Fucosylated insan süt Trisaccharides genetik olarak kullanarak Biyoteknolojik bağlamda analizini biyosensörler kodlanmış

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Burada yüksek üretilen iş algılama ve fucosylated insan sütü oligosakkaritler (HMOs), tüm hücreli Biyoalgılayıcı kullanarak miktar açıklayın. Biz de burada, bu platform HMO üretim suşları, analizini doğru uyarlaması gürültü oranı sinyal geliştirmeye odaklanan göstermek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) bebek sağlığı üzerinde bol yararları sorun oluşturan kompleks karbonhidrat bileşenleri insan anne sütü vardır. Ancak, onların Biyoteknolojik sentez duruma getirilmesi nispeten düşük akış verimi, algılama ve miktar yaşam ve bağlantıları sınırlıdır. Glycan analiz geleneksel teknikleri ile geçerek örnekleri otomasyon olmadan günde yüzlerce sırasına Kromatografik/kütle-spektrometrik yöntemleri içerir. Biz burada, yüksek işlem hacmi, bağlantı özel algılama ve miktar fucosylated HMO yapıları, 2'-fucosyllactose ve 3-fucosyllactose, biz Contegra yoluyla elde için genetik olarak kodlanmış bir bakteriyel Biyoalgılayıcı göstermek fucosidases ifadesidir. Laktoz süt veya Biyoteknolojik süreçler varlığı için yanlış pozitif neden olabilir gibi aynı zamanda farklı stratejiler kullanarak laktoz sinyal azalma göstermektedir. Bu teknik en yüksek üretimi nedeniyle, birçok reaksiyon koşulları veya biyoreaktör parametrelerini paralel HMO üretim optimizasyonu için izin saatlik bir konuda denetlesinler.

Introduction

İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) genellikle 3-8 şeker monomerleri oluşan oligosakkaritler, laktoz kaynaklı vardır. Onlar bir Laktoz (Gal-β1, 4-Glc) sona azaltmak ve daha fazla glycosidic bağlantılarıyla uzamıştır (β-1,3 - veya β-1,6-) (Glc) glikoz, galaktoz (Gal) veya N-peptidoglikan (GlcNAc). Buna ek olarak, fucose (Fuc, α-1, 2 veya α 1,3-) veya sialik asit (SIA veya NeuAc, α-2, 3 veya α 2,6-) artıkları kez1eklendi.

Geçerli analiz oligosakkaritler ve diğer karbonhidratlar Kromatografik/kütle spektrometrik (MS) teknolojisi2,3,4,5, için ihtiyaç ile üretilen iş ve kapsam içinde sınırlıdır 6 , hangi-ebilmek almak kabaca 7, pahalı donanımları, özel sütun ve saptırma ajanlar ve uzmanlık Bu ekipman8operasyonunda bahsetmiyorum örnek başına bir saat. Oligosakkarit bağlantıları gerektiren Gelişmiş MS9,10 ya da Nükleer manyetik rezonans (NMR) teknikleri11belirlemek, özellikle zordur. Bu oligosakkaritler sentezi hızlı optimizasyonu böylece bu yavaş analitik adım işlem hacmi ile sınırlıdır.

Bu çalışmada, biz fucosylated trisaccharide tespiti bağlantı özgü göstermek laktoz tabanlı HMOs 2'-insan sütte en bol HMO olan fucosyllactose (2'-FL) odaklanan, genetik olarak kodlanmış kullanarak Escherichia coli tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı bir sınırı olan 4 mg/l, algılama Bu Biyoalgılayıcı önemli bir özelliği isomeric trisaccharides arasında ayırt etmek için onun yetenek var. Tasarım prensibi varlığı hangi sırayla bir floresan sinyali üretir lac operon tarafından algılanır laktoz HMOs, üzerinden kurtarmak belirli fucosidases E. coli olarak ifade temel alır. Biz bunu bir bağlantı özgü fucosidase ve diğer bir floresan muhabir protein barındıran bir iki-plazmid sistemi kurarak başarmak. Bu Biyoalgılayıcı platform yüksek üretilen iş tarama Akış Sitometresi veya mikro-plaka okuyucu için uygundur. Biz de 2'-FL bir mühendislik zorlanma12tarafından üretilen miktarının içinde Biyoalgılayıcı kullanımını göstermektedir. Verilen bu mühendislik yapımcı zorlanma laktoz üzerinde yetiştirilen bu çalışma içinde biz da üç stratejileri Biyoalgılayıcı yanlış olumlu sinyal sonuçlanabilir laktoz seçici kaldırılması üzerinde mevcut.

Birlikte ele alındığında, genetik olarak kodlanmış biyosensörler algılamak ve HMOs bile zor bir bağlantı özgü şekilde ölçmek için bize izin Kromatografik, MS veya NMR teknikleri. Onun yüksek işlem hacmi ve kullanım kolaylığı nedeniyle, bu yöntem yaygın uygulamalar metabolik Mühendisliği ve HMOs sentezi olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre kültür ve indüksiyon koşulları

Not: aşağıdaki deneyler üç suşlar kullanılır: E. coli BL21 (DE3) boş bir vektör, E. coli BL21 ile (DE3) plazmid pAfcA14 ve pET28:green floresan protein (GFP) ve E. coli BL21 ile (DE3) Plasmid'ler ile pAfcB14 ve pET28:GFP. Tüm suşların Luria-Bertani suyu (LB) veya en az medya uygun antibiyotikler ile yetiştirilen. 1000 x sefaloridin (50 mg/mL) ve carbenicillin (100 mg/mL) hisse senedi çözümleri deiyonize (DI) su hazırlamak.

  1. Medyası hazırlama
    1. LB medya LB toz stokunun 25 g 1 litre DI su ekleyerek hazırlayın. Otoklav sterilize etmek 20 dk için 121 ° C'de çözüm. Steril LB ortam sıcaklığı her 1 mL LB medya için antibiyotik stokunun 1 µL eklenmesi önce 60 ° C'den tamamlanana kadar bekleyin.
    2. LB tabak hazırlamak önce sterilizasyon LB basına 15 g agar ekleyin. Steril LB agar sıcaklık antibiyotik eklenmesi önce 60 ° C'den tamamlanana kadar bekleyin.
    3. 1.1.3 biosensing hücreler için medya veya ikili antibiyotik, sefaloridin ve carbenicillin ile plakalar hazırlayın.
  2. Karbonhidrat indükleyicileri
    1. Karbonhidrat indükleyicileri 20 g/L laktoz molar eşdeğerleri, hisse senedi çözümler hazırlamak: 29 g/L 2'-FL ve 3-FL
      Not: Her 200 µL hücre 2'-FL veya 3-FL 20 µL gerektirecektir
    2. Hücreleri 200 µL 2.0 g/M son 2'-FL/3-FL Incubate 37 ° C'de sürekli sallayarak ile laktoz veya 2.9 g/L son konsantrasyonu konsantrasyonu ile neden ve bir gecede büyümek kültürler izin.
  3. Hücre kültürü
    1. Bir gün önce deney tohum LB orta sefaloridin ve taze bir bakteriyel colony, steril tekniği kullanarak üzerinden carbenicillin ile takıma 5 mL.
    2. Tüm kültürler ajitasyon ile 37 ° C'de kuluçkaya ve kültürleri bir gecede büyümek.
    3. Gecede kültür 50 µL 5 mL taze LB/M9 medya sefaloridin ve carbenicillin de içine aktarın. 37 ° C'de sürekli sallayarak ile kuluçkaya ve kültür 600 optik yoğunluk ulaşmıştır kadar büyümek nm (OD600) 0.5-0.7. Bu orta günlük aşamada hücreleri bağlı olmak.

2. Floresans ve algılama sınırlarının ölçümü

  1. Akış Sitometresi hücreleri hazırlanması
    1. Gecede kültür 1,5 mL tüpler ve 1 dk. için 12.500 x g , santrifüj aktarın.
    2. Süpernatant atmak ve Pelet 500 µL 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1.8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl DI su, pH 7.2) bir tek hücre süspansiyon hazırlamak ve tek hücre aktarmak için yeniden askıya yılında süspansiyon 5 mL Akış Sitometresi tüpler için.
    3. Hücreleri üzerinde bir Akış Sitometresi örnekleri çalışan kadar 4 ° C'de karanlıkta bırakın. En iyi sonuçlar için en kısa zamanda hücreleri analiz.
    4. GFP heyecanlandırmak için 488 nm lazer seçin. Floresein isothiocyanate (FITC) floresan düzeyleri (20,000-40,000 olaylar, ön ve yan dağılım için toplanan hücre ve enkaz önlemek geçişli) 525/50 nm bant filtre ile toplamak.
  2. Biyoalgılayıcı ayarlama
    1. Bir kalibrasyon eğrisi yapmak, 8-10 dilutions Standart 2'-FL aralığı 0 – 2.500 mg yapmak/L.
    2. (PAfcA ve pET28:GFP içeren) 2'-FL biosensing hücreler kültür ve onları daha önce 1.3 bölümünde açıklandığı gibi standart dilutions ile teşvik. Her seyreltme için üç biyolojik çoğaltır yerine getirir.

3. algılama ve miktar 2'-FL bir yapımcı yük içinde

  1. Ekimi yapımcı baskı
    1. En az medya yapmak için 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, sodyum sitrat ve 1 M tiamin ayrı çözümler hazırlamak-HCl. Sterilize 0,22 µm filtre kullanarak çözümler. M9 medya suyu tozu 1 litre DI su ile karıştırın. Otoklav 121 ° C'de 15 dakika süreyle M9 çözüm çözüm 50 ° c kadar serin MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, sodyum sitrat ve tiamin son konsantrasyonları 2 mM, 0.1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L ve 7,5 µg/L, sırasıyla ekleyin.
    2. 2'-zorlanma, örneğin, JM109 gwBC-F2, 5 ml LB medya üreten ve gecede 37 ° C'de Baumgartner vd.12' açıklandığı gibi büyümesine izin FL kültürünü başlatın.
    3. Alt kültür adım 1.3.3 250 mL 3.1.1. adımda hazırlanan en az medya daha önce açıklandığı gibi % 1. Gliserol 10 g/L son bir konsantrasyon ekleyin ve 37 ° C'de kültür kuluçkaya
    4. Kültür 0.5-0.7 OD600 ulaştığında, 0,5 mM ve laktoz 2 g/L. son bir konsantrasyon için son bir konsantrasyon izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) eklemek
    5. 37 ° C'de sürekli sallayarak ile kuluçkaya ve kültürler için 24 h büyümeye izin.
  2. 2'-FL çıkarımı
    1. Gecede kültür steril 50 mL tüpler ve 15 dakika 900 x g , santrifüj aktarın.
    2. 3.2.2 süpernatant atın ve Pelet DI su yeniden askıya alma. Yıkama adım kalan laktoz kaldırmak ve sonunda 5 mL DI su yeniden askıya almak için üç kez tekrarlayın.
    3. Hücre süspansiyon koşullar için 30 s darbeleri % 30 güçte bir sonicator kullanın. Buzda hücreler her zaman tutmak.
    4. Lysed hücreler için 2.000 x gde 25 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak, steril geçmek (örneğin, 0,22 µm) filtre ve analiz kadar 4 ° C'de saklayın.
  3. Miktar ile Biyoalgılayıcı
    1. 2'-FL biosensing hücre ve orta log fazı, bir kültürü aşılamak, hücre lysate eşdeğer tahmini 2'-FL kalibrasyon eğrisi 2.2 bölümünde açıklandığı gibi yapmak için kullanılan konsantrasyonları ile ikna etmek. Kalibrasyon çözümlenmesi için örnek olarak aynı ortamında gerçekleştirmek (örneğin, lysate hücre) dilutions 2'-FL denetimine ekleyerek (yani, Sigara-yapımcı) filtre uygulanan hücre Biyoalgılayıcı hücreleri inducing daha önce lysate.
    2. Örnekleri üzerinde bir Akış Sitometresi çalıştırın. Bir doz-yanıt eğrisi Floresans çıkış oligosakkarit konsantrasyon karşı komplo tarafından oluşturmak. Standartları yanıt hücreye lysate karşılaştırın.

4. seçici laktoz kaldırılması

Not: Biosensing hücreleri için laktoz duyarlıdır ve HMOs üzerinde laktoz seçmeli olarak algılamaya Biyoalgılayıcı için arzu edilir. Bir strateji çamaşır hücre 3.2 bölümünde anlatıldığı gibi yer alıyor. Üç diğer stratejileri aşağıda açıklanmıştır.

  1. Ticari saf β-galaktozidaz ile tedavi
    1. Liyofilize β-galaktozidaz 1000 (FCC laktaz) adet/ml, 1 mm MgCl2 dağıtılması veya ticari β-galaktozidaz çözüm kullanın.
    2. Gerekli enzim optimum konsantrasyonu belirlemek için bir inoculum 2'-FL biosensing hücrelerinin büyümesine ve 2 g/L laktoz ve 2.9 g / L 2' ile teşvik-orta log fazı Utirmek.
    3. 100 µL kültürleri, β-galaktozidaz, en fazla 12 adet, değişken miktarda eklemek ve 37 ° C'de sürekli sallayarak ile bir gecede büyümek kültürler.
    4. Floresans 2.1 bölümünde açıklandığı gibi ölçmek ve en az enzim konsantrasyon belirlenerek sinyal istenilen zayıflama sağlanması için gerekli enzim optimum birimleri hesaplamak.
    5. 24 h için yetiştirilen 2'-FL üreten hücrelere β-galaktozidaz optimum birimleri ekleyin ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya 3.3 bölümünde açıklandığı gibi 2'-FL titresi belirlemek için iletişim kuralı ile devam edin.
  2. LacZ + zorlanma ile ön arıtma
    1. Bir 25 mL kültür 2'-FL üreten baskı ve orta log fazı indüklenen bir kez başlatmak, 24 h 37 ° C'de kültür kuluçkaya.
    2. Bir E. coli BL21 aşılamak LB, kültürde (DE3) orta log fazı 37 ° C'de büyümeye ve kültür (2:1) 50 mL 24 h kültür ekleyin.
    3. 37 ° C'de 3 h. devam et için 3,3 bölümünde açıklandığı gibi 2'-FL titresi belirlemek için iletişim kuralı ile kuluçkaya.
  3. Etanol ile laktoz Yağış
    Not: Bu bölümde Matsuki vd.12' den uyarlanmıştır.
    1. Bir 25 mL kültür 2'-FL üreten baskı ve orta log fazı indüklenen bir kez başlatmak, 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. % 100 etanol kültürüne, iki cilt Iyice çalkalayınız ve 4 h için 37 ° C'de kuluçkaya ekleyin.
    3. Süspansiyon 900 x g 15 dk. toplamak için de süpernatant santrifüj kapasitesi ve gecede 4 ° C, hangi laktoz precipitates kuluçkaya.
    4. Çöktürülmüş laktoz filtre kağıdı (11 µm) ile çözüme geçirerek kaldırın. Hücre 2'-hangi ile aşağıdaki bölüm 3.3 sayısal FL, içeren lysate filtrate toplamak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Biz tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı 2'-oligosakkarit Biyoteknolojik üretimi ile birlikte kullanılan FL için özel tasarlanmış. Bu terminal şekerler laktoz üreten değiştirmenin belirli enzimatik bölünme üzerinde dayanır ve böylece proportion için ifade bir Laktoz indüklenebilir organizatörü altında bir muhabir floresan proteinin önde gelen lac operon aktivasyonu 2'-FL miktarı Onun bağlantı özgüllük, 3-fucosyllactose (3-FL), bir izomer göstermek için de test edildi. Genetik devre iki bölüm içerir: bir fucosidase gen, afcA veya afcBkurucu ifade kaynaklanan bir bünye organizatörü tarafından tahrik, klonlanmış bir vektör ile kodlanmış pelB sinyal dizisi için ters yönde fucosidase gen periplasmic verme, aynı zamanda GFP ifade sürüş T7 organizatörü içeren bir floresan muhabir sistem kolaylaştırmak. İlk bölümü plazmid pAfcA ve plazmid pET28:GFP ikinci muhabir sisteminde ifade edilir. Son yapı E. coli BL21 dönüştü (DE3), yaygın olarak kullanılan bir gerginlik, genom laktoz duyarlı pLacUV5 düzenleyicinin kontrolü altında entegre T7 RNA polimeraz vardır. Okuyucu Biyoalgılayıcı çalışma prensibi takip edebilirsiniz böylece şekil 1A şematik tasarım gösterir. Şekil 1B floresan sinyal indüksiyon farklı koşullar altında bir Akış Sitometresi analiz gibi biri. Floresan 100-fold bir artış üzerinde bizim hipotez ile tutarlı sadece vektör denetimine göre 2'-FL Biyoalgılayıcı veya Biyoalgılayıcı için 3-fl ile gözlenmiştir Bu Biyoalgılayıcı yüksek bağlantı özgüllük gösterir. Sinyal gerçekten defucosylation nedeniyle olduğundan emin olmak için bir kontrol çubukları sağ tarafından gösterildiği gibi doğruladı indüksiyon sırasında kültür için ticari α-1,2-fucosidase ekleyerek ettik. Testin duyarlılığı karbonhidrat düzeyleri (şekil 2A) değişen bir doz-yanıt eğrisi oluşturuluyor tarafından belirlenebilir. Komplo, doğrusal dinamik 2'-FL algılama arasında 40 ve 400 mg/L ve algılama sınırı 4 mg/l Bu tahlil bir iş günü boyunca muhabir ifade (şekil 2B) dinamikleri anlık ölçümler tarafından gösterildiği gibi yapılabilir.

Son olarak, biz nasıl biosensing hücreleri tespit ve 2'-FL bir mühendislik 2'-FL yapımcı zorlanma ölçmek için kullanılabilir mevcut. Bu zorlanma bir substrat laktoz kullandığından, sinyal okuma doğrudan 2'-FL konsantrasyonu (şekil 3A) karşılık gelen böylece sinyal eksojen laktoz azaltmak için stratejiler geliştirdik. Enzimatik aşağılamak değil hareket etmez bir β-galaktozidaz kullanarak değiştirilmiş laktoz laktoz bir stratejidir. Bu laktoz laktoz sinyal orijinal (3B rakam) veya bir LacZ + yük, vahşi tipli BL21 ile kuluçka üzerinden % 20 azaltılması, tercihen davranır ticari β-galaktozidaz kullanma elde edilebilir (DE3), üç saat içinde damla laktoz arka plan düzeylerine (şekil 3 c) sinyal. Son strateji sadece seçmeli olarak laktoz precipitates ama aynı zamanda yapımcı hücreleri, hücre lizis gerekli adım aşağı akım (3D şekil) olmak lyses etanol kullanır. Bu basit ayıklama işlemi, ancak 2'-FL, muhtemelen kayıp nedeniyle 2'-FL bazı kristalleşme diğer yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha düşük kurtarma nedeniyle dikkat edilmelidir Son etanol konsantrasyonları düşük olduğundan etanol ek rağmen biz önemli biosensing hücrelerinin büyük olasılıkla büyüme inhibisyonu gözlemleme (< % 2, v/v) kültürler. Son olarak, biz göstermek en etkili ama zaman alıcı yöntemi cips ve hücreleri hücre lizis hücre içi 2'-FL (şekil 3E) serbest bırakmak için önce yıkayın etmektir. Verimliliği ve zaman ve reaktifler kullanılabilirliğini temel laktoz kaldırma için uygun olan yöntemi seçmek için sağduyulu okuyucu tavsiye ediyoruz.

Şekil 3E aynı zamanda güvenilir bir şekilde 2'-FL Biyoteknolojik bağlamda ölçmek yeteneğimizi gösterir. Biz de bir mühendislik 2'-FL-üreten zorlanma kültürlü11 ya da mutant (negatif kontrol) ile 2'-FL hücre lysate üretimini izlemek için laktoz negatif bir fucosyltransferase. Hücre kültürü çalışmalarının sonra hem Biyoalgılayıcı hem de yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) kullanarak doğrulama için (ek şekil 1) konsantrasyonu ölçülür. Yapımcı lysate ve kontrol lysate 2'-FL ile çivili için doz yanıt eğrileri çok hangi 2'-FL hücre lysate bağlamında nicel ölçüm gösterir benzer.

Figure 1
Şekil 1: 2'-FL Biyoalgılayıcı tasarım ve temsilcisi veri şematik. (A)2'-Fucosyllactose (2'-FL) bakteriyel periplasm girer ve laktoz için tarafından heterologously ifade fucosidase dönüştürülür. Laktoz sonra sitoplazmaya taşınır ve allolactose için dönüştürülür. Bu E. coli BL21 yerli LacUV5 organizatörü etkinleştirir (DE3), floresan protein ifade için önde gelen T7 organizatörü altında GFP transkripsiyonun T7 RNAP üreten. 2'-FL (B) tespiti ve pET28:GFP ve pAfcA (yeşil), pAfcB (macenta) veya bir boş vektör kontrolü (mavi) içeren 3-FL hücreleri indüklenen gecede yok şeker, 2'-FL, 2'-FL exogenously eklenen α-1,2-fucosidase, 3-FL veya laktoz. Tüm veriler ortalama üç biyolojik çoğaltır her nüsha, nerede hata çubukları standart sapma ortalamasını temsil analiz vardır. İstatistiksel anlamlılık Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi ile kararlı ve ** p < 0,01 göstergesidir.  Bu rakam ilk Enam ve Mansell14 ' te ortaya çıktı ve izni ile yeniden kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Biyoalgılayıcı 2'-FL algılama için karakterizasyonu. (A)biyosensörler algılama ve transfer fonksiyonların sınırları. Yanıt eğrileri heykelde ortalama Floresans pAfcA/2 için ' FL (Yeşil Daire) veya boş denetim vektörünü 2'-FL kültürlü değişen miktarlarda (mavi elmas). (B) zaman ders muhabir ifade. Soy pAfcA 2'-FL ile (yeşil kare) inkübe ve floresan 8 h indüksiyon üzerinden izlenir. Laktoz ile inkübe zorlanma pAfcA bir denetim olarak dahil edilir. Tüm veriler ortalama üç biyolojik çoğaltır her nüsha, nerede hata çubukları standart sapma ortalamasını temsil analiz vardır. Bu rakam ilk Enam ve Mansell14 ' te ortaya çıktı ve izni ile yeniden kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: algılama ve miktar 2'-FL yapımcı zorlanma. (A)iş akışı Biyoalgılayıcı kalan laktoz gürültü kaldırma anahtar odak ile basit bir protokol olarak kullanımını gösteren. (B) laktoz β-galaktozidaz Enzimatik sindirim tarafından kaldırılması. %0,3 2'-FL (yeşil kare) veya % 0,2 laktoz (mavi daire) içeren kültürlerin değişen miktarlarda içeren eksojen β-galaktozidaz indüksiyon zaman Floresans gecede kuluçka sonra için denetlesinler Biyoalgılayıcı kültürleri ile inkübe. (C) laktoz kuluçka vahşi tipli LacZ + zorlanma ile tarafından kaldırılması. %0,3 2'-FL (Yeşil Daire), % 0,2 laktoz (mavi kare) veya 1:1 karışımı (% 0,2 laktoz eşdeğer, yani, % 0,1 laktoz + %0,15 2'-FL, pembe üçgen) içeren LB inkübe için çeşitli zamanlarda BL21 ile (DE3) hücreleri ve sonra Biyoalgılayıcı kültürleri için eklendi Floresans ölçüm gecede kuluçka sonra. (D) yağış, laktoz ve hücre lizis etanol Önarıtma tarafından. Fermentations JM109 gwBC-F2 (kırmızı daire) veya JM109 gwBC (mavi üçgen) hücrelerin etanol 2 cilt ile inkübe ve kuluçka floresan Biyoalgılayıcı hücrelerle önce filtre ve floresan tedavi edilmezse JM109 gwBC-F2 kültür () üzerinden ile karşılaştırıldığında Yeşil kare). (E) miktar 2'-FL hücreye lysate. Biyoalgılayıcı 2'-FL metabolik olarak mühendislik yapımcı zorlanma tespit etmek onun yetenek değerlendirilmiştir. Buna ek olarak her iki ham lysate JM109 gwBC-F2 (kırmızı daire, 2'-FL LC-MS tarafından quantified olarak), 2'-FL nonproducer gerilme JM109 gwBC hücre lysate (yeşil kare) tanımlanan miktarda veya ham JM109 gwBC suşu (mavi lysate tarafından oluşturulan Floresans ölçümleri elmas). Sonuçları HPLC miktar 2'-FL yapımcı baskı içinde tarafından doğrulanmış. Tüm veriler ortalama her analiz nerede dikey hata çubukları temsil standart sapma ortalama Floresans ve yatay hata çubukları temsil eden standart sapma 2'-FL içinde HPLC tarafından ölçülen nüsha içinde üç biyolojik çoğaltır vardır triplicates. Bu rakam ilk Enam ve Mansell14 ' te ortaya çıktı ve izni ile yeniden kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 1: 2'-FL HPLC-MS analizi (A)çıkarılan 2'-FL (m/z 511) iyon chromatograms. Kromatografik ticari bir standart üst köþesinde gösterilir. Kromatografik 2'-FL JM109gwBC-F2 zorlanma (10 kat seyreltme) alt kısmında gösterilir. 511 m/z sodyum adduct tepedir. (B) ticari standart (üst) ve yapımcı zorlanma (alt) 2'-FL için büyütülmüş kütle spektrumu m/z 300−800, en bol sinyalleri konsantre neredeydin üzerinden gösterilir. (C) A standart eğri LC-MS analizi ticari 2'-FL düzeyleri değişen tarafından oluşturuldu Hata çubukları standart sapmalar onaylatılacak ölçümleri temsil. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz insan sütü oligosakkaritler yüksek üretilen iş stratejisi fucosylated bağlantı özgü tespiti için mevcut. Bu genetik olarak E. coli , indüksiyon belirli glukanlardir ile floresan bir sinyal ile yanıt mühendislik tarafından tüm cep telefonu biyosensörler yapı tarafından gerçekleştirilmiştir. İletişim kuralı da nasıl Biyoalgılayıcı algılamak ve metabolik olarak tasarlanmış bir bakteriyel yük HMOs ölçmek için kullanılabilir Tarih ayrıntıları.

Bizim iletişim kuralı ek olarak kendi bağlantı özgüllük onun yüksek işlem hacmi nedeniyle alternatif yöntemler üzerinde avantajları Kromatografik/MS yöntemlerine göre sunmaktadır. Algılama ve geniş dinamik alan düşük limitli HMOs doğrudan ölçüm için sağlar.

Bu protokol kritik adımlar yapımcı suşların lysate hücre hazırlanmasında oluşur. 2'-FL maksimum titresi sağlamak için en uygun koşulları sağlamak önemlidir. Variabilities gruplar halinde sonication parametreleri veya indüksiyon kez nedeniyle ortaya çıkabilir. Biyoalgılayıcı karakterizasyonu sırasında özen gösterilmelidir. Ayrıca denemeye tutarlı sonuçlar sağlamak için tüm adımları için uygun denetimleri çalıştırmak için tavsiye edilir.

Bir bizim protokol laktoz laktoz doğal olarak mevcut, anne sütü olduğu gibi bir performans sorunu olur ya da belgili tanımlık substrate HMOs Biyoteknolojik üretiminde kullanılan indüksiyon için üzerindeki güven kısıtlamasıdır. Bu Biyoalgılayıcı seçerek HMOs üzerinde laktoz algılaması için sinyal gürültü oranı kaldırmak için dört farklı stratejilerle ele sahip.

Fazla reaksiyon koşulları veya biyoreaktör parametreleri paralel birkaç saat içinde denetlesinler gibi burada sunulan genetik olarak kodlanmış bütün hücreli Biyoalgılayıcı duruma getirilmesi üretimi için HMOs, izin verir. 96 - veya 384-da tabak içinde gerçekleştirildiğinde, yöntem ekran binlerce günlük örnekleri için potansiyel gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Iowa State Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir. Fe kısmen NSF Trinect Bursu ve Manley Hoppe profesörlük tarafından finanse edildi. T.J.M. kısmen Karen ve Denny Vaughn öğretim bursu tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Floresans ve LC-MS çalışmaları ile Iowa State Üniversitesi Akış Sitometresi tesis ve incelemelerinden Keck Metabolomics araştırma laboratuvarı yardım için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics