Identifisering av Nucleolar faktorer under HIV-1-replikering gjennom rev Immunutfelling og Mass massespektrometri

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her beskriver vi rev immunutfelling i nærvær av HIV-1 replikering for masse massespektrometri. Metodene som er beskrevet kan brukes for identifisering av nucleolar faktorer involvert i HIV-1 smittsomme syklusen og gjelder for andre sykdoms modeller for karakterisering av lite studert trasé.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Arizala, J. A. C., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den HIV-1 smittsomme syklusen krever viral protein interaksjoner med verten faktorer for å lette viral replikering, emballasje, og slipp. Den smittsomme syklusen ytterligere krever dannelsen av viral/vert protein komplekser med HIV-1 RNA å regulere skjøting og aktivere nucleocytoplasmic transport. HIV-1 rev protein oppnår kjernefysisk eksport av HIV-1 mRNAs gjennom multimerization med intronic CIS-fungerende mål-rev respons element (RRE). En nucleolar lokalisering signal (NoLS) finnes innenfor COOH-Terminus av rev Arginine-rike motiv (ARM), slik at akkumulering av rev/RRE komplekser i nucleolus. Nucleolar faktorer er spekulert å støtte HIV-1 smittsomme syklus gjennom ulike andre funksjoner i tillegg til formidling mRNA-uavhengig kjernefysisk eksport og skjøting. Vi beskriver en immunutfelling metode av vill-type (WT) rev i forhold til rev nucleolar mutasjoner (sletting og single-point rev-NoLS mutasjoner) i nærvær av HIV-1 replikering for masse massespektrometri. Nucleolar faktorer innblandet i nucleocytoplasmic transport (nucleophosmin B23 og nucleolin C23), samt cellulære skjøting faktorer, mister interaksjon med rev i nærvær av rev-NoLS mutasjoner. Ulike andre nucleolar faktorer, for eksempel snoRNA C/D-boksen 58, er identifisert for å miste interaksjon med rev mutasjoner, men deres funksjon i HIV-1 replikering syklusen forblir ukjent. Resultatene som presenteres her demonstrere bruken av denne tilnærmingen for identifisering av viral/vert nucleolar faktorer som opprettholder HIV-1 smittsomme syklusen. Begrepene som brukes i denne tilnærmingen er gjeldende for andre viral og sykdom modeller som krever karakterisering av lite studert trasé.

Introduction

Den nucleolus er postulert som samspillet bakken av ulike mobilnettet vert og viral faktorer som kreves for viral replikering. Nucleolus er en kompleks struktur inndelt i tre forskjellige rom: fibrillær rommet, det tette fibrillær rommet og det detaljerte rommet. HIV-1 rev protein lokaliseres spesielt innenfor kornet avdelinger; årsaken til dette lokaliserings mønsteret er imidlertid ukjent. I nærvær av single-point mutasjoner innenfor NoLS sekvensen (rev mutasjoner 4, 5 og 6), rev opprettholder et nucleolar mønster og har tidligere vist å redde HIV-1HXB2 replikering, men med redusert effektivitet i forhold til WT rev1 . Alle single-point mutasjoner er ikke i stand til å opprettholde HIV-1NL4-3 smittsomme syklusen. I nærvær av flere single-point mutasjoner innenfor NoLS sekvensen (rev-NoLS mutasjoner 2 og 9), rev har blitt observert å spre hele kjernen og cytoplasma og har ikke vært i stand til å redde HIV-1HXB2 Replication1. Målet med denne Proteomikk studien er å dechiffrere nucleolar så vel som nonnucleolar cellulære faktorer involvert i rev-mediert HIV-1 smittsomme veien. Rev immunutfelling forhold er optimalisert gjennom interaksjon med nucleolar B23 phosphoprotein, som tidligere har vist å miste interaksjon med rev i nærvær av nucleolar mutasjoner.

Rev cellulære faktorer har blitt grundig studert i det siste; Men, dette har blitt gjort i fravær av viral patogenesen. Ett protein, spesielt, som er karakterisert ved denne studien gjennom rev interaksjon under HIV-1 replikering er nucleolar phosphoprotein B23-også kalt nucleophosmin (NPM), numatrin eller NO38 i amfibier2,3, 4. B23 uttrykkes som tre isoformene (NPM1, NPM2 og NPM3)-alle medlemmer av nucleophosmin/nucleoplasmin kjernefysiske Anstandsdame familie5,6. Den NPM1 molekylære Anstandsdame funksjoner i riktig montering av nucleosomes, i dannelsen av protein/nukleinsyre acid komplekser involvert i kromatin høyere orden strukturer7,8, og i forebygging av aggregering og misfolding av mål proteiner gjennom et N-Terminal kjerne domene (rester 1-120)9. NPM1 funksjonalitet strekker seg til ribosom Genesis gjennom transport av preribosomal partikler mellom kjernen og cytoplasma10,11, behandling av preribosomal RNA i den interne transkribere spacer sekvensen 12,13, og arrestere den nucleolar aggregering av proteiner under ribosomal forsamlingen14,15. NPM1 er innblandet i Hemming av apoptose16 og i stabilisering av tumor Suppressors Arf17,18 og p5319, avslører sin dual rolle som en kreftfremkallende faktor og tumor Suppressor. NPM1 deltar i mobilnettet aktiviteter av Genova stabilitet, centrosome replikering, og transkripsjon. NPM1 er funnet i nucleoli under celle syklus Interphase, langs kromosom periferien under mitose, og i prenucleolar organer (PNB) ved avslutningen av mitose. NPM2 og NPM3 er ikke så godt studert som NPM1, som gjennomgår endrede uttrykks nivåer under kreft20.

NPM1 er dokumentert i nucleocytoplasmic skytteltrafikk av ulike kjernefysiske/nucleolar proteiner gjennom en intern NES og NLS9,21 og ble tidligere rapportert å drive kjernefysisk import av HIV-1 TAT og rev proteiner. I nærvær av B23-bindende-domene-β-galaktosidase Fusion proteiner, TAT mislocalizes innenfor cytoplasma og mister transactivation aktivitet; Dette demonstrerer en sterk affinitet av TAT for B232. En annen studie etablerte en rev/B23 stabilt kompleks i fravær av RRE-inneholder mRNAs. I nærvær av RRE mRNA, rev dissociates fra B23 og binder fortrinnsvis til HIV RRE, fører til forskyvning av B2322. Det er ukjent hvor, på subnuclear nivå, TAT transactivation og rev utveksle prosessen med B23 for HIV mRNA finner sted. Begge proteinene er postulert å gå inn i nucleolus samtidig gjennom B23 interaksjon. Involvering av andre vert cellulære proteiner i HIV nucleolar veien er forventet. Metodene som er beskrevet i denne Proteomikk undersøkelsen vil bidra til å belyse samspillet mellom nucleolus med verts cellulære faktorer involvert under HIV-1-patogenesen.

Den Proteomikk etterforskningen ble initiert gjennom uttrykk for rev NoLS enkelt punkt mutasjoner (M4, M5, og M6) og flere Arginine erstatninger (M2 og M9) for HIV-1HXB2 produksjon. I denne modellen, en jakten cellelinje stabilt uttrykker rev-mangelfull HIV-1HXB2 (HLfB) er TRANSFEKTERTE med WT rev og rev nucleolar mutasjoner som inneholder et flagg merke på 3 ' end. Tilstedeværelsen av WT rev vil tillate viral replikering til å skje i HLfB kultur, i forhold til rev-NoLS mutasjoner som ikke redde rev mangel (M2 og M9), eller tillate viral replikering til å skje, men ikke så effektivt som WT rev (M4, M5, og M6)1. Cellen lysat samles 48 h senere etter viral spredning i nærvær av rev uttrykk og utsatt for immunutfelling med en lyseringsbuffer optimalisert for rev/B23 interaksjon. Lyseringsbuffer optimalisering ved hjelp av varierende salt konsentrasjoner er beskrevet, og protein eluering metoder for HIV-1 rev blir sammenlignet og analysert i sølv-farget eller Coomassie-farget SDS-PAGE gels. Den første Proteomikk tilnærmingen innebærer direkte analyse av en eluert prøve fra uttrykt WT rev, m2, M6 og M9 ved tandem masse massespektrometri. En annen tilnærming der eluates av WT rev, M4, M5 og M6 gjennomgikk en gel utvinningsprosess sammenlignes med den første tilnærmingen. Peptid affinitet til rev-NoLS mutasjoner i forhold til WT rev analyseres og protein identifikasjon sannsynlighet vises. Disse tilnærmingene avslører potensielle faktorer (nucleolar og nonnucleolar) som deltar i HIV-1 mRNA transport og skjøting med rev under HIV-1 replikering. Total, cellen lyse, IP, og eluering vilkårene beskrevet er anvendelig på viral protein av interesse for forståelsen av vert Cellular faktorene det aktivere og regulere infeksjon trasé. Dette gjelder også for studiet av mobilnettet vert faktorer som kreves for utholdenhet av ulike sykdoms modeller. I denne Proteomikk modellen, HIV-1 rev IP er optimalisert for B23 interaksjon til belyse nucleolar faktorer involvert i nucleocytoplasmic skytteltrafikk aktivitet og HIV-1 mRNA bindende. I tillegg, cellelinjer stabilt uttrykker smittsomme sykdommer modeller som er mangelfull for viktige proteiner av interesse kan utvikles, ligner på HLfB cellelinje, for å studere smittsomme stier av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cellekultur

  1. Opprettholde HLfB i Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS), 2 mM L-glutamin, og 1 mM natrium pyruvat innen vev-kultur-behandlet 100 mm plater. Hold celle kulturen ved 37 ° c i en fuktet inkubator som leveres med 5% CO2. Passage confluent celler til en celle tetthet på 1 x 106 celler/ml.
  2. Forkast cellekultur mediene. Skyll forsiktig cellene med 10 mL 1x fosfat-bufret saltvann (PBS). Fjern og Forkast 1x PBS uten å forstyrre celle laget.
  3. Tilsett 2 mL 1x Trypsin-EDTA-løsning til cellene. Rock parabolen å belegge monolag og ruge ved 37 ° c i et fuktet kammer i 5 min.
  4. Fast på siden av fatet med håndflaten til å løsne cellene. Resuspend de frittliggende cellene i 8 mL fersk kultur Media. Snurr cellene på 400 x g i 5 minutter.
  5. Kast kultur mediene uten å forstyrre celle pellet. Resuspend celle pellet i 10 mL fersk kultur Media. Kultur 1 mL konsentrert celler med 9 mL fersk kultur Media innen vev-kultur-behandlet 100 mm plater.
    Merk: for hver rev-NoLS mutasjon, 3x 100 mm HLfB eller HeLa kultur plater vil gi nok protein lysat for Western Blot analyse og masse massespektrometri. Legg til ekstra plater for en WT rev positiv kontroll og negativ kontroll. Den under kultur celle volumet vil kreve optimalisering med bruk av ulike celletyper.

2. uttrykk for rev-NoLS-3'flag mutasjoner under HIV-1 replikering

  1. Vokse HLfB cellekultur til en celle tetthet på 2 x 106 celler/ml. Forbered 4 mL kalsium fosfat-DNA suspensjon for hver 100 mm plate som følger.
    1. Etikett 2 15 mL rør som 1 og 2. Tilsett 2 mL 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl og 1,5 mM na2HPO4 [pH 7,12]) til rør 1. Tilsett TE 79/10 (1 mM Tris-HCl og 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) til rør 2. Volumet av TE 79/10 er 1,760 mL-volumet av DNA.
    2. Tilsett 20 mikrogram plasmider som inneholder rev-NoLs-3'flag mutasjon av interesse for rør 2 og bland innholdet gjennom blanding. Tilsett 240 μL av 2 M CaCl2 til rør 2 og bland igjen gjennom blanding.
    3. Overfør blandingen av rør 2 til rør 1 dråpevis, forsiktig miksing. La suspensjonen sitte ved romtemperatur i 30 min. Vortex nedbøren.
  2. Tilsett 1 mL av suspensjonen dråpevis til hver av 3-cellers kultur, 100 mm plater mens du forsiktig virvler mediene. Returner platene til inkubator og la transfeksjoner blandingen for 6 h. Erstatt transfeksjoner blandingen med 10 mL fersk kultur Media og ruge cellene for 42 h.

3. innsamling av viral protein lysat

  1. Forkast celle mediene 48 h posttransfection. Plasser hver 100 mm plate på en seng av is. Label 15 mL rør for hver rev-NoLS mutasjon prøve og plassere rørene på isen.
  2. Skyll forsiktig cellene med 10 mL prechilled 1x PBS uten å forstyrre celle laget. Kast 1x PBS. Tilsett 3 mL lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl og 1% X-100 vaskemiddel [se tabell over materialer]), behandlet med protease inhibitor cocktail, til hver av de 100 mm platene.
  3. Bruk en celle skraper for å forstyrre celle laget. Vipp platen og forsiktig skrape og samle cellene i et basseng. Samle celle lysat ved hjelp av en 1 000 μL micropipette og bland celle lysater fra hver av de 3 100 mm platene i prelabeled 15 mL rør.
  4. Ruge cellen lysat på isen i 15 min, virvlingen hver 5 min. sentrifuger cellen lysat ved 15 000 x g i 5 min.
  5. Samle proteinet supernatanten uten å forstyrre cellen rusk pellet og overføre den til en annen steril 15 mL rør. Skaff deg den lysat konsentrasjonen av viral protein ved hjelp av Bradford-metoden (se avsnitt 4).
  6. Lagre en alikvot av inngangs prøven (20 μg) for vestlig immunoblot analyse. Legg til 2x prøve buffer (20% glyserol, 0,02% bromophenol blå, 125 mM Tris-CL [pH 6,8], 5% SDS, og 10% 2-mercaptoethanol) til det endelige volumet. Kok den ved 95 ° c i 10 min, og oppbevar inngangs prøven ved-20 ° c.

4. Bradford analysen

Merk: klargjør 10x blod serum albumin (BSA) fra 100 x BSA-lager før du genererer protein standard kurver.

  1. Alikvot vann i mikrosentrifugen rør for følgende blank og standarder: blank = 800 μL; Standard 1 = 2 mg/mL, 798 μL; Standard 2 = 4 mg/mL, 796 μL; Standard 3 = 6 mg/mL, 794 μL; Standard 4 = 8 mg/mL, 792 μL; Standard 5 = 10 mg/mL, 790 μL. Alikvot 10x BSA i følgende utpekte standarder: standard 1 = 2 μL; Standard 2 = 4 μL; Standard 3 = 6 μL; Standard 4 = 8 μL; Standard 5 = 10 μL.
  2. Lag en blanding av protein prøver ved å blande 795 μL av vann med 5 μL protein prøver. Tilsett 200 μL av protein analysen fargestoff reagens (se tabell over materialer) til hver blank, standard, og protein prøve. Vortex prøvene kort for en jevn blanding og ruge ved romtemperatur (18-20 ° c) i 5 min.
  3. Overfør tomme, standarder og protein prøver til kyvetter. Mål protein konsentrasjonen ved en OD på 595 NM.

5. Coimmunoprecipitation av rev-NoLS-3'flag

  1. Skyll 25 μL av m2 affinitet gel perler (se tabell over materialer) med 500 μL av lyseringsbuffer, behandlet med protease inhibitor cocktail. Skyll mer affinitet gel perler for hver mutasjon prøve og kontroller.
    Merk: Forbered nok m2 affinitet gel perler for to gels (50 μL)-en for vestlig immunoblot analyse og den andre for protein farging og masse massespektrometri.
  2. Spin ved 820 x g for 2 min ved 4 ° c. Fjern supernatanten. Skyll 2x mer.
  3. Tilsett viral protein lysat (1 mg/mL i 5 mL totalt volum) til prerinsed m2 affinitet perler. Juster det totale volumet ved hjelp av lyseringsbuffer.
  4. Ruge reaksjonen i 3 timer, roterende ved 4 ° c. Sentrifuger m2 affinitet perler/viral protein lysat ved 820 x g for 1 min.
  5. Samle supernatanten og lagre en alikvot med post-IP-utvalg (20 μg) for vestlig immunoblot analyse. Mål protein konsentrasjonen av post-IP lysat. Samle 20 μg for vestlig proteinimmunoblotting.
  6. Legg til 2x prøve buffer til det endelige volumet. Kok den ved 95 ° c i 10 min, og oppbevar post-IP-prøven ved-20 ° c.
  7. Skyll m2 perler med 750 μL av lyseringsbuffer og vask perlene på en Rotator ved 4 ° c i 5 min. sentrifuger m2 perler ved 820 x g og kast supernatanten.
  8. Gjenta trinn 5,7 for to vasker på en Rotator ved 4 ° c i 5 min. Etter den tredje vasken, Fjern eventuelle spor av lyseringsbuffer fra m2 perler/co-IP kompleks med en lang gel-lasting spissen.
    Merk: knip enden av gel-loading-spissen med en flat pinsett før du fjerner eventuelle spormengder av lyseringsbufferen. Dette vil hindre avbrudd og opptak av m2 perler.
  9. Resuspend m2 perler i 55 til 2 x-lasting buffer. Kok prøven ved 95 ° c i 10 min.
  10. Last 25 μL av eluatet på to separate SDS-PAGE gels (en gel for vestlig proteinimmunoblotting og den andre for Coomassie farging).

6. utarbeidelse av SDS-PAGE gels

  1. Cast 2 15% SDS-akrylamid som løser gels ved å blande følgende reagenser i et 50 mL rør (ved et endelig volum på 40 mL, nok til fire gels): 4,16 mL ultrarent vann, 15 mL 40% akrylamid: bisacrylamide (29:1), 10 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 400 μL av 10% SDS, 400 μL av 10% ammonium persulfate, og 40 μL av TEMED.
  2. Bland løse gel ved invertere av 50 mL rør flere ganger. Pipetter den løse gel blandingen i en precleaned vestlig gel apparat (fire gels-tre for vestlig proteinimmunoblotting og en for Coomassie/sølv farging).
  3. Forsiktig pipette nok vann til å dekke det øverste laget av gel blandingen. La den løse gelen polymeres.
  4. Hell vann laget fra løse gel, ved hjelp av en delikat oppgave visker (se tabellen av materialer) til å absorbere overflødig vann.
  5. Cast to 5% SDS-akrylamid stabling gels ved å blande følgende reagenser i et 50 mL rør (ved et endelig volum på 20 mL, nok for fire gels): 11,88 mL ultrarent vann, 2,5 mL 40% akrylamid: bisacrylamide (29:1), 5,2 mL av 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 μL av 10% SDS, 200 μL av 10% ammonium persulfate og 20 μL av TEMED.
  6. Bland stabling gel ved invertere av 50 mL rør flere ganger. Pipetter stabling gel blandingen over løse gel til toppen av apparatet.
  7. Plasser en gel kassett kam som inneholder riktig antall kjørefelt inn i stabling gel. Absorber en overflyt av gel blandingen ved hjelp av en delikat oppgave visker (se tabell over materialer). La stabling gel polymeres helt.
  8. Flom den vestlige gel apparat med 1x vestlig kjører buffer (5x konsentrasjon: 250 mM Tris-CL [pH 8,3], 1,92 M Glycine, 0,5% SDS, og 10 mM EDTA).
  9. Trekk gel kassett kammen forsiktig ut av stabling gel. La den 1x vestlige løpe bufferen fylle laste brønnene. Skyll hver brønn med 1x vestlig løpe buffer ved hjelp av en sprøyte før du laster inn prøvene.
  10. Last de vestlige immunoblot prøvene inn i hver tilsvarende gel (innspill prøver, coimmunoprecipitated prøver, og post-IP prøver). Legg den vestlige gel protein markører.
  11. Legg coimmunoprecipitated prøvene for Coomassie/Silver farging i en annen gel. Legg den vestlige gel protein markører.
  12. Koble den løpende gel apparat til en strømkilde og kjøre gels på 100 V til lasting fargestoff når løse gel. Øk spenningen til 140 V til lasting fargestoff når bunnen av løse gel.

7. Western Blot overføring

  1. Demonter det vestlige gel apparatet. Slice og forkaste stabling gel, forlater løse gel intakt.
  2. Overfør forsiktig løse gels til et rent brett fylt med vestlig overføringsbuffer (25 mM Tris, 194 mM Glycine, 0,005% SDS, 20% metanol) og sug dem i 15 min.
  3. Monter gel overførings apparatet som følger.
    1. Skjær tre PVDF overføring membraner og seks stykker av filter papir (se tabell over materialer) til størrelsen på løse gel.
    2. Sug PVDF membranen i metanol i 5 min. fukt den i vann i 5 min. Plasser PVDF-membranen i den vestre overføringsbufferen til den er klar til bruk.
    3. Plasser gel holderen kassetten i et glass bakervarer skuffen fylt delvis med vestlig overføring buffer, med den svarte siden nederst.
    4. Plasser en skumputen dynket med vestlig overføringsbuffer mot den svarte siden av gel holderen kassetten.
    5. Fukt et stykke filter papir i vestlig overføring buffer og plassere den på toppen av skumputen. Plasser løsnings gelen oppå filter papiret.
      Merk: Plasser løsnings gelen i riktig laste retning for å bli overført til PVDF-membranen.
    6. Plasser en PVDF overføring membran på toppen av løse gel. Fukt et stykke filter papir med vestlig overføringsbuffer og plasser det på toppen av PVDF overførings membran.
    7. Plasser en annen skumputen dynket med vestlig overføring buffer på toppen av filteret papiret. Forsiktig fold den hvite siden av gelen holderen kassetten på toppen av gjennomvåt skumputen. Lås kassetten tett.
    8. Plasser gel holder kassetten i overførings apparatets elektrode enhet. Gjenta trinn 7.3.4-7.3.8 for hver resterende løse gel.
    9. Fyll overførings apparat tanken med vestlig overføringsbuffer. Plasser en røring tang i apparat tanken.
    10. Sett apparat tanken oppå en rør plate. Juster rør innstillingen til 5-6, og pass på at rør linjen ikke står fast eller at du treffer kassetter med gel-holder.
    11. Koble gel overførings apparatet til en strømkilde og Overfør gelen ved 100 V for 1 time ved 4 ° c.

Åttende proteinimmunoblotting

  1. Fjern gel holderen kassetten og plasser den svarte siden ned mot et rent glass bakervarer skuffen. Åpne kassetten og kast skumputen og filter papiret forsiktig. Merk et hjørne av PVDF-membranen for å identifisere riktig innlastings retning. Hold membranen våt.
    Merk: PVDF-membranen kan lufttørkes og oppbevares i en ren, lukket beholder. Rehydrate membranen ved å gjenta trinnene 7.3.2.
  2. Plasser membranen i 100 mL blokkerings løsning (5% melk, 1x TBS og 0,1% mellom 20). Blokker membranen ved skånsom rocking ved romtemperatur (18-20 ° c) for 1 time.
  3. Klipp over membranen over 25 kDa protein markør. Plasser den øverste delen av membranen, som inneholder protein bånd som er større enn 25 kDa, i blokkerings løsning som inneholder B23 mus monoklonale IgG1 (1:500 fortynning). Blokk over natten, rocking ved 4 ° c.
  4. Plasser den nederste delen av membranen, som inneholder protein bånd mindre enn 25 kDa, i blokkerings løsning som inneholder m2 mus monoklonale IgG1 (1:1000 fortynning, se tabell over materialer). Blokk over natten, rocking ved 4 ° c.
  5. Vask membranen 3x i 10 min i 25 mL vestlig vaskeløsning (1x TBS, 0,1% mellom 20) på en rocking plattform.
  6. Ruge membraner i geit-anti-mus IgG1-HRP (1:5000 fortynning) fortynnet i blokkerende løsning for 1 t ved romtemperatur. Vask membranen 3x i 10 min i 25 mL vestlig vaskeløsning på en rocking plattform.
  7. Forbered kjemiluminescens vestlige blotting substrat. Bruk en P1000 micropipette for å legge underlaget til membranen.
  8. Utvikle hver membran i kjemiluminescens vestlige blotting substrat i 5 min. Fjern membranen fra underlaget. Absorberer overflødig substrat ved hjelp av en delikat oppgave visker (se tabell over materialer).
  9. Plasser membranen i et rent ark beskytter tapet på innsiden av en kassett. Ta kassetten inn i et mørkt rom og Legg ett ark med film inn i kassetten. Lås kassetten på plass og ruge i 5 – 15 min. Fjern filmen fra kassetten og utvikle den.

9. Coomassie farging

  1. Demonter det vestlige gel apparatet. Slice og forkaste stabling gel, forlater løse gel intakt. Overfør forsiktig løsnings gelen til et rent brett fylt med 25 mL ultrarent vann.
  2. Ruge gelen på en rocking plattform i 15 min. Bruk milde rocking å hindre løse gel fra å bryte. Kast det ultrarent vannet og gjenta vaske trinnet 2x mer.
    Merk: Hvis SDS bobler igjen etter vaske trinnene, kan gelen vaskes i ultrarent vann over natten. Rest-SDS kan forårsake høy bakgrunns farging av gelen.
  3. Bland Coomassie flekk reagens ved å invertere flasken (se tabell over materialer). Plasser 100 mL Coomassie flekk reagens for å dekke løsnings gelen og ruge gelen på en rocking plattform for 1 t. kast Coomassie flekk reagens og vask gelen i deionisert vann på en rocking plattform i 15 minutter.
  4. Kast det deionisert vannet. Gjenta vaske trinnet 2x mer. Fortsett å vaske gelen til ønsket oppløsning av protein band er observert.

10. sølv farging

  1. Demonter det vestlige gel apparatet. Slice og forkaste stabling gel, forlater løse gel intakt. Overfør forsiktig løsnings gelen til et rent brett fylt med 25 mL ultrarent vann.
  2. Ruge gelen på en rocking plattform i 15 min. Bruk milde rocking å hindre løse gel fra å bryte. Kast det ultrarent vannet og gjenta vaske trinnet 2x mer.
    Merk: Hvis SDS bobler igjen etter vaske trinnene, kan gelen vaskes i ultrarent vann over natten. Rest-SDS kan forårsake høy bakgrunns farging av gelen.
  3. Fix gelen i 30% etanol: 10% eddiksyreløsning (6:3:1 vann: etanol: eddiksyre) over natten ved romtemperatur. Vask gelen i en 10% etanol løsning i 5 min ved romtemperatur. Erstatt etanol løsning og vask for ytterligere 5 min.
  4. Forbered sensitiverende arbeids løsning fra Pierce Silver stain Kit ved å blande en del sølv flekk sensitiverende med 500 deler ultrarent vann (50 μL av sensitiverende med 25 mL ultrarent vann). Ruge den løse gelen i den sensitiverende arbeids løsningen i 1 min. vask gelen i ultrarent vann i 1 min, Bytt ut vannet og vask gelen igjen i 1 min.
  5. Forbered flekk arbeider løsning ved å blande en del sølv flekk Enhancer med 50 deler sølv beis (500 μL av Enhancer med 25 mL sølv beis). Ruge gelen i flekken arbeider løsning i 30 min.
  6. Forbered utvikler arbeider løsning ved å blande 1 del sølv flekk Enhancer med 50 deler sølv flekk utvikler (500 μL av Enhancer med 25 mL av utbygger). Forbered 5% eddiksyreløsning som stopp løsning. Vask gelen med ultrarent vann i 1 min, Bytt ut vannet og vask gelen i ytterligere 1 min.
  7. Erstatt vannet med utbygger arbeider løsning og ruge til ønsket protein bandet intensitet er løst (5 min). Erstatt utvikleren arbeider løsning med stopp løsning og ruge i 10 min.

11. i-gel reduksjon, alkylation, og fordøyelsen av Coomassie-farget gel band

  1. Skjær gel band fra gel ved hjelp av en ren barberhøvel blad. Skjær hvert gel-bånd i ca. 5 mm terninger og legg dem i et rent 0,5 mL mikrosentrifugen rør.
  2. Destain gelen brikkene ved å dekke dem med 100 mM ammonium bikarbonat i 1:1 acetonitril: vann ved romtemperatur i 15 min. kast supernatanten. Gjenta dette trinnet.
  3. Tørk gel brikkene i 5 min i en vakuum sentrifuge. Reduser proteiner ved å dekke de tørkede gel bitene med 10 mM dithiotreitol i 100 mM ammonium bikarbonat og incubating dem for 1 time ved 56 ° c.
  4. Pipetter av alle supernatanten. Alkylat proteinene ved å dekke gel bitene med 100 mM iodoacetamide i vann og incubating dem i 1 time ved romtemperatur i mørket.
  5. Pipetter av supernatanten og krympe gel stykker ved å dekke dem med acetonitril og riste dem forsiktig ved romtemperatur i 15 min. Pipetter av supernatanten og reswell gelen brikkene ved å dekke dem med 100 mM ammonium bikarbonat og risting dem forsiktig ved romtemperatur i 15 minutter.
  6. Gjenta trinn 11,5. Tørk gel brikkene i 5 min i en vakuum sentrifuge.
  7. Dekk gel stykker med 50 ng/μL sekvensering karakter modifisert Trypsin (se tabell over materialer) i 100 mm ammonium bikarbonat. La gelen til å svelle i 5 min; deretter pipette av eventuelle gjenværende løsning. Dekk gel stykker med 100 mM ammonium bikarbonat og la dem reswell helt, og legger til ekstra 100 mM ammonium bikarbonat så gel brikkene er helt dekket.
  8. Ruge gel brikkene over natten ved 37 ° c. Stopp reaksjonen ved å legge 1/10 av volumet på 10% maursyre syre i vann. Samle supernatanten fra hvert rør.
  9. Pakk ut gel stykker ved å dekke dem med 1% maursyre syre i 60% acetonitril og incubating dem i 15 min med milde risting.
  10. Reduser volumet til den kombinerte supernatanter til mindre enn 20 μL i en vakuum sentrifuge, og pass på å unngå å tørke supernatanter helt. Tilsett 1% maursyre syre for å bringe det totale volumet tilbake til 20 μL.

12. flytende kromatografi/masse massespektrometri

Merk: prøvene ble analysert ved hjelp av en masse spektrometer utstyrt med ultra HPLC, en nanospray kilde, og en kolonne (se tabell over materialer). Løsemidler A og B er 0,1% maursyre syre i vann og acetonitril, henholdsvis.

  1. Legg de fordøyd proteiner i høy utvinning polypropylen autosampler hetteglass. Legg hetteglassene inn i prøve behandlingen i et UPLC-system.
  2. Injiser 6 μL av hver prøve. Legg hver prøve på overtrykks søylen til nanotile for 1,5 min. ved 8 μL/min, med 99% løsemiddel A/1% løsemiddel B.
  3. Eluere peptider i massen spektrometer med en lineær gradient fra 3% til 35% av løsemiddel B over 30 min, etterfulgt av en gradient fra 35% til 50% av løsemiddel B over 4 min og 50% til 90% av løsemiddel B over 1 min. Oppretthold 90% acetonitril i 3 minutter; deretter redusere% B tilbake til 3% over 5 min.
  4. Tilegne seg positive ion profil masse spec data i oppløsning (20 000 oppløsning) modus. Hente data fra 100 til 2 000 da med en hastighet på en skanning hver 0,6 s. hente data i MSE -modus ved å veksle skanninger uten kollisjon energi og skanner med forhøyet kollisjon energi.
  5. For forhøyet kollisjons energi, rampe kollisjonsenergien i Trap cellen fra 15 V til 40 V. Skaff en lås masse skanning hver 30 s, ved hjelp av + 2 ion av [Glu1]-Fibrinopeptide B som låsen massen. Skaff deg en datafil ved hjelp av en blank injeksjon av løsemiddel A, med samme anskaffelses metode mellom hvert par av prøvene for å kontrollere carryover.

13. data analyse for masse massespektrometri

  1. Kopier massen massespektrometri resultatene filer til datamaskinen kjører en kvantitativ og kvalitativ Proteomikk forskning plattform (f. eks ProteinLynx global server). Dataanalyse er svært CPU-intensiv og bør utføres på en separat, høy ytelse dataanalyse datamaskin.
  2. Opprett et nytt prosjekt for dataene. Opprett en ny mikrotiterbrønnene plate som representerer autosampler platen. Tildel prøvene til samme posisjon i mikrotiterbrønnene platen som deres posisjon i autosampler.
  3. Tilordne hvert utvalg behandling parametere. Parametere som skal brukes, er automatisk kromatografiske topp bredde og MSTOF-oppløsning. lav energi terskel, 100 teller; forhøyet energi terskel, 5 teller; intensitet terskel, 500 teller.
  4. Tilordne hvert eksempel arbeidsflyt parametere. Parametere som skal brukes er database, sammensatt menneskelig SwissProt og HIV, med reversert sekvenser; automatisk peptid og fragment toleranse; min fragment ion kamper per peptid, 3; min fragment ion kamper per protein, 7; min peptid kamper per protein, 1; primære fordøye reagens, Trypsin; ubesvarte splittelsene, 1; faste spesial reagenser, carbamidomethyl C; variabel modifikasjons reagenser, oksidasjon M; falsk oppdagelses rate, 100.
  5. Velg eksemplene, og velg Behandle siste rådata. Når søket er fullført, velger du prøvene og velger Eksporter data til stillas (versjon 3). Åpne stillas, opprette en ny fil, og importere hver fil eksportert fra Proteomikk plattformen som en ny biosample ved hjelp av forløper ion kvantifisering.
  6. Når alle filene er importert, går du videre til skjermbildet Last inn og analyser data . Velg den samme databasen som brukes for å søke og importere data ved hjelp av LFDR scoring og standard eksperiment-Wide protein gruppering. Angi visningsalternativer til protein identifikasjon sannsynlighet, protein terskelen til 20%, minimum antall peptider til 1, og peptid terskelen til 0% under analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rev-NoLS enkelt-og flere-punkts Arginine mutasjoner, som tilsvarer en rekke subcellulære lokalisering mønstre, ble undersøkt i deres evne til å samhandle med mobilnettet vert faktorer i forhold til WT rev. WT rev-3'flag og pcDNA-Flag vektor ble uttrykt i HLfB kultur. Protein komplekser ble behandlet fra total celle lysat og beiset med sølv flekk reagens. Rev-NoLS-3'flag er synlig (ca. 18 kDa) i tre forskjellige lyseringsbuffer forhold som inneholder ulike konsentrasjoner av NaCl (137 mM, 200 mM, og 300 mM) i figur 1. B23 var synlig (37 kDa) i lyseringsbuffer med lavere saltkonsentrasjon (137 mM, baner 2 – 4), knapt synlig i lyseringsbuffer inneholdende 200 mM NaCl, og undetectable i lyseringsbuffer som inneholder en høy saltkonsentrasjon (300 mM NaCl). I figur 2, WT rev-3'Flag, rev-NoLS M1-3 ' flagg, og pcDNA-flagg vektor ble uttrykt i HLfB kultur. Protein komplekser ble behandlet fra total celle lysater fremstilt av to lyseringsbuffer forhold (137 mM og 200 mM NaCl). M2 mus monoklonale IgG1 ble brukt i påvisning av rev-3'flag uttrykk fra celle lysater. B23 deteksjon var optimal i lyseringsbuffer inneholdende 137 mM NaCl med WT rev-3'flag (input og α-Flag-rev IP), men mistet affinitet med rev-NoLS M1-3 ' flagg. B23 affinitet med WT rev-3'flag redusert med en høyere saltkonsentrasjon i lyseringsbuffer inneholdende 200 mM NaCl. pcDNA negativ kontroll gav ikke spesifikke immunodetection i inn data og α-flagg-rev IP over alle lyseringsbuffer forhold.

Eluering forhold var optimalisert for rev-NoLS-3'flag IP i Figur 3. WT rev-3'flag og pcDNA-flagg vektor ble uttrykt i HLfB kultur. Protein komplekser ble behandlet fra total celle lysater og eluert ved hjelp av tre ulike forhold for å utrydde lys og tung kjede bakgrunn (25 og 50 kDa)-2x sample lasting buffer ved 37 ° c i 15 min, 2x sample lasting buffer ved 95 ° c i 3 min, og 3x flagg peptid e ved 4 ° c i 30 min. rev NoLS-3'flag (~ 18 kDa) var mest synlig etter eluering gjennom kokende i 2x sample lasting buffer. B23 (~ 37 kDa) var synlig under to forhold-37 ° c inkubasjons i 2x sample lasting buffer for 15 min og 95 ° c inkubasjons i 2x sample lasting buffer i 3 min.

M2 (kjernefysisk/nucleolar i lokalisering, fungerende i HIV-1HXB2 produksjon), M6 (nucleolar i mønster, funksjonell i HIV-1HXB2 produksjon), og M9 (spredt i cytoplasma/nucleus, fungerende i viral produksjon) ble uttrykt i HLfB kultur. Protein komplekser ble behandlet fra total celle lysat, eluert gjennom 95 ° c inkubasjons i 2x sample lasting buffer for 3 min, og løst i sølv flekk reagens (Figur 4). WT rev var synlig etter IP-flagget reaksjon. Rev-NoLS m2, M6 og M9 var også synlig på 18 kDa. Band tilsvarende B23 protein ble observert ved 37 kDa markør. Protein komplekser ble ytterligere observert i hvert kjørefelt tilsvarende IP-reaksjoner av WT rev, m2, M6, M9, og pcDNA negativ bakgrunns kontroll. Protein lysater ble analysert av immunodetection for α-Flag-rev og B23. Rikelig WT rev og moderate nivåer av M6 ble uttrykt (α-flagg input) og oppdages etter flagget IP (α-Flag-rev IP, figur 5). M2 og M9 var ikke høyt uttrykt fra 20 mikrogram protein lysat innspill, men oppdages ved lav intensitet etter flagg IP fra 5 mg protein lysat. pcDNA negativ kontroll gav ikke spesifikk immunodetection i input og α-Flag-rev IP. B23 affinitet med WT rev ble observert etter IP-flagg reaksjon (B23 co-IP). B23 affinitet ble litt observert med m2 (to single-point mutasjoner R48, 50G) og M6 (single-point mutasjon R50G). B23 affinitet gikk tapt i nærvær av tre enkelt-punkt mutasjoner av M9 (R46, 48, 50G) innen rev-NoLS.

Totalt lysater fra immunoprecipitated WT rev og rev-NoLS-3'flag mutasjoner (4, 5, 6 og 8) ble behandlet, beiset med Coomassie reagens, og visualisere i forhold til BSA seriell fortynninger (høyre panel). Rev-NoLS-3'flag er synlig (12,5-25 μg) i nærvær og fravær av mutasjoner ved 18 kDa (figur 6). Protein komplekser behandlet fra IP-reaksjoner av WT rev-3'flag, nucleolar-lokalisere rev-NoLS-3'flag mutasjoner (M4, M5, og M6), og negativ kontroll pcDNA-flagg ble VISUALISERE i SDS-Page gels beiset med Coomassie reagens (figur 7). WT rev (WT1 og WT2) ble synlig etter IP-flagg reaksjonen ved 18 kDa. Rev-NoLS mutasjoner var litt synlig etter uttrykk i HLfB og IP-flagg reaksjon. pcDNA negativ kontroll gav ikke spesifikk bakgrunn på 18 KDA.

Immunoprecipitated lysater fremstilt fra WT rev-3'flag, m2, M6, M9, og negativ kontroll pcDNA-Flag (vist i Figur 4) ble analysert ved tandem masse massespektrometri. Protein identifisering sannsynlighet (i prosenter) vises for sammenligning av protein interaksjoner oppstår med hver nucleolar-lokalisere rev-NoLS mutasjon versus WT rev (tabell 1). Cellular proteiner, hvorav noen er nucleolar i lokalisering mønster (ribosomal isoformene, eukaryote oversettelse Initiation faktor 48, snoRNA C/D boks 58B, og nucleophosmin B23), ble identifisert som direkte/indirekte bindende partnere av WT rev. disse nucleolar faktorer mistet bindende affinitet til m2 (to single-point mutasjoner R48, 50G), M6 (single-point mutasjon R50G), og M9 (tre single-point mutasjon R46, 48, 50G), lik pcDNA negativ kontroll. Hvert felt av den Coomassie gel i figur 6 ble behandlet for tandem masse massespektrometri (tabell 2). Peptid affinitet til rev-NoLS mutasjoner ble analysert og vist ved hjelp av protein identifisering sannsynlighet (i prosenter). En rekke cellulære proteiner, hvorav noen er nucleolar i lokalisering mønster (nucleolin C23, nucleophosmin B23, og nucleosome montering protein), ble identifisert som direkte/indirekte protein bindende faktorer av WT rev. disse nucleolar faktorene ble ikke identifisert å binde med M4, M5, og M6. Transport faktorer ARHGEF1 (Rho Guanin nukleotid Exchange faktor 1) og TBC1D24 (TCB1 domene familie, medlem 24) gikk tapt i affinitet i nærvær av rev-NoLS mutasjoner. Skjøting faktorer hnRNPC (heterogen ribonuclear protein C) og PNN (Pinin, desmosome-assosiert protein) ble i tillegg observert å binde til WT rev, som tapte interaksjon med rev single-point nucleolar mutasjoner.

Figure 1
Figur 1 : Optimalisering av cellelyse forhold for rev-3'flag co-IP under HIV-1-produksjon. NoLS-3'flag og negative kontroll pcDNA-Flag IP-forhold ble optimalisert i tre forskjellige NaCl-konsentrasjoner (137 mm, 200 mm og 300 mm) i lyseringsbuffer. Som observert gjennom sølv farging, 137 mM NaCl var den optimale saltkonsentrasjon for rev immunutfelling og B23 binding. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Optimalisering av lyse Rings betingelser for rev-3'flag co-IP-og B23-immunodetection under HIV-1-produksjon. WT rev-NoLS-3'flag, M1-3 ' flagg, og negative kontroll pcDNA-Flag IP-forhold ble optimalisert i to forskjellige NaCl-konsentrasjoner (137 mm og 200 mm) i lyseringsbuffer. Som observert gjennom immunodetection, 137 mM NaCl var den optimale saltkonsentrasjon for rev immunutfelling og B23 binding. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Optimalisering av rev-3'flag co-IP eluering under HIV-1 produksjon, visualisere av sølv flekker. Protein komplekser ble behandlet fra total celle lysater fremstilt under WT rev-3'flag og pcDNA-flagg IP. Tre forskjellige eluering forhold ble testet-2x sample lasting buffer ved 37 ° c i 15 min, 2x sample lasting buffer ved 95 ° c i 3 min, og 3x flagg peptid ved 4 ° c i 30 min. De optimale eluering forholdene for WT rev inntraff etter 15 min inkubasjonsperiode i 2x prøve lasting buffer ved 37 ° c og etter 3 min inkubasjonsperiode i 2x prøve lasting buffer ved 95 ° c. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Immunutfelling av rev-3'flag mutasjoner 2, 6 og 9 under HIV-1-produksjon. Protein komplekser som bundet direkte/indirekte med WT rev, m2 (R48, 50G), M6 (R50G), M9 (R46, 48, 50G), og negativ kontroll pcDNA-flagg i nærvær av HIV-1 replikering er vist i en sølv-farget SDS-side gel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Rev-3'flag co-IP av mutasjoner 2, 6 og 9 for B23 immunodetection under HIV-1 produksjon. Protein lysater og IP-reaksjonene som er klargjort fra WT rev, m2, M6, M9 og negativ kontroll pcDNA-Flag i Figur 4 ble videre analysert av immunodetection for α-Flag-rev og B23. WT rev og mutant uttrykk, samt interaksjon med B23 nucleocytoplasmic protein, er observert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Kvantifisering av rev-NoLS mutasjoner 4, 5, 6 og 8 etter flagg IP reaksjon . IP-reaksjoner fra HLfB som uttrykker WT rev og nucleolar-lokalisere M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (ΔRQ), og negativ kontroll pcDNA-Flag ble målt for proteinkonsentrasjon ved hjelp av BSA seriell fortynninger. En proteinkonsentrasjon på 12,5-25 μg ble observert for hver prøve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Immunutfelling av nucleolar-lokalisere rev-NoLS mutasjoner 4, 5 og 6 under HIV-1-produksjon. Coomassie SDS-PAGE gel inneholdende immunoprecipitated protein komplekser av WT rev (1 og 2), M4, M5 og M6 er vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Identifiserte proteiner Molekylær vekt WT rev M2 M6 M9
signal gjenkjennings partikkel 14kDa (homologe alu RNA bindende protein) 15 kDa 95 prosent 0 0 0
ribosomal protein S3A 30 kDa 95 prosent 0 0 0
eukaryote oversettelse Initiation faktor 4B 69 i kDa 95 prosent 0 0 0
ribosomal protein L31 14 kDa 91 prosent 0 0 0
ribosomal protein L12 18 kDa 93 prosent 0 0 0
ribosomal protein L22 15 kDa 91 prosent 0 0 0
liten nucleolar RNA, C/D-boks 58B 15 kDa 87 prosent 0 0 0
sink finger, CCHC-domene som inneholder 11 185 i kDa 87 prosent 0 0 0
utgangen binding LIM protein 1 79 i kDa 79 prosent 0 0 0
ribosomal protein S13 17 kDa 78 prosent 0 0 0
nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein B23, numatrin) 33 i kDa 73 prosent 0 0 0

Tabell 1: identifisering av cellulære verts faktorer som samhandler med WT rev under HIV-1-produksjon. Protein eluates fremstilt fra WT rev, m2, M6, og M9 var direkte analysert av tandem masse massespektrometri. Protein interaksjoner som er direkte/indirekte bundet til WT rev versus m2, M6 og M9 er oppsummert av protein identifisering sannsynlighet (i prosenter).

Identifiserte proteiner Molekylær vekt M4 M5 M6 Wt pCDNA
Poly (A) bindende protein, cytoplasmatiske 1 61 i kDa 98 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
varme sjokk 70kDa protein 1B 70 i kDa 100 prosent 100 prosent 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L7 29 kDa 91 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
histone klynge 1, H1e 22 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L4 48 i kDa 95 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L13 24 kDa 99 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
komplement komponent 1, q Delkomponenten bindende protein 31 kDa 100 prosent 100 prosent 100 prosent 100 prosent 0
Y boks bindende protein 1 36 i kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
nucleosome montering protein 1-lignende 1 45 i kDa 0 0 0 100 prosent 0
ribosomal protein L8 28 kDa 89 prosent 36 prosent 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L18 22 kDa 27 0 100 prosent 100 prosent 0
varme sjokk 70kDa protein 8 71 i kDa 5 99 prosent 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L19 23 kDa 10 0 81 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L27 16 kDa 92 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L7a 30 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L24 18 kDa 0 0 100 prosent 99 prosent 0
tubulin, beta klassen jeg 50 i kDa 92 prosent 69 prosent 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L6 33 i kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
varme sjokk 70kDa protein 9 (mortalin) 74 i kDa 33 prosent 99 prosent 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein S2 31 kDa 87 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
kasein kinase 2, Alpha 1 polypeptid 45 i kDa 0 0 50 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L14 23 kDa 0 0 81 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein, stor, p0 34 i kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
histone klynge 1, H1B 23 kDa 0 0 73 prosent 100 prosent 0
varme sjokk 70kDa protein 5 (glukose-regulert protein) 72 i kDa 99 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein S4, X-koblet 30 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein S20 13 kDa 98 prosent 94 prosent 99 prosent 99 prosent 0
ribosomal protein L28 16 kDa 0 0 100 prosent 99 prosent 0
ribosomal protein S14 16 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein S3A 30 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L21 19 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
sink finger CCCH-type, antiviral 1 101 i kDa 0 0 97 prosent 100 prosent 0
histone klynge 1, H1c 21 kDa 0 0 0 98 prosent 0
ribosomal protein L36 12 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein S18 18 kDa 90 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
modulator av apoptose 1 40 i kDa 42 prosent 88 prosent 34 prosent 0 0
ribosomal protein L17 21 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein S26 13 kDa 91 prosent 0 99 prosent 98 prosent 0
ribosomal protein L32 18 kDa 0 0 48 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L35 15 kDa 0 0 97 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L29 18 kDa 0 0 57 prosent 94 prosent 0
ribosomal protein S9 23 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
heterogene kjernefysiske ribonucleoprotein H1 (H) 51 i kDa 98 prosent 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein S8 22 kDa 0 0 78 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L10 25 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L23a 18 kDa 0 0 68 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein s6 29 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L31 14 kDa 0 0 95 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein S13 17 kDa 0 0 100 prosent 99 prosent 0
ribosomal protein L10a 25 kDa 45 prosent 0 81 prosent 100 prosent 0
Poly (A) bindende protein, cytoplasmatiske 4 (induserbart form) 70 i kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
transmembrane emp24 protein transport domene som inneholder 1 25 kDa 0 0 0 100 prosent 0
EBNA1 bindende protein 2 35 i kDa 0 0 69 prosent 100 prosent 0
bevarte Helix-loop-Helix allestedsnærværende kinase 85 i kDa 74 prosent 92 prosent 65 prosent 83 prosent 0
ribosomal protein L12 18 kDa 0 0 57 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein s24 15 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
kaldt sjokk domene protein A 40 i kDa 0 0 0 100 prosent 0
ribosomal protein L27a 17 kDa 0 0 89 prosent 99 prosent 0
heterogene kjernefysiske ribonucleoprotein F 46 i kDa 0 0 99 prosent 99 prosent 0
ribosomal protein L11 20 kDa 0 0 99 prosent 100 prosent 0
ribosomal protein L26-like 1 17 kDa 0 0 100 prosent 100 prosent 0
kasein kinase 2, Alpha Prime polypeptid 41 i kDa 0 0 0 100 prosent 0
tubulin, Alpha 1a 50 i kDa 33 prosent 0 100 prosent 0 0
ribosomal protein L3 46 i kDa 0 0 86 prosent 94 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein L15 33 i kDa 0 0 100 prosent 99 prosent 0
nucleolin 77 i kDa 0 0 25 100 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S21 11 kDa 0 0 93 prosent 94 prosent 0
KRR1, liten delenhet (SSU) processome komponent, homologe (gjær) 44 i kDa 89 prosent 0 76 prosent 99 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S7 28 kDa 0 0 0 100 prosent 0
klorid kanal, nukleotid, 1A 22 kDa 0 0 97 prosent 86 prosent 0
cyclin B3 158 i kDa 0 0 67 prosent 49 prosent 0
Guanin nukleotid bindende protein-lignende 3 (nucleolar) 61 i kDa 0 0 99 prosent 98 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S23 22 kDa 0 0 100 prosent 50 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S22 41 i kDa 0 0 0 99 prosent 0
nucleophosmin (nucleolar phosphoprotein B23, numatrin) 33 i kDa 0 0 52 prosent 97 prosent 0
ribosomal protein S19 16 kDa 0 0 0 99 prosent 0
glyceraldehyde-3-fosfat-dehydrogenase 36 i kDa 0 0 100 prosent 0 0
histone klynge 1, H2bg 14 kDa 0 0 53 prosent 72 prosent 0
ribosomal protein S23 16 kDa 0 0 68 prosent 0 0
Nukleotid vekslings faktor for Rho Guanin (GEF) 1 104 i kDa 0 0 0 94 prosent 0
død assosiert protein 3 46 i kDa 0 0 87 prosent 87 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein s6 14 kDa 0 0 52 prosent 84 prosent 0
ribosomal protein L39 6 i kDa 0 0 0 87 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S28 21 kDa 0 0 85 prosent 99 prosent 0
histone klynge 1, H4h 11 kDa 0 0 0 93 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein L43 23 kDa 0 0 0 97 prosent 0
ribosomal protein S15 17 kDa 0 0 0 85 prosent 0
ribosomal protein S12 15 kDa 0 0 68 prosent 39 prosent 0
ribosomal protein L35a 13 kDa 0 0 0 96 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein L38 45 i kDa 0 0 42 prosent 98 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S14 15 kDa 0 0 45 prosent 76 prosent 0
fosfodiesterase 5A, cGMP-spesifikk 95 i kDa 14 0 0 72 prosent 0
ribosomal protein L15 24 kDa 0 0 0 56 prosent 0
heterogene kjernefysiske ribonucleoprotein C (C1/C2) 22 kDa 0 0 0 100 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S16 11 kDa 0 0 0 92 prosent 0
ribosomal protein S15a 15 kDa 0 0 0 91 prosent 0
neurexin 2 185 i kDa 0 50 prosent 0 0 0
autisme mottakelighet kandidat 2 139 i kDa 0 0 46 prosent 0 0
mitokondrie ribosomal protein L17 20 kDa 0 0 0 92 prosent 0
skjøting faktor 3a, delenhet 1, 120kDa 89 i kDa 0 0 56 prosent 89 prosent 0
La ribonucleoprotein domene familie, medlem 1 116 i kDa 0 0 65 prosent 66 prosent 0
leprecan-lignende 2 62 i kDa 0 0 0 68 prosent 0
ribosomal protein L18a 21 kDa 0 0 0 86 prosent 0
ribosomal protein L23 15 kDa 0 0 60 prosent 47 prosent 0
transmembrane emp24 protein transport domene som inneholder 9 27 kDa 0 0 0 78 prosent 0
signal gjenkjennelse partikkel 72kDa 75 i kDa 0 0 0 100 prosent 0
Lektiner, galactoside, løselig, 3 26 kDa 0 71 prosent 28 0 0
mitokondrie ribosomal protein L1 37 i kDa 0 0 0 69 prosent 0
H1 histone familie, medlem X 22 kDa 0 0 0 96 prosent 0
kasein kinase 2, beta polypeptid 25 kDa 0 0 0 89 prosent 0
stoff carrier familie 4, natrium bikarbonat cotransporter, medlem 7 118 i kDa 82 prosent 0 0 0 0
WD gjenta domene 13 54 i kDa 0 81 prosent 0 0 0
transkripsjon forlengelse faktor A (SII), 3 17 kDa 0 0 0 38 prosent 0
ribosomal protein S16 16 kDa 0 0 75 prosent 0 0
SP140 kjernefysiske kroppen protein 92 i kDa 0 0 0 64 prosent 0
otoferlin 227 i kDa 62 prosent 0 0 0 0
Golgi transport 1B 15 kDa 0 0 0 33 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S34 26 kDa 0 0 0 33 prosent 0
ribosomal protein L30 13 kDa 0 0 0 49 prosent 0
utgangen binding LIM protein 1 96 i kDa 0 0 0 43 prosent 0
Guanin nukleotid bindende protein-som 2 (nucleolar) 84 i kDa 40 prosent 0 0 0 0
høy tetthet lipoprotein bindende protein 141 i kDa 0 0 34 prosent 0 0
adenosin deaminase, RNA-spesifikk, B2 81 i kDa 0 0 28 0 0
cystatin E/M 17 kDa 0 27 0 0 0
sink finger protein 786 80 i kDa 0 0 23 0 0
pleckstrin homologi-lignende domene, familie B, medlem 1 145 i kDa 0 0 0 95 prosent 0
protein fosfatase methylesterase 1 44 i kDa 0 0 94 prosent 0 0
Janus kinase og mikrotubulinettverket samspill protein 2 95 i kDa 0 0 0 94 prosent 0
signal gjenkjennelse partikkel 68kDa 67 i kDa 0 0 0 93 prosent 0
TBC1 domene familie, medlem 24 63 i kDa 0 0 0 89 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein L27 16 kDa 0 0 0 89 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein L2 24 kDa 0 0 0 88 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S2 33 i kDa 0 0 0 87 prosent 0
Pentatricopeptide gjenta domene 3 79 i kDa 0 0 0 84 prosent 0
ribosomal protein, stor, P2 12 kDa 0 0 0 76 prosent 0
IMP (inosin 5 '-monofosfat) dehydrogenase 2 56 i kDa 0 0 76 prosent 0 0
tubulin, beta 4B klasse IVb 50 i kDa 0 0 76 prosent 0 0
mitokondrie ribosomal protein L23 19 kDa 0 0 0 74 prosent 0
mitokondrie ribosomal protein S31 45 i kDa 0 0 0 74 prosent 0
galaktose-3-O-sulfotransferase 1 49 i kDa 74 prosent 0 0 0 0
Suppressor av variegation 4-20 homologe 1 (Drosophila) 99 i kDa 0 72 prosent 0 0 0
mitokondrie ribosomal protein S25 20 kDa 0 0 0 70 prosent 0
ribosomal L1-domene som inneholder 1 55 i kDa 0 0 0 70 prosent 0
familie med sekvens likhet 110, medlem D 29 kDa 69 prosent 0 0 0 0
ribosomal protein L36a-lignende 12 kDa 0 0 0 66 prosent 0
cerebellin 4 forløper 22 kDa 0 0 0 64 prosent 0
N-acetylglucosamine-1-fosfat glutamyltransferase, alfa og beta under enheter 144 i kDa 64 prosent 0 0 0 0
RAD51 homologe B (S. cerevisiae) 38 i kDa 0 0 0 64 prosent 0
transkripsjon forlengelse regulator 1 124 i kDa 63 prosent 0 0 0 0
homeobox a1 15 kDa 0 0 0 62 prosent 0
fosfolipid overføre protein 49 i kDa 0 0 0 62 prosent 0
Rho GTPase aktiverer protein 33 137 i kDa 0 0 54 prosent 0 0
mitokondrie ribosomal protein S18B 29 kDa 0 0 0 52 prosent 0
endoplasmatiske retikulum aminopeptidase 2 106 i kDa 51 prosent 0 0 0 0
tre parts motiv som inneholder 28 89 i kDa 0 50 prosent 0 0 0
umodne kolon kreft transkripsjon 1 24 kDa 0 0 0 50 prosent 0
AT Rich interaktivt domene 1A (SVEITSISK-lignende) 242 i kDa 0 0 49 prosent 0 0
mitokondrie ribosomal protein s17 15 kDa 0 0 0 48 prosent 0
Pinin, desmosome assosiert protein 82 i kDa 0 0 0 48 prosent 0
protein fosfatase, Mg2 +/Mn2 + avhengig, 1G 59 i kDa 0 0 0 45 prosent 0
G patch domene og ankyrin gjentar 1 39 i kDa 45 prosent 0 0 0 0
mitokondrie ribosomal protein L3 39 i kDa 0 0 0 44 prosent 0
spirende uhemmet av benzimidazoles 3 homologe (gjær) 37 i kDa 0 44 prosent 0 0 0
WD og tetratricopeptide gjentas 1 76 i kDa 0 0 0 44 prosent 0
protein disulfide isomerase familie A, medlem 2 58 i kDa 0 0 0 42 prosent 0
kazrin, periplakin samspill protein 86 i kDa 0 41 prosent 0 0 0
spiral-spiral-Helix-spiral-spiral-Helix-domene som inneholder 2 16 kDa 0 0 40 prosent 0 0
varme sjokk protein 90kDa Alpha (cytosolic), klasse A-medlem 1 85 i kDa 0 0 40 prosent 0 0
retinitis pigmenta GTPase regulator 83 i kDa 0 0 40 prosent 0 0
CTD (carboxy-domene, RNA polymerase II, polypeptid A)
fosfatase, delenhet 1
104 i kDa 0 39 prosent 0 0 0
mitokondrie ribosomal protein L37 48 i kDa 0 0 0 39 prosent 0
C2CD2-lignende 76 i kDa 0 38 prosent 0 0 0
DnaJ (Hsp40) homologe, gruppe C, medlem 6 106 i kDa 0 0 38 prosent 0 0
mitokondrie ribosomal protein L51 15 kDa 0 0 0 38 prosent 0
bystin-lignende 50 i kDa 0 0 0 38 prosent 0
huntingtin-assosiert protein 1 76 i kDa 0 0 0 37 prosent 0
sink finger protein 263 77 i kDa 0 36 prosent 0 0 0
celledeling syklus og apoptose regulator 1 133 i kDa 0 0 34 prosent 0 0
protein tyrosin fosfatase, ikke-reseptor type 13
(APO-1/CD95 (FAS)-assosiert fosfatase)
256 i kDa 0 0 34 prosent 0 0
KRAB-et domene som inneholder 2 56 i kDa 0 0 0 31 0
aktivere signal cointegrator 1 kompleks delenhet 2 28 kDa 0 0 0 31 0
centrosomal protein 76kDa 74 i kDa 0 30 0 0 0
polymerase (RNA) III (DNA rettet) polypeptid C (62kD) 61 i kDa 0 0 0 30 0
5-hydroxytryptamine (serotonin) reseptor 6 47 i kDa 0 0 0 29 0
T celle reseptor Alpha sammenføyning 56 2 i kDa 0 26 0 0 0
biorientation av kromosomer i celle divisjon 1-lignende 330 i kDa 0 0 0 25 0
RAS-tilknytning og DIL-domener 114 i kDa 0 0 25 0 0
WD gjenta domenet 66 130 i kDa 0 0 0 24 0
Kromosom 6 åpne lese ramme 25 13 kDa 0 0 22 0 0
transmembrane protein 177 34 i kDa 0 0 0 21 0
nevrale forløper celle uttrykt, developmentally ned-regulert 4-lignende 101 i kDa 0 20 0 0 0

Tabell 2: identifisering av cellulær vert faktorer complexed med nucleolar-lokalisere rev mutasjoner 4, 5 og 6 under HIV-1 produksjon. Coomassie-flekket SDS-PAGE gel i figur 6 ble behandlet for tandem masse massespektrometri. Protein interaksjon resultater av WT rev versus nucleolar mutasjoner M4, M5, og M6 er oppsummert av protein identifisering sannsynlighet (i prosenter).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Masse spectrometric analyser sammenligne rev-NoLS mutasjoner og WT rev i nærvær av HIV-1 ble vurdert til å forstå nucleolar faktorer involvert i viral replikering syklus. Dette vil identifisere nucleolar komponenter som kreves for viral infectivity. Nucleolar B23 har en høy affinitet til rev-NoLS og funksjoner i Nucleolar lokalisering av rev3 og nucleocytoplasmic transport av rev-bundet HIV mRNAs22. Affinitet av B23 med rev-NoLS mutasjoner, som inneholdt én eller flere Arginine erstatninger, ble vurdert gjennom immunutfelling av rev-3'flag under viral produksjon (figur 2; WT og mutasjoner m2, M6 og M9). B23 affinitet til single-point rev-NoLS mutasjoner M4, M5, og M6 ble tidligere undersøkt i nærvær av HIV-1 replikering. I forrige studie ble IP-eluates av M4, M5 og M6 utsatt for vestlig proteinimmunoblotting med et antistoff spesifikt for α-flagg for rev og B23 affinitet1. I bakgrunnen av rev enkelt punkt mutasjoner, var B23 bindende affinitet betydelig redusert. B23 opprettholdt affinitet med WT rev under HIV-replikering. Single-Point mutasjoner indusert innenfor rev-NoLS var ventet å redusere bindende affinitet til andre mobilnettet vert faktorer tilrettelegge HIV mRNA bindende og transport. Rev-NoLS enkelt-og flerpunkts mutasjoner i denne modellen avskaffet nucleophosmin B23 affinitet til rev, noe som indikerer en forstyrrelse i nucleocytoplasmic skytteltrafikk og HIV mRNA transport. Det er sannsynlig at nucleolar faktorer (nucleolin C23 og nucleosome montering protein 1), transport faktorer (ARHGEF1 og TCB1D24), og skjøting faktorer (hnRNPC og PNN) er involvert i HIV-1 smittsomme syklus gjennom interaksjon med rev protein komplekser. Tabell 1 og tabell 2 Avslør ulike andre cellulære faktorer, både nucleolar og nonnucleolar i mønster, som er potensielt involvert i HIV-1-replikering syklusen gjennom rev. den Nucleolar faktoren-snoRNA C/D boks 58, innblandet i snoRNA prosessering, snoRNA transport til nucleolus, og 2 '-O-metylering av ribosomal RNA-ble identifisert, men funksjonen til dette proteinet i HIV-1-replikering syklusen forblir ukjent. De spesifikke rollene til disse cellulære faktorene i HIV-1 smittsomme syklusen undersøkes for tiden.

Resultatene som presenteres her demonstrere bruken av denne tilnærmingen for identifisering av viral/vert nucleolar faktorer som opprettholder HIV-1 smittsomme syklusen. Viral/Host nucleolar faktorer som deltar i andre sykdoms modeller kan identifiseres ved hjelp av denne tilnærmingen. Det er videre sannsynlig at en nucleolar faktor kan innebære multifunksjonelle roller i ulike sykdoms modeller. For eksempel B23 har vært innblandet i transport av nucleolar virus proteiner, viral montering, encapsidation, replikering, og ventetid i andre virale smittsomme modeller. B23 er karakterisert ved interaksjoner med NoLS av cellulære faktorer for nucleocytoplasmic transport-p120 vekstfaktor (aminosyrer 40-57)23 og C23 pre-rRNA prosessor (aminosyrer 540 – 628)24. B23 er også dokumentert å samhandle med den menneskelige T-celle lymfotropt virus (HTLV-1) protein Rex (aminosyrer 1-22)25, HIV-1 TAT (aminosyrer 49 – 57)2, og HIV-1 rev (aminosyrer 37-47)26. Det japansk encefalitt virus (JEV) Genova koder en nucleolar-lokalisere kjernen protein, der hvor amino syren Gly42 og Pro43 påvirke hverandre gjensidig med det N-Terminal område av B23 i løpet av JEV infeksjon, resulterer inne transporten av viral kjernen protein/B23 i kjernen27. Den enkelt-strandet RNA-Genova av hepatitt B-viruset (HBV) består delvis av dobbelt strandet DNA, som koder en nucleolar kjerne protein. Det HBV kjerne proteinet forbinder med nucleolin og B23 i nucleolus28; B23 ble demonstrert i HBV forsamlingen gjennom interaksjon med kjernen protein N-Terminal domene. Nærmere bestemt, B23 aminosyrer 259-294 binde til N-Terminal domene av HBV kjerne protein å tillate viral encapsidation29. Den negative-Sense, enkelt-strandet RNA hepatitt D-viruset (HDV) uttrykker HDVAg antigen i to isoformene; den lille isoformen hjelpemidler i RNA replikering, og den store isoformen forenkler viral montering. RNA-replikering foregår innenfor nucleolus og krever B23 interaksjon med HDVAg30,31. HDV infeksjon forårsaker en oppregulering av B23, som samhandler det meste med den lille HDVAg isoformen og mindre med den store HDVAg isoformen. Interaksjoner foregår gjennom det lille HDVAg NLS-domenet, der B23 binder og oppnår kjernefysisk akkumulering. Ved sletting av HDV bindings stedet til B23 ble RNA-replikering svekket. HDVAg ble vist å colocalize med B23 og nucleolin i nucleolus. Nucleolin ble oppdaget å ha transcriptional egenskaper som en hemmende32, avslører nucleolus som en kupé for regulering av HDV replikering. B23 er likeledes involvert inne det ventetid av det Kaposis ' sarkom-forbundet herpesvirus (KSHV) Genova. KSHV latent protein-v-cyclin-med vert CDK6 kinase, fosforylerer B23 på Thr199, tilrettelegging B23 interaksjon med latency-assosiert kjernefysisk antigen33. Den latency-assosiert kjernefysisk antigen handlinger for å hindre viral lytisk replikering. Forringelse av B23 fører til KSHV reaktivering, avslørende B23 som en regulator av KSHV ventetid. B23-funksjonen i HIV-1-replikering syklusen er karakterisert i nucleocytoplasmic transport aktivitet av TAT og rev, og det er ukjent om B23 kan indusere ventetid under HIV-smitte. B23's engasjement i replikering, encapsidation, og montering av HIV-1 er foreløpig ukjent.

Tilpasning av denne metoden til andre sykdoms modeller ville kreve mye innsats og tid for generering av protein-mangelfull smittsomme infrastruktur uttrykt i den aktuelle cellelinjer. Fordelen med denne rev-mangelfull HIV-1HXB2 ryggrad er evnen til å undersøke rev-NoLS mutasjoner i nærvær av hele viral ryggraden, viral smittsomme faktorer, og vert faktorer involvert i HIV-1 replikering syklus. Andre studier har undersøkt rev nucleolar funksjon i fravær av full HIV-1 smittsomme systemet. Grundig karakterisering av smittsomme og sykdoms trasé må inkludere representative miljøer som støtter den naturlige sykdomsprogresjon. To ulike typer analyser ble gjennomført og sammenliknet i evnen til å identifisere nucleolar faktorer. Tabell 1 lister opp faktorer som forble bundet til WT rev som følge av direkte masse massespektrometri analyse av protein eluatet. Denne analysen ga flere kjente faktorer for HIV-1 rev. denne direkte metoden ble sammenlignet med en annen prosess som involverte utvinning av protein atskilt innen SDS-PAGE gels og masse massespektrometri analyse av slike proteiner. Denne andre metoden ga en rekke kjente og potensielle faktorer som er bundet til rev protein kompleks, men manglet følgende proteiner tidligere identifisert i tabell 1: signal gjenkjennings partikkel 14 KDA, eukaryote oversettelse innvielse faktor 4B, ribosomal protein L22, små nucleolar RNA C/D boks 58B, og sink finger CCHC domene som inneholder 11. Til syvende og sist, den overlegne metoden valgt for masse massespektrometri analyser i denne protokollen involverte utvinning av peptider fra SDS-PAGE gels. Den første direkte metoden inkluderte 2x prøve buffer i eluatet uten bromophenol blå; de resterende komponentene i 2x prøve bufferen kan forstyrre komplett Trypsin behandling og kan gi ufullstendig behandlet peptider for masse massespektrometri analyse. Den andre indirekte metoden var i stand til å rense Trypsin-behandlede peptider fra potensielle forurensninger av SDS-PAGE.

Massen massespektrometri forberedelse metoder beskrevet her kan utnyttes for identifisering av terapeutiske intervensjoner for å utrydde HIV-1-smitte gjennom målretting rev. all sletting og enkeltpunkts rev-NoLS mutasjoner kan undersøkes for dominerende-negativ aktivitet og benyttes i arrestasjonen av rev-funksjonen. Dominerende negative kjennetegn av interesse for rev funksjonell arrest er følgende: Rev/RRE bindende affinitet; relocalization av nucleolar WT rev gjennom multimerization med rev mutanter; tap i affinitet til viktige cellulære faktorer involvert i HIV-1 mRNA transport og skjøting. Rev multimerization involverer coexpression av rev-NoLS mutasjoner med WT rev kan undersøkes. Dominerende negative mutasjoner i denne modellen er forventet å multimerize med WT rev og Skift nucleolar mønstre mot kjernen og cytoplasma, fører til en rev funksjonell arrest. Mass massespektrometri kan brukes til å identifisere tap av viktige cellulære faktorer involvert i HIV-1 mRNA skjøting og transport. Identifisering av manglende interaksjoner med WT rev som følge av coexpression med dominerende-negative rev-NoLS mutasjoner ville avdekke involvering av nucleolar-spesifikke trasé i HIV-1 patogenesen. Alternativt kan viral HIV-1NL4-3 partikler som genereres i bakgrunnen av rev-NoLS mutasjoner bli undersøkt for alle pakket cellulære faktorer. Cellular og viral faktorene pakket innen viral partikler kanskje være fremme kjennemerke igjennom masse massespektrometri. Dette vil avdekke tilstedeværelsen av nucleolar faktorer innen viral partikler og rollen av identifiserte nucleolar faktorer i viral infeksjon. Metodene beskrevet gjelder for andre viral og sykdom modeller for identifisering og karakterisering av lite studert trasé. Dette vil tillate utvikling av terapeutiske intervensjoner mot sykdommer som begrenset behandling er tilgjengelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner Dr. Barbara K. Felber og Dr. George N. Pavlakis for HLfB tilhenger kulturen som tilbys av National Institutes of Health (NIH) AIDS forskning og referanse reagens programmet, Division of AIDS, National Institute of allergi og smittsomme Sykdommer (NIAID), NIH. Forfatterne erkjenner også finansielle kilder gitt av NIH, Grants AI042552 og AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics