बड़े स्थानिक तराजू पर स्पष्ट बायोफिल्म Morphogenesis के लिए स्वचालित 3 डी ऑप्टिकल सामंजस्य टॉमोग्राफी

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Summary

सूक्ष्मजीवी जैवफिल्में इंटरफेज में जटिल आर्किटेक्चर बनाती हैं और अत्यधिक पैमाने पर निर्भर स्थानिक पैटर्न में विकसित होती हैं। यहाँ, हम 3 डी ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) डेटासेट के स्वचालित अधिग्रहण के लिए एक प्रयोगात्मक प्रणाली (हार्ड और सॉफ्टवेयर) पेश करते हैं। इस toolset अंतरिक्ष और समय में biofilm morphogenesis के गैर इनवेसिव और बहु पैमाने पर विशेषता की अनुमति देता है.

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Depetris, A., Wiedmer, A., Wagner, M., Schäfer, S., Battin, T. J., Peter, H. Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales. J. Vis. Exp. (150), e59356, doi:10.3791/59356 (2019).

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Abstract

Biofilms एक सबसे सफल माइक्रोबियल जीवन शैली है और पर्यावरण और इंजीनियर सेटिंग्स की एक भीड़ में प्रबल. जैवफिल्म रूपजनन को समझना, जो सामुदायिक सम्मेलन के दौरान जैव फिल्मों का संरचनात्मक विविधीकरण है, स्थानिक और लौकिक पैमाने पर एक उल्लेखनीय चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। यहाँ, हम ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) पर आधारित एक स्वचालित बायोफिल्म इमेजिंग सिस्टम प्रस्तुत करते हैं। OCT biofilm अनुसंधान में एक उभरती इमेजिंग तकनीक है. तथापि, वर्तमान में प्राप्त और संसाधित किए जा सकने वाले आंकड़ों की मात्रा बायोफिल्म आकारिकी में बड़े पैमाने पर पैटर्न के सांख्यिकीय अनुमान को बाधित करती है। स्वचालित ओसीटी इमेजिंग प्रणाली बायोफिल्म विकास के बड़े स्थानिक और विस्तारित अस्थायी तराजू को कवर करने की अनुमति देता है। यह एक रोबोट स्थिति मंच और सॉफ्टवेयर समाधान के एक सूट के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध OCT प्रणाली को जोड़ती है OCT स्कैनिंग जांच की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए, साथ ही अधिग्रहण और 3 डी biofilm इमेजिंग डेटासेट के प्रसंस्करण. इस सेटअप में situ और गैर इनवेसिव बायोफिल्म विकास की स्वचालित निगरानी की अनुमति देता है और आगे मैक्रोफोटोग्राफी और microsensor रूपरेखा के साथ कुछ OCT इमेजिंग के लिए विकसित किया जा सकता है.

Introduction

बायोफिल्म्स एक अत्यंत सफल माइक्रोबियल जीवन शैली अनुकूलन हैं और सूक्ष्मजीवों के इन अंतर-कलाज-संबद्ध और मैट्रिक्स-संलग्न समुदाय प्राकृतिक और औद्योगिक सेटिंग्स1,2में माइक्रोबियल जीवन पर हावी हैं। वहाँ, बायोफिल्म्स जटिल आर्किटेक्चर का निर्माणकरती हैं, जैसे लम्बी स्ट्रीमर 3, लहर4 या मशरूम की तरह टोपियां5 बायोफिल्म विकास, संरचनात्मक स्थिरता और तनाव के लिए प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण परिणामों के साथ6. जबकि biofilm संरचनात्मक भेदभाव के बारे में बहुत लघु प्रवाह कक्षों में विकसित मोनो प्रजातियों संस्कृतियों पर काम से सीखा गया है, सबसे biofilms अत्यधिक जटिल समुदायों अक्सर जीवन के सभी डोमेन के सदस्यों सहित कर रहे हैं6. माइक्रोबियल परिदृश्य7 के रूप में इन जटिल biofilms की सराहना करते हुए और समझ कैसे biofilm संरचना और समारोह जटिल समुदायों में बातचीत इस प्रकार biofilm अनुसंधान के मामले में सबसे आगे है.

पर्यावरणीय संकेतों के प्रत्युत्तर में जटिल बायोफिल्म्स के रूपजनन की एक यंत्रवादी समझ के लिए प्रासंगिक भर में बायोफिल्म भौतिक संरचना के स्थानिक और लौकिक रूप से हल किए गए प्रेक्षणों के साथ संयोजन के रूप में सावधानीपूर्वक डिजाइन किए गए प्रयोगों की आवश्यकता होती है। तराजू8| हालांकि, प्रयोगात्मक प्रणालियों में biofilm विकास के गैर विनाशकारी अवलोकन गंभीर रूप से इस तरह के नमूने ले जाने की जरूरत के रूप में रसद बाधाओं द्वारा सीमित किया गया है (जैसे, एक माइक्रोस्कोप के लिए) अक्सर नाजुक biofilm संरचना को नुकसान पहुँचा.

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऑप्टिकल सामंजस्य टोमोग्राफी (OCT) के आधार पर एक पूरी तरह से स्वचालित प्रणाली का परिचय है, जो insitu की अनुमति देता है, biofilm morphogenesis के गैर इनवेसिव निगरानी mesoscale (मिमी रेंज). OCT पानी के उपचार और biofouling अनुसंधान, दवा9 और धारा पारिस्थितिकी10में अनुप्रयोगों के साथ biofilm अनुसंधान में एक उभरती इमेजिंग तकनीक है. OCT में, एक कम सामंजस्य प्रकाश स्रोत एक नमूना और संदर्भ हाथ में विभाजित है; प्रकाश के हस्तक्षेप परावर्तित और biofilm (नमूना हाथ) द्वारा बिखरे हुए और संदर्भ हाथ के प्रकाश का विश्लेषण किया है. अक्षीय तीव्रता प्रोफाइल (ए-स्कैन) की एक श्रृंखला जिसमें गहराई से हल की गई संरचनात्मक जानकारी शामिल है, का अधिग्रहण किया जाता है और बी-स्कैन (एक क्रॉस सेक्शन) में विलय कर दिया जाता है। आसन्न बी स्कैन की एक श्रृंखला अंतिम 3 डी मात्रा स्कैन10composes. ओसीटी लगभग 10 डिग्री मीटर की सीमा में एक पार्श्विक ऑप्टिकल संकल्प प्रदान करता है और इसलिए बायोफिल्म्स10,12के मध्यदर्शी संरचनात्मक विभेद का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है . OCT के एक अधिक विस्तृत विवरण के लिए, Drexler और फ़ूजीमोटो13और Fercher और उनके सहयोगियों14को देखें. हालांकि एक एकल OCT xy-स्कैन के क्षेत्र के दृश्य वर्ग micrometers के सैकड़ों तक पहुँच जाता है, बड़े पैमाने पर पैटर्न एक ही स्कैन में OCT के माध्यम से मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता है. नदियों और नदियों जैसे प्राकृतिक आवासों में बायोफिल्मों के संबंध में, यह वर्तमान में निवास के भौतिक और हाइड्रोलिक टेम्पलेट से मेल खाने वाले पैमानों पर बायोफिल्म मॉर्पोजेनेसिस का आकलन करने की हमारी क्षमता को सीमित करता है।

आदेश में इन स्थानिक सीमा को पार करने के लिए और स्वचालित रूप से OCT स्कैन प्राप्त करने के लिए, एक वर्णक्रमीय डोमेन OCT इमेजिंग जांच एक 3-अक्ष स्थिति प्रणाली पर रखा गया था. स्थापना एक ओवरलैपिंग मोज़ेक पैटर्न (टाइल स्कैन) में कई OCT स्कैन के अधिग्रहण की अनुमति देता है, प्रभावी ढंग से 100 सेमी2तक सतह क्षेत्रों के tomographic इमेजिंग को प्राप्त करने. इसके अलावा, इस प्रणाली की उच्च स्थिति परिशुद्धता मज़बूती से विकास और लंबी अवधि के प्रयोगों के दौरान विशिष्ट साइटों में biofilm सुविधाओं के विकास की निगरानी करने के लिए सक्षम बनाता है. प्रणाली मॉड्यूलर और व्यक्तिगत घटक है (यानी, स्थिति डिवाइस और OCT) स्थापना के स्टैंडअलोन समाधान या flexibly संयुक्त के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्र 1 स्थापना के हार्ड- और सॉफ़्टवेयर घटकों का ओवरव्यू प्रदान करता है.

प्रणाली एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध GRBL नियंत्रित सीएनसी स्थिति उपकरण (सामग्री की तालिका)केसाथ परीक्षण किया गया था. इस विशिष्ट स्थिति मंच के ऑपरेटिंग दूरी 600 "840 ] 140 मिमी, एक निर्माता के साथ संकेत सटीकता +/ - 0.05 मिमी और 0.005 मिमी के एक प्रोग्राम संकल्प GRBL एक खुला स्रोत है (GPLv3 लाइसेंस), सीएनसी के लिए उच्च प्रदर्शन गति नियंत्रण उपकरणों. इसलिए, हर GRBL आधारित (संस्करण gt; 1.1) स्थिति डिवाइस दिशा निर्देशों और सॉफ्टवेयर यहाँ प्रस्तुत संकुल के साथ संगत होना चाहिए. इसके अलावा, सॉफ्टवेयर कुछ संशोधनों के साथ कदम-DIR इनपुट प्रकार के साथ अन्य stepmotor नियंत्रकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

सिस्टम के निष्पादन का आकलन करने के लिए प्रयुक्त ओसीटी डिवाइस (सामग्री की तालिका) में 930 दउ (बैंडविड्थ ] 160 दउ) और समायोज्य संदर्भ भुंलना लंबाई और तीव्रता के केंद्र तरंगदैर्ध्य के साथ कम सामंजस्य प्रकाश स्रोत है। यहाँ प्रस्तुत उदाहरण में, ओसीटी जांच को बहते पानी में डुबोने के लिए एक विसर्जन अनुकूलक का भी उपयोग किया गया था (सामग्री की तालिका) । स्वचालित OCT स्कैन अधिग्रहण के लिए यहाँ विकसित सॉफ्टवेयर पैकेज गंभीर रूप से विशिष्ट OCT प्रणाली के साथ एक साथ प्रदान की एसडीके पर निर्भर करता है, हालांकि, अलग स्कैन लेंस और केंद्रीय तरंगदैर्ध्य के साथ एक ही निर्माता से OCT सिस्टम होना चाहिए आसानी से संगत.

GRBL डिवाइस एक एकल बोर्ड कंप्यूटर पर स्थापित एक वेब सर्वर द्वारा नियंत्रित किया जाता है (चित्र1). यह स्थानीय नेटवर्क या इंटरनेट का उपयोग के साथ किसी भी कंप्यूटर से डिवाइस के रिमोट कंट्रोल अनुदान. OCT डिवाइस एक अलग कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जाता है, OCT प्रणाली के संचालन की अनुमति एक तरफ स्वचालित प्रयोगात्मक सेटअप. अंत में, सॉफ्टवेयर संकुल OCT जांच स्थिति और OCT स्कैन अधिग्रहण सिंक्रनाइज़ करने के लिए पुस्तकालयों में शामिल हैं (यानी, स्वचालित रूप से एक मोज़ेक पैटर्न में या परिभाषित पदों का एक सेट में 3 डी इमेजिंग डेटासेट प्राप्त करने के लिए). 3 डी में OCT जांच की स्थिति को परिभाषित प्रभावी ढंग से स्कैन के (क्षेत्रीय) सेट के लिए विशेष रूप से फोकल विमान को समायोजित करने के लिए अनुमति देता है. विशेष रूप से, असमान सतहों पर, विभिन्न फोकल विमानों (यानी, z दिशा में विभिन्न पदों) प्रत्येक OCT स्कैन के लिए निर्दिष्ट किया जा सकता है.

कच्चे ओसीटी स्कैन (सारणी 1) को संसाधित करने के लिए सॉफ्टवेयर पैकेजों का एक सेट विकसित किया गया था। स्थिति डिवाइस के नेविगेशन, OCT स्कैन अधिग्रहण और डेटासेट प्रसंस्करण पायथन कोडित Jupyter नोटबुक, जो विकास और सॉफ्टवेयर के अनुकूलन में उल्लेखनीय लचीलापन की अनुमति के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं. दो काम किया और ऐसी पुस्तिकाओं के एनोटेट उदाहरण (छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण के लिए, क्रमशः) https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git वे अनुकूलन के लिए प्रारंभिक अंक के रूप में इरादा कर रहे हैं से उपलब्ध हैं विधि की. एक Jupyter नोटबुक एक वेब ब्राउज़र आधारित अनुप्रयोग है जो एनोटेटेड पायथन कोड के साथ कोशिकाओं को शामिल है. प्रत्येक चरण नोटबुक के एक सेल में निहित है, जो अलग से निष्पादित किया जा सकता है. स्कैन लेंस (गोलीय विपथन)15के माध्यम से प्रकाश पथ की विभिन्न लंबाई के कारण कच्चे ओसीटी स्कैन विकृत दिखाई देते हैं (चित्र 2क) . हमने अधिग्रहीत OCT स्कैन में इस विरूपण को स्वचालित रूप से ठीक करने के लिए एक एल्गोरिथ्म विकसित किया है (ImageProcessing.ipynb, अनुपूरक फ़ाइल 1)में निहित है। इसके अलावा, biofilm आकारिकी एक 2 डी ऊंचाई नक्शे के रूप में कल्पना की जा सकती है, के रूप में पहले झिल्ली प्रणालियों में इस्तेमाल किया गया था16, और हम वर्णन कैसे ऊंचाई नक्शे एक टाइल सरणी में लिया स्कैन से प्राप्त सिले जा सकता है.

अंत में, वर्णित प्रयोगशाला स्थापना की कार्यक्षमता एक flume प्रयोग जिसमें phototrophic धारा biofilm प्रवाह वेग की एक ढाल को उजागर किया जाता है का उपयोग कर सचित्र है.

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Protocol

1. पोजिशनिंग डिवाइस का सेटअप

  1. https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl में अनुदेश का अनुसरण करते हुए स्थिति को माइक्रो नियंत्रक बोर्ड से तार-
  2. एक यूएसबी केबल के माध्यम से इंटरनेट कनेक्शन के साथ एक एकल बोर्ड कंप्यूटर के लिए microcontroller कनेक्ट और https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git में वर्णित के रूप में GRBL सर्वर स्थापित करें। अब स्थिति डिवाइस http://IP:5020/ पर होस्ट एक वेबपेज से navigable होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, स्थिति डिवाइस एक पायथन स्क्रिप्ट के साथ नेविगेट किया जा सकताहै, के रूप में काम किया उदाहरण ImagesAcquisition.ipynb (अनुपूरक फ़ाइल 2) के पहले भाग में प्रदर्शन किया.

2. ओसीटी सेटअप

  1. एक संगत कबूतर पूंछ धारक का उपयोग कर स्थिति डिवाइस के लिए OCT जांच माउंट. यदि आवश्यक हो, उद्देश्य लेंस पर एक विसर्जन एडाप्टर स्थापित करें.
  2. कंप्यूटर और OCT आधार इकाई को प्रयोग के बगल में स्थित करना (उदा., माइक्रोफ्लूइडी डिवाइस, फ्लो कक्ष, फ्लूम, निस्पंदन सिस्टम)। सुनिश्चित करें कि ऑप्टिकल कॉर्ड (लगभग 1.8 मीटर की अधिकतम लंबाई) स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ रहा है, लंबे समय तक सभी इच्छित स्थानों तक पहुँचने के लिए और प्रयोगात्मक सेटअप के साथ हस्तक्षेप नहीं.
  3. निर्माता द्वारा वर्णित के रूप में उपलब्ध सॉफ़्टवेयर के साथ OCT सिस्टम स्थापित करें।
  4. https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git में वर्णित के रूप में स्वचालित OCT स्कैन प्राप्ति के लिए सॉफ़्टवेयर पैकेज स्थापित करें।

3. छवि अधिग्रहण

  1. OCT प्रणाली और स्थिति डिवाइस पर पावर. सुनिश्चित करें कि डिवाइस स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकते हैं।
  2. किसी पाठ संपादक में फ़ाइल config.Json खोलें। डिफ़ॉल्ट छवि प्राप्ति पैरामीटर (तालिका 2), जैसेकि 20 डिग्री सेल्सियस पर जल के लिए अपवर्तक अनुक्रमणिका (1.33, हवा के लिए 1.00) और अधिग्रहीत डेटा और मेटाडेटा के लिए गंतव्य फ़ोल्डर समायोजित करने के लिए config.Json फ़ाइल संपादित करें.
  3. फ़ील्ड-ऑफ-व्यू (FOV) का आकार और config.Jsonमें B-स्कैन प्रति A-स्कैन की संख्या निर्धारित करें।
    नोट: ये दो पैरामीटर अंतिम डेटासेट के voxels और आउटपुट फ़ाइल का आकार का आकार निर्धारित करते हैं और जांच के ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन से मेल खाना चाहिए (x-y voxel आकार ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन के आधे से छोटा नहीं होना चाहिए)। ए- और बी-स्कैन की संख्या को कवर किया जा करने के लिए स्थानिक सीमा को प्रभावित करता है जो उपलब्ध डिस्क स्थान और प्रसंस्करण शक्ति के खिलाफ ट्रेडों बंद।
  4. config.Jsonमें उत्पादन OCT स्कैन के संकेत सीमाओं को परिभाषित करें। ये नमूने के प्रकार पर निर्भर करते हैं। इस प्रकार प्रारंभिक स्कैन के एक सेट की तीव्रता हिस्टोग्राम के आधार पर इन पैरामीटरों को निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है। config.Jsonमें परिवर्तन सहेजें.
  5. ब्याज की एक साइट के लिए OCT जांच नेविगेट. नमूना फोकस और इष्टतम छवि गुणवत्ता के लिए संदर्भ हाथ और प्रकाश स्रोत तीव्रता को समायोजित। पदों की एक संख्या के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ और निर्देशांक नोट.
    नोट: यह बाद में स्वत: OCT स्कैन अधिग्रहण इन संदर्भ बिंदुओं के आसपास की अनुमति देगा. ध्यान दें कि संदर्भ हाथ लंबाई और तीव्रता स्वचालित छवि प्राप्ति के दौरान बदला नहीं जा सकता।
  6. Juypter नोटबुक में ImageAccuipriition.ipynb फ़ाइल (अनुपूरक फ़ाइल 2) खोलें. प्रत्येक सेल विशिष्ट कार्य करने के लिए कोड होता है और सेल दबाने के माध्यम से अलग से चलाया जा सकता है | चलाएँ,या Ctrl + Enter या Shift + Enter.
    1. आवश्यक लायब्रेरीज़ और डिफ़ॉल्ट कॉन्फ़िगरेशन पैरामीटर के लिए पथ सेट करें। वैकल्पिक रूप से, अस्थायी पैरामीटर का एक नया सेट परिभाषित करें।
    2. स्थिति डिवाइस से कनेक्ट करें और OCT को प्रारंभ करें.
    3. स्थिति डिवाइस को कैलिब्रेट करें (यानी, "homing") निष्पादित करें.
    4. संख्या और ओवरलैप निर्दिष्ट करते हुए, एकल-स्कैन या मोज़ेक पैटर्न में हितों की स्थितियों को कवर करने वाले डेटासेट प्राप्त करें (उदा., 30%) पड़ोसी टाइल्स की.
      नोट: स्मृति स्कैन, जो कंप्यूटर संसाधन का उपयोग ऑप्टिमाइज़ करने से पहले आवंटित किया जाता है। डेटा 8 बिट्स में सहेजा जाता है *.raw प्रारूप भंडारण स्थान को बचाने के लिए, config.Jsonमें परिभाषित गंतव्य फ़ोल्डर में, समय स्टाम्प और नामकरण कन्वेंशन के रूप में स्थिति का उपयोग कर (यानी, %Y%m%d%M%S$lt;स्थिति और gt;). OCT सेटिंग्स और निर्देशांकसहित मेटाडेटा एक ही नामकरण कन्वेंशन के साथ *.srm फ़ाइल में एक ही फ़ोल्डर में सहेजे जाते हैं। FOV और रिज़ॉल्यूशन जैसी सेटिंग्स के आधार पर, फ़ाइल का आकार 1.5 GB प्रति OCT स्कैन तक पहुँच सकता है.
  7. डेटा प्राप्ति के गर्भपात से बचने के लिए, सुनिश्चित करें कि पर्याप्त मुक्त डिस्क स्थान है या लगातार OCT डेटासेट को किसी बाहरी हार्ड ड्राइव पर ले जाएँ.

4. छवि सुधार और प्रदर्शन

  1. OCT छवि प्रसंस्करण (विरूपण का सुधार, पृष्ठभूमि घटाव, ऊंचाई नक्शे की गणना, ऊंचाई नक्शा सिलाई) का एक काम उदाहरण के लिए Jupyter नोटबुक ImageProcessing.ipynb खोलें (अनुपूरक फ़ाइल1)।
  2. यदि आवश्यक हो, तो नकली संकेतों को बाहर करने के लिए फसल OCT स्कैन करता है और डेटासेट को फिर से उन्मुख करता है (बायोफिल्म सब्सट्रम के ऊपर दिखाई देनी चाहिए)।
  3. गोलाकार विपथन के लिए सही. यह एक सुधार एल्गोरिथ्म है कि एक अत्यधिक चिंतनशील संदर्भ फ्लैट होने के लिए जाना जाता सतह का इस्तेमाल द्वारा पूरा किया है (उदा., flume के नीचे, सब्सट्रेम). सबसे पहले, एल्गोरिथ्म 20 डिग्री 20 ऊर्ध्वाधर लाइनों के एक ग्रिड नियमित रूप से OCT स्कैन के xy-तल भर में स्थान निर्धारित करता है. फिर, यह प्रत्येक बिंदु के चारों ओर एक वृत्ताकार क्षेत्र का चयन करता है और ऊर्ध्वाधर प्रोफ़ाइल के साथ औसत संकेत तीव्रता (चित्र 2ख)। ऊर्ध्वाधर प्रोफाइल एक संशोधित गाऊसी फिल्टर के साथ संसाधित कर रहे हैं:
    Equation 1
    जहाँ इनपुट संकेत है, और इसके मानक विचलन, जबकि C इस प्रकार निर्धारित किया जाता है:
    Equation 2
    संदर्भ सतह इन प्रोफाइल में से प्रत्येक में स्थानीय maxima के रूप में स्थानीयकृत है। गलत पहचान वाले बिंदुओं को अपने पड़ोसियों की स्थितियों के आधार पर तीन आयामों में फ़िल्टर किया जाता है (चित्र 2C) अंत में, स्कैन लेंस द्वारा प्रस्तुत विरूपण को दर्शाती एक 2आदेश बहुपदीय सतह इन बिंदुओं पर लगी हुई है (चित्र 2ब्)। फिट सतह तो z-दिशा में प्रत्येक पिक्सेल बदलाव, इस प्रकार एक चपटा छवि प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस एल्गोरिथ्म के पैरामीटर OCT स्कैन की विशेषताओं के लिए समायोजित किया जाना चाहिए.
  4. पृष्ठभूमि शोर के लिए सही है. छवि के एक खाली क्षेत्र की पहचान (आमतौर पर biofilm के ऊपर) और एक अंतिम सही OCT छवि का उत्पादन करने के लिए छवि की तीव्रता मूल्यों से औसत पृष्ठभूमि तीव्रता घटाना सुधार एल्गोरिथ्म का उपयोग करें (चित्र 2 डी).
  5. 3D OCT डेटासेट से एक ऊंचाई मानचित्र की गणना करें। इस चरण में, विशिष्ट प्रयोग (उदा., सब्सट्रेटम) और एक उपयुक्त थ्रेशोल्ड तीव्रता के लिए ब्याज की एक संदर्भ सतह को परिभाषित करें। फिर, द्विआधारी मुखौटा के प्रत्येक निर्देशांक (x,y) के लिए biofilm की मोटाई की गणना करने के लिए उन्नयन नक्शा गणना एल्गोरिथ्म का उपयोग करें और यह एक नया 2 डी मैट्रिक्स के लिए आवंटित (चित्र 3A). मोटाई मूल्यों तो एक्स और वाई दिशाओं में मूल छवि के आकार का एक 2 डी मैट्रिक्स को आवंटित कर रहे हैं. एक प्रतिबिंब प्रदान किया जाता है जिसमें पृष्ठ की ऊँचाव को स्केल मान के रूप में सूचित किया जाता है (चित्र 3ख)।
  6. मामले में कई OCT स्कैन एक मोज़ेक पैटर्न में लिया जाता है, पंक्तियों और स्तंभों की संख्या को परिभाषित करने और संबंधित ऊंचाई नक्शे सिलाई। चित्र 5 सिले ऊंचाई नक्शे के उदाहरण प्रस्तुत करता है, स्थानिक तराजू और वर्णित सेटअप के साथ प्राप्त संकल्प की व्यापक रेंज को कवर.

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Representative Results

हम phototrophic धारा biofilms के spatio-अस्थायी morphogenesis का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक flume प्रयोग का उपयोग कर स्वचालित OCT इमेजिंग प्रणाली की कार्यक्षमता प्रदर्शित करते हैं. फ्लूम के केंद्र के साथ प्रवाह वेग में फ्लूज प्रेरित ग्रेडिएंट की धीरे-धीरे संकुचन ज्यामिति (संदर्भ17देखें)।  बायोफिल्म फार्मोजेनेसिस पर हाइड्रोडायनामिक स्थितियों के प्रभावों को बेहतर ढंग से समझने के उद्देश्य से 18 दिनों में बायोफिल्म के अस्थायी विकास और संरचनात्मक विभेद नों कए गए। चित्रा 4 एक biofilm microcolony के विकास को दर्शाता है विकास के 18 दिनों से अधिक पीछा किया. बायोफिल्म की सतह ी आकृति विज्ञान को ऊपर वर्णित टूलसेट का उपयोग करके परिमाणित किया गया था (चित्र 4क) जैव मात्रा की गणना की गई थी (कार्य उदाहरण ImageProcessing.ipynb, अनुपूरक फ़ाइल 1) प्रवाह वेग ढाल के साथ प्रत्येक स्थिति के लिए 3.6 मिमी किनारे की लंबाई के साथ एक वर्ग चलती विंडो के लिए ( चित्र4B) की गणना की गई थी (चित्र 4ब्) Biofilm संचय काफी प्रवाह वेग में वृद्धि के साथ कमी आई (प्रवाह के व्यापक भाग से दूरी के रूप में संकेत दिया; चित्र 4) . महत्वपूर्ण बात, इस प्रयोगात्मक सेटअप बड़े स्थानिक gradients के साथ संरचनात्मक मानकों (जैसे, biovolume, मोटाई, खुरदरापन) की एक सतत माप की अनुमति देता है. इसलिए, इस नए उपकरण biofilm संरचना और पर्यावरण संकेतों के बीच संबंधों में अंतर्दृष्टि हासिल करने का मतलब प्रदान करता है.

सॉफ़्टवेयर घटक विवरण
stepcraft.py स्थिति डिवाइस को नियंत्रित करने के लिए एक पायथन लायब्रेरी. यह नेविगेट और डिवाइस homing के लिए परिभाषाएँ शामिल हैं।
OctControl.सीपीपी C+ कोड OCT सिस्टम के साथ वितरित सॉफ़्टवेयर डेवलपमेंट किट (SDK) से व्युत्पन्न है. यह VisualStudio 2017, PythonC/API और SDK का उपयोग कर संकलित करने के लिए है।
ImagesAcquisition.py चयनित पदों में OCT स्कैन लेने और स्कैन टाइलिंग पैटर्न को परिभाषित करने के लिए आदेशयुक्त एक पायथन लाइब्रेरी.
छवियाँअधिग्रहण.ipynb स्थिति डिवाइस नेविगेट करने के लिए इस्तेमाल किया Jupyter नोटबुक, OCT स्कैन प्राप्त करने और स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए.
OctCorrection.py एक अजगर पुस्तकालय कच्चे OCT छवियों और पृष्ठभूमि घटाव के सुधार के लिए इस्तेमाल किया कार्यों को परिभाषित.
OctProcessing.py एक पायथन पुस्तकालय जिसमें उन्नयन मानचित्रों की गणना और सिलाई करने के कार्य होते हैं.
ऑक्टप्रसंस्करण.ipynb Jupyter नोटबुक कल्पना करने के लिए, सही है और प्रक्रिया OCT स्कैन. यह भी biovolume गणना का एक उदाहरण है.

तालिका 1| सॉफ़्टवेयर घटक.

पैरामीटर मान विवरण
गैनिमेड 1, 2, 3 OCT प्रणाली और संस्करण का विकल्प
जांच 1, 2 स्कैन लेंस का विकल्प
नैस्कन्स 32-900 बी-स्कैन प्रति A-स्कैन की संख्या
एन बी स्कैन्स 1-900 बी-स्कैन की संख्या
एन सी स्कैन्स 128-1024 गहराई पिक्सेल की संख्या
एक्स 0.1-10 x-दिशा में छवि का आकार (मिमी)
वाई 0.1-10 y दिशा में छवि का आकार (मिमी)
अपवर्तन 1-1.6 अपवर्तक सूचकांक (1 हवा के लिए, पानी के लिए 1.33)
एवीजी]एस्कैन्स 3 A-स्कैन औसत की संख्या
स्कैन स्पीड 1,2,3 A-स्कैन दर (5.5, 15 और 36 kHz)
पथ ".. / %Y-%m-%d$%H$%M$%S" अधिग्रहीत OCT स्कैन के लिए गंतव्य फ़ोल्डर, नामकरण confention के रूप में समय स्टाम्प का उपयोग करता है
color-Boundaries [0.0-256.0,0.0-256.0] अधिग्रहीत स्कैन की रंग सीमाएं

तालिका 2| OCT पैरामीटर सेटिंग्स.

Figure 1
चित्र 1. हार्ड और सॉफ्टवेयर घटकों का अवलोकन. एक GRBL नियंत्रित स्थिति डिवाइस के stepmotors एक microcontroller करने के लिए वायर्ड रहे हैं, एक एकल बोर्ड कंप्यूटर के लिए यूएसबी के माध्यम से जुड़े. GRBL सर्वर बाद पर स्थापित किया गया है, और स्थिति डिवाइस की गति TCP/IP कनेक्शन के माध्यम से किसी भी वेब ब्राउज़र से नियंत्रित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, स्थिति डिवाइस के नेविगेशन से किया जा सकता है एक Python-एनकोडेड Jupyter नोटबुक (ImagesAccuipration.ipynb, अनुपूरक फ़ाइल 2) GRBLServer.py लायब्रेरी का उपयोग कर. OCT सिस्टम एक अलग कंप्यूटर से जुड़ा है जिसमें से स्वचालित OCT स्कैन अधिग्रहण एक पायथन स्क्रिप्ट के माध्यम से किया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. OCT स्कैन सुधार वर्कफ़्लो. पैनल ए एक फ्लैट plexiglass सतह पर बढ़ रही biofilm के एक गैर संसाधित बी स्कैन से पता चलता है. लेंस के माध्यम से निम्न सामंजस्य प्रकाश की पथ लंबाई में अंतर के कारण प्रतिबिंब विकृत (बंट) है। OCT छवि विरूपण छवि में एक दृढ़ता से दर्शाती है, फ्लैट संदर्भ सतह की पहचान करके सही किया जा सकता है. सबसे पहले, 20 डिग्री 20 संदर्भ अंक समान रूप से छवियों के पूरे ढेर भर में वितरित कर रहे हैं. इन बिंदुओं में से प्रत्येक में, छवि संकेत एक परिपत्र क्षेत्र भर में औसत है (x-y दिशा में) प्रत्येक गहराई के लिए (z विमान), संकेत तीव्रता का एक औसत गहराई प्रोफ़ाइल प्राप्त करने. उसके बाद, एक संशोधित गाऊसी फ़िल्टर 400 संदर्भ प्रोफ़ाइल में से प्रत्येक के लिए लागू किया जाता है। पैनल बी पैनल ए में ऊर्ध्वाधर लाल रेखा द्वारा संकेत गहराई प्रोफ़ाइल के साथ मूल संकेत का एक उदाहरण प्रदान करता है, औसत गहराई प्रोफ़ाइल, और संशोधित गाऊसी फिल्टर लागू किया गया है के बाद एक ही प्रोफ़ाइल. संशोधित गाऊसी फिल्टर संकेत तीव्रता में स्थानीय maxima की पहचान की अनुमति देता है, इस प्रकार दृढ़ता से दर्शाती संदर्भ सतह के स्थान की पहचान. सही ढंग से पहचान संदर्भ अंक तो तीन आयामों में अपने पड़ोसियों के निर्देशांक के आधार पर चुना जाता है. पैनल सी में उदाहरण में, पीले अंक बाद छवि सुधार के लिए रखा गया था, जबकि बैंगनी लोगों को खारिज कर दिया गया. एक 2nd आदेश बहुपद सतह तो सही ढंग से रखा संदर्भ अंक के लिए फिट है और z दिशा में पिक्सल स्थानांतरण द्वारा मूल OCT छवि में विरूपण को सही करने के लिए इस्तेमाल किया. औसत पृष्ठभूमि तीव्रता छवि के एक खाली क्षेत्र से अनुमान लगाया है और सही छवियों से घटाया. पैनल डी सुधार और पृष्ठभूमि घटाव के बाद एक ही बी स्कैन से पता चलता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. ऊंचाई नक्शे. Biofilm टोपोलॉजी 2 डी ऊंचाई नक्शे जिसमें बायोमास की मोटाई रंग कोडित है के रूप में कल्पना की जा सकती है. इसके लिए, एक 3 डी OCT छवि थ्रेशोल्ड और biofilm मोटाई सब्सट्रेट करने के लिए सबसे ऊपर संकेत की दूरी के रूप में गणना की है। पैनल ए थ्रेसहोल्ड के बाद प्राप्त बी-स्कैन का बाइनरी मास्क दिखाता है। लाल रेखा संदर्भ सतह को दर्शाती है, जबकि नीली रेखा सबसे ऊपरी संकेत को इंगित करती है। पैनल बी प्राप्त ऊंचाई नक्शे का एक उदाहरण से पता चलता है, OCT जांच के अक्षीय संकल्प के अनुसार स्केल. लाल रेखा पैनल A में B-स्कैन की स्थिति इंगित करती है.

Figure 4
चित्र 4. प्रतिनिधि परिणाम biofilm विकास पर प्रवाह वेग के प्रभाव दिखा. हमने फ्लूम प्रयोगों का उपयोग करके प्रवाह वेग में प्रवणता के साथ फोटोट्रॉफिक धारा बायोफिल्म मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन किया। प्रवाह वेग प्रवाह के प्रवेश से दूरी के साथ वृद्धि हुई. विकास के 10 दिनों के बाद, biofilm आकारिकी विभिन्न संकल्प पर स्वचालित OCT द्वारा विशेषता थी और विभिन्न स्थानिक तराजू को कवर. ऊंचाई नक्शे (ए, बी और सी) क्रमशः कम, मध्यम और उच्च प्रवाह वेग के तहत उगाया biofilm की आकृति विज्ञान का प्रदर्शन. इन ऊंचाई नक्शे OCT स्कैन से x में voxels आकार के साथ गणना कर रहे हैं, 4 डिग्री की y दिशा. स्कैन सतह क्षेत्र 3.6 मिमी बढ़त लंबाई का एक वर्ग है। पैनलों डी, ई और एफ ऊंचाई नक्शे दिखाने (कम, मध्यम और उच्च प्रवाह वेग, क्रमशः) सिलाई द्वारा प्राप्त 3 $3 OCT स्कैन xy-दिशा में एक voxel आकार के साथ 11 डिग्री, 10 मिमी2 के स्कैन क्षेत्र और 30% के पड़ोसी स्कैन के बीच एक ओवरलैप. पैनल जी इस फ्लूम प्रयोग में प्राप्त संपूर्ण वेग प्रवणता के साथ बढ़ते बायोफिल्म के उन्नयन मानचित्र को दर्शाता है। यह सिलाई द्वारा प्राप्त किया गया था 3 "51 OCT स्कैन xy-दिशा में एक voxel आकार के साथ 40 डिग्री, 10 मिमी2 के स्कैन क्षेत्र और 30% के पड़ोसी स्कैन के बीच एक ओवरलैप. प्राप्त कुल स्कैन क्षेत्र है 24 "353 मिमी. पैनल एच 3.6 मिमी बढ़त के एक वर्ग चलती खिड़की में biovolume रिपोर्ट. औसत biovolume काफी प्रवेश से दूरी के एक समारोह के रूप में कमी आई (मैं). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5. स्थिति डिवाइस के लिए प्रेसिजन परीक्षण. स्थिति डिवाइस की परिशुद्धता एक 20.2 मेगापिक्सेल कैमरा स्थिति डिवाइस पर एक 35 मिमी मैक्रो लेंस के साथ सुसज्जित बढ़ते द्वारा मूल्यांकन किया गया था, एक रंग का निशान पर ध्यान केंद्रित. स्थिति डिवाइस निशान से दूर एक यादृच्छिक दिशा में ले जाया गया था और फिर 80 चक्र की कुल के लिए वापस तैनात. इसके बाद निशान की स्थिति की तुलना की गई। आंकड़ा पहली तस्वीर के संबंध में एक्स और वाई दिशा में बदलाव से पता चलता है. ध्यान दें कि अधिकतम shift लगभग 16 डिग्री है y-दिशा में और भी कम x-दिशा में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

OCT इमेजिंग अच्छी तरह से कई वर्ग मिलीमीटर के एक FOV के साथ micrometer रेंज में संरचनाओं को हल करने के लिए अनुकूल है. इस प्रकार यह बायोफिल्म अनुसंधान10,18के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है . हालांकि, OCT वर्तमान में 100 - 256 मिमी2की एक अधिकतम स्कैन क्षेत्र तक सीमित है, जबकि biofilm संरचनात्मक पैटर्न अक्सर इस स्थानिक पैमाने से अधिक19, खासकर जब morphological भेदभाव बड़े पैमाने पर पर्यावरण ढाल द्वारा संचालित है 20. इस प्रोटोकॉल में वर्णित स्वचालित ओसीटी इमेजिंग प्रणाली कई वर्ग सेंटीमीटर तक ओसीटी की विशेषता वाले सतह क्षेत्र को प्रभावी ढंग से स्थानिक पैमाने की एक प्रासंगिक रेंज पर बायोफिल्म आकृतिक विभेदन की निगरानी करने में सक्षम बनाता है (कुछ मिलीमीटर से कई सेंटीमीटर तक)। उच्च स्थिति सटीकता (के भीतर 16 डिग्री मीटर; चित्र 5) समय की विस्तारित अवधि में जैव फिल्मों के संरचनात्मक विकास की सही निगरानी करने की अनुमति देता है (चित्र 4), जैव फिल्मों के ड्राइवरों की एक मशीनी समझ प्राप्त करने के लिए अवसरों को प्रभावी ढंग से बढ़ाने के रूप में भिन्नता . एक ही समय में, इस situ biofilm विशेषता तकनीक में गैर इनवेसिव है और biofilm विकास के साथ हस्तक्षेप को कम करता है. यहाँ प्रस्तुत छवि प्रसंस्करण समाधान biofilm OCT डेटासेट16के पहले से नियोजित विश्लेषण पर निर्माण, फिर भी स्वचालन अभूतपूर्व समय और अंतरिक्ष हल OCT डेटासेट विश्लेषण के लिए उपकरण प्रदान करता है.

इस प्रणाली की कल्पना की और एक विशिष्ट OCT डिवाइस के साथ बेंचमार्क किया गया था, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में. प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम मुख्य रूप से OCT संकल्प की स्थापना और ध्यान केंद्रित है, जो दोनों उच्च छवि गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण हैं चिंता का विषय है. गोलाकार विपथन दिनचर्या के सुधार की एक सीमा यह है कि यह एक अत्यधिक चिंतनशील फ्लैट सतह की उपस्थिति पर निर्भर करता है। वैकल्पिक रूप से, एक मानक सुधार सतह मापा जा सकता है, और फिर OCT स्कैन को सही करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, ओसीटी स्कैन की सिलाई पड़ोसी स्कैन को संरेखित करने के लिए पर्याप्त संरचनात्मक सुविधाओं पर निर्भर करती है। एक समान बायोफिल्म वितरण या कम बायोफिल्म कवरेज के मामले में, सिलाई केवल पोजीशनिंग डिवाइस की परिशुद्धता पर निर्भर करते हुए प्राप्त की जा सकती है। अंत में, किसी भी अन्य छवि प्रसंस्करण पाइप लाइन में के रूप में, जब इन उपकरणों की स्थापना, यह ध्यान से छवियों के बैचों से निपटने से पहले प्रतिनिधि स्कैन का एक सेट पर प्रसंस्करण एल्गोरिथ्म के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है.

दोनों कठिन और सॉफ्टवेयर के लिए अलग-अलग भागों की पूर्ण प्रतिरूपकता प्रदान करने के लिए डिजाइन किए गए थे. अधिक विशेष रूप से, इस प्रणाली को आसानी से इस तरह के hyperspectral कैमरों या microsensor रूपरेखा का उपयोग कर मैक्रो-फोटोग्राफी इमेजिंग के रूप में biofilms विशेषता के लिए अन्य उपकरणों के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. जैव फिल्मों के आसपास और भीतर संसाधनों में स्थानीयकृत ढालों के साथ संरचनात्मक जानकारी के युग्मन से जैव फिल्मों के संसाधन आवंटन को अनुकूलित करने के तरीके के बारे में उपन्यास और निर्णायक अंतर्दृष्टि प्रदान की जाएगी। लचीलापन भी Jupyter पुस्तिकाओं, एक खुली पहुँच, तेजी से और बहुमुखी सॉफ्टवेयर विकासशील उपकरण के उपयोग के माध्यम से लागू किया जाता है.

सामान्य में OCT इमेजिंग की एक महत्वपूर्ण सीमा तेजी से चलती वस्तुओं को हल करने के लिए विकलांगता बनी हुई है। उदाहरण के लिए, प्रवाह में लंबा करने और आगे बढ़ने वाले स्ट्रीमर को सही ढंग से चित्रित नहीं किया जाता है। इस प्रकार इस उपकरण की प्रयोज्यता अपेक्षाकृत स्थिर, गैर चलती बायोफिल्म संरचनाओं तक सीमित है। प्रणाली स्वायत्त काम करने के लिए अनुकूलित है, तथापि, प्रारंभिक सेटिंग्स और यदि आवश्यक हो, ध्यान और रोशनी के मैनुअल समायोजन, अभी भी आवश्यक हैं. यह एक महत्वपूर्ण सीमा का प्रतिनिधित्व करता है अगर नमूने घनत्व और चिंतनशील गुणों में काफी अलग हैं. सॉफ्टवेयर निर्देशित ध्यान केंद्रित और रोशनी के समायोजन सहित पूर्ण स्वचालन हालांकि इसी तरह के सिद्धांतों का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है (उदा., stepper मोटर्स और सॉफ्टवेयर हार्डवेयर feedbacks).

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Disclosures

सेबेस्टियन श्फर Thorlabs इंक में कार्यरत है.

Acknowledgments

हम इस प्रणाली के विकास के लिए उनके योगदान के लिए मौरिसियो Aguirre Morales धन्यवाद.  वित्तीय सहायता स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से T.J.B. के लिए आया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OCT Probe Thorlabs GAN210C1 OCT imaging device
OCT scan lens Thorlabs  OCT-LK3-BB
Immersion adapter Thorlabs  OCT-IMM3-SP1
Stepcraft 840 CK STEPCRAFT NA positioning device
microcontroller Arduino Uno R3 NA
Single-board computer Raspberry PI NA
camera Canon EOS 7D Mark II NA
camera lens Canon MACRO EFS 35 mm NA

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