대규모 공간 스케일을 통해 생물막 형태 형성을 해명하는 자동화된 3D 광학 일관성 단층 촬영

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Summary

미생물 생물막은 서로 복잡한 구조를 형성하고 매우 규모에 의존하는 공간 패턴으로 발전합니다. 여기에서는 3D 광학 일관성 단층 촬영(OCT) 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위한 실험 시스템(하드 및 소프트웨어)을 소개합니다. 이 도구 세트는 공간과 시간에 생물막 형태 형성의 비침습적 및 다중 스케일 특성화를 허용합니다.

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Depetris, A., Wiedmer, A., Wagner, M., Schäfer, S., Battin, T. J., Peter, H. Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales. J. Vis. Exp. (150), e59356, doi:10.3791/59356 (2019).

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Abstract

바이오필름은 가장 성공적인 미생물 라이프스타일이며 다양한 환경 및 엔지니어링 환경에서 우세합니다. 공동체 조립 중에 생물막의 구조적 다각화인 생물막 형태 형성을 이해하는 것은 공간적 및 시간적 비늘 전반에 걸친 놀라운 도전과제입니다. 여기에서, 우리는 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 근거를 둔 자동화한 생물막 화상 진찰 시스템을 제시합니다. OCT는 생물막 연구에서 새롭게 떠오르는 이미징 기술입니다. 그러나 현재 획득 및 처리할 수 있는 데이터의 양은 생물막 형태학에서 대규모 패턴의 통계적 추론을 방해합니다. 자동화된 OCT 이미징 시스템은 생물막 성장의 큰 공간 및 확장된 시간적 스케일을 커버할 수 있게 합니다. 시판되는 OCT 시스템과 로봇 포지셔닝 플랫폼 및 소프트웨어 솔루션 제품군을 결합하여 OCT 스캐닝 프로브의 위치 지정과 3D 생물막 이미징 데이터 세트의 수집 및 처리를 제어합니다. 이 설정은 생물막 개발의 현장 및 비침습적 자동화 모니터링을 허용하며, 매크로 사진 및 마이크로센서 프로파일링과 OCT 이미징을 결합하기 위해 추가로 개발될 수 있습니다.

Introduction

생물막은 매우 성공적인 미생물 라이프 스타일 적응이며, 이러한 상간 관련 미생물의 매트릭스 동봉 된 지역사회는 자연 및 산업 설정에서 미생물 의 삶을 지배 1,2. 거기서, 생물막은 길쭉한 스트리머 3,리플4 또는 버섯형 캡5와 같은 복잡한 구조를 형성하며 생물막 성장, 구조적 안정성 및스트레스에대한 저항성 6. 생물막 구조화에 관한 많은 것들이 미니어처 플로우 챔버에서 자란 모노종 문화에 대한 작업에서 배웠지만, 대부분의 생물막은 종종 생명의 모든 영역의 구성원을 포함하는 매우 복잡한 공동체이다6. 이러한 복잡한 생물막을 미생물 풍경 7로 이해하고 복잡한 지역 사회에서 생물막 구조와 기능이 어떻게 상호 작용하는지 이해하는 것이 생물막 연구의 최전선에 있습니다.

환경 단서에 반응하여 복잡한 생물막의 형태 형성에 대한 기계적 이해는 관련 에 걸쳐 생물막 물리적 구조의 공간적 및 시간적으로 해결 된 관찰과 함께 신중하게 설계된 실험을 필요로합니다. 저울8. 그러나, 실험 시스템에서 생물막 성장의 비파괴적 관찰은 섬세한 생물막 구조를 손상시키는 시료(예를 들어, 현미경)를 이동시킬 필요성과 같은 물류 제약에 의해 심각하게 제한되고 있다.

여기에 제시된 프로토콜은 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 기초한 완전 자동화 된 시스템을 소개하며, 이는 메조 스케일 (mm 범위)에서 생물막 형태 형성의 현장, 비 침습적 모니터링을 허용합니다. OCT는 수처리 및 바이오폴링 연구, 의학9 및 스트림 생태학10에응용된 생물막 연구에서 새로운 이미징 기술입니다. OCT에서, 낮은 일관성 광원은 샘플 및 참조 암으로 분할된다; 생물막(샘플 암)에 의해 반사되고 산란된 빛의 간섭과 기준 암의 빛을 분석한다. 깊이 해결된 구조 정보가 포함된 일련의 축 강도 프로파일(A-스캔)을 획득하여 B 스캔(단면)으로 병합합니다. 일련의 인접한 B-스캔은 최종 3D 볼륨 스캔10을구성합니다. OCT는 약 10 μm의 범위에서 측면 광학 분해능을 제공하므로 생물막10,12의중피 구조적 분화를 연구하는 데 적합합니다. OCT에 대한 자세한 설명은 드렉슬러와 후지모토13,퍼처 및 동료14를참조하십시오. 단일 OCT xy-scan의 시야가 수백 평방 마이크로미터에 도달하지만 단일 스캔에서 OCT를 통해 대규모 패턴을 정량화할 수 없습니다. 하천과 같은 자연 서식지의 생물막과 관련하여, 현재 는 서식지의 물리적 및 유압 템플릿과 일치하는 스케일에서 생물막 형태 형성을 평가하는 능력을 제한합니다.

이러한 공간 한계를 뛰어넘고 OCT 스캔을 자동으로 획득하기 위해 스펙트럼 도메인 OCT 이미징 프로브를 3축 포지셔닝 시스템에 장착했습니다. 설치는 중첩 모자이크 패턴 (타일 스캔)에서 여러 OCT 스캔을 수집하여 최대 100cm 2까지 표면적의 단장 촬영 이미징을 효과적으로 달성 할 수 있습니다. 또한, 이 시스템의 높은 포지셔닝 정밀도를 통해 장기 실험 중에 특정 부위의 생물막 기능의 성장과 개발을 안정적으로 모니터링할 수 있습니다. 이 시스템은 모듈식이며 설치의 개별 구성 요소(즉, 위치 지정 장치 및 OCT)는 독립형 솔루션으로 사용하거나 유연하게 결합할 수 있습니다. 그림 1은 설치의 하드 및 소프트웨어 구성 요소에 대한 개요를 제공합니다.

이 시스템은 시판되는 GRBL 제어 CNC 포지셔닝 장치(재료 표)로 시험하였다. 이 특정 포지셔닝 플랫폼의 작동 거리는 600×840×140mm이며, 제조업체가 표시한 정확도 +/- 0.05 mm, 프로그래밍 가능한 해상도0.005mm. GRBL은 CNC용 오픈 소스(GPLv3 License), 고성능 모션 컨트롤입니다. 장치. 따라서 모든 GRBL 기반(버전 > 1.1) 포지셔닝 장치는 여기에 제시된 지침 및 소프트웨어 패키지와 호환되어야 합니다. 또한, 소프트웨어는 몇 가지 수정과 STEP-DIR 입력 유형과 다른 스텝 모터 컨트롤러에 적응 할 수있다.

시스템의 성능을 평가하는 데 사용되는 OCT장치(재료 표)는 중심 파장이 930nm(대역폭 = 160nm)의 낮은 일관성 광원을 특징으로 하며, 조정 가능한 기준 암 길이 및 강도가 있습니다. 여기에 제시된 예에서, OCT 프로브를 흐르는 물에 담그는 침지 어댑터(표오브 머티리얼)도사용되었다. 자동화된 OCT 스캔 수집을 위해 여기에서 개발된 소프트웨어 패키지는 특정 OCT 시스템과 함께 제공되는 SDK에 따라 크게 달라지지만, 다른 스캔 렌즈와 중앙 파장이 있는 동일한 제조업체의 OCT 시스템은 쉽게 호환됩니다.

GRBL 장치는 단일 보드 컴퓨터에 설치된 웹 서버에 의해제어됩니다(그림 1). 이렇게 하면 로컬 네트워크 또는 인터넷 액세스가 있는 모든 컴퓨터에서 장치를 원격으로 제어할 수 있습니다. OCT 장치는 별도의 컴퓨터에 의해 제어되므로 자동화된 실험 설정을 제외하고 OCT 시스템의 작동이 가능합니다. 마지막으로, 소프트웨어 패키지에는 OCT 프로브 포지셔닝 및 OCT 스캔 수집을 동기화하는 라이브러리가 포함됩니다(즉, 모자이크 패턴 또는 정의된 위치 집합에서 3D 이미징 데이터 세트를 자동으로 수집하기 위해). OCT 프로브의 위치를 3D로 효과적으로 정의하면 (지역) 스캔 세트에 맞게 초점 평면을 조정할 수 있습니다. 특히 고르지 않은 표면에서 각 OCT 스캔에 대해 서로 다른 초점 평면(즉, z 방향으로 다른 위치)을 지정할 수 있습니다.

원시 OCT 스캔을 처리하기 위해 소프트웨어 패키지집합이 개발되었습니다(표 1). 포지셔닝 디바이스의 탐색, OCT 스캔 수집 및 데이터 세트 처리는 파이썬 코딩 된 Jupyter 노트북으로 수행되어 소프트웨어의 개발 및 최적화에 있어 뛰어난 유연성을 제공합니다. 이러한 노트북의 두 가지 작업 및 추가 된 예제 (이미지 수집 및 처리에 대 한) 사용할 수 https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 그들은 사용자 지정에 대 한 시작 점으로 의도 메서드의. Jupyter 노트북은 추가 된 파이썬 코드가있는 셀을 포함하는 웹 브라우저 기반 응용 프로그램입니다. 각 단계는 노트북의 셀에 포함되어 있으며, 별도로 실행할 수 있습니다. 스캔 렌즈(구면 수차)(15)를 통해 광 경로의길이가 상이하기 때문에, 원시 OCT 스캔이 왜곡된 것처럼 보인다(도2A). 우리는 획득 한 OCT 스캔에서이 왜곡을 자동으로 수정하는 알고리즘을 개발했습니다 (ImageProcessing.ipynb, 보충 파일1). 또한, 생물막 형태는 이전에 멤브레인 시스템16에서사용되었던 것처럼 2D 고도 맵으로 시각화될 수 있으며, 타일링 배열에서 가져온 스캔에서 얻은 고도 맵이 어떻게 스티치될 수 있는지 설명합니다.

마지막으로, 설명된 실험실 설치의 기능은 광영양 스트림 생물막이 유속의 구배에 노출되는 수로 실험을 사용하여 설명됩니다.

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Protocol

1. 위치 지정 장치 설정

  1. https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl 지시에 따라 위치 장치를 마이크로 컨트롤러 보드에 연결합니다.
  2. USB 케이블을 통해 인터넷에 연결되는 단일 보드 컴퓨터에 마이크로 컨트롤러를 연결하고 https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git 설명된 대로 GRBL 서버를 설치합니다. 이제 위치 지정 장치는 http://IP:5020/ 호스팅되는 웹 페이지에서 탐색할 수 있어야 합니다. 또는, 포지셔닝 디바이스는 파이썬 스크립트로 탐색할 수있으며, 작업된 예제 ImagesAcquisition.ipynb(보충 파일 2)의 첫 번째 부분에서 설명한 바와 같이.

2. 10월 설정

  1. 호환되는 비둘기 꼬리 홀더를 사용하여 OCT 프로브를 포지셔닝 장치에 장착합니다. 필요한 경우 대물 렌즈에 침지 어댑터를 설치합니다.
  2. 컴퓨터 및 OCT 베이스 유닛을 실험 옆에 있는 벤치에 배치합니다(예: 미세 유체 장치, 유량 챔버, 수로, 여과 시스템). 광학 코드(최대 길이 약 1.8m)가 자유롭게 움직여 모든 의도한 위치에 도달할 수 있고 실험 설정을 방해하지 않도록 하십시오.
  3. 제조업체에서 설명한 대로 사용 가능한 소프트웨어와 함께 OCT 시스템을 설치합니다.
  4. https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git 설명된 대로 자동화된 OCT 스캔 수집을 위해 소프트웨어 패키지를 설치합니다.

3. 이미지 획득

  1. OCT 시스템과 포지셔닝 장치의 전원. 장치가 자유롭게 이동할 수 있는지 확인합니다.
  2. 텍스트 편집기에서 파일 config.json을 엽니다. config.json 파일을 편집하여 기본 이미지 수집매개변수(표 2)를 조정하여 굴절률(20°C의 물1.33, 공기의 경우 1.00)과 획득한 데이터 및 메타데이터의 대상 폴더를 조정합니다.
  3. config.json에서뷰 필드(FOV)의 크기와 B 스캔당 A-스캔 수를 정의합니다.
    참고: 이 두 매개변수는 최종 데이터 집합의 복셀 크기와 출력 파일의 크기를 결정하며 프로브의 광학 해상도와 일치해야 합니다(x-y 복셀 크기는 광학 해상도의 절반보다 작아야 합니다). A- 및 B 스캔의 수는 사용 가능한 디스크 공간 및 처리 기능에 대해 어떤 장단점을 다루는 공간 범위에 영향을 줍니다.
  4. config.json에서출력 OCT 스캔의 신호 경계를 정의합니다. 이들은 견본의 모형에 달려 있습니다. 따라서 예비 검사 세트의 강도 히스토그램을 기반으로 이러한 매개 변수를 결정하는 것이 좋습니다. config.json의변경 내용을 저장합니다.
  5. OCT 프로브를 관심 사이트로 이동합니다. 최적의 이미지 품질을 위해 샘플에 초점을 맞추고 기준 암 및 광원 강도를 조정합니다. 여러 위치에 대해 이 절차를 반복하고 좌표를 기록합니다.
    참고: 이렇게 하면 이러한 참조 점 주위에 후속 자동 OCT 스캔 수집이 허용됩니다. 자동 이미지 수집 중에는 참조 암 길이와 강도를 변경할 수 없습니다.
  6. Juypter 노트북에서 ImageAcquisition.ipynb 파일(보조파일2)을 엽니다. 각 셀에는 특정 작업을 수행하는 코드가 포함되어 있으며 셀 을 눌러 별도로 실행할 수 있습니다 | 실행, 또는 Ctrl + 입력 또는 이동 + 입력.
    1. 필요한 라이브러리와 기본 구성 매개 변수로 경로를 설정합니다. 또는 임시 매개 변수의 새 집합을 정의합니다.
    2. 위치 지정 장치에 연결하고 OCT를 초기화합니다.
    3. 포지셔닝 장치를 보정합니다(즉, "호밍"을 수행).
    4. 단일 스캔 또는 모자이크 패턴의 관심 위치를 포함하는 데이터 집합을 획득하여 숫자와 겹침(예:., 30%)을 지정합니다. 이웃 타일의.
      참고: 컴퓨터 리소스 사용을 최적화하는 검색 전에 메모리가 할당됩니다. 데이터는 저장 공간을 저장하기 위해 8비트 *.raw 형식으로 저장되며, 타임스탬프와 명명 규칙(즉, %Y%m%m%M%M%M%M%S_<<&t;위치>)을 사용하여 config.json에정의된 대상 폴더에 저장됩니다. OCT 설정 및 좌표를 포함한 메타데이터는 동일한 명명 규칙이 있는 *.srm 파일의 동일한 폴더에 저장됩니다. FOV 및 해상도와 같은 설정에 따라 파일 크기는 OCT 스캔당 최대 1.5GB에 도달할 수 있습니다.
  7. 데이터 수집을 방지하려면 충분한 사용 가사용 디스크 공간이 있는지 확인하거나 OCT 데이터 집합을 외장 하드 드라이브로 지속적으로 이동해야 합니다.

4. 이미지 보정 및 디스플레이

  1. OCT 이미지 처리(왜곡 보정, 배경 빼기, 고도 맵 계산, 고도 맵 스티치)의 작업 예에 대해 Jupyter 노트북 ImageProcessing.ipynb(보조 파일1)을 엽니다.
  2. 필요한 경우 스퓨리어스 신호를 배제하고 데이터 집합의 방향을 재조정하기 위해 OCT 를 자르십시오(생물막은 지층 위에 나타나야 합니다).
  3. 구면 수차에 적합합니다. 이것은 평평한 것으로 알려진 고반사 기준 표면을 활용하는 보정 알고리즘에 의해 달성됩니다 (예를 들어, 수로의 바닥, 지층). 첫째, 알고리즘은 OCT 스캔의 xy 평면에 걸쳐 정기적으로 간격을 두는 20×20개의 수직 선 그리드를 정의합니다. 그런 다음, 각 점 주위의 원형 영역을 선택하고 수직 프로파일을따라 신호 강도를 평균화합니다(도 2B). 수직 프로파일은 수정된 가우시안 필터로 처리됩니다.
    Equation 1
    여기서 x는 입력 신호이고 표준 편차를 σ로, C는 다음과 같이 결정됩니다.
    Equation 2
    참조 서피스는 이러한 각 프로파일에서 로컬 최대값으로 지역화됩니다. 잘못 식별된 점은 3차원으로 이웃의 위치에 따라 필터링됩니다(그림2C). 마지막으로, 스캔 렌즈에 의해 도입된 왜곡을 반영하는 2차 다항식 표면이 이러한 점에 걸쳐 장착된다(도2C). 그런 다음 장착된 표면을 사용하여 각 픽셀을 z 방향으로 이동하여 평평한 이미지를 얻습니다. 이 알고리즘의 매개 변수는 OCT 스캔의 특성에 맞게 조정되어야 합니다.
  4. 배경 소음에 대 한 수정. 이미지의 빈 영역(일반적으로 생물막 위)을 식별하고 보정 알고리즘을 사용하여 이미지의 강도 값에서 평균 배경 강도를 빼서최종 수정된 OCT 이미지를 생성합니다(그림 2D).
  5. 3D OCT 데이터 집합에서 입면 맵을 계산합니다. 이 단계에서는 특정 실험(예를 들어, 지층)에 대한 관심 있는 기준 표면과 적절한 임계 강도를 정의합니다. 그런 다음 입면 맵 계산 알고리즘을 사용하여 이진 마스크의 각 좌표(x,y)에 대한 생물막의두께를 계산하고 이를 새 2D 행렬에 할당합니다(그림 3A). 그런 다음 두께 값이 x 및 y 방향으로 원본 이미지 크기의 2D 행렬에 할당됩니다. 지표면의 표고가 그레이스케일 값으로 보고되는 이미지가렌더링됩니다(그림 3B).
  6. 여러 OCT 스캔이 모자이크 패턴으로 수행되는 경우 행과 열 의 수를 정의하고 각 입면 맵을 스티치합니다. 그림 5는 설명된 설정으로 달성 가능한 광범위한 공간 스케일 및 해상도를 포함하는 스티치된 고도 맵의 예를 제시합니다.

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Representative Results

우리는 광영양 스트림 생물막의 spatio 측두체 형태 형성을 연구하기 위하여 디자인된 수로 실험을 사용하여 자동화된 OCT 화상 진찰 시스템의 기능을 보여줍니다. 수로의 점차적으로 좁아지는 기하학적 구조는 수로의 중심을 따라 유속의 그라데이션을 유도하였다(참조17참조).  생물막의 시간적 발달 과 구조적 분화는 생물막 형태 발생에 대한 유체 역학 적 조건의 영향을 더 잘 이해하기 위해 18 일 동안 모니터링되었습니다. 4는 18일 이상 성장한 생물막 소콜로니의 성장을 보여 준다. 생물막의 표면 형태는 전술한 툴세트를 사용하여 정량화하였다(도4A). 유속 구배를 따라 각 위치에 대해 3.6 mm 엣지 길이(도 4B)를 가진정사각형 이동 창에 대해 생체부피(ImageProcessing.ipynb, 보충 파일 1참조)를 계산하였다(도 4C). 유속이 증가함에 따라 생물막 축적이 현저히 감소(수로의 가장 넓은 부분으로부터의 거리로 표시; 그림4). 중요한 것은, 이 실험 설정은 큰 공간 그라데이션을 따라 구조적 파라미터(예: 생체 부피, 두께, 거칠기)를 지속적으로 측정할 수 있게 합니다. 따라서 이 새로운 도구는 생물막 구조와 환경 단서 간의 관계에 대한 통찰력을 얻을 수 있는 수단을 제공합니다.

소프트웨어 구성 요소 설명
stepcraft.py 포지셔닝 장치를 제어하는 파이썬 라이브러리입니다. 그것은 탐색하고 장치를 호밍에 대한 정의가 포함되어 있습니다.
옥스컨트롤.cpp OCT 시스템과 함께 배포되는 소프트웨어 개발 키트(SDK)에서 파생된 C++ 코드입니다. 이것은 VisualStudio 2017, 파이썬C / API 및 SDK를 사용하여 컴파일해야합니다.
ImagesAcquisition.py 선택한 위치에서 OCT 스캔을 취하고 스캔 타일링 패턴을 정의하는 명령을 포함하는 Python 라이브러리입니다.
이미지수집.이핀브 위치 지정 장치를 탐색하고, OCT 스캔을 획득하고, 자동화된 이미지 수집에 사용되는 Jupyter 노트북입니다.
OctCorrection.py 원시 OCT 이미지 및 배경 빼기의 보정에 사용되는 함수를 정의하는 파이썬 라이브러리입니다.
OctProcessing.py 고도 맵을 계산하고 스티치하는 함수가 포함된 Python 라이브러리입니다.
옥프로싱.이핀브 Jupyter 노트북은 OCT 스캔을 시각화, 수정 및 처리합니다. 여기에는 생체 부피 계산의 예도 포함되어 있습니다.

표 1. 소프트웨어 구성 요소입니다.

매개 변수 설명
가니메데 (주) 1, 2, 3 OCT 시스템 및 버전 선택
프로브 1, 2 스캔 렌즈 선택
나스칸스 32-900 B 스캔당 A-스캔 수
nBscans 1-900 B 스캔 수
nCscans 128-1024 깊이 픽셀 수
0.1-10 x 방향(mm)의 이미지 크기
Y 0.1-10 y 방향의 이미지 크기(mm)
굴절 1-1.6 굴절률(공기1, 물 1.33)
평균_아스캔 3 A-스캔 평균 수
스캔 속도 1,2,3 A-스캔 속도(5.5, 15 및 36kHz)
경로 ".. / %Y%m%d_%H_%M_%S" 획득 한 OCT 스캔에 대한 대상 폴더는 타임 스탬프를 명명 컨펜션으로 사용합니다.
색상 경계 [0.0-256.0,0.0-256.0] 획득한 스캔의 색상 경계

표 2. OCT 매개 변수 설정.

Figure 1
그림 1. 하드 및 소프트웨어 구성 요소의 개요입니다. GRBL 제어 포지셔닝 장치의 스텝 모터는 마이크로 컨트롤러에 연결되며 USB를 통해 단일 보드 컴퓨터에 연결됩니다. GRBL 서버는 후자에 설치되며, TCP/IP 연결을 통해 모든 웹 브라우저에서 포지셔닝 장치의 동작을 제어할 수 있습니다. 대안적으로, 포지셔닝 디바이스의 탐색은 GRBLServer.py 라이브러리를 이용하여 파이썬 인코딩된 Jupyter 노트북(ImagesAcquisition.ipynb, 보충 파일2)에서 수행될 수 있다. OCT 시스템은 파이썬 스크립트를 통해 자동화 된 OCT 스캔 수집을 수행 할 수있는 별도의 컴퓨터에 연결되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. OCT 스캔 보정 워크플로우. 패널 A는 평평한 플렉시유리 표면에서 성장하는 생물막의 비가공 B 스캔을 나타낸다. 렌즈를 통한 낮은 응집광 라이트의 경로 길이 차이로 인해 이미지가 왜곡(굽힘)됩니다. OCT 이미지 왜곡은 이미지에서 강하게 반사되는 평평한 참조 표면을 식별하여 수정할 수 있습니다. 먼저 20×20 참조점이 전체 이미지 스택에 고르게 분포됩니다. 이러한 각 지점에서 이미지 신호는 각 깊이(z 평면)에 대해 원형 영역(x-y 방향)에 걸쳐 평균화되어 신호 강도의 평균 깊이 프로파일을 얻습니다. 그런 다음 수정된 가우시안 필터가 400개의 참조 프로파일 각각에 적용됩니다. 패널 B는 패널 A의 수직 빨간색 선으로 표시된 깊이 프로파일, 평균 깊이 프로파일 및 수정된 가우시안 필터가 적용된 후 동일한 프로파일을 따라 원래 신호의 예를 제공합니다. 수정된 가우시안 필터를 사용하면 신호 강도에서 로컬 최대를 식별할 수 있으므로 강하게 반사되는 기준 표면의 위치를 식별할 수 있습니다. 그러면 올바르게 식별된 참조점이 3차원으로 인접한 사람의 좌표를 기준으로 선택됩니다. 패널 C의 예에서는 이후 이미지 보정을 위해 노란색 점이 유지되었지만 보라색 점은 삭제되었습니다. 그런 다음 2차 다항식 서피스가 올바르게 배치된 기준점에 맞고 픽셀을 z 방향으로 이동하여 원래 OCT 이미지의 왜곡을 보정하는 데 사용됩니다. 평균 배경 강도는 이미지의 빈 영역에서 추정되고 수정된 이미지에서 뺍니다. 패널 D는 보정 및 배경 빼기 후 동일한 B 스캔을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 고도 맵입니다. 생물막 토폴로지는 바이오매스의 두께가 색상이 코딩되는 2D 입면 맵으로 시각화할 수 있습니다. 이를 위해, 3D OCT 영상은 기판에 대한 최상위 신호의 거리로 계산되고 생물막 두께가 계산된다. 패널 A는 임계값 이후에 얻은 B-스캔의 이진 마스크를 보여줍니다. 파란색 선은 최상위 신호를 나타내고 빨간색 선은 기준 표면을 표시합니다. 패널 B는 OCT 프로브의 축 분해능 에 따라 배율이 조정된 얻어진 고도 맵의 예를 보여줍니다. 빨간색 선은 패널 A에서 B 스캔의 위치를 나타냅니다.

Figure 4
그림 4. 유동 속도가 생물막 성장에 미치는 영향을 나타내는 대표적인 결과. 우리는 수로 실험을 사용하여 유속의 구배를 따라 광영양 스트림 생물막 형태 형성을 연구했습니다. 유속은 수로의 입구로부터의 거리에 따라 증가했습니다. 성장 10 일 후, 생물 막 형태는 다른 해상도에서 자동화 된 OCT와 다른 공간 스케일을 덮는 특징을 가지고 있었습니다. 고도 맵(A, B 및 C)은 각각 낮은, 중간 및 높은 유속하에서 자란 생물막의 형태를 보여줍니다. 이러한 고도 맵은 4 μm의 y 방향의 복셀 크기가 있는 OCT 스캔에서 계산됩니다. 스캔 표면적은 3.6mm 의 모서리 길이의 사각형입니다. 패널 D, E 및 F는 11μm의 xy 방향의 복셀 크기로 3×3 OCT 스캔을 스티칭하여 얻은 고도 맵(각각 낮음, 중간 및 높은 유속)을 표시하고, 10mm 2의 스캔 면적과 30%의 인접 스캔 사이의 중첩을 보여줍니다. 패널 G는 이 수로 실험에서 달성된 전체 속도 구배를 따라 성장하는 생물막의 고도 지도를 보여줍니다. 3×51 OCT 스캔을 40 μm의 xy 방향으로 복셀 크기로 스티칭하고, 10 mm2의 스캔 면적과 30%의 인접 스캔 사이의 중첩을 통해 수득하였다. 달성된 총 스캔 면적은 24×353mm입니다. 평균 생체부피는 입구로부터의 거리의 함수로서 현저하게 감소하였다(I). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5. 위치 지정 장치에 대한 정밀 도면 테스트. 포지셔닝 장치의 정밀도는 35mm 매크로 렌즈가 장착된 20.2메가픽셀 카메라를 컬러 마크에 맞추어 평가했습니다. 포지셔닝 장치는 마크에서 떨어진 임의의 방향으로 이동한 다음 총 80사이클 동안 다시 위치시켰다. 그런 다음 마크의 위치를 비교했습니다. 그림은 첫 번째 그림과 관련하여 x 및 y 방향의 변화를 보여줍니다. 최대 시프트는 y 방향에서 약 16 μm이며 x 방향에서는 더 적습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1. ImageProcessing.ipynb. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2. 이미지수집.ipynb. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

OCT 이미징은 수 제곱 밀리미터의 FOV로 마이크로미터 범위의 구조를 해결하는 데 적합합니다. 따라서 생물막 연구를 위한 강력한 도구10,18. 그러나 OCT는 현재 최대 스캔 면적이 100- 256 mm2로 제한되어 있으며, 생물막 구조 패턴은 종종 이 공간 스케일19를초과하는 반면, 특히 형태학적 차별화가 대규모 환경 그라데이션에 의해 구동되는 경우 20. 이 프로토콜에 설명된 자동화된 OCT 이미징 시스템은 OCT를 특징으로 하는 표면적을 몇 평방 센티미터까지 확장하여 관련 공간 스케일 범위에서 생물막 형태학적 분화를 효과적으로 모니터링할 수 있게 합니다. (몇 밀리미터에서 몇 센티미터까지). 높은 포지셔닝 정확도(16 μm 이내; 그림5) 장시간 생물막의 구조적 발달을 정확하게 모니터링할수 있습니다(그림 4) 생물막 형태학적 분화의 동인에 대한 기계적 이해를 얻을 수 있는 기회를 효과적으로 증폭시킵니다. . 동시에, 이러한 현장에서 의 생물막 특성화 기술은 비침습적이며 생물막 성장과의 간섭을 최소화한다. 여기에 제시된 이미지 처리 솔루션은 이전에 사용하던 생물막 OCT 데이터 세트16의분석을 기반으로 하지만 자동화는 전례 없는 시간 및 공간 해결 OCT 데이터 집합 분석을 위한 도구를 제공합니다.

이 시스템은 프로토콜에 설명된 대로 특정 OCT 장치로 구상되고 벤치마킹되었습니다. 프로토콜의 중요한 단계는 주로 높은 이미지 품질에 중요한 OCT 해상도 및 초점 설정과 관련이 있습니다. 구면 수차 루틴의 보정의 한계는 반사율이 높은 평평한 표면의 존재에 달려 있다는 것입니다. 또는 표준 보정 표면을 측정한 다음 OCT 스캔을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 OCT 스캔의 스티칭은 인접 스캔을 정렬하기에 충분한 구조적 특징에 따라 달라집니다. 균일한 생물막 분포 또는 낮은 생물막 커버리지의 경우, 스티치는 포지셔닝 장치의 정밀도에만 의존하여 달성될 수 있다. 마지막으로, 다른 이미지 처리 파이프라인과 마찬가지로 이러한 도구를 설정할 때 이미지 일괄 처리를 처리하기 전에 대표 검사 집합에서 처리 알고리즘의 성능을 신중하게 평가하는 것이 중요합니다.

하드 및 소프트웨어는 모두 개별 부품의 완전한 모듈성을 제공하도록 설계되었습니다. 보다 구체적으로, 이 시스템은 하이퍼스펙트럼 카메라 또는 마이크로센서 프로파일링을 이용한 매크로 사진 이미징과 같은 생물막 특성화를 위한 다른 도구와 함께 쉽게 조정할 수 있습니다. 구조 정보와 생물막 내의 지역화된 그라데이션의 결합은 생물막이 자원 할당을 최적화하기 위해 어떻게 적응되는지에 대한 새로운 중추적 인 통찰력을 제공합니다. 또한 개방형, 빠르고 다재다능한 소프트웨어 개발 도구인 Jupyter 노트북을 사용하여 유연성을 구현할 수 있습니다.

OCT 이미징의 중요한 한계는 일반적으로 빠르게 움직이는 물체를 해결하기 위해 장애로 남아 있습니다. 예를 들어, 흐름에 따라 길어지고 이동하는 스트리머는 정확하게 묘사되지 않습니다. 따라서 이 도구의 적용가능성은 상대적으로 고정되고 움직이지 않는 생물막 구조로 제한됩니다. 이 시스템은 자율적으로 작동하도록 최적화되어 있지만 초기 설정과 필요한 경우 초점 및 조명의 수동 조정이 여전히 필요합니다. 이는 샘플이 밀도와 반사 특성이 크게 다를 경우 상당한 제한을 나타냅니다. 그러나 소프트웨어 유도 초점 조정 및 조명 조정을 포함한 전체 자동화는 유사한 원칙(예: 스테퍼 모터 및 소프트웨어-하드웨어 피드백)을 사용하여 달성될 수 있습니다.

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Disclosures

세바스찬 셰퍼는 Thorlabs Inc.에서 근무하고 있습니다.

Acknowledgments

마우리시오 아구에르 모랄레스가 이 시스템 개발에 기여한 것에 대해 감사드립니다.  재정 지원은 스위스 국립 과학 재단에서 T.J.B에 왔습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OCT Probe Thorlabs GAN210C1 OCT imaging device
OCT scan lens Thorlabs  OCT-LK3-BB
Immersion adapter Thorlabs  OCT-IMM3-SP1
Stepcraft 840 CK STEPCRAFT NA positioning device
microcontroller Arduino Uno R3 NA
Single-board computer Raspberry PI NA
camera Canon EOS 7D Mark II NA
camera lens Canon MACRO EFS 35 mm NA

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References

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