قياس الاستقرار الانزيمية بالقياس متحاور المعايرة

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

ويقاس الثبات الحراري لنشاط إنزيم سهولة بمعايرة متحاور القياس (ITC). معظم فحوصات الاستقرار البروتين المستخدمة في قياس البروتين التي تتكشف حاليا، ولكن لا توفر معلومات حول النشاط الأنزيمي. مركز التجارة الدولية يتيح التصميم مباشرة أثر التعديلات الإنزيم على الاستقرار نشاط الإنزيم.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chan, W. K., Mason, M., Hansen, L. D., Kenealey, J. D. Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry. J. Vis. Exp. (145), e59302, doi:10.3791/59302 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويوضح هذا العمل أسلوب جديد لقياس استقرار نشاط إنزيم بمعايرة متحاور القياس (مركز التجارة الدولية). ذروة الحرارة المعدل الملاحظ بعد حقنه واحدة من الحل الركيزة في حل إنزيم يرتبط بنشاط إنزيم. إظهار حقنات متعددة من الركازة إلى نفس الحل الإنزيم مع مرور الوقت الخسارة في نشاط إنزيم. المقايسة المتمتعة بالحكم الذاتي، التي تتطلب القليل جداً من وقت الموظفين، وهو ينطبق على معظم وسائل الإعلام والأنزيمات.

Introduction

الإنزيمات بروتينات قادرة على حفز مجموعة واسعة من التفاعلات العضوية. معظم الإنزيمات الدالة في محلول مائي في القرب من الأس الهيدروجيني محايدة وبالتالي تجنب استخدام المذيبات قاسية. وبسبب هذه الانتقائية العالية، إنتاج إنزيم حفزت ردود الفعل أقل (في بعض الحالات لا تركات) تركات من محفزات غير انتقائية مثل الأحماض والقواعد1. وهذا مهم خصوصا في تصنيع الأغذية ويجب أن يتم فيها جميع التفاعلات الكيميائية حتى المنتج النهائي آمنة للاستهلاك البشري. حاليا، والأنزيمات تستخدم لإنتاج ارتفاع سكر الفواكه عصير الذرة2والجبن3، البيرة4، الحليب الخالي من اللاكتوز5، وغيرها من المنتجات الغذائية الهامة. بينما تركز هذه الورقة على استخدام إنزيم في صناعة المواد الغذائية، وهناك العديد من الاستخدامات الأخرى للإنزيمات بما في ذلك في توليف المخدرات والكيمياء الخضراء.

الأداة المساعدة للإنزيمات محدود باستقرار نشاط الإنزيم، الذي يعتمد على الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد للانزيم. يمكن أن تستقر بنية الإنزيم التعديلات مثل بيجيليشن6، والتثبيت على دعم قوي7والتعديلات الوراثية8والصياغات. حاليا استقرار الإنزيم يقاس عادة بالقياس المسح التفاضلي (DSC)، ونشاط إنزيم نقطة النهاية فحوصات9. DSC يقيس درجة الحرارة التي تتكشف إنزيم؛ ارتفاع درجة الحرارة، الأكثر استقرارا في الهيكل. ومع ذلك، غالباً ما يحدث فقدان النشاط عند درجة حرارة أقل مما هو مطلوب تتكشف إنزيم أو المجالات داخل الإنزيم10. ولذلك، DSC ليس كافياً لتحديد ما إذا كان تعديل إنزيم يزيد من استقرار نشاط إنزيم. فحوصات إنزيم نقطة النهاية هي عادة الوقت مكثفة، وتتطلب عينات متعددة، وغالباً ما تنطوي على رد فعل اللونية إلى جانب أن هذا لا ينطبق على الحلول عالية الملونة أو مبهمة أو تعليق.

يوضح هذا العمل وسيلة لقياس مباشر لاستقرار نشاط إنزيم بمعايرة متحاور القياس (مركز التجارة الدولية). مركز التجارة الدولية يقيس معدل الحرارة الإفراج أو استيعابها وأثناء رد فعل. منذ ما يقرب من جميع ردود الفعل إنتاج أو امتصاص الحرارة، يمكن استخدام المركز لمعظم الإنزيم حفزت ردود الفعل، بما في ذلك ردود الفعل التي لا يكون لها رد فعل يزوج أو تحدث في وسائل الإعلام مبهمة مثل الحليب. مركز التجارة الدولية وقد استخدمت لعقود عديدة لقياس البارامترات الحركية الكيميائية لأنواع كثيرة من ردود الفعل، ولكن البروتوكول المعروضة هنا يركز على استخدام المركز لقياس معدل الحرارة الذروة لحفز إنزيم ردود الفعل ويدل على أن نشاط إنزيم خطيا يرتبط بمعدل الحرارة القصوى. مركز التجارة الدولية إجراء قياسات لمعدلات الحرارة القصوى هي في معظمها المتمتعة بالحكم الذاتي وتتطلب القليل جداً من وقت الموظفين لإعداد وتحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد العينات

  1. 1,000 مل مخزن خلات الصوديوم 0.1 M في الأس الهيدروجيني 4.6
    1. قياس 800 مل ماء المقطر في كوب 1,000 مل تخرج.
    2. وزن ز 8.2 من خلات الصوديوم اللامائية وإضافته إلى الكأس.
    3. ضع في الكأس على طبق من إثارة ووضع قضيب إثارة في الكأس، تشغيل لوحة ضجة ويحرك حتى يذوب تماما.
    4. خلات الصوديوم لا مائي عندما يذوب تماما، وقياس درجة حموضة الحل مع مقياس الأس الهيدروجيني معايرة.
    5. أضف 1 M HCl أو هيدروكسيد الصوديوم تبعاً لذلك للحصول على درجة الحموضة المطلوبة 4.6.
    6. أضف الماء المقطر حتى يصل إجمالي حجم مل 1,000.
    7. تخزين في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
  2. حل الإنزيم
    1. إعداد 10 مل اسطوانة الحل داخل نطاق 10-30 ملغ/مل من أول مل 8 قياس من 0.1 متر صوديوم اسيتات المخزن المؤقت pH 4.6 في 15 مل تخرج إنزيم.
    2. إضافة حل المخزن المؤقت إلى أنبوب مخروطي 15 مل مع الإنزيم واهتز بشدة حتى الإنزيم قد حلت.
    3. إضافة المزيد المخزن المؤقت الحل حتى يصل إجمالي حجم 10 مل.
    4. تخزين محلول الإنزيم عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. الحل الركيزة
    1. إعداد حلاً الركيزة في نطاق 300-600 مم، حساب كمية الركازة اللازمة في غرام لجعل التركيز المطلوب.
    2. تزن من الركازة ووضع في دورق زجاج 100 مل
    3. قياس 20 مل الحل المخزن المؤقت باستخدام اسطوانة 25 مل تخرج وثم إضافته إلى كوب الزجاج.
    4. ضع في الكأس على طبق من إثارة ووضع قضيب إثارة مغناطيسية في الكأس. تحويل الحرارة وضبط سرعة إثارة تبعاً لذلك.
    5. السماح بالتحريك للمتابعة حتى الركيزة قد حلت.
    6. صب الحل الركيزة في أنبوب 50 مل مخروطية وإضافة 0.1 م خلات الصوديوم المخزن المؤقت pH 4.6 حتى يصل إجمالي حجم 45 مل. مزيج من الهز.
    7. تخزين الحل الركيزة في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.

2-القيام بالتجربة

  1. إعداد الصك مركز التجارة الدولية
    1. تأكد من أن يتم تحميل الخلية المرجعية مع 350 ميليلتر من الماء المقطر. قبل تحميل الإنزيم إلى الخلية عينة، تحقق من أنه قد تم تنظيف الخلية عينة.
    2. تنظيف البروتوكول في ملء المحاقن التحميل مع 500 ميليلتر من محلول التنظيف 2% (جدول المواد)، بعناية إدراج الإبرة في الخلية عينة وتعبئة الخلية وإزالة السائل باستخدام نفس المحاقن ببطء. التصرف السائل في كوب. كرر هذه الخطوة مرتين مع محلول التنظيف 2% (جدول المواد)، ثلاث مرات مع الإيثانول 70% ويغسل عشر مرات بماء مقطر.
    3. ملء المحاقن التحميل مع 450 ميليلتر من حل الإنزيم، بعناية إدراج الإبرة وصولاً إلى الجزء السفلي من نموذج الخلية واضغط المكبس وصولاً إلى الخط 100 ميليلتر ببطء منع تكوين فقاعات الهواء.
    4. أغسل المحاقن معايرة 50 ميليلتر بالماء المقطر ثلاث مرات بوضع طرف الإبرة في الماء ثم تناول الماء في المحاقن ببطء، ثم الاستغناء عن المياه في حاوية نفايات.
    5. إزالة المياه المتبقية قبل الشطف بمحلول الركازة ثلاث مرات.
    6. ملء المحاقن المعايرة بمحلول الركازة برسم الحل الأعلى حتى يتم حقنه الكامل دون أي فقاعات الهواء.
    7. مع المحاقن لا يزال في الحل الركازة، إزالة المكبس والسماح لحوالي 2 ميليلتر من الجو إدخال الجزء العلوي من المحاقن وإعادة تركيبها المكبس.
    8. إزالة مقبض بريت لمركز التجارة الدولية، ووضع حقنه داخل المقبض بريت والمسمار حتى ضيق.
    9. مسح غيض محرض مع أنسجة خالية من الوبر، ثم بعناية وضع مقبض بريت في الصك المركز وقفله في المكان.

3-إعداد إيتكرون

  1. على جهاز الكمبيوتر، افتح إيتكرون ثم انقر فوق إعداد.
  2. انقر فوق معدل التحريك وتعيين إلى 350 دورة في الدقيقة. تحقق من حجم المحاقن (ميليلتر) والتأكد من أنها في 50 ميليلتر.
  3. ضبط درجة حرارة وضغط التحديث. من المستحسن أن يتم تنفيذ هذه الخطوة على الأقل 1 ساعة قبل إعداد مركز التجارة الدولية. وهذا ما يسمح الوقت الكافي للصك تسخين أو تبريد حسب الحاجة.
  4. لتجربة برنامج الإعداد، حدد المعايرة تزايدي.
  5. انقر فوق إدراج للإعداد الحقن. ضبط الفاصل الزمني الحقن إلى 5,400 s، حجم الحقن (ميليلتر) إلى 4 وعدد الحقن إلى 4. اضغط موافق لتأكيد الإعدادات.
  6. في خانة الموازنة، حدد حجته السيارات و الكبيرة المتوقع مع ارتفاع درجات الحرارة. (إذا كانت صغيرة ارتفاع درجات الحرارة المتوقعة، واحد يمكن تحديد الصغيرة تحت ارتفاع درجات الحرارة المتوقعة؛ ومع ذلك، وهذا سيزيد الوقت الموازنة).
  7. تعيين الأساس الأولية إلى 300 ثانية.
  8. لبدء التشغيل، انقر فوق الرمز الموجود بجانب معدل التحريك ابدأ وثم انقر فوق بدء تشغيل الذي يقع بجوار الرمز وجع.
  9. قم بحفظ الملف وتسمح هذه الوسيلة لتشغيل.

4-تحليل البيانات

  1. قم بفتح الملف في نانواناليزي. انقر فوق البيانات وتحديد أعمدة البيانات.
  2. حدد كافة البيانات ونسخ ثم لصق البيانات في Microsoft Excel.
  3. ضبط خط الأساس الصفري بإضافة القيمة المطلوبة 300 s لتجعل من الصفر. تطبيق هذا التصحيح على العمود بأكمله من قيم معدل الحرارة.
  4. البحث عن قيمة الحد الأدنى أو الحد الأقصى لمعدل الحرارة لكل الحقن باستخدام المعادلة: =MIN(cell:cell) أو MAX(cell:cell). كل نقطة بيانات يمثل ذروة النشاط الأنزيمي إنزيم في كل حقن.
  5. رسم الرسوم البيانية للقيم الأدنى أو الأقصى مقابل الوقت الذي حدث القيمة أثناء المعايرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج ممثلة في الشكل 1 و الشكل 5 إظهار البيانات من الإنزيمات اثنين، اللاكتاز وإينفيرتاسي. اللاكتاز و invertase تحفيز التحلل المائي ديساكهارايد إلى اثنين من السكريات الأحادية، اندوثيرميكالي واكسوثيرميكالي، على التوالي. تم تشغيل كل التفاعلات الانزيمية في التركيزات التي حالت دون تشبع الإنزيم.

وتظهر البيانات اللاكتاز كيف يمكن استخدام بيانات مركز التجارة الدولية لتقدير الاستقرار الإنزيم. حقن ميليلتر 4 أربعة متتابعة من اللاكتوز 600 مم (الشكل 1) كانت معاير في اللاكتاز 20 ملغ/مل. فاصل 5,400 s بين كل حقن تم تطبيقها، وهذا يتيح ما يكفي من الوقت للعودة إلى خط الأساس الأولى قبل كل حقن. وأجرى البروتوكول المذكورة أعلاه على 25 درجة مئوية و 35 درجة مئوية، 45 درجة مئوية و 55 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، اللاكتوز 600 مم كان معاير في المخزن خلات الصوديوم 100 ملم فقط في 55 درجة مئوية كعنصر تحكم للحرارة من الاختلاط. لكل حقن إنزيم في الركازة، هناك حرارة طارد أولية من الاختلاط، وبعد ذلك يحدث التحلل اللاكتاز حفزت ماص للحرارة من اللاكتوز حتى الانتهاء من رد فعل وأن معدل الحرارة يعود إلى خط الأساس. ثم تتكرر ضخ اللاكتوز في الحل اللاكتاز ثلاث مرات أكثر مع ارتفاع الذروة من رد فعل ماص للحرارة من كل الحقن اللاحقة أقل قليلاً من الحقن السابقة بسبب انخفاض النشاط الأنزيمي. ثم يمكن تحويل البيانات الخام إلى إظهار الحرارة القصوى بالنسبة للوقت (الشكل 2 أ). ذروة الذروة لكل حقن ثم يمكن أن يكون لائقاً لانحدار خطي والمنحدر يشير إلى استقرار الإنزيم في درجة الحرارة المختارة. الأكثر سلبية المنحدر، مستقرة أقل الإنزيم. كما هو متوقع، استقرار الإنزيم تتناقص مع ارتفاع درجة الحرارة (الشكل 2E).

كل الحقن هو موضح في الشكل 1 النتائج في تمييع اللاكتاز اللاكتوز. لإثبات أن هذا التخفيف ليس سبب الانخفاض في النشاط الأنزيمي، كما فعلت تحليل نشاط اللاكتاز المركز عند 25 درجة مئوية، تركيز اللاكتاز في الحقن الأول وفي حقن آخر (الشكل 3). تمييع هذه النتائج انخفاض 8% في نشاط إنزيم، بينما حقن الرابع في الفحص يظهر انخفاض 73 في المائة في النشاط. إضعاف اللاكتاز خلال التجربة حقن أربعة وبالتالي كان لها أثر صغيرة نسبيا (أي، 11%) في نشاط إنزيم. كانت الخسارة الفعلية للنشاط التالي 73-8 = 65%.

كما هو مذكور في إدخال واحدة من المزايا استخدام مركز التجارة الدولية أن ردود الفعل هذه يمكن أن يتم في وسائل الإعلام مبهمة، مثل الحليب. وللتدليل على هذه القدرة للمركز، تم حقن الحليب مباشرة في اللاكتاز (الشكل 4). نظراً لعدم تطابق الرقم الهيدروجيني للحليب إلى المخزن المؤقت خلات الصوديوم، وهناك حرارة الطاردة للحرارة كبيرة من خلط مباشرة بعد الحقن. ويعتبر الحرارة طارد لذروة خلط في عنصر التحكم الذي يفتقر إلى اللاكتاز (الشكل 4، الخط الرمادي) وحقن اثنين مع الحليب (الشكل 4، الأسود والخطوط المنقطة) عقب الحرارة من خلط الذروة. يحدث رد فعل ماص للحرارة يشير إلى نشاط اللاكتاز. الحليب يحتوي على خليط معقد من البروتينات والفيتامينات، والمعادن، واللاكتوز. بسبب الطابع المعقد للحليب، ومن المحتمل أن تحدث ردود أفعال أخرى أثناء رد فعلنا. للبرهنة على أن ذروة ماص للحرارة بسبب نشاط اللاكتاز، قد ارتفعت الحليب مع اللاكتوز 146 ملم. في رد فعل مع الحليب اللاكتوز ارتفعت (الشكل 4، السطر المنقط)، ذروة ماص للحرارة والمساحة تحت المنحنى أكبر من لبن وحدها (خطرقم 4، أسود)، مشيراً إلى أن ذروة ماص للحرارة في الواقع بسبب نشاط اللاكتاز. إزاحة الخط الأساسي يشير إلى أن رد فعل بطيء لا تزال بعد الانتهاء من رد فعل اللاكتوز.

لإظهار كيف يمكن استخدام هذا التحليل لمقارنة استقرار النشاط الأنزيمي لاثنين من الاستعدادات إنزيم مختلف، تتم مقارنة استقرار invertase الحرة و invertase المعطل تداولها في غشاء النايلون-6 نانوفيبير في الشكل 5 في 35 درجة مئوية11 . كما هو الحال في الفحص اللاكتاز، حقن ميليلتر 4 أربعة من السكروز وقدمت تسلسلياً ويحدد معدل الحرارة القصوى من الارتفاع الأقصى لكل حقن. كما هو موضح في الشكل 6، مرتفعات ذروة نقصان خطيا مع الوقت مما يشير إلى انخفاض نشاط إنزيم.

Figure 1
الشكل 1 : مركز التجارة الدولية بيانات آثار لنشاط اللاكتاز. يظهر كل تتبع حقن ميليلتر 4 أربعة متتابعة من 600 مم اللاكتوز في حل اللاكتاز في المخزن المؤقت للأس الهيدروجيني 4.6. الآثار أجريت في 55 درجة مئوية (أسود)، 45 درجة مئوية (رمادي داكن)، 35 درجة مئوية (متقطع)، 25 درجة مئوية (رمادي فاتح)، وعنصر تحكم إنزيم لا (منقط) عند 55 درجة مئوية. تمثل الخطوط المستقيمة تناسب إلى أدنى حد الذروة ماص للحرارة بعد كل حقن.  الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : استقرار نشاط إنزيم استناداً إلى معدل التغير في ذروة النشاط. ذروة النشاط الأنزيمي لكل من حقن أربعة بالنسبة للوقت (ق) في 25 درجة مئوية (A)، 35 درجة مئوية (ب)، 45 درجة مئوية (ج)، و 55 درجة مئوية (د). يتم تمثيل تناسب البيانات الخطية بخط متصل. يتم رسمها على منحدرات الخطوط المجهزة في أجزاء د ضد درجات الحرارة في هالرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تأثير إنزيم تمييع في ذروة الارتفاع في 25 درجة مئوية. يتم قياس نشاط اللاكتاز في تركيز الإنزيم في الحقن الأولى والرابعة من 20 ملغ/مل (أسود) و 18.62 ملغ/مل (رمادي)، على التوالي. اقحم أسرع نظراً لنشاط إنزيم الذروة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : قياس نشاط اللاكتاز في الحليب. مركز التجارة الدولية أثر لحقنه بيي كريميري الدهون الحليب مجاناً في المخزن المؤقت (رمادي) والحليب إلى 20 ملغ/مل اللاكتاز (أسود)، والحليب ارتفعت مع اللاكتوز إضافية 5% إلى 20 ملغ/مل (منقط). المحور ص متقطع لإظهار رد فعل إنزيم ماص للحرارة والحرارة الطاردة للحرارة من الاختلاط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : مثال ممثل كيف يمكن استخدام مقايسة الاستقرار إنزيم المركز على 35 درجة مئوية مقارنة الاستعدادات مختلفة اثنين من إينفيرتاسي- تظهر أنشطة invertase المعطل تداولها على غشاء نانوفيبير وإنزيم مجاناً حسب خطوط رمادي منقط والظلام، على التوالي. الخط الأسود هو عنصر التحكم مع إينفيرتاسي لا تظهر فقط حرارة الاختلاط على مقاييس مناسبة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم 6 : العلاقة الخطية بين طارد الحرارة invertase ومعدل تركيز الذروة بعد حقنه 4 ميليلتر من السكروز 600 مم- يمكن استخدام هذا المنحنى المعياري لتحديد تركيز إينفيرتاسي في نموذج غير معروف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ميزة رئيسية للمقايسة الاستقرار إنزيم المركز الموصوفة هنا هو التشغيل الآلي للمكاتب. حالما يتم إجراء كافة المخازن المؤقتة الملائمة والحلول، وقت الإعداد لكل فحص حوالي 15 دقيقة للشخص الذي يقوم الفحص. على النقيض من ذلك، تتطلب فحوصات التقليدية للنشاط invertase واللاكتاز حوالي 2 ح مع مشاركة مستمرة من الشخص الذي يقوم الفحص وأخذ الكثير من النشاط الأنزيمي فحوصات أكبر بكثير من عدد ساعات العمل الشخصية. في منشور سابق، لقد أظهرنا كيف يقارن البيانات من الأسلوب المركز إلى أسلوب سبيكتروفوتروميتريك تقليدية ل النشاط إينفيرتاسي11.

وهناك ميزة أخرى لتحليل المركز هو انطباقه على ما يقرب من أي إنزيم12. وهكذا، اختبار استقرار إنزيمات مختلفة ضمن مجموعة معينة من الظروف لا تتطلب إعداد عدة فحوصات مختلفة. بالإضافة إلى ذلك، مقايسة المركز مفيد في تحديد استقرار نشاط إنزيم رواية أو إنزيم ليس لديه مقايسة اللونية مناسبة.  أيضا يمكن أن يتم تحليل المركز في وسائل الإعلام مبهمة وميزة كبيرة في علوم الأغذية. نظراً لاستخدام معظم الاختبارات السابقة لنشاط إنزيم كانت أو الأسفار التﻷلؤ لقياس نشاط الإنزيم، أنها ليست متوافقة مع وسائط الإعلام غير شفافة أو ملونة عالية. على الرغم من أن هذا العمل يوضح فقط تأثير درجة الحرارة على استقرار نشاط إنزيم، أسلوب مركز التجارة الدولية ينطبق على معظم الشروط الأخرى التي تؤثر على استقرار الإنزيم (مثلاً، الرقم الهيدروجيني والأملاح والمذيبات غير المائية ووكلاء يشوه).

كما هو الحال مع جميع تجارب مركز التجارة الدولية، يجب أن تتطابق مع المخزن المؤقت المستخدم لحل الإنزيم والركازة أكبر قدر ممكن من الدقة. عدم تطابق في تركيز أو الأس الهيدروجيني يمكن أن يسبب تأثيرات الحرارة الكبيرة التي تتجاوز النطاق الديناميكي مسعر. استخدام المخزن المؤقت نفس الأسهم لإعداد حلول كل من الإنزيم والركيزة، عادة ما تكون كافية. ولكن إذا لم يكن كذلك، الحلول التي يمكن أن يقابل دياليزينج كل الحلول ضد نفس الحل المخزن المؤقت.

شرط آخر هو أن الإنزيم لا ينبغي أن تكون الركيزة المشبعة، وفي هذه الحالة، يصبح ارتفاع ذروة مستقلة الركازة التركيز. أيضا، وقت رد الفعل للانتقال إلى إنجاز أو إلى التوازن بين الحقن يمكن أن تصبح المفرط و/أو الإشارة يمكن أن يتجاوز النطاق الديناميكي مسعر. ومع ذلك، يجب أن يكون تركيز الركازة كبيرة بما يكفي لتوفير إشارة حرارة قوية. إذا كان الإنزيم الركازة المشبعة، يمكن تقليل تركيز الركازة، أو زيادة تركيز الإنزيم. عند تحميل الخلية مسعر والمحاقن، واحدة يجب التأكد من وجود لا فقاعات الحالية. إذا كان حقن فقاعة أو أطلق سراحهم من الخلية أثناء التجربة، فإنه سيؤدي حدثاً شاذا في إشارة معدل الحرارة.

طريقة مركز التجارة الدولية تعتمد على تغيير محتوى حراري رد فعل الحفز ومعدل ومقدار رد الفعل. إذا تغير محتوى حراري لرد فعل صغير جداً، الركيزة أيضا غير قابلة للذوبان، أو ليس لديه الإنزيم نشاط كاف، قد يكون معدل الحرارة صغير جداً للحصول على إشارة كافية. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان هو إعاقة الإنزيم بتركيزات منخفضة من المنتجات، الانخفاض في النشاط الأنزيمي ولاحظ أثناء التجربة سوف يكون سبب تثبيط المنتج فضلا عن فقدان النشاط على مر الزمن. على سبيل المثال، يسبب النهائي تركيز الجلوكوز 54 مم واللبن في المعايرة اللاكتاز، انخفاض نسبة 27 في المائة في ذروة ذروة نشاط الإنزيم في 55 درجة مئوية (البيانات لا تظهر). وهذا أقل كثيرا من انخفاض 78 في المائة في ذروة الارتفاع من حقن 1 للحقن 4 في الشكل 1. ومع ذلك، يمكن تصحيح هذا عن طريق قياس نشاط الإنزيم وجود تركيز المنتج الذي تم التوصل إليه أثناء الفحص. علاوة على ذلك، يمكن أن تقلل من المعايرة الإنزيم مع الركازة أقل مقدار تثبيط المنتج.

قيود أخرى يمكن أن تحدث بسبب الإنزيم. على سبيل المثال، مع كل حقن الإنزيم سوف تكون المخفف. نظراً لأن هذا المركز يستخدم سفينة رد فعل تجاوز سعة، تتم إزالة وحدة تخزين لحل ما يعادل حجم الحقن أثناء التجربة مع كل حقن. وهكذا، يتم إزالة كمية صغيرة من إنزيم، وزيادة منتجات التفاعل مع كل حقن. يمكن أن تظل آثار التخفيف وكمية الإنزيم إزالة الصغيرة إذا كان يتم الاحتفاظ بحجم الحقن الصغيرة، وبالتالي فكثيراً ما الضروري تركيز كبير من الركازة. نظراً لأن نسبة حجم الحقن إلى رد فعل السفينة حجم أقل في مركز التجارة الدولية مع أوعية التفاعل أكبر تأثير تمييع أصغر من حجم انخفاض مركز التجارة الدولية المستخدمة في هذا العمل. بالإضافة إلى ذلك، سوف تتطلب كل رد فعل للعديد من الإنزيمات ميكروغرام لكميات منخفضة مليغرام، حتى إذا كان لديك إنزيم غير مكلفة أو صعبة لتنقية، وهذا يمكن أن تحظر استخدام هذا الفحص.

معظم القضايا التي يمكن أن تنشأ من خلال هذا التحليل المتعلقة بالصيانة المناسبة وتنظيف السفينة رد فعل مركز التجارة الدولية. إذا كان مركز التجارة الدولية لا تصل إلى خط أساس مستقر، وهذا كثيرا ما سبب رد فعل السفينة لا يجري نظيفة بما فيه الكفاية. نوصي باستخدام مطهر قوي بعد كل تجربة عند استخدام البروتينات في مركز التجارة الدولية للبروتينات يمكن أن تتمسك بوعاء التفاعل والتدخل بقياس معدل الحرارة. لأعمق نظيفة، حل حمض الفورميك 50% المحتضنة في 55 درجة مئوية لمدة تصل إلى 12 ح متبوعاً بالتنظيف مع محلول التنظيف (جدول المواد)، الإيثانول، والمياه سوف إزالة معظم الملوثات.

أن مركز التجارة الدولية يستغرق حوالي 45 دقيقة لحجته بعد تحميل الحلول، وأخيراً، قد لا يكون ممكناً نشاط الإنزيمات غير مستقرة نسبيا أو في ظل ظروف هامشية. إذا كان يتم إلغاء تنشيطه الإنزيم خلال هذا الوقت أي إشارة، وسوف تكون متاحة أو قد يكون الانحلال السريع جداً بعد الحقن الأول للحصول على بيانات الاستقرار.

لأن التحليل المركز تدابير مباشرة نشاط إنزيم، أنه يمكن تمديدها لعدد من الاستخدامات الأخرى. على سبيل المثال، يمكن أن يتم هذا التحليل مع التركيزات المتزايدة للمانع لتحديد ثابت تثبيط، كي، استناداً إلى انخفاض نشاط إنزيم مع زيادة تركيز مثبط. كما هو موضح في الشكل 5، يمكن تكييف هذا البروتوكول للإنزيمات المعطل تداولها على دعامة متينة. استخدم غشاء نانوفيبير في هذا العمل، ولكن الدعم الصلبة الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا إذا كان يمكن وضع طريقة لإدراج وإزالته من خلال أنبوب صغير الوصول. الأسلوب المركز يمكن أن يمتد أيضا إلى الإنزيمات التي تتغير كيميائيا أو وراثيا لتحسين الثبات الحراري أو لتحديد كمية الإنزيم النشط في نموذج غير معروف (أي، ويبين الشكل 6 العلاقة الخطية بين ذروة معدل الحرارة تركيز الإنزيم واﻻرتفاع).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء

Acknowledgments

لا شيء

Materials

Name Company Catalog Number Comments
a-Lactose Fisher Scientific  unknown (too old) 500g
Sodium Acetate, Anhydrous 99% min Alfa Aesar A13184-30 250g
Lactase  MP Bio 100780 5g
Hydrocholric Acid Solution, 1N  Fisher Scientific  SA48-500 500mL
Benchtop Meter- pH VWR 89231-622
Ethanol 70% Fisher Scientific  BP8231GAL 1gallon
Micro-90 Fisher Scientific  NC024628 1L (cleaning solution)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39, (1), 301-312 (2010).
  2. Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183, (1), 293-306 (2017).
  3. Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. 182-203 (2018).
  4. van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
  5. Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
  6. Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
  7. Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36, (5), 1470-1480 (2018).
  8. Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2, (1), 011501 (2018).
  9. Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531, (1), 100-109 (2013).
  10. Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814, (10), 1318-1324 (2011).
  11. Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. (2017).
  12. Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics