Tomografia a coerenza ottica 3D automatizzata per chiarire la morfogenesi del biofilm su grandi scale spaziali

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Summary

I biofilm microbici formano architetture complesse a interfasi e si sviluppano in modelli spaziali altamente dipendenti dalla scala. Qui, introduciamo un sistema sperimentale (hard e software) per l'acquisizione automatizzata di set di dati di tomografia a coerenza ottica 3D (OCT). Questo set di strumenti consente la caratterizzazione non invasiva e multiscala della morfogenesi dei biofilm nello spazio e nel tempo.

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Depetris, A., Wiedmer, A., Wagner, M., Schäfer, S., Battin, T. J., Peter, H. Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales. J. Vis. Exp. (150), e59356, doi:10.3791/59356 (2019).

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Abstract

I biofilm sono uno stile di vita microbico di maggior successo e prevalgono in una moltitudine di ambienti ambientali e ingegnerizzati. Comprendere la morfogenesi dei biofilm, cioè la diversificazione strutturale dei biofilm durante l'assemblaggio della comunità, rappresenta una sfida notevole su scale spaziali e temporali. Qui presentiamo un sistema automatizzato di imaging di biofilm basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT). L'OCT è una tecnica di imaging emergente nella ricerca sui biofilm. Tuttavia, la quantità di dati che attualmente possono essere acquisiti ed elaborati ostacola l'inferenza statistica di modelli su larga scala nella morfologia dei biofilm. Il sistema di imaging automatizzato dello OCT consente di coprire ampie scale temporali spaziali ed estese della crescita dei biofilm. Combina un sistema OCT disponibile in commercio con una piattaforma di posizionamento robotico e una suite di soluzioni software per controllare il posizionamento della sonda di scansione dello Strumento di personalizzazione di Office, nonché l'acquisizione e l'elaborazione di set di dati di imaging di biofilm 3D. Questa configurazione consente il monitoraggio automatizzato in situ e non invasivo dello sviluppo di biofilm e può essere ulteriormente sviluppata per associare l'imaging dello OCT a macrofotografia e alla profilatura dei microsensori.

Introduction

I biofilm sono un adattamento di stile di vita microbico di grande successo e queste comunità di microrganismi associate a matrici associate a matrici e associate a matrici dominano la vita microbica in ambienti naturali e industriali1,2. Lì, i biofilm formano architetture complesse, comegli streamer allungati 3, le increspature4 o i tappi simili a funghi5 con importanti conseguenze per la crescita del biofilm, la stabilità strutturale e la resistenza allo stress6. Mentre molto sulla differenziazione strutturale dei biofilm è stata appresa dal lavoro sulle culture monospecie coltivate in camere di flusso in miniatura, la maggior parte dei biofilm sono comunità altamente complesse, spesso compresi i membri di tutti i domini della vita6. Apprezzare questi complessi biofilm come paesaggi microbici7 e comprendere come la struttura e la funzione dei biofilm interagiscono in comunità complesse è quindi in prima linea nella ricerca sui biofilm.

Una comprensione meccanicistica della morfogenesi di biofilm complessi in risposta a segnali ambientali richiede esperimenti attentamente progettati in combinazione con osservazioni spaziali e temporali della struttura fisica dei biofilm attraverso bilance8. Tuttavia, l'osservazione non distruttiva della crescita di biofilm nei sistemi sperimentali è stata fortemente limitata da vincoli logistici come la necessità di spostare campioni (ad esempio, al microscopio) spesso danneggiando la delicata struttura del biofilm.

Il protocollo qui presentato introduce un sistema completamente automatizzato basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT), che consente il monitoraggio in situ e non invasivo della morfogenesi dei biofilm su scala mesoscala (gamma mm). L'OCT è una tecnica di imaging emergente nella ricerca sui biofilm con applicazioni nel trattamento delle acque e nella ricerca sul biofouling, medicina9 ed ecologia del flusso10. Nella PTOM, una sorgente di luce a bassa coerenza viene divisa in un campione e in un braccio di riferimento; viene analizzata l'interferenza della luce riflessa e dispersa dal biofilm (braccio campione) e la luce del braccio di riferimento. Una serie di profili di intensità assiale (A-scan) che contiene informazioni strutturali risolte in profondità viene acquisita e unita in un B-scan (una sezione trasversale). Una serie di B-scan adiacenti compone la scansione del volume 3D finale10. Il PToM fornisce una risoluzione ottica laterale nell'intervallo di circa 10 m ed è quindi adatto per studiare la differenziazione strutturale mesoscopica dei biofilm10,12. Per una descrizione più dettagliata dello Strumento di personalizzazione di Office, fare riferimento a Drexler e Fujimoto13e Fercher e colleghi14. Sebbene il campo visivo di una singola analisi xy dello Strumento di personalizzazione di Office raggiunga fino a centinaia di micrometri quadrati, i modelli su scala più grande non possono essere quantificati mediante lo Strumento di personalizzazione di Office in una singola analisi. Per quanto riguarda i biofilm in habitat naturali come corsi d'acqua e fiumi, questo attualmente limita la nostra capacità di valutare la morfogenesi del biofilm su scale corrispondenti al modello fisico e idraulico dell'habitat.

Per superare questi limiti spaziali e acquisire automaticamente le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office, è stata montata una sonda di imaging dello OCT basata su un dominio spettrale su un sistema di posizionamento a 3 assi. L'installazione consente l'acquisizione di diverse scansioni OCT in un mosaico sovrapposto (taccature), ottenendo in modo efficace l'imaging tomografico di aree di superficie fino a 100 cm2. Inoltre, l'elevata precisione di posizionamento di questo sistema consente di monitorare in modo affidabile la crescita e lo sviluppo delle caratteristiche dei biofilm in siti specifici durante esperimenti a lungo termine. Il sistema è modulare e singoli componenti (ad esempio, dispositivo di posizionamento e OCT) dell'installazione possono essere utilizzati come soluzioni autonome o combinati in modo flessibile. Figura 1 fornisce una panoramica dei componenti hardware e hardware dell'installazione.

Il sistema è stato testato con un dispositivo di posizionamento CNC a supporto GRBL disponibile in commercio (Table of Materials). Le distanze di funzionamento di questa specifica piattaforma di posizionamento sono di 600-840-140 mm, con una precisione indicata dal produttore di 0,05 mm e una risoluzione programmabile di 0,005 mm. GRBL è un open-source (licenza GPLv3), un controllo del movimento ad alte prestazioni per CNC Dispositivi. Pertanto, ogni dispositivo di posizionamento basato su GRBL (versione > 1.1) deve essere compatibile con le linee guida e i pacchetti software qui presentati. Inoltre, il software potrebbe essere adattato ad altri controller stepmotor con tipo di ingresso STEP-DIR con poche modifiche.

Il dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office utilizzato per valutare le prestazioni del sistema (Tabella dei materiali) presenta una sorgente luminosa a bassa coerenza con una lunghezza d'onda centrale di 930 nm (larghezza di banda : 160 nm) e lunghezza e intensità del braccio di riferimento regolabili. Nell'esempio qui presentato è stato utilizzato anche un adattatore per l'immersione della sonda dello Strumento di personalizzazione di Office (Tabella dei materiali). Il pacchetto software sviluppato qui per l'acquisizione automatica dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office dipende in modo critico dall'SDK fornito insieme al sistema dello Strumento di personalizzazione di Office specifico, tuttavia, i sistemi dello Strumento di personalizzazione di Office dello stesso produttore con lenti di scansione e lunghezze d'onda centrali diverse dovrebbero essere prontamente compatibile.

Il dispositivo GRBL è controllato da un server Web installato su un computer a scheda singola (Figura 1). Ciò garantisce il controllo remoto del dispositivo da qualsiasi computer con accesso a Internet o rete locale. Il dispositivo DELLO Strumento di personalizzazione di Office è controllato da un computer separato, consentendo il funzionamento del sistema OCT a parte la configurazione sperimentale automatizzata. Infine, i pacchetti software includono librerie per sincronizzare il posizionamento del probe dello Strumento di personalizzazione di Office e l'acquisizione dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office (ad esempio, per acquisire automaticamente i set di dati di imaging 3D in un modello a mosaico o in un insieme di posizioni definite). La definizione della posizione della sonda OCT in 3D consente di regolare in modo efficace il piano focale in base a insiemi di scansioni (regionali). In particolare, su superfici non uniformi, è possibile specificare piani focali diversi (ad esempio, posizioni diverse nella direzione z) per ogni analisi dello Strumento di personalizzazione di Office.

È stato sviluppato un set di pacchetti softwareper elaborare le scansioni grezze dello Strumento di personalizzazione di Office (Tabella 1). Navigazione del dispositivo di posizionamento, l'acquisizione della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office e l'elaborazione del set di dati vengono eseguite con notebook Jupyter con codifica Python, che consentono una notevole flessibilità nello sviluppo e nell'ottimizzazione del software. Due esempi lavorati e annotati di tali notebook (rispettivamente per l'acquisizione e l'elaborazione delle immagini) sono disponibili da https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Essi sono da intendersi come punti di partenza per la personalizzazione del metodo. Un notebook Jupyter è un'applicazione basata su browser web che contiene celle con codice Python con annotato. Ogni passaggio è contenuto in una cella del blocco appunti, che può essere eseguita separatamente. A causa della diversa lunghezza del percorso della luce attraverso l'obiettivo di scansione (aberrazione sferica)15, le scansioni grezze dello Strumento di personalizzazione di Office appaiono distorte (Figura 2A). Abbiamo sviluppato un algoritmo per correggere automaticamente questa distorsione nelle scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office acquisite (contenute in ImageProcessing.ipynb, Supplementary File 1). Inoltre, la morfologia dei biofilm può essere visualizzata come una mappa di elevazione 2D, come è stato precedentemente utilizzato nei sistemi di membrana16, e illustriamo come le mappe di elevazione ottenute da scansioni prese in una matrice di afiltura possono essere cucite.

Infine, la funzionalità dell'installazione di laboratorio descritta viene illustrata utilizzando un esperimento a flume in cui il biofilm del flusso fototrofico è esposto a un gradiente di velocità del flusso.

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Protocol

1. Configurazione del dispositivo di posizionamento

  1. Collegare il dispositivo di posizionamento a una scheda microcontrollore, seguendo le istruzioni in https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.
  2. Collegare il microcontrollore a un computer a scheda singola con connessione internet tramite un cavo USB e installare il server GRBL come descritto nel https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. Ora il dispositivo di posizionamento dovrebbe essere navigabile da una pagina web ospitata in http://IP:5020/. In alternativa, è possibile navigare nel dispositivo di posizionamento con uno script Python, come illustrato nella prima parte dell'esempio di lavoro ImagesAcquisition.ipynb (File supplementare 2).

2. Configurazione dello Strumento di personalizzazione di Office

  1. Montare la sonda dello Strumento di personalizzazione di Office sul dispositivo di posizionamento utilizzando un supporto compatibile con coda di colomba. Se necessario, installare un adattatore di immersione sull'obiettivo.
  2. Posizionare il computer e l'unità di base dello Strumento di personalizzazione di Office su un banco accanto all'esperimento (ad esempio, dispositivi microfluidici, camere di flusso, flumi, sistemi di filtrazione). Assicurarsi che il cavo ottico (lunghezza massima di circa 1,8 m) sia liberamente in movimento, abbastanza a lungo da raggiungere tutte le posizioni previste e non interferisca con la configurazione sperimentale.
  3. Installare il sistema dello Strumento di personalizzazione di Office con il software disponibile come descritto dal produttore.
  4. Installare i pacchetti software per l'acquisizione automatica dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office come descritto in https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.

3. Acquisizione di immagini

  1. Accendere il sistema OCT e il dispositivo di posizionamento. Assicurarsi che il dispositivo possa muoversi liberamente.
  2. Aprire il file config.json in un editor di testo. Modificare il file config.json per regolare il parametro di acquisizione dell'immagine predefinito (Tabella 2), ad esempio l'indice di rifrazione (1,33 per l'acqua a 20 , 1,00 per air) e la cartella di destinazione per i dati e i metadati acquisiti.
  3. Definire le dimensioni del campo di visualizzazione (FOV) e il numero di a-scan per B-scan in config.json.
    NOTA: questi due parametri determinano la dimensione dei voxel del set di dati finale e le dimensioni del file di output e devono corrispondere alla risoluzione ottica della sonda (la dimensione di voxel x-y non deve essere inferiore alla metà della risoluzione ottica). Il numero di scansioni A e B influisce sull'entità spaziale da coprire e quali operazioni con lo spazio disponibile su disco e la potenza di elaborazione.
  4. Definire i limiti del segnale dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office di output in config.json. Questi dipendono dal tipo di campione. Si raccomanda quindi di determinare questi parametri in base agli istogrammi di intensità di una serie di scansioni preliminari. Salvare le modifiche in config.json.
  5. Spostare il probe dello Strumento di personalizzazione di Office fino a un sito di interesse. Mettere a fuoco il campione e regolare il braccio di riferimento e l'intensità della sorgente luminosa per una qualità ottimale dell'immagine. Ripetere questa procedura per un certo numero di posizioni e prendere nota delle coordinate.
    NOTA: ciò consentirà la successiva acquisizione automatica dell'analisi automatica dello Strumento di personalizzazione di Office intorno a questi punti di riferimento. Si noti che la lunghezza e l'intensità del braccio di riferimento non possono essere modificate durante l'acquisizione automatica dell'immagine.
  6. Aprire il file ImageAcquisition.ipynb (File supplementare 2) in Juypter Notebook. Ogni cella contiene il codice per eseguire attività specifiche e può essere eseguito separatamente tramite la pressione di Cell Eseguire ,oppure premere CTRL e INVIO o MAIUSC e INVIO.
    1. Impostare il percorso per le librerie necessarie e i parametri di configurazione predefiniti. In alternativa, definire un nuovo set di parametri temporanei.
    2. Connettersi al dispositivo di posizionamento e inizializzare lo Strumento di personalizzazione di Office.
    3. Calibrare il dispositivo di posizionamento (cioè, eseguire un "homing").
    4. Acquisire i set di dati che coprono le posizioni di interesse in un modello a scansione singola o mosaico, specificando il numero e la sovrapposizione (ad esempio, 30%) di piastrelle vicine.
      NOTA: la memoria viene allocata prima della scansione, che ottimizza l'utilizzo delle risorse del computer. I dati vengono salvati in formato 8 bit ,ovvero .raw per risparmiare spazio di archiviazione, nella cartella di destinazione definita in config.json, utilizzando il timestamp e la posizione come convenzione di denominazione (ad esempio, %Y%m%d_%H%M%S_). I metadati, incluse le impostazioni e le coordinate dello Strumento di personalizzazione di Office, vengono salvati nella stessa cartella in un filecon estensione srm con la stessa convenzione di denominazione. A seconda di impostazioni quali FOV e risoluzione, le dimensioni del file possono raggiungere fino a 1,5 GB per analisi dello Strumento di personalizzazione di Office.
  7. Per evitare l'interruzione dell'acquisizione dei dati, assicurarsi che lo spazio disponibile su disco sia sufficiente o spostare continuamente i set di dati dello strumento di personalizzazione di Office in un disco rigido esterno.

4. Correzione e visualizzazione dell'immagine

  1. Aprire il blocco appunti di Jupyter ImageProcessing.ipynb ( File supplementare1) per un esempio di elaborazione delle immagini dello Strumento di personalizzazione di Office (correzione della distorsione, sottrazione dello sfondo, calcolo delle mappe di elevazione, cucitura delle mappe di elevazione).
  2. Se necessario, ritagliare le scansioni oct per escludere i segnali spurie e riorientare il set di dati (biofilm dovrebbe apparire sopra il substrato).
  3. Corretto per l'aberrazione sferica. Ciò avviene con un algoritmo di correzione che utilizza una superficie di riferimento altamente riflettente nota per essere piatta (ad esempio, fondo del flume, substrato). In primo luogo, l'algoritmo definisce una griglia di linee verticali 20-20 regolarmente distanziate sul piano xy dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office. Quindi, seleziona un'area circolare intorno a ogni punto e calcola la media delle intensità del segnale lungo il profilo verticale (Figura 2B). I profili verticali vengono elaborati con un filtro gaussiano modificato:
    Equation 1
    dove x è il segnale di ingresso, e la sua deviazione standard, mentre C è determinato come:
    Equation 2
    La superficie di riferimento è localizzata come maxima locale in ciascuno di questi profili. I punti identificati in modo non corretto vengono filtrati in base alle posizioni dei loro vicini in tre dimensioni (Figura 2C). Infine, una superficie polinomiale di 2nd ordine che riflette la distorsione introdotta dall'obiettivo di scansione è montata su questi punti (Figura 2C). La superficie montata viene quindi utilizzata per spostare ogni pixel nella direzione z, ottenendo così un'immagine appiattita. I parametri di questo algoritmo devono essere regolati in base alle caratteristiche dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office.
  4. Correggere il rumore di fondo. Identificare un'area vuota dell'immagine (in genere sopra il biofilm) e utilizzare l'algoritmo di correzione per sottrarre l'intensità media dello sfondo dai valori di intensità dell'immagine per produrre un'immagine finale corretta dello Strumento di personalizzazione di Sistema (Figura 2D).
  5. Calcolare una mappa di elevazione dal set di dati 3D OCT. In questa fase, definire una superficie di riferimento di interesse per l'esperimento specifico (ad esempio, il substrato) e un'intensità di soglia appropriata. Quindi, utilizzare l'algoritmo di calcolo della mappa di elevazione dei privilegi per calcolare lo spessore del biofilm per ogni coordinata (x,y) della maschera binaria e assegnarlo a una nuova matrice 2D (Figura 3A). I valori di spessore vengono quindi assegnati a una matrice 2D delle dimensioni dell'immagine originale nelle direzioni x e y. Viene eseguito il rendering di un'immagine in cui la quota altimetrica della superficie viene segnalata come valore in scala di grigi (Figura 3B).
  6. Nel caso in cui diverse scansioni dello OCT sono prese in un modello a mosaico, definire il numero di righe e colonne e cucire le rispettive mappe di elevazione. La figura 5 presenta esempi di mappe di elevazione cucite, che coprono l'ampia gamma di scale e risoluzioni spaziali raggiungibili con la configurazione descritta.

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Representative Results

Dimostriamo la funzionalità del sistema automatico di imaging OCT utilizzando un esperimento di flume progettato per studiare la morfogenesi spatio-temporale dei biofilm fototrofici. Una geometria gradualmente restringimento dei flumi indusse gradienti in velocità di flusso lungo il centro del flume (vedi riferimento17).  Lo sviluppo temporale e la differenziazione strutturale del biofilm sono stati monitorati per 18 giorni con l'obiettivo di comprendere meglio gli effetti delle condizioni idrodinamiche sulla morfogenesi del biofilm. La figura 4 mostra la crescita di una microcolonia di biofilm seguita in 18 giorni di crescita. La morfologia superficiale del biofilm è stata quantificata utilizzando il set di strumenti descritto in precedenza (Figura 4A). Il biovolume è stato calcolato (vedere l'esempio elaborato ImageProcessing.ipynb, File supplementare 1) per una finestra mobile quadrata con lunghezza del bordo di 3,6 mm (Figura 4B) per ogni posizione lungo il gradiente di velocità di flusso (Figura 4C). L'accumulo di biofilm è diminuito significativamente con l'aumentare della velocità di flusso (indicata come la distanza dalla parte più ampia del flume; Figura 4). È importante sottolineare che questa configurazione sperimentale consente una misurazione continua dei parametri strutturali (ad esempio, biovolume, spessore, rugosità) lungo grandi gradienti spaziali. Pertanto, questo nuovo strumento fornisce i mezzi per ottenere informazioni sulle relazioni tra la struttura dei biofilm e i segnali ambientali.

Componente software descrizione
stepcraft.py Una libreria Python per controllare il dispositivo di posizionamento. Contiene le definizioni per la navigazione e l'homing del dispositivo.
Controllo oct.cpp Il codice C'è derivato dal Software Development Kit (SDK) distribuito con il sistema dello Strumento di personalizzazione di Office. Questo deve essere compilato utilizzando VisualStudio 2017, PythonC/API e l'SDK.
ImagesAcquisition.py Libreria Python contenente i comandi per l'acquisizione delle scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office in posizioni selezionate e la definizione del modello di apposizione di scansione.
ImagesAcquisition.ipynb Il notebook Jupyter utilizzato per navigare nel dispositivo di posizionamento, acquisire scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office e per l'acquisizione automatica delle immagini.
OctCorrection.py Una libreria Python che definisce le funzioni utilizzate per la correzione delle immagini dello Strumento di personalizzazione di Office non elaborate e la sottrazione dello sfondo.
OctProcessing.py Una libreria Python contenente le funzioni per calcolare e cucire le mappe di elevazione.
OctProcessing.ipynb Blocco appunti Jupyter per visualizzare, correggere ed elaborare le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office. Questo contiene anche un esempio di calcolo del biovolume.

Tabella 1. Componenti software.

parametro valore descrizione
Ganimede 1, 2, 3 Scelta del sistema e della versione dello Strumento di personalizzazione di Office
sonda 1, 2 Scelta dell'obiettivo di scansione
nAscans 32-900 Numero di A-scan per B-scan
bbscan 1-900 Numero di B-scan
NCCcans 128-1024 Numero di pixel di profondità
X 0.1-10 Dimensioni dell'immagine nella direzione x (mm)
Y 0.1-10 Dimensioni dell'immagine in direzione y (mm)
refr 1-1.6 Indice di rifrazione (1 per l'aria, 1,33 per l'acqua)
avg_Ascans (addis) 3 Numero di informazioni in media Di A-scan
velocità di scansione 1,2,3 Velocità A-scan (5,5, 15 e 36 kHz)
Percorso ".. / %Y-%m-%d_%H_%M_%S" Cartella di destinazione per le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office acquisite, utilizza il timestamp come cartella di stampa di denominazione
colorContorni [0.0-256.0,0.0-256.0] Confini di colore delle scansioni acquisite

Tabella 2. Impostazioni dei parametri dello Strumento di personalizzazione di Office.

Figure 1
come illustrato nella Figura 1. Panoramica dei componenti hard e software. I stepmotor di un dispositivo di posizionamento a controllo GRBL sono collegati a un microcontrollore, collegato tramite USB a un computer a scheda singola. Il server GRBL è installato su quest'ultimo, e il movimento del dispositivo di posizionamento può essere controllato da qualsiasi browser web tramite connessione TCP/IP. In alternativa, la navigazione del dispositivo di posizionamento può essere eseguita da un notebook Jupyter con codifica Python (ImagesAcquisition.ipynb, Supplementary File 2) utilizzando la libreria GRBLServer.py. Il sistema dello Strumento di personalizzazione di Office è connesso a un computer separato da cui è possibile eseguire l'acquisizione automatica dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office tramite uno script Python. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. Flusso di lavoro di correzione dell'analisi dello Strumento di personalizzazione di Office. Il pannello A mostra una scansione B non elaborata di biofilm che cresce su una superficie di plexiglass piatta. L'immagine è distorta (piega) a causa delle differenze nella lunghezza del percorso della luce a bassa coerenza attraverso l'obiettivo. La distorsione dell'immagine dello Strumento di personalizzazione di Office può essere corretta identificando una superficie di riferimento piatta che riflette fortemente nell'immagine. In primo luogo, i punti di riferimento da 20-20 vengono distribuiti uniformemente nell'intero stack di immagini. In ciascuno di questi punti, il segnale dell'immagine viene mediato su un'area circolare (in direzione x-y) per ogni profondità (piano z), ottenendo un profilo di profondità medio dell'intensità del segnale. Quindi, un filtro gaussiano modificato viene applicato a ciascuno dei 400 profili di riferimento. Il pannello B fornisce un esempio del segnale originale lungo il profilo di profondità indicato dalla linea rossa verticale nel pannello A, dal profilo di profondità media e dallo stesso profilo dopo l'applicazione del filtro gaussiano modificato. Il filtro gaussiano modificato consente l'identificazione della massima locale in intensità del segnale, identificando così la posizione della superficie di riferimento fortemente riflettente. I punti di riferimento identificati correttamente vengono quindi selezionati in base alle coordinate dei rispettivi vicini in tre dimensioni. Nell'esempio nel pannello C, i punti gialli sono stati mantenuti per la successiva correzione dell'immagine, mentre quelli viola sono stati scartati. Una superficie polinomiale di 2nd ordine viene quindi adattata ai punti di riferimento posizionati correttamente e utilizzata per correggere la distorsione nell'immagine originale dello Strumento di personalizzazione di Office spostando i pixel nella direzione z. L'intensità media dello sfondo è stimata da un'area vuota dell'immagine e sottratta dalle immagini corrette. Il pannello D mostra lo stesso B-scan dopo la correzione e la sottrazione dello sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
come illustrato nella figura 3. Mappe di quota altimetrica. La topologia dei biofilm può essere visualizzata come mappe di elevazione 2D in cui lo spessore della biomassa è codificato a colori. Per questo, un'immagine 3D OCT è sogliata e lo spessore del biofilm viene calcolato come la distanza del segnale più in alto al substrato. Il pannello A mostra la maschera binaria di una scansione B ottenuta dopo la soglia. La linea blu indica il segnale più in alto, mentre la linea rossa indica la superficie di riferimento. Il pannello B mostra un esempio della mappa di elevazione ottenuta, scalata in base alla risoluzione assiale del probe dello Strumento di personalizzazione di Office. La linea rossa indica la posizione del B-scan nel Pannello A.

Figure 4
come illustrato nella Figura 4. Risultati rappresentativi che mostrano l'effetto della velocità di flusso sulla crescita dei biofilm. Abbiamo studiato la morfogenesi del biofilm del flusso fototrofico lungo un gradiente nella velocità di flusso utilizzando esperimenti sul flume. La velocità di flusso è aumentata con la distanza dall'ingresso del flume. Dopo 10 giorni di crescita, la morfologia dei biofilm è stata caratterizzata da Un Oct automatizzato a diverse risoluzioni e che copre diverse scale spaziali. Le mappe di elevazione (A, B e C) dimostrano la morfologia del biofilm coltivato rispettivamente con velocità di flusso bassa, media e alta. Queste mappe di elevazione sono calcolate dalle scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office con le dimensioni di voxel in x, y direzione di 4 m. L'area della superficie di scansione è un quadrato di 3,6 mm di lunghezza del bordo. I pannelli D, E e F mostrano mappe di elevazione (rispettivamente bassa, media e alta velocità di flusso) ottenute cucindo scansioni 3/3 dello OCT con una dimensione voxel in xy-direction di 11 m, un'area di scansione di 10 mm2 e una sovrapposizione tra scansioni vicine del 30%. Il pannello G mostra una mappa di elevazione del biofilm che cresce lungo l'intero gradiente di velocità raggiunto in questo esperimento flume. È stato ottenuto cucendo scansioni 3/51 OCT con una dimensione voxel in direzione xy di 40 m, area di scansione di 10 mm2 e una sovrapposizione tra scansioni vicine del 30%. L'area di scansione totale raggiunta è di 24,353 mm. Il biovolume medio è diminuito significativamente in funzione della distanza dall'inserimento (I). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
come illustrato nella Figura 5. Test di precisione per il dispositivo di posizionamento. La precisione del dispositivo di posizionamento è stata valutata montando una fotocamera da 20,2 Megapixel dotata di un obiettivo macro da 35 mm sul dispositivo di posizionamento, focalizzato su un marchio colorato. Il dispositivo di posizionamento è stato spostato in una direzione casuale lontano dal marchio e quindi posizionato indietro per un totale di 80 cicli. La posizione del marchio è stata quindi confrontata. La figura mostra lo spostamento nella direzione x e y rispetto alla prima immagine. Si noti che lo spostamento massimo è di circa 16 m nella direzione y e anche meno nella direzione x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1. ImageProcessing.ipynb. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2. ImagesAcquisition.ipynb. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

L'imaging dello OCT è adatto per risolvere le strutture nella gamma dei micrometri con un FOV di diversi millimetri quadrati. È quindi un potente strumento per la ricerca sui biofilm10,18. Tuttavia, lo OCT è attualmente limitato a un'area discansione massima di 100 - 256 mm 2, mentre i modelli strutturali dei biofilm spesso superano questa scala spaziale19, soprattutto quando la differenziazione morfologica è guidata da gradienti ambientali su larga scala 20.Il sistema di imaging automatizzato dello STRUMENTO di personalizzazione di Office descritto in questo protocollo estende la superficie caratterizzata dallo OCT a diversi centimetri quadrati, consentendo in modo efficace di monitorare la differenziazione morfologica dei biofilm su una gamma rilevante di scale spaziali (da pochi millimetri a diversi centimetri). L'elevata precisione di posizionamento (entro 16 m; Figura 5) permette di monitorare con precisione lo sviluppo strutturale dei biofilm per lunghi periodi di tempo (Figura 4), aumentando efficacemente le opportunità per ottenere una comprensione meccanicistica dei fattori di differenziazione morfologica dei biofilm . Allo stesso tempo, questa tecnica di caratterizzazione del biofilm in situ non è invasiva e riduce al minimo l'interferenza con la crescita dei biofilm. Le soluzioni di elaborazione delle immagini qui presentatesi basano su analisi precedentemente utilizzate dei set di dati 16 dell'OCT di biofilm, ma l'automazione fornisce strumenti per analisi senza precedenti di set di dati dello OCT risolti in base a tempi e spazi.

Questo sistema è stato concepito e confrontato con uno specifico dispositivo OCT, come descritto nel protocollo. I passaggi critici del protocollo riguardano principalmente l'impostazione della risoluzione e della messa a fuoco dello Strumento di personalizzazione di Office, che sono entrambe fondamentali per un'elevata qualità dell'immagine. Una limitazione della correzione della routine di aberrazioni sferiche è che dipende dalla presenza di una superficie piana altamente riflettente. In alternativa, è possibile misurare una superficie di correzione standard e quindi utilizzare per correggere le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office. Inoltre, le cuciture delle scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office dipendono da caratteristiche strutturali sufficienti per allineare le scansioni adiacenti. In caso di distribuzione uniforme di biofilm o di copertura di biofilm bassa, le cuciture possono essere ottenute basandosi esclusivamente sulla precisione del dispositivo di posizionamento. Infine, come in qualsiasi altra pipeline di elaborazione delle immagini, quando si impostano questi strumenti, è fondamentale valutare attentamente le prestazioni dell'algoritmo di elaborazione in un set di scansioni rappresentative prima di gestire batch di immagini.

Sia hard- e software sono stati progettati per fornire la piena modularità delle singole parti. Più specificamente, questo sistema può essere facilmente adattato per lavorare con altri strumenti per la caratterizzazione dei biofilm, come l'imaging macro-fotografia, utilizzando fotocamere iperspettrali o la profilatura dei microsensori. L'accoppiamento delle informazioni strutturali con i gradienti localizzati nelle risorse intorno e all'interno dei biofilm fornirà nuove e fondamentali informazioni sul modo in cui i biofilm vengono adattati per ottimizzare l'allocazione delle risorse. La flessibilità è implementata anche attraverso l'uso di notebook Jupyter, uno strumento di sviluppo software aperto, veloce e versatile.

Una limitazione critica dell'imaging dello Strumento di personalizzazione di Office in generale rimane la disabilità di risolvere gli oggetti in rapido movimento. Ad esempio, gli streamer che si allungano e si spostano con il flusso non sono rappresentati con precisione. L'applicabilità di questo strumento è quindi limitata a strutture di biofilm relativamente fisse e non in movimento. Il sistema è ottimizzato per funzionare in modo autonomo, tuttavia, le impostazioni iniziali e, se necessario, la regolazione manuale della messa a fuoco e dell'illuminazione, sono ancora necessarie. Ciò rappresenta una limitazione significativa se i campioni differiscono in modo significativo in densità e proprietà riflettenti. L'automazione completa, inclusa la messa a fuoco guidata dal software e la regolazione dell'illuminazione può tuttavia essere ottenuta utilizzando principi simili (ad esempio, motori stepper e feedback hardware software).

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Disclosures

La sediglia è stata impiegata presso Thorlabs Inc.

Acknowledgments

Ringraziamo Mauricio Aguirre Morales per il suo contributo allo sviluppo di questo sistema.  Il sostegno finanziario è stato fornito dalla Fondazione nazionale svizzera per la scienza a T.J.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OCT Probe Thorlabs GAN210C1 OCT imaging device
OCT scan lens Thorlabs  OCT-LK3-BB
Immersion adapter Thorlabs  OCT-IMM3-SP1
Stepcraft 840 CK STEPCRAFT NA positioning device
microcontroller Arduino Uno R3 NA
Single-board computer Raspberry PI NA
camera Canon EOS 7D Mark II NA
camera lens Canon MACRO EFS 35 mm NA

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References

  1. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
  2. Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
  3. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
  4. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
  5. Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
  6. Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
  7. Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
  8. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
  9. Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21, (12), 127002 (2016).
  10. Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
  11. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
  12. Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
  13. Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. Springer Verlag. (2008).
  14. Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
  15. Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. 41236-41254 (2013).
  16. Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
  17. Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
  18. Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
  19. Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
  20. Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).

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