anteriormente22). Haga una serie de pequeños cortes a lo largo del ligamento espiral usando una cuchilla de afeitar, y retire la membrana tectorial y la membrana de Reissner (Figura2).
    NOTA: Mientras la cócleara diseccionada esté intacta, este proceso se puede modificar de acuerdo con el protocolo habitual del operador individual.
  6. Diseccionar aún más el epitelio auditivo restante, incluyendo el limbo espiral en giros cocleares individuales (ápice, medio y base con región de gancho) para preparaciones de montaje completo.
  7. Bajo un objetivo de aceite de 40x de un microscopio de luz, mida la longitud de la membrana basilar con una escala de 250 m colocada en el ocular, que se puede ajustar a lo largo de la estereocilia de los IHCs.
  8. Calcular la longitud de cada giro coclear añadiendo todas las longitudes de segmento (250 m por segmento), y obtener de forma concomitante la longitud total de la membrana basilar sumando las longitudes de cada vuelta.
  9. Convertir la longitud total de la membrana basilar incluyendo la región del gancho en un porcentaje basado en la distancia desde el ápice coclear (0% se refiere al ápice coclear, 100% a la base coclear).
  10. Convierta esta distancia en la frecuencia característica coclear utilizando una función logarítmica (d(%) á 1 - 156,5 + 82,5 a log(f), con una pendiente de 1,25 mm/octava de frecuencia, donde d es la distancia normalizada del ápice coclear en porcentaje, f es la frecuencia en kHz), como se describió anteriormente5,6. Por lo tanto, se puede adquirir un rango de frecuencia en un área correspondiente de la membrana basilar en cada giro coclear.

4. Mancha de inmunofluorescencia

  1. Después de la disección, coloque cada giro coclear en un tubo centrífugo separado de 2,5 ml e incubar giros cocleares en 10% suero de cabra/PBS/0.1% Tritón X-100 para 1 h a RT en un rotador.
  2. Retire la solución de bloqueo/permeabilización anterior de cada tubo utilizando una punta de pipeta de 200 ml bajo un microscopio de disección e incubar las muestras con anticuerpos primarios diluidos en un 5% de suero de cabra/PBS/0.1% Triton X-100 durante la noche a 4 oC en un rotador.
    NOTA: Para el inmunoetiquetado de cintas sinápticas cocleares, utilice el marcador presináptico ratón anti-carboxilo-terminal proteína de unión 2 IgG1 (CtBP2, etiquetando el dominio B de la proteína de andamiaje RIBEYE, 1:400) y el receptor anti-glutamato de ratón marcador postsináptico 2 IgG2a (GluR2, etiquetado de una subunidad del receptor AMPA, 1:200)23.
  3. Enjuagar tres veces durante 5 min con 0,1 M DE PBS frío para eliminar anticuerpos primarios residuales e incubar los especímenes con anticuerpos secundarios diluidos en 5% de suero de cabra/PBS/0.1% Tritón X-100 en RT para 2-u20123 h en la oscuridad en un rotador.
    NOTA: Preparar mezclas de anticuerpos secundarios apropiadas utilizando Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) y Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), que son complementarios a los anticuerpos primarios utilizados en el paso 4.2. Para mejorar la eficiencia del etiquetado de las cintas sinápticas, se recomienda seleccionar anticuerpos secundarios específicos. Algunos laboratorios extienden la incubación con anticuerpos secundarios para aumentar el inmunoetiquetado GluR224.
  4. Enjuague tres veces durante 5 min con 0,1 M PBS para eliminar anticuerpos secundarios residuales y transferir las muestras de tubos centrífugos de 2,5 ml a placas de 35 mm que contengan 0,1 M PBS.
  5. Coloque una gota de medio de montaje que contenga 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en la corredera y transfiera las muestras de PBS al medio de montaje. Coloque un borde de un cubreobjetos en la diapositiva y suelte para dejar que el cubreobjetos caiga suavemente.
    NOTA: Para asegurarse de que las células pilosas miran hacia arriba y que no se produzca nilcante o torsión de muestras cocleares durante el procedimiento, monte muestras cocleares bajo un microscopio de disección estéreo.
  6. Coloque las diapositivas en una caja deslizante a 4 oC durante la noche para dejar que las diapositivas se sequen y luego la imagen bajo un microscopio confocal láser.

5. Evaluación morfológica de las sinapsis de la cinta coclear

  1. Diapositivas de imagen utilizando un microscopio confocal con tres láseres: un diodo UV de 405 nm, un láser de argón de 488 nm y un láser de estado sólido (DPSS) de 561 nm para excitar DAPI (espectro de excitación 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (espectro de excitación 496–549 nm) y Alexa Fluor 568nm) y Alexa Fluor 568nm) (Espectro de excitación 573–631 nm), respectivamente.
  2. Adquiera pilas z confocales a una distancia de 8 m de cada giro coclear utilizando una lente de inmersión de aceite de alta resolución de 63x.
    NOTA: Una vez definidos, todos los parámetros para digitalizar fotomicrografías deben guardarse y aplicarse uniformemente a todas las diapositivas.
  3. Para recuentos de punctum sináptico, establezca las pilas z (tamaño de paso de 0,3 m) para abarcar toda la longitud de los IHC, asegurando así que se pueda crear una imagen de todos los puncta sinápticos.
  4. Combine las imágenes que contienen puncta en una pila z para obtener la proyección del eje z e importarlas al software de procesamiento de imágenes.
  5. Divida los recuentos totales sinápticos en cada pila z en regiones de frecuencia específicas por el número de IHC (igual a los recuentos manuales de la energía nuclear dAPI) para calcular el número de puncta sináptica para cada IHC. En cada región de frecuencia específica, promedio de todos los puncta sinápticos en tres imágenes de diferentes campos microscópicos que contienen 9-11 IC.
    1. Esbozar la región de intereses (ROI) incluyendo las regiones basolaterales de cada IHC utilizando el botón de selección a mano alzada. Utilice la función de medida para la cuantificación automática de puncta y la función de cuenca hidrográfica para distinguir entre puntos estrechamente adyacentes.
    2. Después de cada recuento automatizado, realice inspecciones visuales con correcciones manuales para garantizar que el recuento de puncta sea confiable.
      NOTA: Los experimentadores deben permanecer cegados en cuanto a si la diapositiva es del ápice, medio o giro basal de la cócleara.
  6. Evalúe visualmente la estructura y distribución sináptica, para aislar manualmente los IHC individuales de sus vecinos mediante la Herramienta Lápiz (M) para visualizar mejor la arquitectura citoesquelética y la localización sináptica.
  7. Para inspeccionar la yuxtaposición de cintas presinápticas (CtBP2) y parches de receptores postsinápticos (GluR2), extraiga el espacio de vóxeles alrededor de la cinta mediante la herramienta Marco rectangular y aísle la cinta individual de Recortar. Al hacer clic En Imagen > Tamañode imagen, adquiera una matriz de miniaturas de estas proyecciones en miniatura, que luego se puede utilizar para identificar sinapsis emparejadas (aparecieron como pares estrechamente yuxtapuestos de Puncta positiva y GluR2 positiva) frente a huérfana cintas (falta de parches receptores de glutamato postsináptico) (Figura 3).
    NOTA: Las sinapsis cocleares normales aparecen como inmunoetiquetado combinado de la cinta presináptica dentro de la célula pilosa (anti-CtBP2) y el parche del receptor de glutamato postsináptico en el terminal del nervio auditivo (anti-GluR2)25. Algunos laboratorios utilizan proyecciones confocales junto con el modelado 3D para cuantificar el tamaño del parche sináptico o el volumen26,27. Antes de la pérdida significativa de sinapsis de cinta, cintas que presentan cambios en el tamaño o sin parches receptores de glutamato emparejados son probablemente indicativos de disfunción sináptica27,28.

6. Evaluación funcional de las sinapsis de la cinta coclear

  1. Recoja todas las ondas ABR para cada estímulo de frecuencia presentado en un SPL de 90 dB para el análisis de las amplitudes supraumbrales de la onda ABR I.
    NOTA: Estudios neurofisiológicos y morfológicos han demostrado que las fibras de baja velocidad espontánea y alto umbral son especialmente vulnerables al envejecimiento y a la exposición al ruido29,30. Aunque la simple pérdida de sinapsis de cinta no puede afectar a los umbrales ABR, comúnmente resulta en reducciones significativas en las amplitudes de onda I de ABR, porque estos aferentes incluyen baja tasa espontánea, fibras de alto umbral y alta tasa espontánea, las fibras de umbral bajo contribuyen en gran medida a las actividades sumadas de las fibras nerviosas cocleares28,29,31. Aquí se selecciona una intensidad supraumbral de 90 dB SPL.
  2. Determinar la amplitud de la onda de pico a pico I mediante un programa de análisis sin conexión (Figura4). Cada onda I en la prueba ABR consiste en una desviación positiva inicial (p) y la posterior desviación negativa (n). La amplitud de la onda I ABR se define como la diferencia de voltaje entre Ip (el pico positivo de la onda I) y In (el pico negativo de la onda I)29.
    NOTA: En condiciones patológicas, la sinaptoopatía coclear se puede determinar sobre la base de las amplitudes supraumbral de la onda ABR I, que reflejan las respuestas de inicio sumadas de los SGN evocados por el sonido. Sin embargo, la sensibilidad coclear que no se ve comprometida debido a la disfunción OHC es un requisito previo para este método.

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Representative Results

Se realizaron pruebas auditivas de ABR para 10 ratones C57BL/6J (8 semanas de edad) bajo anestesia. Los Abs se introdujeron utilizando estímulos de ráfaga de tono a 4, 8, 16, 32 y 48 kHz. El umbral auditivo de cada animal se detectó visualmente distinguiendo al menos una forma de onda clara en el ABR. Todos los ratones mostraron umbrales de ABR en respuesta a ráfagas de tono, que oscilan entre 25 y 70 dB SPL dependiendo de la frecuencia del estímulo. Nuestros resultados indicaron que el umbral auditivofue más bajo a 16 kHz (Figura 1), correspondiente a aproximadamente un 43% de distancia del ápice coclear (Figura2), lo que sugiere que la sensibilidad acústica se reduce significativamente en otros cocleares Regiones.

Los monturas enteras de Cochlear fueron aislados de huesos temporales en ratones adultos bajo un microscopio de disección estéreo (Figura2A). Los montajes enteros del epitelio auditivo se diseccionaron en tres piezas, las longitudes de las cuales se midieron y finalmente se convirtieron en porcentuales de distancia desde el ápice coclear. La ubicación de frecuencia en la membrana basilar de cada giro coclear se calculó utilizando una función logarítmica, como se describió anteriormente5,6 (Figura 2B).

Para evaluar las características morfológicas de las sinapsis de cinta coclear, se utilizaron anticuerpos contra CtBP2 y GluR2 para etiquetar estructuras presinápticas y postsinápticas, respectivamente. En los oídos normales de ratones adultos, la inmunomancha reveló pares yuxtapuestos de cintas sinápticas y parches de receptores de glutamato que se escapaban de la superficie de la membrana basolateral de los IHC, con 8–20 pares por IHC (Figura3A). Aunque la gran mayoría del puncta apareció como pares yuxtapuestos en los oídos normales, las cintas huérfanas raravez se podían observar con un aumento alto (Figura3B). Los recuentos de sinapsis de cinta IHC (puntos inmunopositivos para CtBP2 y GluR2) fueron más altos en la región de 16 kHz, disminuyendo significativamente a medida que aumentaba la distancia desde esta ubicación (Figura3C). Los recuentos sinápticos determinados en base a proyecciones confocales proporcionan una estimación del número máximo de fibras nerviosas auditivas que transmiten información de la cócleara al cerebro29.

El estado funcional de las sinapsis de cinta coclear se investigó en todos los ratones adultos basados en amplitudes de onda I ABR, que proporcionan información sobre la integridad funcional de las fibras nerviosas auditivas29,31. Las amplitudes de onda I de ABR en cada frecuencia del estímulo presentado a un nivel de presión sonora de 90 dB se midieron de pico a siguiente vaguada, como se muestra en la Figura 4A. La amplitud de la onda I de ABR fue más alta a una frecuencia de 16 kHz, correspondiente al umbral auditivo más bajo, y los valores de amplitud disminuyeron significativamente a medida que aumentaba la distancia desde esta ubicación (Figura4B). Este resultado es consistente con las alteraciones observadas en los recuentos de sinapsis de cinta, lo que indica que las sinapsis dentro de esta región coclear pueden exhibir la función sináptica más vívida. Además, en estudios anteriores de ratón de neurodegeneración coclear inducida por ruido y relacionada con la edad, las amplitudes supraumbrals de la onda ABR I disminuyeron en proporción a la pérdida de cinta, lo que indica que la amplitud de la onda I abr está altamente correlacionada con el grado de sinaptopatía coclear29,31.

Figure 1
Figura 1 : Evaluación auditiva. Las comparaciones de umbrales abr entre diferentes frecuencias de estímulos de ráfaga de tono demostraron que el umbral auditivo era más bajo a 16 kHz en 10 ratones C57BL/6J adultos. La respuesta abr se elevó significativamente en otras regiones de frecuencia (ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de comparación múltiple de Dunnett; *: P < 0.01, n a 20 orejas). Los datos se expresan como la media de SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Localización de frecuencia coclear en ratones. (A) Una imagen representativa de la cócleara explantada completa, que se ha diseccionado fuera del hueso temporal bajo un microscopio de disección estéreo. (B) La cócleardel de ratón se divide en giros apicales, medios y basales, donde se retira la pared lateral coclear. Los círculos rojos en los fragmentos de la membrana basilar coclear indican las ubicaciones de frecuencia y sus posiciones normalizadas correspondientes en la cócleara (0% se refiere al ápice coclear, 100% a la base coclear). Barra de escala a 250 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Análisis confocal de sinapsis de cinta coclear en ratones. (A) Imágenes representativas de sinapsis de cinta para las regiones de 4, 8, 16, 32 y 48 kHz, inmunoconservadas para cintas presinápticas (CtBP2, rojo) y estructuras postsinápticas (GluR2, verde). Las líneas discontinuas blancas se utilizan para delinear las células del cabello internas como referencia. Barra de escala a 10 m. (B) Las miniaturas de alta potencia de las pilas z confocales muestran que estas sinapsis de cinta aparecieron como pares estrechamente yuxtapuestos de CtBP2 positivo (rojo) y GluR2 positivo (verde) puncta (izquierda y medio), mientras que las cintas huérfanas (derecha) carecen de puncta postsináptica (izquierda y media), mientras que las cintas huérfanas (derecha) carecen de puntáptica simpáptica (izquierda y media), mientras que las cintas huérfanas (derecha) carecen de puncta postsináptica (izquierda y media), mientras que las cintas huérfanas (derecha) careciendo de postsinápticas los parches receptores de glutamato eran muy raros. Barra de escala a 0,5 m. (C) El análisis cuantitativo de la puncta de cinta emparejada con todos los elementos presinápticos y postsinápticos reveló que el número de puncta sináptica por célula de cabello interno era significativamente mayor en la región de 16 kHz que en otras regiones de frecuencia (ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de comparación múltiple de Dunnett; *: P < 0.01, n.o 6 orejas). Los datos se expresan como la media de SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Análisis de Amplitudes de onda ABR I en ratones . (A) Forma de onda ABR representativa de un ratón C57BL/6J de 8 semanas expuesto a un estímulo de tono puro de 16 kHz a una intensidad de 90 dB (inicio de estímulo a 0 ms). Los números romanos marcan los picos de las ondas ABR. Las líneas de puntos marcan el pico de la onda I y la vaguada, lo que indica la amplitud. (B) Análisis cuantitativo de amplitudes de onda media I en respuesta a los estímulos de 4, 8, 16, 32 y 48 kHz presentados a un nivel de presión sonora de 90 dB. Las amplitudes de onda I de ABR fueron más altas a la frecuencia de 16 kHz y significativamente más bajas en otras frecuencias (ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de comparación múltiple de Dunnett; *: P < 0.01, n a 20 orejas). Los datos se expresan como la media de SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Dado que la sinaptoopatía coclear se caracterizó por primera vez en ratones adultos con un desplazamiento temporal de umbral (TTS) inducido por el ruido de banda de octava de 8 u201216 kHz a 100 dB SPL durante 2 h31, los investigadores han investigado cada vez más los efectos de la sinaptopatía en varios mamíferos, incluyendo monos y humanos32,33. Además de la exposición al ruido, varias otras condiciones se han asociado con la sinaptopatía coclear (por ejemplo, el envejecimiento, el uso de fármacos ototóxicos y mutaciones genéticas), lo que lleva a la interrupción a corto plazo de la audición supraumbral, seguida de una degeneración del nervio auditivo. En la fase temprana del insulto coclear, la sinaptoopatía a menudo ocurre en un lugar de frecuencia específico, especialmente en modelos experimentales en los que el daño a las sinapsis iHC se limita a seleccionar las regiones de frecuencia24,31. Por lo tanto, nuestro protocolo es significativo en el que permite la investigación de la morfología sináptica y la función en una región de frecuencia específica.

El mapa coclear de frecuencia de lugar se puede utilizar para discriminar la función auditiva normal y anormal, reflejando aún más el área normal y anormal en el oído interno. Dado que las técnicas de preparación de superficies se utilizaron por primera vez para trazar células pilosasintactas y faltantes en los diferentes giros cocleares, el coclear se ha convertido en un método rutinario para cuantificar la pérdida de células pilosas 6. Por lo tanto, para correlacionar los insultos morfológicos en la cóclear a los cambios fisiológicos relevantes, es razonable incluir un mapa de frecuencia de lugar en el coclear. Este método permite determinar el número y la estructura de las sinapsis en función de sus posiciones a lo largo de la membrana basilar coclear en relación con los mapas de frecuencia de lugar coclear establecidos, proporcionando así información suficiente para comparaciones detalladas entre los resultados histológicos y fisiológicos. Sin embargo, algunos estudios evalúan la sinaptopatía basada en el segmento coclear o la distancia a lo largo del conducto coclear, lo que no permite comparaciones directas entre las cóclearas individuales debido a las variaciones intra-especie en la longitud de la membrana basilar. Por lo tanto, es particularmente importante estandarizar el coclear mediante la conversión de longitudes cocleares individuales de milímetros a un porcentaje relativo.

La sinaptoopatía se puede confirmar mediante la visualización de inmunomanchas para la proteína CtBP2 (el isoforme sináptico "ribeye") en las regiones basolaterales de los IHCs. Estos parches con positivos en CtBP2 pueden servir como un marcador estructural para la cuantificación de cintas presinápticas, y la presencia de menos parches suele indicar pérdida presináptica. Aunque estudios anteriores han reportado que el 98% de las cintas presinápticas están emparejadas con terminales postsinápticos en el oído normal30, el número simple de parches positivos de CtBP2 puede no ser preciso para el análisis cuantitativo de sinapsis completas, ya que puede conducir a una sobreestimación del recuento de sinapsis en el oído lesionado mediante la participación de "huérfanos" (cintas presinápticas no emparejadas con terminales postsinápticos). Para mejorar la precisión de la estimación del número de sinapsis, se utilizan anticuerpos adicionales contra la estructura postsináptica como GluA2, GluA2/3 o PSD-95. La proteína de densidad postsináptica PSD-95, una proteína de andamios de guanylate quinasa asociada a la membrana (MAGUK), se puede etiquetar utilizando un anticuerpo contra la PSD-95, que se observa principalmente en los contactos entre las células pilosas y las terminaciones de fibra SGN34, 35. Sin embargo, el anticuerpo contra GluR2 es más específico para los receptores de glutamato ionotrópico de tipo AMPA en la membrana postsináptica, que pueden identificar de manera más fiable las sinapsis de la cinta (pares yuxtapuestos de puncta inmunofluorescente de CtBP2 presináptica2 y gluR2 postsináptica)15. Además del análisis morfológico, el análisis histológico de las sinapsis completas se puede utilizar como indicador funcional de la sinaptopatía. En ratones adultos con sinaptoopatía coclear, las reducciones en la amplitud de la onda I de ABR tras la presentación de estímulos de tono moderado a alto se producen a frecuencias tonotópicamente relacionadas con regiones de pérdida sináptica26,29. Los recuentos de sinapsis obtenidos con este método son limitados en que se tarda aproximadamente 10 minutos en escanear un sitio en la membrana basilar. Además, para evaluar las variaciones espaciales en el número sináptico y la morfología en función de la ubicación de la IHC, es necesario identificar con precisión el límite del cuerpo del ICH (por ejemplo, a través de la tinción de miosina VIIa) y realizar pasos particulares de procesamiento de imágenes26 . Utilizando estos métodos, estudios previos han confirmado que la pérdida sináptica es mayor en el lado modiolar del IHC que en el lado del pilar en modelos animales de degeneración inducida por ruido26.

Estudios anteriores han demostrado que las fibras de baja velocidad espontánea y alto umbral son más susceptibles al daño por ruido que las fibras de alta velocidad espontánea y de bajo umbral en modelos animales de sinaptopatía restringida26,30. Estos estudios proporcionan la razón para utilizar amplitudes supraumbrales de la onda ABR I (medida mediante estímulos de tono moderado a alto) para evaluar la función sináptica en modelos animales con umbral normal de ABR y emisiones otoacústicas de productos de distorsión ( DPOAEs). Debido a que la onda I del ABR refleja las respuestas neuronales sumadas de las fibras nerviosas auditivas, cuando la sinaptopatía se evalúa a través de la amplitud de la onda I ABR, las pruebas DPOAE también se deben realizar para excluir el daño de OHC, que también puede reducir las amplitudes ABR debido a la interrupción de transducción mecanoeléctrica. Aunque la primera onda del potencial de acción compuesta (CAP), que se mide a partir de electrodos de ventana redonda, también representa la actividad sumada del nervio coclear, este método es más invasivo y complejo que las mediciones de ABR. Si las respuestas DPOAE vuelven a la normalidad después de los cambios temporales de umbral en ratones expuestos al ruido31 o aún no se han deteriorado en ratones envejecidos29, la amplitud supraumbral de la onda ABR puedo predecir fuertemente el grado de sinaptopatía coclear , ya que las neuronas afectadas se silencian cuando se interrumpen sus conexiones sinápticas con los IHC. Sin embargo, si la sensibilidad coclear se reduce debido a varios factores (por ejemplo, disfunción OHC), las disminuciones en la amplitud de la onda ABR I ya no se pueden atribuir únicamente a la pérdida sináptica porque reflejarán la combinación de todo daño coclear. Por lo tanto, se requieren condiciones experimentales controladas para la preparación del modelo restringida por la sinaptopatía para garantizar que la sensibilidad coclear no se vea comprometida por otros factores. Desafortunadamente, aunque la amplitud de la onda ABR I proporciona una medida objetiva de la pérdida de fibra nerviosa auditiva en animales, es difícil de medir en los seres humanos. Además, las patologías mixtas que implican sinaptopatología, pérdida de células pilosas y la presencia de otras anomalías en la cócleara pueden coexistir en humanos, lo que limita el uso de mediciones de amplitud de onda I de ABR en entornos clínicos. La latencia de onda ABR se calcula como el tiempo en milisegundos desde el inicio del estímulo hasta el pico positivo de cada onda, proporcionando una visión de los tiempos de transmisión a lo largo de la vía auditiva. No se han observado cambios significativos en la latencia de onda I en los modelos de ratón de sinaptopatía coclear inducida por ruido o relacionada con la edad36. Sin embargo, algunas pruebas sugieren que los efectos del ruido de enmascaramiento en la latencia de onda V ABR se pueden utilizar para diagnosticar la sinaptoopatía coclear en humanos37.

Varios estudios recientes han apoyado la noción de que la sinaptoopatía coclear es el evento inicial principal asociado con la pérdida auditiva oculta, el tinnitus y la hiperacusis. Aunque el concepto de sinaptoopatía coclear en enfermedades del oído interno se ha establecido firmemente, su impacto detallado en la capacidad auditiva sigue siendo desconocido. El protocolo presentado en el estudio actual permite la investigación de la morfología y la función en las sinapsis de cinta coclear dentro de una región de frecuencia específica. Por lo tanto, este protocolo se puede utilizar para investigar la sinaptopatía coclear, sus mecanismos subyacentes y la eficacia de posibles intervenciones terapéuticas en varios modelos animales experimentales.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81770997, 81771016, 81830030); el proyecto de financiación conjunta de beijing Natural Science Foundation y Beijing Education Committee (KZ201810025040); la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing (7174291); y la Fundación de Ciencia Postdoctoral de China (2016M601067).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine hydrochloride Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China H35020148 100 mg/kg
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA X-1251 10 mg/kg
TDT physiology apparatus Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
SigGen/BioSig software Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA Auditory Physiology System III
Electric Pad Pet Fun 11072931136
Dumont forceps 3# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0203-3-PO
Dumont forceps 5# Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canada 0209-5-PO
Stereo dissection microscope Nikon Corp., Tokyo, Japan SMZ1270
Goat serum ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9021
Anti-glutamate receptor 2, extracellular, clone 6C4 Millipore Corp., Billerica, MA, USA MAB397 mouse 
Purified Mouse Anti-CtBP2 BD Biosciences, Billerica, MA, USA 612044 mouse 
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG1antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21124 goat
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG2a antibody Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA A21131 goat
Mounting medium containing DAPI ZSGB-BIO, Beijing,China ZLI-9557
Confocal fluorescent microscopy Leica Microsystems, Wetzlar, Germany TCS SP8 II
Image Pro Plus software Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA version 6.0
Professional diagnostic pocket otoscope Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai,China HS-OT10
Needle electrode Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an,China 1029 20 mm, 28 G
Closed-field speaker Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA CF1

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References

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