Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Immunology and Infection

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Summary

Nous décrivons ici un essai de tuerie in vivo basé sur la cytométrie en flux qui permet l’examen de l’immunodominance dans les réponses cytotoxiques des lymphocytes T (CTL) à un antigène tumoral modèle. Nous fournissons des exemples de la façon dont ce dosage élégant peut être utilisé pour les études mécanistes et pour les tests d’efficacité des médicaments.

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Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).

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Abstract

Les dosages de cytotoxicité in vivo à base de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) permettent une quantification sensible et précise des réponses de lymphocytes T cytolytiques (CTL) de la bactérie et des peptides dérivés de tumeurs et d’agents pathogènes. Ils offrent plusieurs avantages par rapport aux tests de tuerie traditionnels. Premièrement, ils permettent le suivi de la cytotoxicité médiée par la CTL au sein des organes lymphoïdes secondaires intacts architecturalement, généralement dans la rate. Deuxièmement, ils permettent des études mécanistiques pendant les phases d’amorçage, d’effecteur et de rappel des réponses CTL. Troisièmement, ils fournissent des plateformes utiles pour les tests d’efficacité des vaccins/médicaments dans un environnement véritablement in vivo. Ici, nous fournissons un protocole optimisé pour l’examen des réponses concomitantes de CTL contre plus d’un épitope de peptide d’un antigène de tumeur de modèle (AG), à savoir, le grand T AG (T AG) codé par le virus simien 40 (SV40). Comme la plupart des autres protéines tumorales cliniquement pertinentes, T AG héberge de nombreux peptides potentiellement immunogéniques. Cependant, seuls quatre de ces peptides induisent des réponses CTL détectables chez les souris C57BL/6. Ces réponses sont systématiquement disposées dans un ordre hiérarchique en fonction de leur magnitude, ce qui constitue la base de la «immunodominance» de T v dans ce système puissant. Par conséquent, la plus grande partie de la réponse T -t-t-t spécifique à t AG est centrée sur un seul épitope immunodominantes tandis que les trois autres épitopes sont reconnus et n’ont réagi que faiblement. L’immunodominance compromet l’ampleur des réponses antitumorales du T et est, en tant que telle, considérée par beaucoup comme un obstacle à la vaccination réussie contre le cancer. Par conséquent, il est important de comprendre les facteurs cellulaires et moléculaires et les mécanismes qui dictent ou forment l’immunodominance T. Le protocole que nous décrivons ici est adapté à l’étude de ce phénomène dans le modèle de vaccination de T AG, mais peut être facilement modifié et étendu à des études similaires dans d’autres modèles tumoraux. Nous fournissons des exemples de la façon dont l’impact des interventions immunothérapeutiques expérimentales peut être mesuré à l’aide de tests de cytotoxicité in vivo.

Introduction

Les cellules traditionnelles de l+ T(t) jouent des parties importantes dans la surveillance immunitaire anticancéreuse. Ils fonctionnent principalement dans la capacité des lymphocytes T cytolytiques (CTL) qui reconnaissent des antigènes peptidiques spécifiques ou associés à des tumeurs (AGS) affichés dans la fente fermée des molécules de classe I de complexe d’histocompatibilité majeure (MHC). Les CTL entièrement armés utilisent leur arsenal cytotoxique pour détruire les cellules malignes. L’anticancéreux T peut être détecté dans la circulation ou même à l’intérieur des masses primaires et métastatiques de nombreux patients cancéreux et animaux porteurs de tumeurs. Cependant, ils sont souvent anergiques ou épuisés et ne parviennent pas à éradiquer le cancer. Par conséquent, de nombreuses modalités immunothérapeutiques sont conçues pour augmenter les fréquences anticancéreuses du T et pour rétablir et renforcer leurs fonctions.

Les protéines tumorales abritent de nombreux peptides, dont certains peuvent être immunogènes et potentiellement immunoprotecteurs. Cependant, les réponses quantifiables de T-b sont obtenues avec des magnitudes variables par rapport à quelques peptides seulement. Cela crée une «hiérarchie d’immunodominance» parmi les clones T1. En conséquence, l’immunodominante (ID ) T s. v. occupent des rangs hiérarchiques importants, qui sont généralement jugés par leur abondance. En revanche, les cellules t, dont le récepteur de lymphocytes t (TCR) est spécifique pour les épitopes sous-dominants (SD), se retrouvent dans les fréquences inférieures. Nous et d’autres avons identifié certains des facteurs qui dictent ou façonnent l’immunodominance dans les réponses de T. Parmi ceux-ci figurent, entre autres, le mode de présentation AG à T (c.-à-d. présentation directe, Cross-Presentation, cross-dressing)2,3,4, le type de cellules présentatrices AG (APCS) participation à l' activation5de T, l’abondance et la stabilité des protéines AGS6,7 et l’efficacité et la cinétique de leur dégradation par les protéasomes7,8, le sélectivité relative du transporteur associé au traitement AG (TAP) pour les peptides9, l’affinité des peptides libérés pour les molécules de MHC I9,10, la présence, les fréquences précurseurs et la diversité TCR des dans les pools de lymphocytes t11,12,13, la concurrence croisée entre les lymphocytes t pour l’accès aux APCS14,15et la capacité fratricide de t clones16. De plus, l' immunodominance t-1 est soumise à des mécanismes immunologiques médiés par plusieurs types de cellules suppresseurs tels que les cellules t (ntreg) régulatrices naturelles17, la molécule co-inhibitrice de surface cellulaire programmée Death-1 (DP-1)16, et certaines enzymes intracellulaires telles que l’INDOLÉAMINE 2,3-dioxygénase (IDO)18 et l’objectif mammifère de la rapamycine (mTOR)19. Il est important de noter, cependant, que les facteurs ci-dessus ne représentent pas toujours pleinement l’immunodominance.

En dehors de la biologie de base de l’immunodominance T, l’examen de ce phénomène intrigant a des implications importantes dans l’immunologie et l’immunothérapie du cancer. Premièrement, un statut d’ID ne confère pas nécessairement à un clone T-1 donné la capacité de prévenir l’initiation ou la progression de la tumeur20. La question de savoir si et comment ID et SD T a contribuer à l’immunité antitumorale peut dépendre du type et de l’étendue de la malignité et du système expérimental utilisé. Deuxièmement, on pense que les clones ID T-1 peuvent être «trop visibles» pour le système immunitaire et par conséquent plus enclins aux mécanismes de tolérance centraux et/ou périphériques16,21. Troisièmement, les tumeurs hétérogéniques peuvent contenir des cellules néoplasiques qui évitent la détection par beaucoup, sinon la plupart, des CTL en affichant seulement un spectre étroit de peptide: complexes de MHC. Dans ces circonstances, les réponses de T. 5 de la largeur insuffisante sont susceptibles d’offrir à ces cellules tumorales un avantage de survie, potentiant ainsi leur excroissance22. C’est pour les raisons ci-dessus que de nombreux considèrent l’immunodominance comme un obstacleà la réussite de la vaccination basée sur T et des thérapies contre le cancer.

L’inoculation de souris C57BL/6 avec des cellules transformées de virus simien 40 (SV40) qui expriment une grande tumeur AG (T AG) fournit un système préclinique puissant pour étudier l’immunodominance de t. Ce modèle offre plusieurs avantages. Premièrement, les épitopes peptidiques de cette oncoprotéine cliniquement pertinente sont bien caractérisées dans cette souche de souris23 (tableau 1). Deuxièmement, les épitopes de T AG, qui sont appelés sites I, II/III, IV et V, déclenchent des réponses de T-b qui sont systématiquement disposées dans l’ordre hiérarchique suivant: site iv > > site i ≥ site II/iii > ≫ site v. en conséquence, le site IV spécifique t Montez la réponse la plus robuste à T AG. En revanche, les sites I et II/III sont sous-dominants, et le site V -specific T est moins abondant et n’est généralement détectable qu’en l’absence de réactivité à d’autres épitopes23,24. Troisièmement, la lignée de cellules tumorales T AG+ utilisée dans le protocole décrit ici, à savoir les cellules de Fibrosarcome C57SV, et celles utilisées dans nos enquêtes antérieures16,17,18,19 ,25,26, sont transformés avec des fragments de SV40 subgénomiques25. Par conséquent, ils ne peuvent pas assembler et libérer des virions SV40 qui pourraient potentiellement infecter les APCs d’hôte. En outre, les cellules C57SV sont dénuées de molécules costimulatrices classiques telles que CD80 (B7-1), CD86 (B7-2) et CD137 ligand (4-1BBL)16. Les attributs ci-dessus font de ces lignes idéales pour l’examen de l’activation in vivo T par l’amorçage croisé. L’amorçage croisé est une voie majeure pour induire des réponses de T-b, en particulier celles lancées contre des cellules tumorales d’origine non hématopoïétique qui ne parviennent pas à amorcer directement les lymphocytes t naïfs25.

Les fréquences et /ou les fonctions de l’antitumorale T sont contrôlées par la coloration du tétramère MHC I, la coloration intracellulaire pour les cytokines effectrices (p. ex. interféron [IFN]-γ) ou les molécules lytiques (p. ex. perforine), les dosages d’immunospot (ELISPOT) enzymatiques et tests de cytotoxicité vivo. Depuis leur création dans les années 199027,28, la carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE)-essais de mise à mort in vivo ont permis l’évaluation des réponses cytotoxiques médiées par les CTL antiviraux29,30 , 31, antitumeur CTLS16,32, Natural Killer (NK) cellules33, glycolipidique invariant Natural Killer T (iNKT) cellules34, et préexistant et de Novo spécifique au donneur alloanticorps26. Par conséquent, leurs applications peuvent intéresser un large lectorat, y compris, mais sans s’y limiter, les enquêteurs travaillant dans les domaines de l’immunologie tumorale et de l’immunothérapie, l’immunité anti-pathogène, et la conception préventive et thérapeutique des vaccins.

Pour évaluer la cytotoxicité véhiculée par les cellules dans des scénarios typiques, deux populations de splénocytes naïfs qui présentent soit une AG non pertinente, soit une AG (s) apparentée, sont étiquetées avec deux doses différentes de CFSE, mélangées en nombres égaux et injectées dans des naïfs (témoins) ou des tueurs souris à l’herse cellulaire. La présence/absence de chaque population cible est ensuite examinée par cytométrie en flux.

Nous avons optimisé et utilisé des essais de mise à mort in vivo dans nos études sur l’immunodominance dans les réponses antivirales et anti-tumorales de T-112,16,17. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’évaluation simultanée des réponses d’ID et de SD t de l’épitopes de t AG, qui peuvent être facilement adoptées pour des investigations semblables dans d’autres systèmes expérimentaux. Nous fournissons également des résultats représentatifs démontrant que la déplétion des cellules nTreg et le blocus de laDP-1 peuvent améliorersélectivement la cytotoxicité induite par l’ID t-t-T et le SD t-t. À la fin, nous discuterons de multiples avantages des essais de mise à mort in vivo ainsi que de certaines de leurs limitations inhérentes.

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Protocol

Les expériences décrites ici suivent les protocoles d’utilisation des animaux approuvés par les entités institutionnelles et adhèrent aux lignes directrices nationales établies.

1. inoculation de souris C57BL/6 avec des cellules tumorales exprimant le T AG

  1. Cultiver la lignée de cellules de Fibrosarcome SV40 transformée C57SV (ou une lignée de cellules adhérentes T AG+ similaire) dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 4,5 g/l de D-glucose et de l-glutamine (1x) et complétée par du pyruvate de sodium à 1 mm et 10% de la chaleur inactivée sérum bovin fœtal (FBS) dans des flacons traités à la culture tissulaire à 37 ° c dans une atmosphère humidifiée contenant 10% de CO2.
  2. Une fois que les cellules deviennent complètement confluentes ou légèrement surconfluentes, enlevez doucement et jetez le milieu et rincez la monocouche avec une solution saline préchauffée de phosphate-tamponné (PBS).
    Remarque: l’expression T AG maximale est obtenue lorsque les cellules T AG+ atteignent 100% de confluences.
  3. À l’intérieur d’un coffret de sécurité biologique, ajouter de la trypsine-EDTA préchauffée (0,25%) pour couvrir la monocouche à température ambiante jusqu’à ce que les cellules soient délogées dans des patchs. Appuyez plusieurs fois sur les côtés de la ou des fiole (s) de culture pour libérer les autres cellules adhérentes.
    Remarque: si nécessaire et pour accélérer le processus de trypsinisation, transférer la (les) fiole (s) dans un incubateur de 37 ° c. Les cellules délogées adopteront rapidement une forme arrondie sous un microscope optique. Cette étape devrait durer environ 5 min.
  4. Ajouter 5 mL de milieu DMEM et dissocier les amas pour préparer une suspension à une seule cellule en pipetant le contenu de chaque flacon de haut en bas.
  5. Transférer la suspension cellulaire à travers un tamis à cellules avec des pores de 70 μm dans un tube.
  6. Faire tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 ° c.
  7. Jetez le surnageant. Resuspendre les cellules granulées dans 10 mL de PBS froid stérile.
  8. Répétez les étapes 1,6 et 1,7 deux fois.
  9. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Préparez une suspension uniforme contenant 4 x 107 cellules/ml de PBS stérile.
  10. Injecter 500 μL de la suspension ci-dessus intrapéritonéale (i.p.) dans chaque adulte (6-12 semaines) mâle ou femelle C57BL/6 souris.

2. schémas thérapeutiques

  1. Schéma thérapeutique pour examiner la contribution des cellules nTreg à l' immunodominance de T
    1. Quatre jours avant l’amorçage in vivo de souris C57BL/6 avec des cellules C57SV (étape 1,10), injecter chaque animal une fois i.p. avec 0,5 mg d’un anticorps monoclonal anti-CD25 (mAb) à faible endotoxine, sans azide (clone PC-61.5.3), qui épuise les cellules nTreg, ou avec un isotype de rat contrôle (par exemple, clone KLH/G1-2-2, clone HRPN, ou clone TNP6A7).
  2. Schéma thérapeutique pour tester l’importance in vivo des interactions de la DP-1-DP-L1 (2) dans la formation de l’immunodominance de T
    NOTE: l’engagement de la DP-1 par la DP-L1 souvent, mais pas toujours, médite la co-inhibition et/ou l’épuisement de T-spécifique de AG. Par conséquent, le traitement par anti-DP-1 peut être effectué en parallèle avec l’administration de mAbs anti-DP-L1 et anti-DP-L2 pour révéler l’interaction intercellulaire exacte impliquée dans un phénomène biologique.

3. préparation des splénocytes cibles

  1. Euthanasier des souris C57BL/6 naïves de sexe (6-12 semaines d’âge) qui serviront de donneurs splénocytes par dislocation cervicale.
  2. Positionnez chaque souris avec son abdomen orienté vers le haut à l’intérieur d’un coffret de sécurité biologique. Vaporisez la peau avec 70% (v/v) EtOH. En utilisant des pinces et des ciseaux stériles, soulevez la peau et faites une petite incision ventrale de la ligne médiane. Ensuite, coupez la peau d’une façon croisée pour exposer le péritoine.
  3. À l’aide de forceps, tirez le péritoine d’une façon tente-like sans arracher les organes internes. Coupez le péritoine ouvert pour exposer la cavité péritonéale et enlevez doucement la rate.
  4. Placer la (les) rate (s) à l’intérieur d’un broyeur à tissu Dounce de 15 mL contenant 5 mL de PBS stérile. Appliquez une pression manuelle à l’aide du piston en verre de la meuleuse jusqu’à ce que le tissu splénique se dissite dans une suspension de cellule rouge homogène.
    NOTE: selon le nombre d’animaux receveurs par groupe expérimental, plusieurs rates de souris donneuses peuvent être nécessaires pour la préparation des cellules cibles. Jusqu’à 3 rates peuvent être homogénéisées ensemble à l’intérieur d’une meuleuse de 15 mL.
  5. Transférer l’homogénéate dans un tube de 15 mL. Faire tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 ° c.
  6. Jetez le surnageant. Resuspendre les cellules granulées dans 4 mL de tampon de lyse de chlorure d’ammonium et de potassium (ACK) pendant 4 min pour éliminer les érythrocytes.
    Remarque: il s’agit d’une étape sensible au temps. Surexposer les splénocytes au tampon de lyse ACK augmentera leur fragilité et les rendra sensibles à la mort cellulaire non spécifique.
  7. Pour chaque tube, ajouter 8 mL de milieu RPMI 1640 contenant 10% de FBS inactivés en chaleur, L-alanyl-L-glutamine, 0,1 mM d’acides aminés non essentiels (MEM), de 1 mM de sodium pyruvate, 10 mM d’HEPES, et 1x pénicilline/streptomycine, qui seront ci-après comme moyen complet de RPMI (table des matières).
  8. Transférer le contenu dans un nouveau tube de 15 mL à travers les pores de 70 μm d’un filtre à cellules.
  9. Faire tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 ° c.
  10. Jetez le surnageant. Resuspendre les cellules granulées dans 12 mL de RPMI complet.
  11. Diviser la suspension splénocyte en 3 portions égales (4 mL chacune) dans 3 tubes distincts.

4. enrobage des splénocytes cibles avec des peptides non pertinents et apparentés

  1. Étiqueter les tubes selon les peptides qui serviront à pulser les splénocytes cibles. Les splénocytes de contrôle seront pulsés avec un peptide non pertinent, et chaque population de splénocytes cibles cognées sera pulsée avec un peptide synthétique correspondant à l’épitope immunodominantes dérivé de T AG (site IV) ou un épitope de T AG sous-dominant (site I ou site II/III) (tableau 1).
    Remarque: le choix des peptides non pertinents dépend de la configuration expérimentale et de la souche de souris utilisée dans chaque investigation. Les auteurs utilisent souvent gB498-505 (un épitope de peptide immunodominantes restreint h-2kbdu virus de l’herpès simplex [HSV]-1) et/ou GP33-41 (un épitope de peptide immunodominantes restreint h-2Dbde lymphocytaire le virus chorioméningite ([lcmv]) chez les souris C57BL/6 (tableau 1). Ces peptides sont des choix optimaux parce que: (i) ils sont dérivés de pathogènes qui n’ont pas été précédemment rencontrés dans le modèle de souris décrit ici; (II) similaires aux peptides dérivés de T AG, les gB498-505 et GP33-41 sont limités par et se lient aux molécules H-2b . Dans les essais de mise à mort in vivo à trois pics, chacun des deux pics qui correspondent à des cellules cibles apparentées peut représenter des splénocytes pulsés avec un peptide immunodominantes ou sous-dominant. Le choix de chaque ensemble de peptides varie en fonction des objectifs de chaque expérience. Voir la figure 1 et la figure 2 comme exemples de cette variation. Pour le reste de ce protocole, les sites I et IV dérivés de T AG représenteront respectivement des peptides sous-dominants et immunodominants.
  2. Pulser le contenu de chaque tube étiqueté avec 1 μM du peptide respectif pendant 1 h à 37 ° c et 5% CO2.
  3. Utilisez un filtre à cellules distinct (avec pores de 70 μm) pour chaque tube pour enlever les touffats et les débris si nécessaire.
  4. Faire tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 ° c. Jetez le surnageant.
  5. Resuspendre les cellules granulées dans 12 mL de PBS froid stérile et répéter l’étape 4,4 une fois de plus.
    Remarque: il est important de supprimer autant de FBS que possible car FBS peut lier CFSE à l’étape suivante.

5. étiquetage des splénocytes cibles avec CFSE

  1. Resuspendre les splénocytes à impulsions peptidiques dans 4 mL de PBS stérile.
  2. Ajouter CFSE à 0,025 μM, 0,25 μM, et 2 μM dans les tubes contenant des splénocytes pulsés de peptide, de site I et de site IV, respectivement.
    Remarque: pour obtenir un étiquetage uniforme de CFSE, tenez chaque tube à un angle de 45 ° avant d’ajouter le CFSE sur le côté légèrement au-dessus de la suspension de la cellule suivie immédiatement par un vortexing doux. Cela garantira l’apparition d’histogrammes lisses à la fin. Les variations par lot et par âge des intensités de CFSE ne sont pas rares. Par conséquent, on peut avoir besoin d’expérimenter avec des doses différentielles de CFSE avant de décider sur les concentrations optimales à utiliser.
    ATTENTION: le CFSE est toxique à des concentrations supérieures à 5 μM.
  3. Placez les tubes à l’intérieur d’un incubateur de 37 ° c pendant 15 min et inversez-les une fois toutes les 5 min.
  4. Ajouter 3 mL de FBS inactivés à la chaleur à chaque tube pour arrêter la réaction du CFSE. En haut du contenu avec PBS stérile.
  5. Faire tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 ° c. Jetez le surnageant.
  6. Resuspendre les cellules granulées dans 12 mL de PBS stérile et répéter l’étape 5,5.

6. examen de l’étiquetage adéquat/égal du CFSE des populations de Splocytes cibles

  1. Resuspendre les cellules granulées dans 3 mL de PBS.
  2. Agiter doucement les tubes. Transférer 10 μL, chacun, des suspensions à cellulesélevées CFSELow, CFSEintermédiaire (int)et CFSE dans un tube de tri de cellules activées par fluorescence de polystyrène (FACS) de 5 ml contenant 200 μl de PBS.
  3. Interrogez les cellules à l’aide d’un cytomètre à flux équipé d’un laser 488 nm. Dessinez une barrière lymphocytaire basée sur les propriétés de dispersion en avant (FSC) et de dispersion latérale (SSC) des cellules avant d’acquérir 5000 événements tombant dans la barrière lymphocytaire du canal FL-1.
  4. Au sein de la population CFSE+ de «parent», dessinez des grilles d’histogramme additionnelles pour identifier les sous-populations de CFSELow, CFSEintet CFSE.
  5. Confirmez les numéros d’événement égaux ou quasi égaux dans les trois portes. Si nécessaire, ajustez les nombres de cellules dans les tubes «source» (étape 6,1) avant de mélanger et d’injecter des splénocytes cibles dans des souris naïves et apprêtés dans la section 7.

7. injection de cellules cibles marquées par le CFSE dans des receveurs naïfs et de T-AG

  1. Agiter doucement les tubes sources. Transférer les trois suspensions de cellules marquées par CFSE dans des proportions égales dans un nouveau tube.
  2. En haut du contenu avec PBS stérile.
  3. Faire tourner le tube à 400 x g pendant 5 min à 4 ° c. Resuspendre les cellules granulées avec du PBS stérile.
  4. Compter les cellules en bleu trypan par un hemocytomètre pour assurer la viabilité cellulaire d’au moins 95%.
  5. Réglez le volume afin d’injecter 1 x 107 cellules cibles mixtes/200 ΜL de PBS par voie intraveineuse (i.v.), par veine de queue, dans chaque souris C57BL/6 du receveur.
    Remarque: stockez les cellules sur la glace entre les injections. Mélanger délicatement les cellules cibles avant chaque injection. Notez l’heure exacte d’injection pour chaque souris, qui déterminera quand l’animal devra être euthanasié. Il est important de maintenir la durée de la cytotoxicité in vivo cohérente entre tous les animaux de la même expérience.

8. acquisition de données

  1. Deux ou quatre heures après l’injection de cellules cibles marquées par le CFSE, l’euthanasie des souris receveurs par la dislocation cervicale.
    NOTE: la durée de la cytotoxicité in vivo peut varier en fonction du système expérimental utilisé, de l’immunogénicité de l’AGS cible, de l’abondance attendue de T e-T dans la rate par l’antigène peptidique spécifique et de la robustesse de leur fonction lytique entre autres facteurs.
  2. Retirer et traiter chaque rate séparément comme dans les étapes 3.2 − 3.9.
  3. Jetez le surnageant et resuspendez les cellules granulées dans 3 mL de PBS.
    Remarque: prenez soin de manipuler le tissu splénique et les préparations cellulaires à 4 ° c ou sur la glace avant les analyses cytofluorimétriques. Il s’agit d’empêcher la cytotoxicité continue ex vivo.
  4. Transférer approximativement 1 x 107 cellules de chaque rate traitée dans un tube FACS propre.
  5. Interrogez immédiatement les cellules à l’aide d’un cytomètre à flux équipé d’un laser 488-nm. Dessinez une barrière lymphocytaire basée sur les propriétés FSC et SSC des cellules.
  6. Identifiez les splénocytes et les cellules cibles transférées du CFSE- receveur. Dessinez des barrières additionnelles qui accueillent des populations de cellules ciblesélevées de CFSELow, CFSEintet CFSE.
  7. Obtenez un total de 2000 événements defaible CFSE dans le canal FL-1.

9. analyse des données

  1. Calculez la lyse spécifique de chaque population de cellules cibles apparentées à l’aide de la formule suivante:
    % Cytotoxicité spécifique =Equation
    x = CFSEint/High numéro d’événement en t AG-souris amorcée, y = CFSELow numéro d’événement en t AG-souris primées, a = CFSEint/High numéro d’événement dans la souris naïve, et b = CFSELow événement nombre dans la souris naïve.
    Note: dans les essais de cytotoxicité à trois pics dans lesquels la lyse spécifique de plus d’une population cible de apparenté est évaluée, il n’est pas approprié d’utiliser les fréquences des cellules cibles. C’est simplement parce que la fréquence d’une population de cellules cibles apparentées est influencée non seulement par le pourcentage des témoins non pertinents, mais aussi par celui des autres splénocytes cibles apparentés. Par conséquent, les numéros d’événement au sein de chaque porte doivent être utilisés dans la formule ci-dessus pour calculer avec précision la lyse de chaque population de cellules cibles apparentées (soit CFSEint , soit CFSEHigh Cells) contre les contrôlesLow de CFSE.

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Representative Results

L’objectif de l’expérience dont les résultats sont décrits dans la figure 1 était de déterminer si la présence et les fonctions des cellules nTreg formaient ou modifiaient la hiérarchie de l’immunodominance de t s t AG spécifique. Des souris C57BL/6 ont été injectées i.p. avec PBS ou avec 0,5 mg d’un mAb anti-CD25 (clone PC-61.5.3 [PC61]) quatre jours avant de recevoir 2 x 107 C57SV cellules tumorales i.p. Dans des expériences distinctes, un contrôle isotype du rat a été utilisé au lieu de PBS. La déplétion de cellules nTreg réussie par PC61 a été confirmée par cytométrie en flux17.

Neuf jours après l’inoculation de cellules de C57SV, un moment où les réponses T- 1 de t Ag spécifiques atteignent leur maximum23, chaque animal a reçu une injection i.v. d’une suspension cellulaire contenant 3 populations distinctes de cellules cibles marquées par le CFSE. Les cellules cibles de contrôle étaient des splénocytes naïfs syngéniques concomitamment pulsés avec deux peptides non pertinents (GP33-41 et GB498-505) et étiquetés avec une faible dose de CFSE (0,02 μM). Pour préparer des cellules cibles apparentées, les splénocytes naïfs syngéniques ont été pulsés avec un peptide du site I dérivé de T AG ou un peptide du site IV (tableau 1), puis étiquetés avec CFSE à 0,2 μm et 2 μm respectivement. Les cellules cibles de contrôle et de apparenté ont été lavées et mélangées en nombre égal (à un ratio de 1:1:1) avant d’être injectées dans des souris C57BL/6 naïves (témoins) et T AG-primées. Deux heures après l’injection de cellules cibles, des souris ont été sacrifiées pour leur rate, dans laquelle la présence/l’absence de cellules cibles marquées par le CFSE a été déterminée par cytométrie en flux. Les cellules cibles ont été distinguées en fonction de leurs intensités différentielles de coloration CFSE.

Comme prévu, les pics quasi égaux correspondant aux cellules cibles de contrôle et de apparenté étaient détectables chez les souris naïves (figure 1, panneau de gauche). En revanche, le site IV affichant des cellules cibles était presque complètement absent chez les souris primées de T AG, quel que soit leur traitement antérieur avec le PC61 ou le PBS (figure 1). Fait intéressant, la déplétion des cellules nTreg par la PC61 augmentée in vivo de la lyse induite par la CTL du site I-cellule cible pulsée17. Ces résultats nous ont poussés à conclure que les cellules nTreg inhibent sélectivement la cytotoxicité spécifique au site I. Par conséquent, les agents appauvrissant ou inactivant les cellules nTreg peuvent améliorer la fonction effecteur cytolytique des CTLs reconnaissant certains épitopes dérivés de tumeurs.

La configuration ci-dessus fournit un exemple de la façon dont les essais de cytotoxicité in vivo peuvent être utilisés pour tester simultanément la fonction lytique des clones ID et SD CTL chez le même animal.

Figure 1
Figure 1: analyse cytofluorimétrique représentative de lacytotoxicité médiée par le t par l’intermédiaire des épitopes dérivés de t AG en présence ou en l’absence de cellules nTreg. Les splénocytes cibles pulsés avec des peptides témoins, le site I ou le site IV, qui ont été marqués de façon différenciée avec CFSE, ont été suivis par cytométrie en flux dans la rate d’une souris naïve (panneau de gauche), une souris à amorçage par injection de PBS (panneau central) et un PC61 (NTI-CD25)- souris à amorçage injecté (nTreg-appauvri) T AG (panneau de droite). Le pourcentage de meurtres spécifiques de cellules cibles a été calculé à l’aide de la formule décrite dans le protocole et des nombres représentatifs sont affichés. Ce chiffre est adopté, avec la permission de Haeryfar et coll.17. Copyright 2005. L’Association américaine des immunologistes, Inc. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Dans une enquête plus récente, nous avons demandé si le blocage de la DP-1 affectait la « largeur» de la réponse du t-i à la t AG16 (figure 2). Il s’agissait d’une question cliniquement pertinente à la lumière des bienfaits thérapeutiques observés des «inhibiteurs de point de contrôle» fondés sur la DP-1 dans plusieurs tumeurs malignes. Bien que de tels inhibiteurs soient pensés pour fonctionner principalement en inversant l’épuisement des lymphocytes T, nous étions curieux de savoir si interférer avec les interactions de la DP-1-DP-L1 peut en outre élargir (ou rétrécir) les réponses anticancéreuses de t. Dans notre modèle de reconnaissance de la T AG, les expériences de coloration intracellulaire des cytokines (ICS) ont révélé que le traitement avec l’anti-DP-1 ou l’anti-DP-L-1 élargit sélectivement les sites I et II/III16de la production d’IFN-γ. Nous avons ensuite élargi notre étude pour examiner la fonction d’effecteur cytolytique in vivo de ces CTLs SD. C57BL/6 souris ont été injectées i.p. avec 100 μg d’un mAb anti-DP-1 (clone RMP1-14) ou un rat IgG2a isotype contrôle (clone 2A3) deux heures avant l’inoculation de la cellule C57SV. Les souris ont reçu deux doses additionnelles d’anti-DP-1 ou d’isotype trois et six jours après l’injection de cellules tumorales. Au jour 9, après l’amorçage, des cohortes de souris naïves et primées ont été données, par des veines de queue latérales, un mélange de cellules contenant des nombres égaux defaible CFSE (dose d’étiquetage cfse: 0,025 μM), de CFSEint (dose d’étiquetage CFSE: 0,25 ΜM) et de CFSEHi (CFSE dose d’étiquetage: 2 μM) les splénocytes naïfs syngéniques pulsés avec gB498-505, site II/III et site I, respectivement. Quatre heures plus tard, les animaux ont été euthanasiés et les cellules cibles étiquetées par le CFSE ont été suivies cytofluorimequement dans leur rate. Les parcelles représentatives du FACS (figure 2a) et les données de 3 animaux par cohorte (figure 2b) sont illustrées. Bien que le blocus de la DP-1 n’ait pas affecté la réponse de l’ID T sur le site IV16, les réponses SD spécifiques aux sites I et II/III ont été revigorées. Nous avons donc conclu que l’interférence avec les interactions de la DP-1-DP-L1 peut induire une «étalement de l’épitope» dans les réponses anticancéreux du T.

La configuration ci-dessus représente des essais de mise à mort in vivo qui permettent de quantifier la cytotoxicité provoquée par deux clones de SD CTL chez le même animal.

Figure 2
Figure 2: cytotoxicité in vivo d’un T-T- t spécifique de t AG dans des souris traitées à l’anti-DP-1. (A) les diagrammes d’histogramme représentatifs démontrent les pics de CFSE correspondant aux splénocytes cibles pulsés avec un peptide non pertinent (CFSELow), le site II/III (CFSEint) et le site I (CFSEHigh) chez les souris primées de T AG qui a reçu un isotype (panneau de gauche) ou un mAb de blocage de la DP-1 (panneau de droite). (B) le pourcentage de meurtres spécifiques de chaque population de cellules cibles apparentées a été calculé à l’aide des numéros d’événement CFSE+ chez les souris primées de T AG (n = 3 par groupe) et les receveurs naïfs (non représentés) et la formule décrite dans le protocole. Les barres d’erreur représentent des erreurs standard de la moyenne (SEM), et * * indique une différence statistique avec p < 0,01 par les tests tdes étudiants non appariés. Ce chiffre est adopté, avec la permission, de Memarnejadian et coll.16. Copyright 2017. L’Association américaine des immunologistes, Inc. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Source d’antigène protéique Épitope peptidique désignation ordre Restriction de la MHC I
SV401 grand T AG2 T AG206-215 Site I Le Saint-Laurent H-2Db
SV40 grand T AG T AG223-231 Site II/III La porte H-2Db
SV40 grand T AG T AG404-411 Site IV VVYDFLKC H-2Kb
SV40 grand T AG T AG489-497 Site V Le QGINNLDNL H-2Db
HSV-13 glycoprotéine B gB498-505* gB498-505 Le SSIEFARL H-2Kb
Glycoprotéine LCMV4 GP33-41* GP33-41 Le KAVYNFATC H-2Db
le premier Virus Simian 40
2 les deux Grand antigène tumoral
3 les trois Virus de l’herpès simplex de type 1
le 4 Virus de la Chorioméningitis lymphocytaire
* utilisé comme un peptide non pertinent

Tableau 1. Les peptides introduits dans ce protocole

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Discussion

Les dosages de cytotoxicité in vivo basés sur le CFSE offrent plusieurs avantages par rapport aux essais de mise à mort traditionnels, tels que le chrome radioactif (51CR) et les essais de libération de la lactate déshydrogénase (LDH) colorimétrique. Premièrement, ils permettent le contrôle de la fonction CTL au sein d’un organe lymphoïde secondaire intact sur le plan architectural.

Deuxièmement, la mise à mort spécifique des cellules cibles dans les essais de cytotoxicité in vivo reflète le nombre absolu det e. e., qui est généralement, mais pas toujours, une fonction des fréquences de t-b présentes dans la rate. Ceci est en contraste avec 51essais de libération de CR/LDH dans lesquels un nombre constant de cellules sont employées comme source d’effecteurT. Par conséquent, les essais de libération de CR/LDH 51ne parviennent pas à estimer de façon fiable le nombre total de T e-i spécifiques à l’AG qui peuvent être disponibles pour l’hôte afin d’éliminer les cellules tumorales ou de combattre les infections. Ceci est important puisque dans beaucoup de cas et de conditions, la taille et la cellularité des organes/tissus lymphoïdes secondaires qui s’adaptent au T-T-T de AG spécifique sont altérées. Par exemple, un scénario hypothétique peut être envisagé dans lequel une infection virale élève le nombre total de T. spécifique pour le peptide X, tout en développant plusieurs autres clones de t. Par conséquent, la fréquence du T-i-T -T-t spécifique au X dans la splénique totale ne peut pas augmenter, auquel cas un essai de libération de Cr/LDH 51ne sera pas utile. À titre d’exemple, nous avons récemment démontré que certains superantigènes bactériens élargissent la mémoire T pour le NP147-155, un épitope peptidique immunodominantes des virus grippaux A chez les souris BALB/c, qui a bien corrélé avec l’augmentation Lyse in vivo des cellules cibles de NP147-155-pulsées31. Étant donné que l’exposition aux superantigènes provoque la prolifération des lymphocytes T non spécifiquement, il aurait été très peu probable qu’elle démontre une importante cytotoxicité spécifique au NP147-155à l’aide de 51essais de libération de CR/LDH.

Troisièmement, les cellules cibles pulsées avec des peptides qui se lient à la même molécule de classe I de MHC peuvent être étiquetées avec différentes doses de CFSE, mélangées et utilisées dans des essais de cytotoxicité in vivo. L’analyse concomitante des fonctions CTL vers de tels peptides n’est pas une option dans 51essais de libération de CR/LDH.

Quatrièmement, les essais de cytotoxicité in vivo permettent des études mécanistiques pendant les phases d’amorçage, d’effecteur et de rappel des réponses CTL. Par exemple, l’inoculation de cellules tumorales ou la vaccination antitumorale peut être menée chez des souris génétiquement modifiées pour l’évaluation de l’induction de la CTL. En outre, les splénocytes des souris knock-in et knock-out génétiques peuvent être utilisés comme cellules cibles pendant la phase effecteur. Enfin, divers agents (p. ex., inhibiteurs pharmacologiques et candidats aux médicaments) peuvent être administrés avant l’amorçage, pendant la phase effecteur, ou les deux. Par conséquent, les essais de cytotoxicité in vivo fournissent une plate-forme puissante pour les tests d’efficacité des médicaments/vaccins dans un environnement véritablement in vivo. Dans ce corpus de travail, nous avons fourni des exemples d’interventions immunologiques qui stimulent les réponses de la CTL in vivo (figure 1 et figure 2).

Comme d’autres essais de mise à mort couramment utilisés, les essais de cytotoxicité in vivo ne fournissent aucune information directe sur la capacité des CTL à recycler d’une cible à une autre avant qu’ils ne deviennent épuisés. En outre, nous avons testé plusieurs types de cellules tumorales comme cibles potentielles dans les essais de cytotoxicité in vivo, mais en vain jusqu’à présent. C’est tout simplement parce que les cellules tumorales n’atteignent pas la rate au moins dans les nombres détectables après qu’ils sont injectés i.v. Par conséquent, compter sur les splénocytes de souris comme cellules cibles peut être considéré comme une limitation inhérente des essais de cytotoxicité in vivo. Il est à noter, cependant, que les splénocytes cibles transférés adoptivement peuvent être facilement trouvés dans plusieurs autres organes (en plus de la rate), par exemple dans le foie. Par conséquent, la fonction CTL spécifique à AG peut être évaluée dans plusieurs organes ou tissus.

Nous avons optimisé les dosages de cytotoxicité in vivo pour l’examen de l’immunodominance dans les réponses t-1 spécifiques à t AG16,17. De nombreux outils et réactifs sont disponibles pour étudier ces réponses dans les contextes d’immunité antitumorale et de thérapie. La lignée cellulaire du Fibrosarcome utilisée dans le protocole décrit ici (c.-à-d. les cellules C57SV) ne donne pas lieu à des tumeurs chez les souris immunocompétentes. Par conséquent, il est un outil utile pour enquêter sur la vaccination antitumorale. La transformation néoplasique pilotée par T AG dans certains tissus a généré plusieurs modèles de cancer autochtone de valeur. Par exemple, les souris SV11 qui développent des papillomes du plexus choroïde à l’intérieur de leurs ventricules cérébraux35 ne hébergent pas de t de t-t spécifique endogène t AG parce que ces cellules sont choisies et supprimées dans le thymus. Cependant, le transfert de C57BL/6 splénocytes dans des souris SV11 porteuses de tumeurs sous-léthargies conduit à un contrôle prolongé des tumeurs, ce qui serait associé à l’amorçage in vivo du site IVspécifique T36,37 . Dans l’adénocarcinome transgénique du modèle38de la prostate de souris (Tramp), la réponse spécifique au site IV diminue avec la progression de la malignité. Cependant, les cellules T de l’autre site immunorécessif spécifiques à la V échappent à la sélection négative dans le thymus et évitent également les mécanismes de tolérance périphérique21. Cela offre de nombreuses possibilités d’interventions thérapeutiques expérimentales tournant autour des fonctions T. V spécifiques au site. Les essais de cytotoxicité in vivo devraient s’avérer instructifs dans l’étude et potentiellement inverser la tolérance immunologique dans divers systèmes modèles, y compris dans le modèle de reconnaissance de T AG.

L’immunodominance est une caractéristique cohérente des réponses de T. n. a générées non seulement contre la tumeur AGS mais aussi vers des épitopes dérivés de pathogènes. En fait, nous avons déjà utilisé des tests de cytotoxicité in vivo pour étudier l’immunodominance dans les réponses anti-grippales du T-112. Par conséquent, le dosage optimisé décrit dans ce protocole peut être modifié et utilisé dans un large éventail d’applications immunologiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par les subventions MOP-130465 et PJT-156295 de la SMMH par les instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). JC est partiellement appuyé par une bourse d’études supérieures de la Reine Elizabeth II en sciences et technologie du ministère de la formation, des collèges et des universités de l’Ontario. CEM a été récipiendaire d’une bourse d’études supérieures Alexander Graham Bell Canada (doctorat) du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration

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