Immunology and Infection
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Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana
Chapters
Summary May 21st, 2019
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Este artículo describe dos métodos para cuantificar las respuestas de defensa en Arabidopsis thaliana después de la exposición a los impulsores inmunes: la ráfaga oxidativa transitoria y la inhibición del crecimiento de la plántula.
Transcript
Estos ensayos se pueden utilizar para evaluar y comparar las salidas inmunitarias de diferentes genotipos vegetales. La principal ventaja de estas técnicas es que son rápidas, confiables y utilizan equipos de laboratorio comunes. Para el ensayo de inhibición del crecimiento, las plántulas del mismo tamaño y edad deben trasplantarse y secarse completamente antes de pesar para limitar la variación.
A las cuatro a cinco semanas después de la germinación, utilice un punzón de biopsia de cuatro milímetros para extraer un disco de hoja por planta de Arabidopsis, evitando la mitad de laveina y teniendo cuidado de limitar las heridas. Recoger los discos en pozos individuales de una placa de luminómetro de 96 pozos no utilizada que contiene 100 microlitros de agua de doble destilación por pozo, lado adaxial hacia arriba, para evitar la desicación. Si evalúa varios elicitores, retire un segundo disco de hoja de la misma hoja para cada tratamiento de elicitor y cubra la placa con la tapa para permitir que los discos de la hoja se recuperen durante la noche a temperatura ambiente.
A la mañana siguiente, establezca los parámetros del lector de microplacas en un tiempo de integración de 1.000 milisegundos en intervalos de dos minutos durante un período de 40 a 60 minutos para capturar la ráfaga oxidativa dinámica. A continuación, utilice una pipeta multicanal para reemplazar el agua de cada pozo por 100 microlitros de solución de reacción recién preparada, incluido un control, sin reacción elicitor para cada genotipo para evaluar los niveles de especies de oxígeno de reacción basal en ausencia de aclaración. A continuación, mida inmediatamente la emisión de luz para todas las longitudes de onda en el espectro visible en el lector de microplacas.
A los cuatro días después de la germinación, cargue cada pocódito de una placa de 48 pocillos con 500 microlitros de medio MS complementado con una dilución del péptido del aeropuerto. A continuación, utilice fórceps estériles para trasplantar cuidadosamente de seis a ocho plántulas del mismo tamaño, edad y genotipo a cada dilución de péptido, teniendo cuidado de que no haya daño a la plántula o rotura a la raíz y que la raíz esté sumergida en medio. Cuando todas las plántulas hayan sido chapadas, selle las placas con cinta de micropore y coloque las plantas en condiciones estándar de día corto durante ocho a 12 días.
Para determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento, tomar una foto para registrar visualmente la inhibición del crecimiento antes de eliminar cuidadosamente las plántulas de cada pozo. Luego, toque las raíces en una toalla de papel para secar, y pesar cada plántula en una escala analítica. En este experimento representativo, las plantas mutantes con señalización inmune hiperactiva demostraron una ráfaga oxidativa mayor y media en comparación con las plantas de Arabidopsis de tipo salvaje, mientras que las plantas mutantes con señalización inmune deteriorada mostraron una ráfaga oxidativa reducida a concentraciones entre 10 y 1.000 nanomolares.
Las diferencias esperadas en la inhibición del crecimiento de las plántulas también podrían discernirse entre todos los genotipos cultivados en 100 y 1.000 concentraciones de péptidos de elicitor nanomolar. Cuando se cultivaban en la dilución de 1.000 péptidos nanomolares, los mutantes con señalización inmune hiperactiva eran notablemente más pequeños que las plantas de tipo salvaje cultivadas en las mismas condiciones, mientras que los mutantes con señalización inmune deteriorada mostraron una inhibición débil del crecimiento en relación con las plantas de tipo silvestre. Estos métodos proporcionan evidencia para las respuestas inmunitarias tempranas y tardías.
Varias otras técnicas, incluyendo ensayos de quinasa MAP, expresión génica inducida por patógenos y ensayos de infección, se pueden utilizar para delinear estas vías. Estas técnicas se han modificado para su uso en pantallas a gran escala, que han identificado con éxito proteínas receptoras de patógenos y varios otros componentes de señalización.
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