पैटर्न-ट्रिगर ऑक्सीडेटिव बर्स्ट और सीडिंग ग्रोथ निषेध परासास में Arabidopsis thaliana

Immunology and Infection

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Summary

इस पत्र में प्रतिरक्षा elicitors के लिए जोखिम के बाद Arabidopsis thaliana में रक्षा प्रतिक्रियाओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए दो तरीकों का वर्णन: क्षणिक ऑक्सीडेटिव फट, और अंकुर विकास के निषेध.

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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).

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Abstract

पौधों रोगजनकों को अनुभव और रोग के खिलाफ की रक्षा करने के लिए एक मजबूत प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित की है। इस पत्र में दो assays कि प्राप्त करने वाले अणुओं के साथ उपचार के बाद Arabidopsis thaliana में प्रतिरक्षा सक्रियण की ताकत को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन करता है. पहले प्रस्तुत तेजी से प्रेरित और गतिशील ऑक्सीडेटिव फट पर कब्जा करने के लिए एक विधि है, जो एक luminol आधारित परख का उपयोग कर नजर रखी जा सकती है. प्रस्तुत दूसरा एक तरीका है वर्णन कैसे अंकुर विकास की प्रतिरक्षा प्रेरित निषेध को मापने के लिए है. इन प्रोटोकॉल तेजी से और विश्वसनीय हैं, विशेष प्रशिक्षण या उपकरणों की आवश्यकता नहीं है, और व्यापक रूप से संयंत्र प्रतिरक्षा के आनुवंशिक आधार को समझने के लिए उपयोग किया जाता है.

Introduction

रोगजनकों को देखने और उनकी रक्षा करने के लिए, पौधों ने झिल्ली-बद्ध पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर) विकसित किए हैं जो माइक्रोब-संबद्ध आण्विक पैटर्न (एमएआरपी)1के रूप में जाने जाने वाली कोशिका के बाहर संरक्षित माइक्रोब ीय अणुओं का पता लगाते हैं। MAMPs की बाध्यता उनके cognate PRRs के लिए प्रोटीन kinase-मध्यस्थ प्रतिरक्षा संकेत नजारे जिसके परिणामस्वरूप व्यापक स्पेक्ट्रम रोग प्रतिरोध2. पीआरआर सक्रियण के बाद जल्द से जल्द प्रतिक्रियाओं में से एक फॉस्फोरिलेशन और अभिन्न प्लाज्मा झिल्ली के सक्रियण है श्वसन BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) प्रोटीन है कि extracellular प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन को उत्प्रेरित (ROS)3 , 4. आरओएस रोग प्रतिरोध स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ,प्रतिरक्षा संकेतन के साथ-साथ प्रत्यक्ष एंटीमाइक्रोबियल एजेंट5 का प्रचार करने के लिए माध्यमिक दूत के रूप में कार्य करते हैं . प्रतिरक्षा-प्राप्त ऑक्सीडेटिव फट के पहले अवलोकन का वर्णन phytophthora infestans inoculation6के बाद cv. Rishiri के आलू कंद का उपयोग कर के लिए किया गया था। आरओएस उत्पादन का मूल्यांकन कई पादप प्रजातियों में किया गया है जिसमें पत्ती डिस्क7, सेल निलंबन संस्कृतियों8और प्रोटोप्लास्ट6का उपयोग किया गया है . यहाँ वर्णित अरबिडोप्सिस थालियाना (अरबीडोप्सिस) की पत्ती डिस्क में पैटर्न-ट्रिगर किए गए आरओएस उत्पादन पर ाााली करने का एक सरल तरीका है.

MAMP धारणा के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में, सक्रिय RBOH प्रोटीन superoxide कण के उत्पादन को उत्प्रेरित (O2-), hydroxyl कण (•OH), और एकल ऑक्सीजन (1हे2) कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड में परिवर्तित कर रहे हैं (एच2हे 2) अतिरिक्त कोशिकीय अंतरिक्ष में9. ज2व्2 को ऑक्सीकरण एजेंट हॉर्सराडिश परोक्सिडेस (एचआरपी)10की उपस्थिति में ल्यूमिनोल-आधारित केमियुमिनेसन द्वारा परिमाणित किया जा सकता है। एचआरपी एच22 को एक हाइड्रॉक्साइड आयन (ओएच)और ऑक्सीजन गैस (ओ2) पैदा करता है जो ल्यूमिनोल के साथ प्रतिक्रिया करता है जो एक अस्थिर मध्यवर्ती का उत्पादन करता है जो प्रकाश10का फोटॉन रिलीज करता है . फोटॉन उत्सर्जन सापेक्ष प्रकाश इकाइयों के रूप में मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (RLUs) एक microplate पाठक या छविक luminescence का पता लगाने में सक्षम है, जो सबसे आणविक प्रयोगशालाओं में उपकरणों के मानक टुकड़े बन गए हैं का उपयोग कर. 40-60 मिनट के अंतराल पर उत्पादित प्रकाश को मापने के द्वारा, एक क्षणिक ऑक्सीडेटिव फट के रूप में जल्दी के रूप में 2-5 मिनट के रूप में प्रकाश की प्राप्ति उपचार के बाद पता लगाया जा सकता है, 10-20 मिनट में चोटी, और $ 60 मिनट11के बाद बेसल के स्तर पर लौटने . इस समय पाठ्यक्रम के दौरान उत्पादित संचयी प्रकाश का उपयोग आरबीओडब्ल्यूई एफ प्रोटीन12के सक्रियण के अनुरूप प्रतिरक्षा शक्ति के माप के रूप में किया जा सकता है . सुविधाजनक, इस परख विशेष उपकरण या बोझिल नमूना तैयारी की आवश्यकता नहीं है.

MAMP का पता लगाने के तुरंत बाद पीकिंग, ऑक्सीडेटिव फट एक प्रारंभिक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माना जाता है, MAPK सक्रियण और ethylene उत्पादन5के साथ. बाद में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं में ट्रांसक्रिप्शनल रीप्रोग्रामिंग,स्टोमटल क्लोजर, और कैलोज निक्षेप2,5शामिल हैं। MAMPs के लिए लंबे समय तक जोखिम लगातार ऊर्जावान रूप से लागत प्रतिरक्षा संकेत सक्रिय करता है जिसके परिणामस्वरूप पौधे के विकास में बाधा होती है, विकास और प्रतिरक्षा13के बीच व्यापार बंद होने का संकेत मिलता है। पैटर्न-ट्रिगर अंकुर विकास निषेध (SGI) व्यापक रूप से Arabidopsis में प्रतिरक्षा उत्पादन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और पीआरआर सहित प्रतिरक्षा संकेतन के कई प्रमुख घटकों की पहचान करने के लिए अभिन्न रहा है14,15 ,16. इसलिए, इस कागज के अतिरिक्त Arabidopsisमें पैटर्न ट्रिगर SGI के लिए एक परख प्रस्तुत करता है, जिससे अंकुर मानक मीडिया या मीडिया 8-12 दिनों के लिए एक प्रतिरक्षा elicitor के साथ पूरक युक्त बहु अच्छी तरह से प्लेटों में बड़े हो रहे हैं और फिर तौला एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग कर.

प्रदर्शित करने के लिए कैसे ROS और SGI परख पीआरआर मध्यस्थता संकेतन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तीन जीनोटाइप है कि अलग प्रतिरक्षा outputs का प्रतिनिधित्व चुना गया: (1) जंगली प्रकार Arabidopsis accession कोलंबिया (कोल-0), (2) प्रमुख-नकारात्मक bak1-5 उत्परिवर्ती जिसमें बहु-कार्यात्मक पीआरआर सह-रिसेप्टर ब्रैसिनोस्टीड असंवेदनशील 1-एसोसिएटेड किने1 (BAK1) प्रतिरक्षा संकेतन में गैर-कार्यात्मक है17,18, और (3) अप्रभावी cpk28-1 उत्परिवर्ती, जो कमी है नियामक प्रोटीन कोल्हो-डिप्रेंडेंट प्रोफेन्डो किनेस 28 (CPK28) और प्रदर्शित करता है बढ़ प्रतिरक्षा ट्रिगर प्रतिक्रियाओं19,20. ROS और SGI परख एक कृत्रिम रूप से उत्पादित एल्फ18 पेप्टाइड जीवाणु दीर्घीकरण फैक्टर तू (EF-Tu) के epitope के जवाब में प्रस्तुत कर रहे हैं, PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15द्वारा Arabidopsis में मान्यता प्राप्त . इन प्रोटोकॉल अन्य प्रतिरक्षा elicitors के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है जैसे जीवाणु गतिशीलता प्रोटीन flagellin14 या अंतर्जात संयंत्र Elicitor प्रोटीन (AtPeps)16, तथापि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि संयंत्र जवाबदेही के आधार पर अलग है प्राप्त करने वाला21| साथ में, ROS और SGI परख जल्दी और देर से पीआरआर मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं के त्वरित और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

1. प्रतिरक्षा प्रकाश में आने के बाद Arabidopsis पत्ती डिस्क में आरओएस फट की जांच

  1. संयंत्र विकास और रखरखाव.
    1. अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए, 1 एमएल बाँझ 0.1% agar [w/v] में लगभग 50 बीजों को निलंबित करके Arabidopsis बीजों को स्तरित करें और 3-4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (कोई प्रकाश नहीं) पर स्टोर करें।
      नोट: एक जंगली प्रकार पृष्ठभूमि नियंत्रण Stratify (उदाहरण के लिए, कोल-0) और उच्च और कम प्रतिरक्षा outputs के साथ जीनोटाइप (उदाहरण के लिए, cpk28-1 और bak1-5, क्रमशः) आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए.
    2. मिट्टी पर बीज बोना और मानक कम दिन की स्थिति (22 डिग्री सेल्सियस, 10 एच प्रकाश, 150 mE/m2/ प्रकाश तीव्रता, और 65-70% सापेक्ष आर्द्रता) के तहत अंकुरित।
    3. लगभग 7 दिनों के बाद, नए बर्तन के लिए अलग-अलग अंकुर प्रत्यारोपण करने के लिए forceps का उपयोग करें, कम से कम 4 सेमी से अलग पूर्ण गुलाब के विकास की अनुमति के लिए। प्रति जीनोटाइप 6-12 अंकुर प्रत्यारोपण और मानक कम दिन की स्थिति में लौटने। नियमित रूप से पानी और उपजाऊ पौधों (1 ग्राम /
  2. रात भर वसूली के लिए 96-वेल प्लेटों में पत्ती डिस्क लीजिए।
    1. 4-5 सप्ताह के बाद के अंकुरण (चित्र 1A) में , एक तेज 4 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करने के लिए संयंत्र प्रति एक पत्ती डिस्क को दूर करने के लिए, मध्य नस से बचने और घाव को सीमित करने के लिए सावधान किया जा रहा है (चित्र 1B) . एक अप्रयुक्त 96-वेल ल्युमीटर प्लेट में पत्ती डिस्क रखें जिसमें 100 डिग्री एल डीएच2ओ है, जिसके साथ शुष्कता22 (चित्र 1ग)को रोकने के लिए ऊपर की ओर की ओर की ओर होता है। यदि एकाधिक elicitors का आकलन, प्रत्येक elicitor उपचार के लिए एक ही पत्ती से 1 पत्ती डिस्क निकालें.
      नोट: नमूना पत्ते है कि पूरी तरह से विस्तार कर रहे हैं, गुलाब के शीर्ष से तीसरे से पांचवें, और लगभग एक ही आकार और उम्र परिवर्तनशीलता को सीमित करने के लिए. यदि संभव हो तो, रात भर वसूली से पहले एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर आधे में पत्ती डिस्क काट, के रूप में यह प्रकाश में आने वाले समाधान23के संपर्क में सतह क्षेत्र बढ़ जाती है.
    2. पत्ती डिस्क संग्रह के दौरान घायल द्वारा उत्पादित ROS के हस्तक्षेप को रोकने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर पुनर्प्राप्त करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक ढक्कन के साथ कवर प्लेटें.
  3. प्रकाश में लाने वाला उपचार प्रदर्शन और ROS उत्पादन को मापने।
    1. कार्यक्रम प्लेट रीडर प्रतिक्रिया समाधान जोड़ने से पहले, के रूप में इस ROS फट दीक्षा और पहले माप दर्ज के बीच समय कम हो जाएगा. एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर है कि प्लेट रीडर के लिए उपयुक्त है का उपयोग करें. हमारे मामले में (सामग्री की तालिकादेखें), सेटिंग्सक्लिक करें, और LUM96 कारतूस और काइनेटिक पढ़ें प्रकार का चयन करें. पठन क्षेत्र श्रेणी क्लिक करें और पढ़ने के लिए कुओं या संपूर्ण प्लेट के सबसेट का चयन करने के लिए खींचें. PMT और ऑप्टिक्स टैब के अंतर्गत, एकीकरण समय समय टैब के अंतर्गत 1,000 ms. एकीकरण समय सेट करें, कुल रन समय को 40-60 मिनट और अंतराल को 2 मिनट पर सेट करें.
    2. एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक अच्छी तरह से पानी निकालें.
      नोट: पत्ती डिस्क पंचर नहीं है, क्योंकि यह घाव तनाव और अधिक चर ROS outputs में परिणाम हो सकता है.
    3. एक प्रतिक्रिया समाधान जिसमें 100 डिग्री सेल्सियस ल्युमिनोल, 10 ग्राम/एमएल एचआरपी, और प्राप्तकरनेकी की वांछित सांद्रता (उदाहरण के लिए: 1 एन एम, 10 एनएम, 100 एनएम, या 1,000 एनएम) में बाँझ डीएच2ओ, एक 96-अच्छी प्लेट के लिए 10 एमएल समाधान का उपयोग करते हुए तैयार करें।
      नोट: कम बाध्यकारी ट्यूबों में lyophilized पेप्टाइड्स भंग एक 10 मीटर स्टॉक बनाने के लिए, तरल एन2में फ्लैश फ्रीज , और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। जब उपयोग करने के लिए तैयार हो, बाँझ एच2हे में स्टॉक पतला एक 100 डिग्री सेल्सियस काम कर स्टॉक उत्पन्न करने के लिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
    4. प्रतिक्रिया मिश्रण के 100 डिग्री सेल्सियस को प्रत्येक वेल में वितरित करने के लिए एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करें, एक ही समय22में एक ही उपचार के सभी पत्ती डिस्क के लिए समाधान जोड़ने । प्रकाश की अनुपस्थिति में बेसल ROS स्तरों का मूल्यांकन करने के लिए प्रत्येक जीनोटाइप के लिए एक नियंत्रण प्रतिक्रिया (कोई प्रकाश में नहीं आना) शामिल करें। एक माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके दृश्य स्पेक्ट्रम में सभी तरंगदैर्ध्य के लिए प्रकाश उत्सर्जन को तुरंत मापें।
      नोट: तैयार है और कम प्रकाश के तहत प्रतिक्रिया समाधान लागू होते हैं, के रूप में luminol और HRP प्रकाश के प्रति संवेदनशील अभिकर्मक हैं. बर्फ पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर अभिकर्मकों रखें जब तक उपयोग में.
    5. गतिशील ऑक्सीडेटिव फट पर कब्जा करने के क्रम में एक माइक्रोप्लेट रीडर में एक 40-60 मिनट की अवधि में 2 मिनट के अंतराल में एक 1,000 एमएस एकीकरण समय के साथ प्रकाश उत्सर्जन को मापने के लिए (चित्र 1D)।
      नोट: एक 96-अच्छी प्लेट में सभी नमूने एक अंतराल के भीतर मापा जा सकता है कि यह सुनिश्चित करते हुए, परख संवेदनशीलता11में सुधार करने के लिए एक लंबे समय तक एकीकरण समय का उपयोग करें.
  4. डेटा व्याख्या.
    1. प्रत्येक जीनोटाइप के लिए, प्रत्येक समय बिंदु पर औसत फोटॉन गणना और मानक त्रुटि की गणना करने के लिए एक स्प्रेडशीट अनुप्रयोग का उपयोग करें, और एक तितर बितर साजिश का उपयोग कर समय के एक समारोह के रूप में ROS उत्पादन प्रदर्शित करते हैं।
      Equation 1
      कहाँ t ] हर समय बिंदु
    2. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक पत्ती डिस्क के लिए फोटॉन गणना ओंकारें और मानक त्रुटि बार या बॉक्स और व्हिस्की प्लॉट के साथ बार ग्राफ़ का उपयोग करके प्रत्येक जीनोटाइप के लिए इन मानों का औसत प्रस्तुत करें.
      Equation 2

2. सीडिंग विकास निषेध परख

  1. बीज ों की बीज बोकर मुरशीज और स्कोग (एमएस) प्लेटों पर बोएं।
    1. बाँझ आधा शक्ति (0.5x) एमएस मध्यम (2.16 g/L) 0.8% agar युक्त [w/ प्लेटों में मीडिया डालो (90 x 15 मिमी) एक laminar प्रवाह हुड में.
    2. 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ धोने और आकांक्षा से हटाने के द्वारा एक microcentrifuge ट्यूब में लगभग 100 बीज बाँझ। 40% ब्लीच के 1 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान पर 17 मिनट के लिए धीरे रॉक. आकांक्षा द्वारा ब्लीच निकालें और बाँझ पानी के 1 एमएल में 5 मिनट के लिए तीन बार धोने. बाँझ 0.1% agar के 1 एमएल में resuspend.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक क्लोरीन गैस बीज नसबंदी प्रोटोकॉल24का उपयोग करें.
    3. एक पिपेट का उपयोग कर एमएस आगर प्लेटों पर प्रति जीनोटाइप लगभग 100 बीज बोना और एक laminar प्रवाह हुड में माइक्रोपोर टेप के साथ सील।
      नोट: करीब निकटता में बीज रखने से बचें क्योंकि इससे बाद में पौधे लगाना मुश्किल हो जाएगा।
    4. अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए 3-4 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (कोई प्रकाश नहीं) पर प्लेटें रखकर बीजों को Stratify करें (चित्र 2क)।
  2. प्रतिरक्षा elicitor पेप्टाइड्स युक्त 48-वेल प्लेटों में प्रत्यारोपण अंकुर।
    1. स्तरीकरण के बाद, कम दिन की स्थितियों (22 डिग्री सेल्सियस, 10 एच प्रकाश, 150 mE/m2/ प्रकाश तीव्रता, और 65-70% सापेक्ष आर्द्रता) के तहत प्रकाश के लिए प्लेटों को ले जाएँ 3-4 दिनों के लिए अंकुरण की अनुमति देने के लिए।
    2. एक लेमिनर प्रवाह हुड में, प्रत्येक 48-अच्छी प्लेट के लिए एमएस के 25 एमएल का उपयोग करते हुए बाँझ 0.5x एमएस तरल मीडिया में (0 एनएम, 1 एनएम, 100 एनएम, और 1,000 एनएम) को तैयार करें। एमएस तरल माध्यम या एमएस मध्यम प्रति अच्छी तरह पेप्टाइड्स युक्त 500 डिग्री सेल्सियस पाइपद्वारा प्लेटें तैयार करें। यदि उपलब्ध हो, तो प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए प्लेट तैयार करने के लिए एक दोहराने पाइपेटर का उपयोग करें।
      नोट: प्रत्येक जीनोटाइप के लिए, बीज वृद्धि में किसी भी अंतर्निहित अंतर के लिए खाते के लिए प्रकाश में आने के बिना एमएस में अंकुर हो जाना।
    3. बाँझ forceps का उपयोग सावधानी से एक ही आकार और उम्र के प्रत्येक अच्छी तरह से एक अंकुर प्रत्यारोपण, यह सुनिश्चित करना है कि वहाँ अंकुर या जड़ को टूटना करने के लिए कोई नुकसान नहीं है और जड़ मीडिया में डूब गया है. प्रत्येक जीनोटाइप के लिए, प्रत्येक पेप्टाइड कमजोर पड़ने में कम से कम 6-8 अंकुरों का प्रत्यारोपण करें (चित्र 2ख)।
      नोट: 4 दिनों के बाद अंकुरीकरण पर प्रत्यारोपण अंकुर, के रूप में कम जड़ों में हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं, और पुराने अंकुर कम इष्टतम परिणाम प्राप्त कर सकते हैं।
    4. माइक्रोपोर टेप के साथ सील प्लेटें और मानक कम दिन की स्थिति (22 डिग्री सेल्सियस,10 एच प्रकाश, 150 मीटर / 8-12 दिनों के लिए अंकुर बढ़ने दें।
  3. प्रतिशत वृद्धि अवरोध निर्धारित करते हैं.
    1. ध्यान से 48 अच्छी प्लेटों से अंकुर निकालें और कागज तौलिया पर dabbing द्वारा सूखी. एक विश्लेषणात्मक पैमाने पर और रिकॉर्ड मूल्यों पर वजन अंकुर। यदि उपलब्ध हो, एक स्प्रेडशीट पर ताजा वजन मूल्यों को रिकॉर्ड करने के लिए USB उत्पादन के साथ सुसज्जित एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग करें. अंकुरों का वजन करने से पहले, विकास निषेध को दृष्टिसे प्रदर्शित करने के लिए एक फोटो लें (चित्र 2C)।
    2. केवल एमएस में उगाए गए पौधकी की तुलना में उत्कम्पक-उपचारित पौधों के प्रतिशत वृद्धि अवरोध का निर्धारण करें (चित्र 2डी) इस प्रकार हैं:
      Equation 3
    3. मानक त्रुटि पट्टियों के साथ बार ग्राफ़ का उपयोग करके या अंतर-प्रयोगात्मक प्रसरण को बेहतर ढंग से प्रदर्शित करने के लिए बॉक्स और व्हिज़र प्लॉट का उपयोग करके डेटा को प्लॉट करें.

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Representative Results

उत्परिवर्ती cpk28-119,25 और bak1-517,18 पौधों को उच्च और कम प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ जीनोटाइप के लिए अपेक्षित परिणामों को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया, क्रमशः ऑक्सीडेटिव फट और SGI में एक जंगली प्रकार पृष्ठभूमि नियंत्रण (कोल-0) के सापेक्ष assays. खुराक पर निर्भर प्रभाव का आकलन करने के लिए, एक 10 गुना पेप्टाइड कमजोर पड़ने श्रृंखला (1-1,000 एनएम) elf18 का इस्तेमाल किया गया था. जैसा कि अपेक्षित था, cpk28-1 हानि-की-फलन लाइनों में अधिक संचयी (चित्र 3क) और औसत (चित्र 3ख) ROS फट गया था , जबकि बैक1-5 ने 10 एन एम के बीच सांद्रता में कम ROS उत्पादन प्रदर्शित किया था और 1,000 एनएम (चित्र 3)। एसजीआई में अपेक्षित अंतर 100 एनएम और 1,000 एनएम एल्फ18 में उगाए गए सभी जीनोटाइपों के बीच विचार किया जा सकता है (चित्र 4ए), जिसे 1000 एनएम एल्फ18 उपचार में भी नेत्रहीन देखा जा सकता है (चित्र 4 बी) । उच्च प्रतिरक्षा संकेतन की विशेषता, cpk28-1 म्यूटेंट कोल-0 की तुलना में काफी छोटे थे जब 1,000 एनएम elf18 में बड़े हो, जबकि bak1-5 म्यूटेंट बाधित MAMP का पता लगाने के कारण कोल-0 के सापेक्ष कमजोर विकास निषेध प्रदर्शित किया.

Figure 1
चित्र 1. Luminol आधारित ऑक्सीडेटिव फट परख Arabidopsisमें प्रतिरक्षा प्रेरण के बाद | (क) 4-5 सप्ताह के लिए कम दिन की स्थितियों में मिट्टी पर पौधे उगाएं। (बी) प्रत्येक संयंत्र से पत्ती डिस्क एकत्र करने और डीडीएच2ओ (सी) ऐड रिएक्शन समाधान (100 डिग्री सेल्सियस ल्यूमिनॉल, 10 ग्राम/एमएल एचआरपी, और प्राप्त करने की वांछित सांद्रता) में पत्तियों की डिस्क एकत्र करने के लिए 4 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करें और 2 मिनट के अंतराल में 40-60 मिनट से अधिक प्रकाश उत्सर्जन को मापें। 1,000 एमएस के एकीकरण समय के साथ (डी) कोल-0 (हरे रंग में दिखाया गया) के सापेक्ष प्रत्येक जीनोटाइप के लिए औसत फोटॉन गणना निर्धारित करें, एक उच्च ROS नियंत्रण जैसे cpk28-1 (बैंगनी में दिखाया गया है), और एक कम ROS नियंत्रण जैसे bak1-5 (नारंगी में दिखाया गया है)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. अरिबिडोप्सिसमें एलिजिटर-प्रेरित अंकुर वृद्धि अवरोध परख | (क) एमएस आगर पर बोएं और मानक अल्प-दिन की परिस्थितियों में 3-4 दिनों तक बढ़ें। (बी) एमएस मीडियम या एमएस युक्त 48-वेल प्लेटों में ट्रांसप्लांट अंकुर, जिसमें एल्फ18 की विभिन्न सांद्रता होती है। (सी) 8-12 दिनों के बाद, नेत्रहीन अंकुर आकार का आकलन और फिर प्रतिशत विकास अवरोध निर्धारित करने के लिए एक विश्लेषणात्मक पैमाने का उपयोग कर ताजा वजन को मापने। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. प्रतिनिधि elf18 प्रेरित ऑक्सीडेटिव तीन Arabidopsis जीनोटाइप में फट. चार सप्ताह पुराने पौधों elf18 (0 एन एम 'मोक', 1 एनएम, 10 एनएम, 100 एनएम, और 1,000 एनएम की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ इलाज किया गया. कर्नल-0 क्रमशः उच्च और कम ROS phenotypes का प्रतिनिधित्व करने वाले cpk28-1 और bak1-5 के साथ, जंगली प्रकार पृष्ठभूमि नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है। (क) योगिनी उपचार के बाद सापेक्ष प्रकाश इकाइयोंके रूप में प्रदर्शित कुल फोटॉन संख्या (द र् 6 स्वतंत्र पादपों से ली गई डिस्क)। सांख्यिकीय मतभेद कम मामले पत्र द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं और एक के बाद-हॉक Tukeyईमानदार महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA का उपयोग कर गणना की गई (p;lt;0.05). (ख) औसत फोटॉन गणना, सापेक्ष प्रकाश इकाइयों के रूप में प्रतिनिधित्वकिया, elf18 उपचार के बाद 40 मिनट से अधिक (n $ 6 स्वतंत्र पौधों से पत्ती डिस्क). त्रुटि पट्टियाँ माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं. इसी तरह के परिणाम तीन में से दो प्रयोगों में प्राप्त किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. प्रतिनिधि elf18 प्रेरित अंकुर विकास निषेध तीन Arabidopsis जीनोटाइप में. जंगली प्रकार (कोल-0), cpk28-1,और bak1-5 अंकुर elf18 की एक 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला (0-1,000 एनएम) में बड़े हो गए थे. (क) प्रतिशत वृद्धि अवरोध की गणना एलएफ 18 (n $6 व्यक्तिगतअंकुर) में उगाए गए व्यक्तिगत पौधों के वजन की तुलना करके उसी जीनोटाइप के औसत वजन की तुलना करके की गई थी जो केवल एमएस ('मॉक') (n ]6 व्यक्तिगत अंकुरों) में उगाए गए थे। एक 10 दिन की अवधि में. सांख्यिकीय मतभेद कम मामले पत्र द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं और एक के बाद-हॉक Tukeyईमानदार महत्वपूर्ण अंतर परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA का उपयोग कर गणना की गई (p;lt;0.05). (ख) एल्फ18 की सांद्रता में वृद्धि के प्रत्युत्तर में कोल-0, cpk28-1 और bak1-5 के दो प्रतिनिधि अंकुरों में एसजीआई का दृश्य प्रदर्शन। इसी प्रकार के परिणाम चार में से तीन प्रयोगों में प्राप्त किए गए। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस कागज पर assaying पैटर्न के लिए दो तरीकों का वर्णन करता है Arabidopsisमें प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं ट्रिगर, विशेष उपकरणों के उपयोग के बिना प्रतिरक्षा उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण की पेशकश. संयोजन में, पैटर्न-ट्रिगर ROS और SGI का उपयोग क्रमशः माइक्रोब धारणा के लिए जल्दी और देर से प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

ऑक्सीडेटिव फट परख की प्रमुख सीमा परिवर्तनशीलता है. कारण है कि पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहे हैं के लिए, निरपेक्ष RLUs अक्सर प्रयोगों के बीच परिमाण के एक आदेश से अलग. क्योंकि के बीच प्रयोग परिवर्तनशीलता उच्च है, यह उच्च के साथ आंतरिक संदर्भ नियंत्रण शामिल करने के लिए सलाह दी जाती है(उदा., cpk28-1) और कम(उदा, bak1-5) एक जंगली प्रकार नियंत्रण के अलावा ऑक्सीडेटिव फटने(उदा, कोल-0). तथापि, प्रयोगों के बीच पुनरूत्थानता बढ़ाने के लिए उपाय किए जा सकते हैं। इस तरह के तापमान, आर्द्रता, photoperiod, और प्रकाश तीव्रता के रूप में पर्यावरण की स्थिति प्रतिकृति के बीच एक समान होना चाहिए। नमूने के दौरान पौधों की आयु और स्वास्थ्य पर भी विचार किया जाना चाहिए। लीफ डिस्क उन पौधों से एकत्र की जा सकती है जो कम दिन की स्थितियों (6-10 घंटे के प्रकाश) के तहत 4 से 7 सप्ताह की आयु के बीच होते हैं। वास्तविक रूप से, सबसे सुसंगत परिणाम अंकुरण के बाद 6 सप्ताह से पुराने पौधों के साथ पाए गए, लेकिन अभी तक फूल या senescing नहीं. स्वच्छ पर्यावरण कक्षों में पौधों को विकसित करना महत्वपूर्ण है ताकि वे पाउडर फफूंदी या चबाने वाले कीड़ों जैसे सामान्य कांच के खाने के कीटों के संपर्क में न हों। चूंकि SGI के लिए अंकुर बाँझ एमएस मीडिया में बड़े हो रहे हैं, और एक कम समय के लिए, पर्यावरण के उतार चढ़ाव काफी हद तक एक चिंता का विषय नहीं हैं. हालांकि, भिन्नता हो सकती है अगर रोपण के दौरान अंकुर क्षतिग्रस्त हो जाते हैं, यदि उत्पीडउपचार के लिए चयनित अंकुर अलग-अलग आकार के होते हैं, या यदि विकास मीडिया दूषित हो जाता है। यह आंतरिक संदर्भ नियंत्रण जीनोटाइप SGI प्रयोगों में ऊपर वर्णित के रूप में अच्छी तरह से शामिल करने के लिए सिफारिश की है.

प्रतिरक्षा परख का संचालन करते समय एप्रिल्टर एकाग्रता एक और महत्वपूर्ण विचार है। एलिक्वेटर्स पीआरआर द्वारा माना जाता है जिसके परिणामस्वरूप एक तीव्र और मजबूत आरओएस फट 10-20 मिनट के बाद प्रकाश में लाया जाता है (चित्र 2ख) . तथापि, फट का परिमाण उत्क्षेपक और पादप जीनोटाइप दोनों पर निर्भर करता है। अतः चित्र 3 और चित्र 4में प्रस्तुत एक उत्कया खुराक श्रृंखला की सिफारिश की जाती है ताकि उपयुक्त उत् कित्र सांद्रता की पहचान की जा सके। पैटर्न-ट्रिगर आरओएस को लाइव रोगाणुओं23,26 या माइक्रोबियल अर्क26,27,28के साथ पत्तियों की डिस्क टीका लगाकर भी परख किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, क्षणिक और खुराक पर निर्भर आरओएस फटने का पता Arabidopsis में Peudomonas syringaeके उग्र pathovars के जवाब में पाया जा सकता है , 35-40 मिनट पर चोटी और लगभग 70 मिनट के प्रकाश में आने के बाद बेसल स्तर तक पहुँचने 23 , 29. एविरूलेंट बैक्टीरिया29 या फंगल रोगज़नक़ पी केजवाब में30,31,आरओएस का दूसरा अधिक स्पष्ट संचय उत्पन्न होता है जिसे 6-10 घंटे बाद निगरानी की जा सकती है टीका. कमजोर elicitors के लिए, इस तरह के कवक chitin32 या chitosan33के रूप में, अधिक संवेदनशील luminescent संकेतक इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे luminol व्युत्पन्न एल-012, हालांकि, पृष्ठभूमि संकेत का उत्पादन अक्सर उच्च32है, 34. महत्वपूर्ण बात यह है कि संयंत्र पर्यावरण प्रकार भी विशिष्ट प्रकाश में लाने के लिए अपनी जवाबदेही तय करेगा35,36. उदाहरण के लिए, जबकि बैक्टीरियल flagellin कर्नल-0 सहित कई Arabidopsis ecotypes में प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्राप्त करने में सक्षम है, Wassilewskiza (Ws-0) ecotype PRR FLAGELIN-SENSING 2 (FLS2) के एक गैर कार्यात्मक संस्करण व्यक्त करता है और है इसलिए ध्वजारोहण14,37के प्रति असंवेदनशील .

इम्यून प्रेरित आरओएस को ब्रासिका नैपस38, टमाटर39, निकोटियाना बेंटहामियाना22,40,41, और सहित अन्य डाइकोटिल्डोस पौधों की पत्तियों डिस्क में भी देखा जा सकता है , और कई अन्य Solanaceous प्रजातियों41| अतिरिक्त luminol आधारित ROS का पता लगाने परख ऊतक अर्क का उपयोग कर पौधों के लिए विकसित किया गया है10, सेल निलंबन संस्कृतियों8,42, और protoplasts43, और सिस्टम में विशेष रूप से उपयोगी होते हैं जहां पत्ती डिस्क प्रोटोकॉल प्रभावी नहीं हैं42. उदाहरण के लिए, प्रकाश में प्रेरित ROS फटने चावल42,44 और गेहूं45,46,के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जिम्नोस्पर्म Araucaria angustifolia में सेल निलंबन संस्कृतियों का उपयोग कर वर्णित किया गया है 47 और काई Physcomitrella patens48| SGI के रूप में मोटे तौर पर प्रतिरक्षा संकेतन को मापने के लिए इस्तेमाल नहीं किया गया है. तथापि, उत् साह प्राप्त करने वालों के प्रत्युत्तर में वृद्धि अवरोध का प्रदर्शन एन बेंटहमियाना41 और बी नेपस38,49में किया गया है. पी पैटेन्स में भी तेजी से वृद्धि अवरोध का प्रदर्शन किया गया है जो जोखिम के 2 मिनट के भीतर होने वाली फंगल चिटिन के जवाब में है, जिसे समय चूक फोटोग्राफी48का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है।

संशोधन के साथ, दोनों SGI और ऑक्सीडेटिव फट परख उच्च throughput स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रतिरक्षा नियामकों की पहचान. उदाहरण के लिए , आरबिडोप्सिस की मूकीकृत जनसंख्या एमएस माध्यम पर उगाई जा सकती है और असंवेदनशील उत्परिवर्ती15,50,51,52,53की पहचान करने के लिए प्रकाश में लाई जा सकती है . वैकल्पिक रूप से, mutagenized आबादी elicitor-triggered ROS, जो सफलतापूर्वक दोनों पत्ती डिस्क54 और एमएस प्लेटों19पर बड़े पूरे अंकुर के साथ मार डाला गया है के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है. एक अन्य उपयोगी स्क्रीनिंग विधि ट्रांसजेनिक ओवरएक्सप्रेशन लाइनों22,40,55के विकास से पहले ROS विश्लेषण के लिए N. benthamiana में प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति है . हालांकि, अंतर-प्रयोगात्मक भिन्नता स्थिर Arabidopsis लाइनों में एन benthamiana पत्तियों22में अंतर प्रोटीन की वजह से अधिक है, हालांकि यह आंशिक रूप से घुसपैठ संदर्भ द्वारा कम किया जा सकता है प्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही पत्ती पर नियंत्रण.

संक्षेप में, प्रतिरक्षा प्रेरित ऑक्सीडेटिव फट और SGI परख Arabidopsis में पीआरआर मध्यस्थता संकेत का आकलन करने के लिए त्वरित और विश्वसनीय तरीके हैं. इन तरीकों को अन्य प्रणालियों के लिए बढ़ाया जा सकता है और उपन्यास प्रतिरक्षा नियामकों को उजागर करने के लिए बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया.

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Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

हमारी प्रयोगशाला में काम कनाडा के प्राकृतिक संसाधन और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) डिस्कवरी कार्यक्रम, अभिनव जॉन आर इवांस नेता कोष के लिए कनाडा फाउंडेशन, और रानी विश्वविद्यालय के माध्यम से वित्त पोषित है. केएस और आईएस मास्टर के छात्रों (सीजीएस-एम) के लिए अग्रानुक्रम ओंटारियो स्नातक छात्रवृत्ति और NSERC कनाडा स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589

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