Maatwerk in vivo chemo tests om Immunodominance in tumor-specifieke CD8+ T Cell responsen te bestuderen

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

We beschrijven hier een flow Cytometry-based in vivo doden assay die het mogelijk maakt onderzoek van immunodominance in chemo T lymfocyten (CTL) Reacties op een model tumor antigeen. Wij bieden voorbeelden van hoe deze elegante assay kan worden gebruikt voor mechanistische studies en voor de effectiviteit van geneesmiddelen testen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Choi, J., Meilleur, C. E., Haeryfar, S. M. M. Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses. J. Vis. Exp. (147), e59531, doi:10.3791/59531 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE)-gebaseerde in vivo chemo tests kunnen gevoelige en nauwkeurige kwantificatie van CD8+ cytolytische T LYMFOCYTEN (CTL) reacties uitgelokt tegen tumor-en pathogeen-afgeleide peptiden. Zij bieden verscheidene voordelen over traditionele het doden analyses aan. Eerst, toestaan zij de controle van CTL-gemedieerde chemo in architecturaal intacte secundaire lymfeorganen, typisch in de milt. Ten tweede, ze zorgen voor mechanistische studies tijdens de priming, de effect-en Recall fasen van CTL Responses. Ten derde, ze bieden nuttige platforms voor vaccin/drug effectiviteit testen in een echt in vivo setting. Hier bieden wij een geoptimaliseerd protocol voor het onderzoek van gelijktijdige CTL reacties tegen meer dan een peptide epitope van een model tumor antigen (AG), namelijk Simian virus 40 (SV40)-gecodeerde grote T AG (T AG). Net als de meeste andere klinisch relevante tumor eiwitten, T AG havens veel potentieel immunogeen peptiden. Echter, slechts vier van deze peptiden induceren detecteerbare CTL reacties in C57BL/6 muizen. Deze antwoorden worden constant gerangschikt in een hiërarchische orde die op hun omvang wordt gebaseerd, die de basis voor TCD8 "immunodominance" in dit krachtige systeem vormt. Dienovereenkomstig, het grootste deel van de T AG-specifieke TCD8 reactie is gericht tegen een enkele immunodominant epitope terwijl de andere drie epitopes worden erkend en gereageerd op slechts zwak. Immunodominance compromissen de breedte van antitumorale TCD8 reacties en is als zodanig, door velen beschouwd als een belemmering voor een succesvolle vaccinatie tegen kanker. Daarom is het belangrijk om te begrijpen van de cellulaire en moleculaire factoren en mechanismen die dicteren of vorm TCD8 immunodominance. Het protocol beschrijven we hier is afgestemd op het onderzoek van dit fenomeen in de T AG immunisatie model, maar kan gemakkelijk worden gewijzigd en uitgebreid tot soortgelijke studies in andere tumor modellen. Wij bieden voorbeelden van hoe de impact van experimentele immunotherapeutische interventies kan worden gemeten met behulp van in vivo chemotherapie analyses.

Introduction

Conventionele CD8+ t-cellen (tCD8) spelen belangrijke onderdelen in antikanker immuun toezicht. Ze werken voornamelijk in de hoedanigheid van cytolytische T lymfocyten (Ctl's) die herkennen tumor-specifieke of-geassocieerde peptide antigenen (AGS) weergegeven binnen de gesloten spleet van de grote Histocompatibility complexe (MHC) klasse I moleculen. Volledig gewapend Ctl's gebruiken hun chemo arsenaal om kwaadaardige cellen te vernietigen. Antikanker TCD8 kan worden gedetecteerd in de circulatie of zelfs binnen primaire en gemetastaseerde massa's van vele kankerpatiënten en tumor-dragende dieren. Echter, ze zijn vaak anergic of uitgeput en niet aan kanker uit te roeien. Daarom zijn veel immunotherapeutische modaliteiten ontworpen om kanker TCD8 frequenties te verhogen en om hun functies te herstellen en te stimuleren.

De proteïnen van de tumor haven vele peptides, wat waarvan kan worden immunogeen en potentieel immunoprotective. Echter, kwantificeerbare TCD8 reacties worden uitgelokt met verschillende magnitudes tegen enkele peptiden alleen. Dit leidt tot een "immunodominance hiërarchie" onder TCD8 klonen1. Dienovereenkomstig, immunodominant (ID) TCD8 bezetten prominente hiërarchische rangen, die algemeen wordt beoordeeld door hun overvloed. In tegenstelling, TCD8 cellen waarvan t-cel receptor (TCR) is specifiek voor subdominante (SD) epitopes optreden in lagere frequenties. Wij en anderen hebben een aantal van de factoren die dicteren of vorm immunodominance in TCD8 reacties. Deze omvatten, onder andere, de wijze van AG presentatie aan naïef TCD8 (d.w.z., directe presentatie, dwars-presentatie, cross-dressing)2,3,4, het type van AG-presenterende cellen (APCs) deelnemen aanT CD8 activering5, de overvloed en stabiliteit van eiwittenAGS 6,7 en de efficiëntie en kinetiek van hun afbraak door proteasomes7,8, de relatieve selectiviteit van de vervoerder geassocieerd met AG verwerking (TAP) voor peptiden9, de affiniteit van de bevrijde peptiden voor mhc I moleculen9,10, de aanwezigheid, voorloper frequenties en TCR diversiteit van cognate tCD8 in t Cell zwembaden11,12,13, cross-concurrentie onder t-cellen voor de toegang tot APCs14,15, en de broeder capaciteit van tCD8 klonen16. Bovendien, TCD8 immunodominance is onderworpen aan immunoregulerende mechanismen bemiddeld door verschillende suppressor cel typen, zoals natuurlijk voorkomende regelgevende T (nTreg) cellen17, de cel oppervlakte co-remmende molecuul geprogrammeerd Death-1 (PD-1)16, en bepaalde intracellulaire enzymen zoals Indoleamine 2, 3-DIOXYGENASE (Ido)18 en de zoogdier doelstelling van rapamycine (mTOR)19. Het is belangrijk op te merken, echter, dat de bovenstaande factoren niet altijd volledig rekening houden met immunodominance.

Behalve de basis biologie van TCD8 immunodominance, heeft het onderzoek van dit intrigerende fenomeen belangrijke implicaties in kanker immunologie en immunotherapie. Ten eerste, een ID-status niet noodzakelijkerwijs verleent aan een bepaalde TCD8 kloon de mogelijkheid om tumor initiatie of progressie te voorkomen20. Of en hoe ID en SD TCD8 bijdragen aan antitumorale immuniteit kan afhankelijk zijn van het type en de omvang van de kwaadaardigheid en het experimentele systeem tewerkgesteld. Ten tweede wordt gedacht dat ID TCD8 klonen kan worden ' te zichtbaar ' om het immuunsysteem en dus meer vatbaar voor centrale en/of perifere tolerantiemechanismen16,21. Ten derde, heterogene tumoren kunnen bevatten neoplastische cellen die detectie te voorkomen door vele, zo niet de meeste, Ctl's door het weergeven van slechts een smal spectrum van peptide: MHC-complexen. Onder deze omstandigheden, TCD8 reacties van onvoldoende breedte zijn waarschijnlijk een dergelijke tumorcellen veroorloven een overlevingsvoordeel, dus versterkende hun uitgroei22. Het is om de bovengenoemde redenen dat vele mening immunodominance als hindernis aan succesvolle TCD8-based inenting en therapie tegen kanker.

Inenting van C57BL/6 muizen met Simian virus 40 (SV40)-omgezette cellen die uitdrukken grote tumor AG (T AG) verstrekt een krachtig preklinisch systeem om TCD8 immunodominance te bestuderen. Dit model biedt verschillende voordelen. Eerst, is peptide epitopes van dit klinisch relevante oncoprotein goed-gekenmerkt in deze muis spanning23 (lijst 1). Ten tweede, T AG epitopes, die worden genoemd sites I, II/III, IV en V, trigger TCD8 reacties die consequent zijn gerangschikt in de volgende hiërarchische volgorde: site iv > > site I ≥ site II/III > ≫ site V. dienovereenkomstig, site IV-specifieke TCD8 Monteer de meest robuuste reactie op T AG. In tegenstelling, sites I en II/III zijn subdominante, en site V-specifieke TCD8 zijn minst overvloedig en meestal alleen detecteerbaar in het ontbreken van responsiviteit naar andere epitopes23,24. Ten derde, de T AG+ tumor Cell line gebruikt in het Protocol hierin beschreven, namelijk C57SV fibrosarcoom cellen, en die worden gebruikt in onze eerdere onderzoeken16,17,18,19 ,25,26, worden getransformeerd met subgenomische SV40 fragmenten25. Daarom zijn ze niet in staat te assembleren en release SV40 virionen die mogelijk kunnen infecteren host APCs. Bovendien zijn de C57SV cellen verstoken van klassieke costimulatoire moleculen zoals CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), en CD137 ligand (4-1BBL)16. De bovenstaande attributen maken deze lijnen ideaal voor onderzoek van in vivo TCD8 activering via cross-priming. Cross-priming is een belangrijke weg in het induceren van TCD8 reacties, vooral die gelanceerd tegen tumorcellen van niet-hematopoietische oorsprong die niet direct Prime naïeve T-cellen25.

Antitumorale TCD8 frequenties en/of functies kunnen worden gecontroleerd door MHC I Tetramer kleuring, intracellulaire kleuring voor de werking cytokines (bijv. interferon [IFN]-γ) of lytische moleculen (bijv. perforin), enzym-gebonden Immunospot (ELISPOT) assays en ex vivo chemo tests. Sinds hun oprichting in de jaren 199027,28, carboxyfluorescein succinimidyl Ester (CFSE)-gebaseerd in vivo doden tests hebben ingeschakeld evaluatie van chemo reacties bemiddeld door antivirale ctl's29,30 , 31, antitumorale ctl's16,32, Natural Killer (NK) cellen33, glycolipide-reactieve invariante Natural killer T (iNKT) cellen34, en reeds bestaande en de Novo donor-specifieke alloantibodies26. Daarom kunnen hun toepassingen van belang zijn voor een breed lezerspubliek, met inbegrip van maar niet beperkt tot onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van tumor immunologie en immunotherapie, anti-pathogeen immuniteit, en preventieve en therapeutische vaccin ontwerp.

Om de cel-gemedieerde chemo behandeling in typische scenario's te beoordelen, twee populaties van naïeve splenocyten die ofwel een irrelevante AG of een cognate AG (s) worden aangeduid met twee verschillende doses van CFSE, gemengd in gelijke aantallen en geïnjecteerd in naïeve (controle) of moordenaar Cell-harboring muizen. De aanwezigheid/afwezigheid van elke doelpopulatie wordt vervolgens onderzocht door stromings Cytometry.

We hebben geoptimaliseerd en werkzaam in vivo doden assays in onze studies over immunodominance in zowel antivirale en antitumorale TCD8 reacties12,16,17. Hier bieden wij een gedetailleerd protocol voor de gelijktijdige beoordeling van ID en SD TCD8 reacties op t AG epitopes, die gemakkelijk kan worden vastgesteld voor soortgelijke onderzoeken in andere experimentele systemen. We bieden ook representatieve resultaten waaruit blijkt dat nTreg cel uitputting en PD-1 blokkade kan selectief verbeteren ID TCD8-en SD tCD8-geïnduceerde chemo, respectievelijk. Aan het eind zullen we bespreken meerdere voordelen van in vivo doden assays, alsmede enkele van hun inherente beperkingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De hier beschreven experimenten volgen de door institutionele entiteiten goedgekeurde protocollen voor het gebruik van dieren en houden zich aan de vastgestelde nationale richtlijnen.

1. inenting van C57BL/6 muizen met T AG-het uitdrukken van tumor cellen

  1. Kweek de SV40-getransformeerde fibrosarcoom Cell line C57SV (of een soortgelijke T AG+ aanhanger cel lijn) in Dulbecco gemodificeerde Eagle 's medium (DMEM) met 4,5 g/l D-glucose en l-glutamine (1x) en aangevuld met 1 mm natrium pyruvaat en 10% warmte-geïnactiveerd foetale boviene serum (FBS) in weefselkweek-behandelde kolven bij 37 °C in bevochtigde atmosfeer met 10% CO2.
  2. Zodra de cellen worden volledig Confluent of iets overconfluent, voorzichtig verwijderen en gooi het medium en spoel de monolayer met voorverwarmde steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
    Opmerking: maximale T AG expressie wordt bereikt wanneer T AG+ cellen 100% confluentie bereiken.
  3. In een biologisch veiligheidskabinet, voeg voorverwarmde trypsine-EDTA (0,25%) ter dekking van de monolayer bij kamertemperatuur tot de cellen worden verdreven in patches. Tik meerdere malen op de zijkanten van de kweek kolf (en) om de resterende aanhangende cellen vrij te geven.
    Opmerking: indien nodig en om het trypsinization proces te versnellen, breng de kolf (s) over in een incubator van 37 °C. De verdreven cellen zullen snel een rond gemaakte vorm onder een lichte Microscoop goedkeuren. Deze stap moet ongeveer 5 minuten duren.
  4. Voeg 5 mL DMEM medium toe en scheid klonten om een enkelvoudige schorsing voor te bereiden door de inhoud van elke kolf op en neer te pipetteren.
  5. Breng de cel schorsing door een cel zeef met 70-µm poriën in een buis.
  6. Draai onderaan de buis bij 400 x g voor 5 min bij 4 °c.
  7. Verwijder de bovendrijvende. Hersuspendeer gekorrelde cellen in 10 mL steriel koud PBS.
  8. Herhaal de stappen 1,6 en 1,7 tweemaal.
  9. Cellen tellen met een hemocytometer. Maak een uniforme vering met 4 x 107 cellen/ml steriele PBS.
  10. Injecteren 500 µ L van de bovenstaande schorsing ze intraperitoneaal (i.p.) in elke volwassene (6-12-week-oud) mannelijke of vrouwelijke C57BL/6 muis.

2. behandelschema's

  1. Behandeling regime om de bijdrage van nTreg cellen te onderzoeken naar TCD8 Immunodominance
    1. Vier dagen voor in vivo priming van C57BL/6 muizen met C57SV cellen (stap 1,10), Injecteer elk dier eens i.p. met 0,5 mg van een low-endotoxine, azide anti-CD25 monoclonal antilichaam (mAb) (kloon PC-61.5.3), die nTreg cellen afbreken, of met een rat IgG1 Isotype controle (bijv. kloon KLH/G1-2-2, Clone HRPN, of clone TNP6A7).
  2. Behandelschema voor het testen van de in vivo betekenis van PD-1-PD-L1 (2) interacties in het vormgeven van TCD8 Immunodominance
    Opmerking: de overeenkomst van PD-1 door PD-L1 vaak, maar niet altijd, bemiddelt de co-remming en/of uitputting van AG-specifieke TCD8. Daarom kan de behandeling met anti-PD-1 parallel worden uitgevoerd met toediening van anti-PD-L1 en anti-PD-L2-Meerhout om de exacte intercellulaire interactie te onthullen die betrokken is bij een biologisch fenomeen.

3. voorbereiding van target Splenocyten

  1. Euthanaseren Sex-matched naïeve C57BL/6 muizen (6-12 weken oud) die zal dienen als splenocyte donoren door cervicale dislocatie.
  2. Plaats elke muis met de buik naar boven in een biologisch veiligheidskabinet. Spray de huid met 70% (v/v) EtOH. Met behulp van steriele Tang en schaar, til de huid en maak een kleine buik middellijn incisie. Dan, snijd de huid in een cross-achtige manier om het buikvlies bloot.
  3. Met behulp van een tang, trek het buikvlies in een tent-achtige mode zonder snatching een van de interne organen. Snijd het buikvlies open om de buikholte bloot te leggen en voorzichtig verwijderen van de milt.
  4. Plaats de milt (en) in een 15 mL Dounce weefsel slijper met 5 mL steriel PBS. Breng handmatige druk met behulp van de Grinder glas zuiger totdat de milt weefsel verdwijnt in een rode homogene cel schorsing.
    Nota: afhankelijk van het aantal ontvangende dieren per experimentele groep, kunnen verscheidene milten van de donor muis voor de voorbereiding van de doel cel nodig zijn. Tot 3 milt kan worden gehomogeniseerd samen in een 15 mL Grinder.
  5. Breng de homogenaat over in een buis van 15 mL. Draai onderaan de buis bij 400 x g voor 5 min bij 4 °c.
  6. Verwijder de bovendrijvende. Hersuspendeer gekorrelde cellen in 4 mL ammonium-chloride-kalium (ACK) Lysing buffer voor 4 min om de bezinking te elimineren.
    Opmerking: dit is een tijdgevoelige stap. Overbelichten splenocyten naar ACK Lysing buffer zal hun kwetsbaarheid te verhogen en maken ze vatbaar voor niet-specifieke celdood.
  7. Aan elke buis, voeg 8 mL RPMI 1640 medium met 10% warmte-geïnactiveerd FBS, L-alanyl-L-glutamine, 0,1 mM minimale essentiële media (MEM) niet-essentiële aminozuren, 1 mM natrium pyruvaat, 10 mM HEPES, en 1x penicilline/streptomycine, die hierna zal worden bedoeld als volledig RPMI middel (lijst van materialen).
  8. Breng de inhoud door 70 µm poriën van een cel zeef in een nieuwe 15 mL buis.
  9. Draai onderaan de buis bij 400 x g voor 5 min bij 4 °c.
  10. Verwijder de bovendrijvende. Opnieuw op te schorten pellets cellen in 12 mL van de volledige RPMI.
  11. Splits de splenocyte suspensie in 3 gelijke gedeelten (4 mL elk) in 3 aparte buizen.

4. coating doel Splenocyten met irrelevante en cognate peptiden

  1. Label de buizen volgens de peptiden die zullen worden gebruikt om Pulse target splenocyten. Controle splenocyten zal worden gepulseerd met een irrelevante peptide, en elke populatie van cognate target splenocyten zal worden gepulseerd met een synthetische peptide overeenkomt met de T AG-afgeleide immunodominant epitope (site IV) of een sub-dominante T AG epitope (site I of site II/III) (tabel 1).
    Nota: de keus van onbelangrijke peptides hangt van de experimentele opstelling en de muis spanning af die in elk onderzoek wordt gebruikt. De auteurs gebruiken vaak gB498-505 (een h-2kb-beperkte immunodominant peptide epitope van het virus van de herpes simplex [HSV]-1) en/of GP33-41 (een h-2Db-beperkte immunodominant peptide epitope van lymfatische choriomeningitis virus ([LCMV]) in C57BL/6 muizen (tabel 1). Deze peptiden zijn optimale keuzes, omdat: (i) ze zijn afgeleid van pathogenen niet eerder aangetroffen in de muismodel hier beschreven; (II) vergelijkbaar met T AG-afgeleide peptiden, gB498-505 en GP33-41 zijn beperkt door en bindt aan H-2b moleculen. In ' Three-Peak ' in vivo Killing assays, elk van de twee pieken die overeenkomen met cognate doelcellen kunnen vertegenwoordigen splenocyten gepulseerd met een immunodominant of subdominant peptide. De keuze van elke peptide set varieert naar gelang van de doelstellingen van elk experiment. Zie figuur 1 en figuur 2 als voorbeelden van dergelijke variatie. Voor de rest van dit protocol, zullen T AG-afgeleide plaatsen I en IV respectievelijk subdominante en immunodominant peptiden vertegenwoordigen.
  2. Pulse de inhoud van elke gelabelde buis met 1 µ M van de respectieve peptide voor 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Gebruik een aparte cel zeef (met 70-μm poriën) voor elke buis om klontjes en puin te verwijderen indien nodig.
  4. Draai onderaan de buis bij 400 x g voor 5 min bij 4 °c. Verwijder de bovendrijvende.
  5. Hersuspendeer gekorrelde cellen in 12 mL steriel koud PBS en herhaal stap 4,4 eens te meer.
    Nota: het is belangrijk om zo veel FBS mogelijk te verwijderen omdat FBS CFSE in de volgende stap kan binden.

5. labeling doel splenocyten met CFSE

  1. Hersuspendeer peptide-gepulseerde splenocyten in 4 mL steriel PBS.
  2. Voeg CFSE bij 0,025 μM, 0,25 μM, en 2 μM in de buizen toe die onbelangrijke peptide-, plaats I-, en plaats IV-gepulseerde splenocyten, respectievelijk bevatten.
    Nota: om eenvormige CFSE etikettering te bereiken, Houd elke buis bij een hoek van 45 ° alvorens CFSE aan de kant lichtjes boven de cel opschorting te voegen die onmiddellijk door zachte vortexing wordt gevolgd. Dit zal zorgen voor de verschijning van gladde histogrammen aan het eind. Batch-to-charge en leeftijdsafhankelijke variaties in CFSE intensiteiten zijn niet ongewoon. Daarom kan men nodig hebben om te experimenteren met differentiële CFSE doses alvorens te beslissen over de optimale concentraties worden gebruikt.
    Let op: CFSE is giftig bij concentraties die hoger zijn dan 5 μM.
  3. Plaats de buizen in een incubator van 37 °C voor 15 min en keer ze om de 5 minuten omkeren.
  4. Voeg 3 mL warmte-geïnactiveerde FBS toe aan elke buis om de CFSE reactie te stoppen. Top up van de inhoud met steriele PBS.
  5. Draai onderaan de buis bij 400 x g voor 5 min bij 4 °c. Verwijder de bovendrijvende.
  6. Hersuspendeer gekorrelde cellen in 12 mL steriele PBS en herhaal stap 5,5.

6. onderzoek van adequate/gelijke CFSE etikettering van target Splenocyte populaties

  1. Hersuspendeer gekorrelde cellen in 3 mL PBS.
  2. Draai de tubes zachtjes. Breng 10 l, elk, van CFSElaag, CFSEIntermediate (int), en CFSEHigh -cel suspensies in een 5 ml ronde-bodem polystyreen fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS) buis met 200 l van PBS.
  3. Verhoor cellen met behulp van een flow cytometer uitgerust met een 488 nm laser. Teken een lymfocyten poort gebaseerd op voorwaartse spreiding (FSC) en kant Scatter (SSC) eigenschappen van de cellen voor het verwerven van 5000 evenementen die binnen de lymfocyten poort in de FL-1 kanaal.
  4. Binnen de ' ouder ' CFSE+ populatie, trekken extra histogram poorten te identificeren CFSElage, CFSEint, en CFSEhoge sub-populaties.
  5. Bevestig gelijke of dichtbijgelegen-gelijke gebeurtenis aantallen binnen de drie poorten. Stel indien nodig de cel nummers in de ' Bron ' tubes (stap 6,1) in voordat u de doel splenocyten mengt en inspuit in naïeve en geprimede muizen in sectie 7.

7. injectie van CFSE-gelabelde doelcellen in naïeve en T-AG-primed ontvangers

  1. Draai de bron buizen zachtjes. Breng de drie CFSE-gelabelde cel schorsingen in gelijke ratio's in een nieuwe buis.
  2. Top up van de inhoud met steriele PBS.
  3. Draai onderaan de buis bij 400 x g voor 5 min bij 4 °c. Opnieuw op te schorten pellets cellen met steriele PBS.
  4. De cellen van de telling in trypaanblauw blauw door een hemocytometer om cellulaire levensvatbaarheid van minstens 95% te verzekeren.
  5. Pas het volume aan om 1 x 107 gemengde doelcellen/200 l PBS intraveneus (i.v.), via staart ader, in elke ontvanger C57BL/6 muis te injecteren.
    Opmerking: Bewaar de cellen op het ijs tussen de injecties. Meng doelcellen voorzichtig vóór elke injectie. Registreer de exacte tijd van de injectie voor elke muis, die zal bepalen wanneer het dier zal moeten worden euthanized. Het is belangrijk om de duur van de in vivo chemo zorg consistent te houden tussen alle dieren in hetzelfde experiment.

8. data acquisitie

  1. Twee of vier uur na de injectie van CFSE-gelabelde doelcellen, euthanaseren de ontvangende muizen door cervicale dislocatie.
    Opmerking: de duur van de in vivo chemo kan variëren afhankelijk van het experimentele systeem in dienst, de immunogeniciteit van target AGS, de verwachte overvloed van peptide antigeen-specifieke TCD8 in de milt, en de robuustheid van hun lytische functie onder andere factoren.
  2. Verwijder en proces elke milt afzonderlijk zoals in stappen 3.2 − 3.9.
  3. Verwijder de bovendrijvende en hersuspendeer de gekorrelde cellen in 3 mL PBS.
    Let op: Neem extra zorg om de milt weefsels en cellen preparaten op 4 °C of op ijs te behandelen voor cytofluorimetric analyses. Dit is om te voorkomen dat voortgezet chemo-ex vivo.
  4. Breng ongeveer 1 x 107 cellen van elke verwerkte milt in een schone FACS buis over.
  5. Verhoor cellen onmiddellijk met behulp van een flow cytometer uitgerust met een 488-nm laser. Teken een lymfocyten poort op basis van FSC en SSC eigenschappen van de cellen.
  6. Identificeer CFSE- ontvanger SPLENOCYTEN en CFSE+ overgedragen doelcellen. Teken extra poorten opvang van verschillende CFSElage, CFSEint, en CFSEhoge doelgroep cel populaties.
  7. Het verwerven van een totaal van 2000 CFSElage gebeurtenissen in de fl-1 kanaal.

9. gegevensanalyse

  1. Bereken de specifieke Lysis van elke cognate target Cell populatie met behulp van de volgende formule:
    % Specifieke chemo-Equation
    waarbij x = CFSEint/High -gebeurtenis nummer in t AG-primed muis, y =CFSE laag gebeurtenis nummer in t AG-primed muis, a = CFSEint/hoog -gebeurtenis nummer in naïeve muis, en b = CFSElaag evenement aantal in naïeve muis.
    Opmerking: in ' Three-Peak ' chemo onderzoeken waarbij de specifieke Lysis van meer dan één doelpopulatie van cognate wordt geëvalueerd, is het niet geschikt om frequenties van doelcellen te gebruiken. Dit is gewoon omdat de frequentie van een cognate doelgroep cel wordt beïnvloed, niet alleen door het percentage van de irrelevante controles, maar ook door die van de andere cognate target splenocyten. Daarom, gebeurtenis nummers binnen elke Gate moet worden gebruikt in de bovenstaande formule om nauwkeurig te berekenen van de lysis van elke cognate doelgroep cel populatie (ofwel CFSEint of CFSEhoge cellen) tegen CFSElage controles.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel van het experiment waarvan de resultaten zijn afgebeeld in Figuur 1 was om te bepalen of de aanwezigheid en functies van nTreg cellen vorm of wijzigen van de immunodominance hiërarchie van t AG-specifieke tCD8. C57BL/6 muizen werden geïnjecteerd i.p. met PBS of met 0,5 mg van een anti-CD25 mAb (Clone PC-61.5.3 [PC61]) vier dagen voordat ze ontvangen 2 x 107 C57SV tumorcellen i.p. In afzonderlijke experimenten, werd een rat IgG1 Isotype controle gebruikt in plaats van PBS. Succesvolle nTreg cel uitputting door PC61 werd bevestigd door flow Cytometry17.

Negen dagen na C57SV cel inenting, een tijdpunt waarop T AG-specifieke TCD8 antwoorden bereiken hun maximum23, elk dier kreeg een i.v. injectie van een cel schorsing met 3 verschillende populaties van CFSE-label doelcellen. De doelcellen van de controle waren syngeneic naïeve splenocyten gelijktijdig gepulseerd met twee onbelangrijke peptides (GP33-41 en GB498-505) en geëtiketteerde met een lage dosis van CFSE (0,02 μM). Voor te bereiden cognate doelcellen, syngeneic naïeve splenocyten werden gepulseerd met ofwel T AG-afgeleide site I peptide of site IV peptide (tabel 1), en vervolgens GELABELD met CFSE op 0,2 μm en 2 μm, respectievelijk. Controle en cognate doelcellen werden gewassen en gemengd in gelijke aantallen (bij een 1:1:1 ratio) voordat ze werden geïnjecteerd in naïeve (controle) en T AG-primed C57BL/6 muizen. Twee uren na de injectie van de doel cel, werden de muizen geofferd voor hun milt waarin de aanwezigheid/de afwezigheid van CFSE-geëtiketteerde doelcellen doorstroom Cytometry werd bepaald. Target cellen werden onderscheiden op basis van hun differentiële CFSE kleuring intensiteiten.

Zoals verwacht waren bijna-gelijke pieken die overeenkomen met controle en cognate doelcellen detecteerbaar in naïeve muizen (Figuur 1, linkerpaneel). In tegenstelling, site IV-weergeven doelcellen waren bijna volledig afwezig in T AG-primed muizen, ongeacht hun eerdere behandeling met PC61 of PBS (Figuur 1). Interessant, nTreg cel uitputting door PC61 Augmented in vivo CTL-gemedieerde Lysis van de site I-gepulste doelcellen17. Deze resultaten hebben ons ertoe aangezet om te concluderen dat nTreg cellen selectief site I-specifieke chemo-remmers remmen. Daarom, nTreg cel-afbrekende/Inactiveer agenten kunnen verbeteren van de cytolytische effect functie van Ctl's herkennen bepaalde tumor-afgeleide epitopes.

De bovenstaande set-up geeft een voorbeeld van hoe in vivo chemo tests kunnen worden gebruikt om gelijktijdig testen van de lytische functie van ID en SD CTL klonen in hetzelfde dier.

Figure 1
Figuur 1: representatieve cytofluorimetric analyse van TCD8-gemedieerde chemo tegen t AG-afgeleide epitopes in aanwezigheid of afwezigheid van nTreg cellen. Target splenocyten gepulseerd met controle peptiden, site I of site IV, die werden gedifferentieerd gelabeld met CFSE, werden bijgehouden doorstroming Cytometry in de milt van een naïeve muis (linker paneel), een PBS-geïnjecteerde T AG-primed muis (middelste paneel), en een PC61 (NTI-CD25)- geïnjecteerde (nTreg-uitgeput) T AG-primed muis (rechter paneel). Percentage specifieke doden van doelcellen werd berekend met behulp van de formule beschreven in het Protocol, en representatieve nummers worden weergegeven. Dit cijfer wordt goedgekeurd, met toestemming, van Haeryfar et al.17. Copyright 2005. De Amerikaanse vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

In een recenter onderzoek vroegen we of het blokkeren van PD-1 invloed heeft op de ' breedte ' van de TCD8 reactie op t AG16 (Figuur 2). Dit was een klinisch relevante vraag in het licht van de waargenomen therapeutische voordelen van PD-1-based ' Checkpoint-remmers ' in verschillende maligniteiten. Hoewel dergelijke remmers worden gedacht om te werken in de eerste plaats door het omkeren van T-cel uitputting, we waren benieuwd om te weten of bemoeien met PD-1-PD-L1 interacties kan bovendien verbreden (of smalle) antikanker TCD8 reacties. In onze T AG erkenning model, intracellulaire cytokine vlekken (ICS) experimenten bleek dat de behandeling met ofwel anti-PD-1 of anti-PD-L-1 selectief breidt IFN-γ-producerende TCD8 herkennen van sites I en II/III16. Vervolgens hebben we onze studie uitgebreid naar de in vivo cytolytische effect functie van deze SD Ctl's te onderzoeken. C57BL/6 muizen werden geïnjecteerd i.p. met 100 μg van een anti-PD-1 mAb (kloon RMP1-14) of een rat IgG2a Isotype controle (kloon 2A3) twee uur voor C57SV cel inenting. De muizen ontvingen twee extra dosissen anti-PD-1 of Isotype drie en zes dagen na de injectie van de tumor cel. Op dag 9 post-priming, cohorten van naïeve en geprimed muizen werden gegeven, via laterale staart aderen, een cel mengsel met gelijke aantallen CFSElage (CFSE etikettering dosis: 0,025 μm), CFSEint (CFSE etikettering dosis: 0,25 ΜM), en CFSEHi (CFSE etikettering dosis: 2 μM) syngeneic naïeve splenocyten gepulseerd met gB498-505, site II/III, en site I, respectievelijk. Vier uur later, dieren werden euthanized, en CFSE-label doelcellen werden bijgehouden cytofluorimetrically in hun milt. Representatieve FACS percelen (Figuur 2a) en gegevens van 3 dieren per cohort (Figuur 2b) worden geïllustreerd. Terwijl PD-1 blokkade heeft geen invloed op de ID TCD8 reactie tegen site IV16, sites I-en II/III-specifieke SD-reacties werden versterkt. We hebben dus geconcludeerd dat interfereren met PD-1-PD-L1 interacties kan induceren ' epitope verspreiden ' in antikanker TCD8 reacties.

De bovenstaande set-up vertegenwoordigt in vivo doden assays die het mogelijk maken kwantificatie van chemo, opgewekt door twee SD-CTL klonen in hetzelfde dier.

Figure 2
Figuur 2: in vivo chemo van T AG-specifieke TCD8 in anti-PD-1-behandelde muizen. (A) representatieve HISTOGRAM percelen tonen CFSE pieken die overeenkomen met target splenocyten gepulseerd met een irrelevante peptide (CFSElaag), site II/III (CFSEint), en site I (CFSEhoog) in T AG-primed muizen die een Isotype (linkerdeelvenster) of een PD-1-blocking mAb (rechter paneel) ontvangen. (B) het percenten specifieke doden van elke de bevolking van de doel cel van cognate werd berekend gebruikend CFSE+ gebeurtenis aantallen in T AG-geprimed muizen (n = 3 per groep) en naïeve ontvangers (niet getoond) en de formule die in het protocol wordt beschreven. Foutbalken vertegenwoordigen standaardfouten van de gemiddelde (SEM), en * * duidt op een statistisch verschil met p < 0,01 door niet-gepaarde student t-tests. Dit cijfer wordt goedgekeurd, met toestemming, van Memarnejadian et al.16. Copyright 2017. De Amerikaanse vereniging van immunologen, Inc. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Eiwit antigeen bron Peptide epitope Aanwijzing Volgorde MHC I beperking
SV401 grote T AG2 T AG206-215 Site die ik SAINNYAQKL H-2Db
SV40 grote T AG T AG223-231 Site II/III CKGVNKEYL H-2Db
SV40 grote T AG T AG404-411 Site IV VVYDFLKC H-2Kb
SV40 grote T AG T AG489-497 Site V QGINNLDNL H-2Db
HSV-13 glycoproteïne B gB498-505* gB498-505 SSIEFARL H-2Kb
LCMV4 glycoproteïne GP33-41* GP33-41 KAVYNFATC H-2Db
1 Simian virus 40
2 Groot tumor antigeen
3 Herpes simplex virus type 1
4 Lymfatische Choriomeningitis virus
* gebruikt als een irrelevante peptide

Tabel 1. Peptiden die in dit protocol worden geïntroduceerd

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CFSE-based in vivo chemo tests bieden verschillende voordelen ten opzichte van traditionele doden assays zoals radioactieve chromium (51CR) release en colorimetrische lactaatdehydrogenase (LDH) release assays. Eerst, laten zij de controle van CTL functie binnen een architecturaal intact secundair lymfe orgaan toe.

Ten tweede, de specifieke doden van doelcellen in in vivo chemo tests weerspiegelt het absolute aantal van AG-specifieke TCD8, die meestal, maar niet altijd, een functie van tCD8 frequenties aanwezig zijn in de milt. Dit is in tegenstelling met 51CR/LDH versie analyses waarin een constant aantal cellen als bron van effect TCD8wordt tewerkgesteld. Bijgevolg, 51CR/LDH release assays niet betrouwbaar schatten het totale aantal van AG-specifieke TCD8 die beschikbaar kunnen zijn voor de gastheer om tumorcellen te elimineren of om infecties te bestrijden. Dit is belangrijk aangezien in veel gevallen en voorwaarden, de grootte en de cellulairheid van secundaire lymfeorganen/weefsels die AG-specifieke TCD8 aanpassen worden veranderd. Bijvoorbeeld, kan een hypothetisch scenario worden overwogen waarin een virale besmetting het totale aantal TCD8 specifiek voor Peptide X verheft terwijl ook het uitbreiden van veelvoudige andere tCD8 klonen die andere specificiteit harboring. Dientengevolge, kan de frequentie van X-specifieke TCD8 onder totale milt tCD8 niet verhogen, in welk geval een 51CR/LDH versie analyse niet nuttig zal zijn. Zoals een ander voorbeeld, hebben we onlangs aangetoond dat bepaalde bacteriële antigenen geheugen uitbreiden TCD8 specifiek voor NP147-155, een immunodominant peptide epitope van influenza A virussen in Balb/c muizen, die goed gecorreleerd met een verhoogde in vivo Lysis van NP147-155-gepulseerde doelcellen31. Aangezien de blootstelling aan supergenes veroorzaakt T-cel proliferatie niet-specifiek, zou het hoogst onwaarschijnlijk zijn geweest om wezenlijke NP147-155-specifieke chemo straling te demonstreren gebruikend 51CR/LDH versie analyses.

Ten derde, doelcellen gepulseerd met peptiden die binden aan dezelfde MHC klasse I molecuul kan worden geëtiketteerd met verschillende doses van CFSE, gemengd en gebruikt in in vivo chemo tests. De gelijktijdige analyse van CTL functies naar dergelijke peptiden is geen optie in 51CR/LDH versie analyses.

Ten vierde, in vivo chemo tests zorgen voor mechanistische studies tijdens priming, effect en Recall fasen van CTL Responses. Bijvoorbeeld, tumor cel inenting of antitumorale vaccinatie kan worden uitgevoerd in genetisch veranderde muizen voor de beoordeling van CTL inductie. Bovendien kunnen splenocyten van Gene knock-in en knock-out muizen worden gebruikt als doelcellen tijdens de effect fase. Ten slotte kunnen verschillende agentia (bijv. farmacologische remmers en drugs kandidaten) worden toegediend voordat priming, tijdens de effect fase, of beide. Daarom, in vivo chemo tests bieden een krachtig platform voor de effectiviteit van drugs/vaccin testen in een echt in vivo setting. In dit werk, hebben we voorbeelden van immunologische interventies die boost in vivo CTL Reacties (Figuur 1 en Figuur 2).

Net als andere routinematig gebruikte doden assays, in vivo chemo tests bieden geen directe informatie over het vermogen van Ctl's te recyclen van het ene doel naar het andere voordat ze uitgeput raken. Daarnaast hebben we getest verschillende soorten tumorcellen als potentiële doelcellen in in vivo chemo tests, zij het tevergeefs tot nu toe. Dit is gewoon omdat tumorcellen niet de milt te bereiken op zijn minst in detecteerbare nummers nadat ze zijn geïnjecteerd i.v. Daarom kan een beroep op de muis splenocyten als doelcellen worden beschouwd als een inherente beperking van in vivo chemo tests. Het is opmerkelijk, echter, dat adoptively overgedragen target splenocyten kan gemakkelijk worden gevonden in verschillende andere organen (in aanvulling op de milt), bijvoorbeeld in de lever. Daarom kan AG-specifieke CTL functie worden beoordeeld in meerdere organen of weefsels.

We hebben geoptimaliseerd in vivo chemo tests voor het onderzoek van immunodominance in t AG-specifieke tCD8 reacties16,17. Talrijke hulpmiddelen en reagentia zijn beschikbaar voor het bestuderen van deze reacties in de context van antitumorale immuniteit en therapie. De fibrosarcoom cel lijn gebruikt in het protocol hier beschreven (dat wil zeggen, C57SV cellen) geeft geen aanleiding tot tumoren in immunocompetente muizen. Daarom is het een nuttig instrument bij het onderzoeken van antitumorale vaccinatie. T AG-gedreven neoplastische transformatie in SELECT tissues heeft gegenereerd verschillende waardevolle modellen van autochtone kanker. Bijvoorbeeld, SV11 muizen die ontwikkelen choroid plexus papillomen in hun hersenen ventrikels35 niet Harbor endogene t AG-specifieke tCD8 omdat deze cellen worden geselecteerd tegen en geschrapt in de thymus. Echter, de overdracht van C57BL/6 splenocyten in subdodelijk bestraald, tumor-dragende SV11 muizen leidt tot een uitgebreide controle van de tumoren, die naar verluidt geassocieerd met in vivo priming van de site IV-specifieke TCD836,37 . In de transgene adenocarcinoom van de muis prostaat (VAGEBOND) model38, de site IV-specifieke reactie verdwijnt weg met progressie van de kwaadaardigheid. Echter, de anders immunorecessive site V-specifieke TCD8 cellen ontsnappen negatieve selectie in de thymus en ook voorkomen perifere tolerantiemechanismen21. Dit biedt volop mogelijkheden voor experimentele therapeutische interventies die rond site V-specifieke TCD8 functies draaien. In vivo moeten chemo tests informatief blijken in het bestuderen en mogelijk omkeren van immunologische tolerantie in verschillende modelsystemen, ook in het T AG herkennings model.

Immunodominance is een consistente functie van TCD8 reacties gegenereerd, niet alleen tegen de tumor AGS, maar ook naar pathogeen-afgeleide epitopes. In feite hebben we eerder gebruikt in vivo chemo tests om immunodominance studie in anti-influenza TCD8 reacties12. Daarom kan de geoptimaliseerde assay beschreven in dit protocol worden gewijzigd en gebruikt in een breed scala van immunologische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door Canadese instituten van het onderzoek van de gezondheid (CIHR) verleent MOP-130465 en PJT-156295 aan SMMH. JC wordt gedeeltelijk gesteund door een koningin Elizabeth II gediplomeerde beurs in wetenschap en technologie van het ministerie van Ontario van opleiding, hogescholen en universiteiten. CEM was een ontvanger van een Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship (doctoraal) van natuurwetenschappen en Engineering Research Council van Canada (NSERC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Thermo Fisher Scientific 25200-056
ACK Lysing Buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Anti-mouse CD25 (clone PC-61.5.3) Bio X Cell BE0012
Anti-mouse PD-1 (clone RMP1-14) Bio X Cell BE0146
CFSE Thermo Fisher Scientific C34554
DMEM (1X) Thermo Fisher Scientific 11965-092
Fetal bovine serum (FBS) Wisent Bioproducts 080-150 Heat-inactivate prior to use
GlutaMAX (100X) Thermo Fisher Scientific 35050-061
HEPES (1M) Thermo Fisher Scientific 15630080 10 mM final concentration
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)  Thermo Fisher Scientific 11140-050
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Stock is 100X
Rat IgG1 (clone KLH/G1-2-2) SouthernBiotech 0116-01 Isotype control
Rat IgG1 (clone HRPN) Bio X Cell BE0088 Isotype control
Rat IgG1 (clone TNP6A7) Bio X Cell BP0290 Isotype control
Rat IgG2a (clone 2A3) Bio X Cell BP0089 Isotype control
RPMI 1640 (1X) Thermo Fisher Scientific 11875-093
Sodium Pyruvate (100 mM) Thermo Fisher Scientific 11360-070 1 mM final concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yewdell, J. W., Bennink, J. R. Immunodominance in major histocompatibility complex class I-restricted T lymphocyte responses. Annual Review of Immunology. 17, 51-88 (1999).
  2. Chen, W., et al. Reversal in the immunodominance hierarchy in secondary CD8+ T cell responses to influenza A virus: roles for cross-presentation and lysis-independent immunodomination. The Journal of Immunology. 173, (8), 5021-5027 (2004).
  3. Otahal, P., et al. Inefficient cross-presentation limits the CD8+ T cell response to a subdominant tumor antigen epitope. The Journal of Immunology. 175, (2), 700-712 (2005).
  4. Lauron, E. J., et al. Cross-priming induces immunodomination in the presence of viral MHC class I inhibition. PLoS Pathogens. 14, (2), e1006883 (2018).
  5. Crowe, S. R., et al. Differential antigen presentation regulates the changing patterns of CD8+ T cell immunodominance in primary and secondary influenza virus infections. The Journal of Experimental Medicine. 198, (3), 399-410 (2003).
  6. Probst, H. C., et al. Immunodominance of an antiviral cytotoxic T cell response is shaped by the kinetics of viral protein expression. The Journal of Immunology. 171, (10), 5415-5422 (2003).
  7. Gileadi, U., et al. Generation of an immunodominant CTL epitope is affected by proteasome subunit composition and stability of the antigenic protein. The Journal of Immunology. 163, (11), 6045-6052 (1999).
  8. Zanker, D., Waithman, J., Yewdell, J. W., Chen, W. Mixed proteasomes function to increase viral peptide diversity and broaden antiviral CD8+ T cell responses. The Journal of Immunology. 191, (1), 52-59 (2013).
  9. Deng, Y., Yewdell, J. W., Eisenlohr, L. C., Bennink, J. R. MHC affinity, peptide liberation, T cell repertoire, and immunodominance all contribute to the paucity of MHC class I-restricted peptides recognized by antiviral CTL. The Journal of Immunology. 158, (4), 1507-1515 (1997).
  10. Chen, W., Khilko, S., Fecondo, J., Margulies, D. H., McCluskey, J. Determinant selection of major histocompatibility complex class I-restricted antigenic peptides is explained by class I-peptide affinity and is strongly influenced by nondominant anchor residues. The Journal of Experimental Medicine. 180, (4), 1471-1483 (1994).
  11. Kotturi, M. F., et al. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. The Journal of Immunology. 181, (3), 2124-2133 (2008).
  12. Haeryfar, S. M., et al. Terminal deoxynucleotidyl transferase establishes and broadens antiviral CD8+ T cell immunodominance hierarchies. The Journal of Immunology. 181, (1), 649-659 (2008).
  13. Leon-Ponte, M., Kasprzyski, T., Mannik, L. A., Haeryfar, S. M. Altered immunodominance hierarchies of influenza A virus-specific H-2(b)-restricted CD8+ T cells in the absence of terminal deoxynucleotidyl transferase. Immunological Investigations. 37, (7), 714-725 (2008).
  14. Kedl, R. M., et al. T cells compete for access to antigen-bearing antigen-presenting cells. The Journal of Experimental Medicine. 192, (8), 1105-1113 (2000).
  15. Kastenmuller, W., et al. Cross-competition of CD8+ T cells shapes the immunodominance hierarchy during boost vaccination. The Journal of Experimental Medicine. 204, (9), 2187-2198 (2007).
  16. Memarnejadian, A., et al. PD-1 Blockade Promotes Epitope Spreading in Anticancer CD8(+) T Cell Responses by Preventing Fratricidal Death of Subdominant Clones To Relieve Immunodomination. The Journal of Immunology. 199, (9), 3348-3359 (2017).
  17. Haeryfar, S. M., DiPaolo, R. J., Tscharke, D. C., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. Regulatory T cells suppress CD8+ T cell responses induced by direct priming and cross-priming and moderate immunodominance disparities. The Journal of Immunology. 174, (6), 3344-3351 (2005).
  18. Rytelewski, M., et al. Suppression of immunodominant antitumor and antiviral CD8+ T cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase. PLoS One. 9, (2), e90439 (2014).
  19. Maleki Vareki, S., et al. Differential regulation of simultaneous antitumor and alloreactive CD8(+) T-cell responses in the same host by rapamycin. American Journal of Transplantation. 12, (1), 233-239 (2012).
  20. Irvine, K., Bennink, J. Factors influencing immunodominance hierarchies in TCD8+ -mediated antiviral responses. Expert Review of Clinical Immunology. 2, (1), 135-147 (2006).
  21. Grossmann, M. E., Davila, T., Celis, T. Avoiding tolerance against prostatic antigens with subdominant peptide epitopes. Journal of Immunotherapy. 24, (3), 237-241 (2001).
  22. Schreiber, H., Wu, T. H., Nachman, J., Kast, W. M. Immunodominance and tumor escape. Seminars in Cancer Biology. 12, (1), 25-31 (2002).
  23. Mylin, L. M., et al. Quantitation of CD8(+) T-lymphocyte responses to multiple epitopes from simian virus 40 (SV40) large T antigen in C57BL/6 mice immunized with SV40, SV40 T-antigen-transformed cells, or vaccinia virus recombinants expressing full-length T antigen or epitope minigenes. Journal of Virology. 74, (15), 6922-6934 (2000).
  24. Fu, T. M., et al. An endoplasmic reticulum-targeting signal sequence enhances the immunogenicity of an immunorecessive simian virus 40 large T antigen cytotoxic T-lymphocyte epitope. Journal of Virology. 72, (2), 1469-1481 (1998).
  25. Chen, W., et al. Cross-priming of CD8+ T cells by viral and tumor antigens is a robust phenomenon. European Journal of Immunology. 34, (1), 194-199 (2004).
  26. Memarnejadian, A., Meilleur, C. E., Mazzuca, D. M., Welch, I. D., Haeryfar, S. M. Quantification of Alloantibody-Mediated Cytotoxicity In Vivo. Transplantation. 100, (5), 1041-1051 (2016).
  27. Aichele, P., et al. Peptide antigen treatment of naive and virus-immune mice: antigen-specific tolerance versus immunopathology. Immunity. 6, (5), 519-529 (1997).
  28. Oehen, S., Brduscha-Riem, K. Differentiation of naive CTL to effector and memory CTL: correlation of effector function with phenotype and cell division. The Journal of Immunology. 161, (10), 5338-5346 (1998).
  29. Coles, R. M., Mueller, S. N., Heath, W. R., Carbone, F. R., Brooks, A. G. Progression of armed CTL from draining lymph node to spleen shortly after localized infection with herpes simplex virus 1. The Journal of Immunology. 168, (2), 834-838 (2002).
  30. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. The Journal of Immunology. 171, (1), 27-31 (2003).
  31. Meilleur, C. E., et al. Bacterial superantigens expand and activate, rather than delete or incapacitate, preexisting antigen-specific memory CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. Epub ahead of print (2018).
  32. Goldszmid, R. S., et al. Dendritic cells charged with apoptotic tumor cells induce long-lived protective CD4+ and CD8+ T cell immunity against B16 melanoma. The Journal of Immunology. 171, (11), 5940-5947 (2003).
  33. Oberg, L., et al. Loss or mismatch of MHC class I is sufficient to trigger NK cell-mediated rejection of resting lymphocytes in vivo - role of KARAP/DAP12-dependent and -independent pathways. European Journal of Immunology. 34, (6), 1646-1653 (2004).
  34. Wingender, G., Krebs, P., Beutler, B., Kronenberg, M. Antigen-specific cytotoxicity by invariant NKT cells in vivo is CD95/CD178-dependent and is correlated with antigenic potency. The Journal of Immunology. 185, (5), 2721-2729 (2010).
  35. Brinster, R. L., et al. Transgenic mice harboring SV40 T-antigen genes develop characteristic brain tumors. Cell. 37, (2), 367-379 (1984).
  36. Tatum, A. M., et al. CD8+ T cells targeting a single immunodominant epitope are sufficient for elimination of established SV40 T antigen-induced brain tumors. The Journal of Immunology. 181, (6), 4406-4417 (2008).
  37. Schell, T. D., Tevethia, S. S. Control of advanced choroid plexus tumors in SV40 T antigen transgenic mice following priming of donor CD8(+) T lymphocytes by the endogenous tumor antigen. The Journal of Immunology. 167, (12), 6947-6956 (2001).
  38. Greenberg, N. M., et al. Prostate cancer in a transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (8), 3439-3443 (1995).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics